Procédures sévères

910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une irradiation, des injections, des prélèvements de sang hebdomadaires, des prélèvements de moelle osseuse et, pour certaines, une plaie provoquée par brûlure, afin de tester des cibles contre une leucémie agressive, dont des sécrétions de la grenouille utilisée dans le rituel du kambo. Le porteur prévoit la mise à mort quand les cellules leucémiques atteignent 80 % du sang ou dès l'apparition de signes de souffrance. Il affirme que le développement de la leucémie exige un "micro-environnement médullaire" impossible à reproduire in vitro.

Objectifs

Le projet vise à identifier des nouvelles thérapies pour le traitement de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), un cancer agressif des cellules du sang. Ce projet se base sur deux hypothèses. Selon la première hypothèse, la protéine ACLY, impliquée dans le cycle de synthèse des acides gras, jouerait en rôle clef dans le développement de la leucémie. Elle constituerait donc une importante cible thérapeutique. Cette hypothèse sera adressée en vérifiant si la leucémie disparaît après avoir invalidé la protéine ACLY. Selon la deuxième hypothèse, les protéines contenues dans les sécrétions de la grenouille tropicale Phyllomedusa bicolor (utilisées dans le rituel du kambo) pourraient être utilisées comme approche thérapeutique dans les LAM. Cette hypothèse se base sur observations cliniques, car un patient atteint de LAM a été guéri après avoir fait le rituel du kambo. Ces hypothèses seront abordées grâce à trois lignées différentes de souris: - Des souris qui développent une leucémie similaire à celle développée par les patients atteints de LAM - Des souris qui permettent d’invalider la protéine ACLY dans les leucémies - Des souris qui permettent la survie et l’expansion des cellules leucémiques de patients, cellules qui sont trop fragiles pour être maintenues in vitro, pour y mener des tests thérapeutiques

Bénéfices attendus

1. Bénéfices à court terme: ce projet fera progresser le connaissance scientifique car il permet d’identifier de nouveaux mécanismes qui expliquent pourquoi et comment la leucémie aiguë myéloïde survient et se développe. La connaissance de ces mécanismes sera utile non seulement pour comprendre les mécanismes de leucémogenèse mais aussi potentiellement pour d’autres cancers du sang et/ou des cancers solides. 2. Bénéfices à long terme: grâce à ce projet nous espérons identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’améliorer le pronostic de leucémie aiguë myéloïdes, de prévenir la résistance aux médicaments et les rechutes et donc prolonger donc la vie des patients atteints de LAM.

Procédures

P1 - analyse de la leucémie après invalidation de la protéine ACLY: exposition à l’antibiotique doxycycline (eau de boisson, tous les jours de jour 1 à jour 168) Injection intra-péritonéale de tamoxifen, 5 jours consécutifs, de jour 1 à jour 5, prélèvements sanguins hebdomadaires (ponction veineuse submandibulaire sur souris vigile avec une lancette), effectués pour 24 semaines à partir de 15 jours après l’exposition à la doxycycline. P2 - analyse de la progression de la leucémie après invalidation d’ACLY dans des cohortes des souris receveuses: une injection intra-péritonéale d’anesthétique une irradiation sub-létale (durée d’une minute) tout de suite après l’anesthésie 6 heures après l’irradiation, une injection intraveineuse des cellules leucémiques murines Prélèvements sanguins hebdomadaires, effectués pour 36 semaines à partir de 7 jours après l’injection des cellules leucémiques. P3 - analyse de l’invalidation d’ACLY sur la survie des cellules saines de la moelle osseuse: injection intra-péritonéale de tamoxifen, 5 jours consécutifs, de jour 1 à jour 5. P4 -effet de l’application des sécrétions de grenouille sur le dévelopement de la leucémie. exposition à l’antibiotique doxycycline (eau de boisson, tous les jours de jour 1 à jour 198) prélèvements sanguin hebdomadaires, effectués pour 28 semaines à partir de 15 jours après l’exposition à la doxycycline une injection intra-péritonéale de l’anesthétique quand la leucémie apparaît dans le sang (à patrir de la semaine 8) Injection intra-péritonéale de l’analgésique, tout de suite après l’anesthésie 30 minutes après analgésie, induction d’une plaie par brûlure par application pendant 1 seconde d'une tige de laiton de 2mm de diamètre chauffée à 100°C sur la peau du dos de la souris. une application cutanée des peptides bioactifs sur plaies cutanées, faite tout de suite après l’induction de la plaie par brûlure. 8h et 16h après la brulure, injection intra-péritonéale de l’analgésique. P5 - greffe des cellules leucémiques des patients, injection intra-péritonéale de busulfan 24 h après, injection intraveineuse des cellules leucémique humaines, prélèvements sanguin hebdomadaires sur souris vigiles, effectués pour 52 semaines à partir de 15 jours après les injections des cellules leucémiques, prélèvement de la moelle osseuse sur souris anesthésiée (4 prélèvements totaux qui se font en alternant les pattes avec une fréquence de 3 semaines entre les prélèvements

Impact sur les animaux

1. Effets indésirables directement liées aux actes expérimentaux: 1. Nuisances modérées liées aux injections intra-péritonéales et intraveineuse. Ces nuisances sont attendues durer quelques secondes, ce qui est le temps requis pour effectuer les injections. 2. Nuissances sévères à la réalisation d’une plaie par brulure. L’administration de l’analgésique avant la réalisation de la paie diminuera fortement la douleur. On attend donc seulement une nuisance modérée liée à cette intervention. 3. Nuissances modérées aux prélèvements de la moelle osseuse en intra-tibiale. L’administration de l’anesthésie avant la réalisation des prélèvements limitera au maximum ces nuances. Elles vont également être limitées par leur nombre (4 maximum) et l’alternance des deux pattes. 4. Modérées nuisances liées aux prélèvements sanguins hebdomadaires. Ces nuisances sont attendues pour durer quelques secondes, ce qui est le temps requis pour effectuer le prélèvement, car le saignement s’arrête par compression dès que le prélèvement est terminé. Nuissances modérées liées à l’irradiation sub-létale (2.5 Gy). Ces nuisances sont attendues pour durer 1 minute, ce qui correspond au temps nécessaire pour effectuer l’irradiation. 2. Effets indésirables issues des produits injectés: effets indésirables modérées liés à l’injection des cellules leucémiques (réduction de l’activité, position anormale du nez et des oreilles, poil hérissé, yeux plissés ou bridés). Ils vont être prévenus au maximum grâce à une analyse du taux d’infiltration leucémique à travers le prélèvement sanguin, qui doit conduire à la mise à mort anticipée de la souris en cas d'infiltration forte

Devenir

A l’issue de chaque procédure les animaux seront mises à mort avec dislocation cervicale car la moelle osseuse et la rate doivent être prélevées et analysées pour déterminer le taux d’infiltration leucémique.

Remplacement

Les objectives du projet ne peuvent pas être réalisés en faisant des expériences alternatives in vitro car le développement de la leucémie nécessite la présence d’un micro-environnement médullaire qui joue un rôle clef dans le développement de la leucémie et le maintien des cellules souches leucémiques. L’évaluation de l’activité thérapeutique du Kambo nécessite également d’être faite in vivo car l’activité pharmaco-dynamique et la pharmaco-cinétique des peptides contenus dans les sécrétions de la grenouille jouent certainement un rôle clefs dans leur effet thérapeutique et elles ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation nous allons: - mutualiser au sein de l’équipe les ressources cellulaires post-mortem afin qu’un même échantillon puisse être exploité pour différents projets et ainsi éviter l'utilisation itérative de souris - effectuer une étude statistique qui permettra de determiner le nombre des souris à utiliser pour obtenir l’information scientifique en évitant la répétition de l’expérience. Cela permettra de réduire au minimum l’utilisation des animaux optimiser le matériel issu des greffes pour production multiple (congélation des cellules, conservation du materiel génétique etc..) pour analyses rétrospectives et éviter la répétition de l’expérience). quantifier la viabilité cellulaire des échantillons humains avant toute injection pour limiter les échecs de greffe

Raffinement

Pour réduire au maximum la douleur associée à la leucémie, la mise à mort sera pratiquée lorsque les cellules leucémique dans le sang représenteront 80% des cellules circulantes, c’est à dire quand la leucémie peut commencer à générer une légère souffrance aux animaux. Si des signes cliniques de souffrance se déclarent avant ce point limite, l’animal sera mis à mort. La manifestation de signe évoquant une douleur chez l’animal sera surveillée grâce à un suivi de 5 jours par semaine (de lundi au vendredi). Nous veillerons à optimiser, enrichir l’hébergement (nous mettrons de la nourriture dans la cage si nous constatons une difficulté de déplacement et accès à la nourriture et/ou à l'eau). Pour réduire la souffrance liée à la réalisation d’une plaie par brulure, l’analgésie sera administrée 3 fois (30 minutes avant de la réalisation de la plaie, 8 heures et 16 heures après). La plaie sera suivie 5 jours par semaine afin de surveiller tout risque d’infection (jusqu’à cicatrisation de la plaie). Si mise en évidence d’une infection cutanée, la plaie sera désinfectée 2 fois par jour avec une solution de Vétadine à 10% jusqu’à disparition des signes d’infection. Pour réduire au maximum les nuissance liées aux injections et au prélèvement de sang, nous ferons une surveillance 5 jours par semaine. Si des signes cliniques de souffrance animal apparaissent la souris sera mise à mort. Pour réduire les nuisances liées au prélèvement intra-tibial de la moelle osseuse les souris seront anesthésiées avant le prélèvement. D’autre part, nous limiterons ces prélèvements à un total de 4 (c’est à dire 4 prélèvements totaux qui se font en alternant le site de prélèvement entre le tibia gauche et le tibia droit avec une fréquence de 3 semaines entre prélèvements). Nous allons aussi réaliser un suivi du comportement des souris 5 jours par semaine après réalisation de ces prélèvements afin de vérifier que ces prélèvements n’auront pas d’impact sur le déplacement des souris. Si nous constatons des souris incapables de se déplacer, elles seront immédiatement mises à mort par dislocation cervicale

Choix des espèces

L’objective de ce projet est d’identifier de nouveaux traitement pour la LAM, une maladie qui rechute très fréquemment. Au cours des dernières années, la communauté scientifique a générée des lignées génétiquement modifiées en utilisant l’espèce Mus musculus. Ces lignées miment la maladie humaine et permettent donc d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de tester leur efficacité thérapeutique afin d’aboutir à des nouveaux traitements pour les patients atteints de cette maladie. Les souris génétiquement modifiées que nous allons utiliser proviendront de notre élevage. Elles seront utilisées entre 8 semaines et 36 semaines (âge auquel les souris auront toutes développées la leucémie). Les souris que nous allons utiliser comme receveuses de cellules leucémiques murines seront fournies par un fournisseur agrée à l’âge de 7 semaines. Elles seront utilisées à 8 semaines, âge auquel ces souris tolèrent bien la greffe). Elles seront utilisées jusqu’au l’âge de 17-25 semaines, car 8-16 semaines seront nécessaires afin que les souris développent la leucémie après avoir été greffées. Les souris immunodéficientes que nous allons utiliser comme receveuses de cellules leucémiques humaines proviendront de notre élevage. Ces souris seront utilisées entre 8 et 15 semaines car cette fenêtre d’âge permet d’avoir un taux idéal de greffe, en permettant de réaliser la procédure d’injection dans de bonnes conditions. Ces souris seront utilisées jusqu’à 52 semaines après la greffe car, comme décrit dans la littérature scientifique, certaines cellules humaines peuvent greffer après un longue période de temps, qui peux atteindre 52 semaines.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent des injections répétées de deux anticancéreux, le paclitaxel et la vincristine, pour reproduire les neuropathies douloureuses provoquées par la chimiothérapie chez les patients, avec mesure de l'activité nerveuse sous anesthésie. Le porteur décrit des atteintes possibles, perte de poids, baisse d'activité, agressivité et douleur, et reconnaît avoir eu du mal à trouver dans la littérature une description détaillée de ces effets. Il affirme que la réponse aux chimiothérapies ne peut se modéliser ni in vitro ni in silico et qu'aucune alternative ne remplace l'animal, avant un prélèvement terminal de peau et de nerf.

Objectifs

Dans ce projet pilote, notre objectif est de tester deux protocoles actuellement utilisés dans la chimiothérapie chez l’Homme. Les molécules d’intérêts, bien qu’efficaces dans le traitement contre le cancer, sont responsables de l’apparition de neuropathies périphériques particulièrement handicapantes, qui se manifestent chez plus de 68% des patients traités avec un anti-cancéreux. Les troubles neuropathiques perdurent même après l’arrêt du traitement. La neuropathie périphérique induite par chimiothérapie (CIPN : Chemotherapy-induced peripheral neuropathy) se manifeste par une atteinte sensorielle des membres, tels que des douleurs, picotements, engourdissements, sensations de brûlure, sensibilités à la température, etc. et sont globalement similaires d’un agent chimio thérapeutique à l’autre. Malgré la connaissance des mécanismes de toxicité de ces différents traitements, il n’y a, à l’heure actuelle, aucun médicament capable de soigner efficacement et de manière définitive la neuropathie périphérique, les traitements étant majoritairement à but palliatif. Bien que de nombreux modèles rongeurs (souris et rats) aient été développés, l’incohérence des résultats reste un problème. Ainsi, il existe autant de résultats que de protocoles expérimentaux, engendrant une véritable confusion autour de ces modèles. Ici, nous souhaitons mettre en place un modèle fiable et reproductible, qui serait une représentation pré-clinique fidèle des CIPN observés chez l’Homme, en administrant aux rats de molécules couramment utilisées dans la chimiothérapie en hôpital.

Bénéfices attendus

Une fois validé par analyse statistique, ce modèle nous donnera la possibilité d’envisager différentes approches pharmacologiques et thérapeutiques qui pourraient conduire au traitement des CIPN. La construction de ce modèle est impossible sans l’utilisation d’animaux vivants. L’organisme étant un ensemble complexe, il serait difficile de modéliser la réponse systémique aux chimiothérapies sur des modèles in-vitro ou in-silico. Ainsi, à l’heure actuelle, nous ne sommes pas capables de remplacer l'expérimentation animale par d'autres alternatives pour ce projet.

Procédures

Les animaux de la première procedure (Taxol), auront quatre injections en intrapéritonéale. Ainsi qu'une mesure électromyographique sous anesthésique gazeuse au jour 29. Les animaux de la second procédure (Vincristine), auront cinq injections par voie intraveineuse. Ainsi qu'une mesure électromyographique sous anesthésique gazeuse au jour 18.

Impact sur les animaux

Pour ce modèle, les nuisances possibles sont une baisse du poids, une baisse d’activité, le développement d’une agressivité et/ou de douleur, une inflammation du point d’injection. Cependant, il nous a été très difficile de trouver dans la littérature une description détaillée des effets secondaires qui ont déjà été observés à la suite du traitement par les anticancéreux

Devenir

Tous les animaux subissant des prélèvements de peau et de nerf à la fin de leur procédure, ils sont tous euthanasiés.

Remplacement

Ce projet s’articule autour d’une pathologie nerveuse liée aux effets secondaires d’un traitement anti-cancereux actuellement utilisé en médecine humaine. Les processus mis en jeu dans ce cas ne peuvent être modélisés qu’à travers l’étude de l’animal vivant. Les cultures cellulaires, de même que les modèles in-silico, ne nous fourniraient qu’une réponse limitée et ne pourraient, en l’état actuel des connaissances, remplacer le système complexe qu’est l’organisme vivant. Ainsi même si des études prélimianires sont possibles et faites (selection des molécules, étude de leur mécanisme anti-cancéreux), l’étude présentée dans ce projet ne pourrait être complètement réalisée sans le recours aux animaux.

Réduction

Nous envisageons d’utiliser 10 animaux par groupe après analyse une statistique à l’aide d’un logiciel. Chaque molécule sera testée à 1 dose choisie suite à notre revue de la littérature et les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques permettant d'évaluer si les traitements chimiothérapiques testés peuvent induire des neuropathies. Chaque groupe sera composé de 10 animaux. Pour comparaison, nous intègrerons également 20 animaux contrôles qui seront traités avec le véhicule de chaque molécule. Cette expérience sera ensuite répétée une deuxième fois afin de confirmer ou infirmer les résultats de la première session.

Raffinement

Les animaux utilisés seront hébergés dans notre animalerie dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations : nous portons une attention particulière aux conditions d’hébergement afin que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. L’enrichissement du milieu comporte des tunnels en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. Le nombre et durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Les animaux font également l’objet d’une surveillance quotidienne, et tout signe de souffrance entraine un signalement à la structure interne du bien-être animal, pour prendre une décision rapide sur le devenir de l’animal (pouvant aller jusqu’à l’interruption des procédures) et pour raffiner notre grille de points limites pour nos futures procédures. Tous les moyens possibles sont utilisés pour améliorer le bien-être des animaux du projet. Afin de réduire la souffrance dans la mesure du possible, par la détermination de points limites prédictifs et de critères d'arrêt permettant d'interrompre les procédures .

Choix des espèces

Dans ce projet, nous avons pris le parti d’utiliser des rats mâles Sprague- Dawley. Cette souche est une des souches les plus utilisées dans la littérature en ce qui concerne la modélisation de cette pathologie (DOI: 10.1371/journal.pone.0221787). Les études utilisant cette souche semblent les plus robustes et les plus reproductibles. De plus, l’appareillage présent dans les locaux de Neurofit est mieux adapté aux souches de rats. Les animaux que nous utiliserons seront adultes (environ 6-8 semaines soit 250g au moment de la première injection pour les mâles et environ 200g au moment de la première injection soit pour les femelles), les CIPNs observés en clinique touchant en grande majorité les individus adultes. De plus nous souhaitons que les animaux puissent supporter au mieux les traitements entrepris dans ce projet.

4 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une fibrose pulmonaire leur est induite par la bléomycine ou par irradiation, puis des composés leur sont administrés par de multiples voies, pour tester des traitements candidats. Le porteur indique que les souris peuvent perdre jusqu'à 20 % de leur poids et présenter des difficultés respiratoires. Il conclut que les données in vitro restent insuffisantes pour prédire l'efficacité et qu'un modèle vivant est requis.

Objectifs

L’objectif est de tester l’efficacité thérapeutique de composés chimiques ou biologiques dans un modèle de fibrose pulmonaire. La fibrose est la conséquence de l’activation chronique des fibroblastes et myofibroblastes qui se mettent à produire en permanence du tissu cicatriciel (dépôts de collagène, élastine, fibronectine). Dans les poumons, l’apparition de ce tissu cicatriciel s'accompagne ou est précédée d’une phase inflammatoire. La fibrose pulmonaire cause une perte d’élasticité du poumon et une insuffisance respiratoire chronique. Il n'existe pas de médicament éliminant la fibrose pulmonaire, les traitements disponibles ralentissent uniquement la progression de la maladie. La bléomycine (agent anti-cancéreux utilisé chez l’homme) est connue pour se concentrer dans les poumons, avec comme effet secondaire délétère le développement chez le patient d’une fibrose pulmonaire. Chez le rongeur, instillée par voie intratrachéale sous anesthésie générale ou par voie sous-cutanée via une mini-pompe la bléomycine induit une fibrose pulmonaire semblable à celle observée chez l’homme. Celle-ci atteint son maximum entre 3 et 4 semaines, puis se résout spontanément 6 à 8 semaines après exposition. La fibrose pulmonaire peut aussi être induite consécutivement à une radiothérapie anti-cancéreuse du poumon. C’est un effet secondaire sévère connu chez le patient car les rayons entraînent une destruction des tissus cancéreux mais aussi des tissus sains, avec une très forte inflammation et une cicatrisation anarchique. Le développement de la fibrose pulmonaire induit par la radiation est plus lent à se mettre en place, et dépend de la dose et de la fréquence des rayons. Ce projet reproduira chez le rongeur la pathologie pulmonaire fibrotique telle qu’elle est observée chez l’homme, et permettra l’évaluation de composés anti-fibrotiques. L’efficacité des composés testés sera déterminée par la mesure de marqueurs circulants et pulmonaires (TGFβ, dépôts de collagène, hydroxyproline…). Les composés chimiques ou biologiques qui seront évalués dans ce projet auront au préalable été sélectionnés sur des critères de puissance et d’efficacité in vitro. En fonction de leurs propriétés pharmacocinétiques, ils pourront être testés en mode préventif ou thérapeutique par exemple par voie orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur la fibrose pulmonaire. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées.

Procédures

La fibrose pulmonaire sera induite sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines soit par administration intra trachéale unique ou sous cutanée (à l’aide d’une minipompe osmotique pendant 28 jours) de Bléomycine soit par exposition à des radiations (unique). Ces deux procédures auront lieu sous anesthésie générale qui durera environ une heure. Afin d’évaluer de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale, sous anesthésie générale d’environ une heure, intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie, orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ), sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon), ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). La phase in vivo pourra durer jusqu’à 35 jours pour la fibrose induite par la bléomycine et jusqu’à 15 semaines pour les radiations. Les volumes administrés respecteront les recommandations. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera environ une heure. Des mesures de saturation en oxygène, sur animal anesthésié ou vigile, pourront être effectuées au cours des procédures. Les mesures vigiles impliquent que les animaux soient placés en hébergement individuel environ 1 heure. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus, lavages broncho-alvéolaires. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie, des mesures de paramètres mécaniques pulmonaires pourront être réalisées. Cette mesure impliquera la réalisation d’une trachéotomie. La mesure prendra environ 15 minutes avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

Dans ce modèle de fibrose pulmonaire, nous nous attendons à observer des pertes de poids chez les animaux du fait de l’inflammation, pouvant atteindre 20%. Par ailleurs, les animaux pourraient présenter des difficultés respiratoires. Concernant les mesures de saturation, peu d’effets indésirables pour l’animal sont attendus, puisque la mesure est peu invasive et indolore. Dans le cas de mesures chez l’animal vigile, un léger stress pourra être généré par l’hébergement individuel mais les souris hébergées individuellement le seront seulement pour environ 1h, le temps de la mesure, et seront seulement séparées par des cloisons transparentes de leurs congénères, afin qu’un contact visuel soit maintenu. Concernant les mesures de paramètres mécaniques par ventilation forcée, elles impliqueront une trachéotomie, donc l’anesthésie inclura l’administration de buprénorphine et un alpha-2 agoniste. Par ailleurs, elles seront réalisées sous anesthésie profonde et suivies d’une euthanasie sans réveil.

Devenir

Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, ainsi qu’à des lavages broncho-alvéolaires et des mesures de compliance pulmonaire, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.

Remplacement

Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.

Réduction

Chez la souris, dans le modèle Bléomycine, un nombre minimum de 8 animaux adultes par groupe est nécessaire pour observer une réduction significative de 50% d’un seul paramètre d’intérêt (dosage hydroxyproline). Ce nombre pourra monter jusqu’à 12 pour une réduction significative sur plusieurs autres paramètres suite à un traitement préventif ou curatif (analyse histologique et dosage TGFb actif ou total). Par ailleurs, étant donné que certains animaux ne répondent pas à la procédure d’induction, 5 animaux supplémentaires par groupe seront systématiquement intégrés. La même stratégie sera appliquée lors de la mise en place du modèle induit par la radiation chez la souris.

Raffinement

Pour la mesure de saturation sur animal vigile, afin de limiter le stress lié à l’hébergement individuel durant la mesure, les animaux seront maintenus en contact visuel avec leurs congénères via une paroi transparente. Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine : • A partir de 10% de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement et une réhydratation sous-cutanée sera mise en place • Entre 10 et 15% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, une fois par jour. • Entre 15 et 25%% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL, deux fois par jour. Un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de la cage. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites ci-dessous concernent l’état général de l’animal. • Perte de poids rapide ou en continu : - 20 à 25% de perte de poids par rapport au poids à J0 du protocole sur trois jours consécutifs - plus de 25% de perte de poids par rapport au poids à J0 du protocole, constatée une fois • Déshydratation sévère (test de pli de peau), cachexie, émaciation • Absence de réponse aux stimuli extérieurs

Choix des espèces

La souris mâle C57BL/6J sera privilégiée pour le modèle de fibrose pulmonaire induit par la bléomycine car ce modèle est bien décrit et documenté dans la littérature avec cette souche et sexe en particulier. La souris femelle C57BL/6J sera utilisée pour le modèle de fibrose pulmonaire induit par la radiation, car ces modèles sont bien décrits dans la littérature sur ces souches et les femelles sont plus sensibles à la radiation que les mâles. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine et les radiations sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.

1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souriceaux sont soumis dès le sevrage à une "défaite sociale juvénile", des agressions physiques répétées par des souris adultes, puis reçoivent du tamoxifène, une chirurgie cérébrale et pour certains une stimulation magnétique, avec de nombreux tests comportementaux. Le porteur écrit que ce modèle induit "de la douleur physique" et "de la douleur psychique" et un phénotype anxio-dépressif, cette souffrance étant "la base du modèle". Les souris agresseuses sont aussi tuées, et il affirme qu'aucune méthode alternative in vitro ou in silico n'est disponible.

Objectifs

L’exposition précoce à des traumas, incluant la maltraitance infantile (négligence, abus sexuel, physique ou psychologique), est indiscutablement un des plus importants facteurs prédicteurs de pathologies psychiatriques à l’adolescence et à l’âge adulte, notamment de la dépression et du suicide. Les études d’imagerie montrent de façon systématique que les expériences de maltraitance infantile modifient les trajectoires de développement et la connectivité de régions cérébrales impliquées dans les mémoires aversives. Les substrats neurobiologiques de ces altérations sont cependant particulièrement inexplorés. Notre hypothèse est les memoires traumatiques associées au stress precoce sont consolidés et deviennent persistantes jusqu’à l’age adulte grace a la formation de la matrice extracellulaire, en particulier les filets perineuronaux (PNNs), qui se developpent autour de certains neurones pendant l’enfance et l’adolescence. Indirectement les PNNs participeraient ainsi à la survenue de troubles liés au stress, dont la dépression et le syndrome de stress post-traumatique. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons un modele animal de stress précoce chez la souris, la défaite sociale juvénile (DSj), basé sur un évenement traumatique pendant la periode juvénile (aggression physique). Nos objectifs sont de : - Cartographier les neurones qui participent à la mémoire du trauma - Tester si la manipulation de ces neurones est suffisante pour rappeler la mémoire du trauma - Tester comment ce modele de stress précoce affecte le développement des PNNs. - Tester si les la suppression des PNNs modifie l’activité des neurones qui participent au souvenir du trauma - Tester si une approche non-invasive de neurostimulation, en particulier la stimulation magnétique transcranienne (rTMS), au potentiel clinique bien établi dans le traitement des pathologies liées au stress tel que le stress post-traumatique et la dépression, modifie la formation des PNNs et perturbe le rappel de la mémoire du trauma.

Bénéfices attendus

L’adversité précoce est le plus grand prédicteur des troubles mentaux, en particulier de l’anxieté, du trouble de stress post-traumatique et de la dépression. Ces troubles sont les maladies mentales les plus rependues et la première cause d’invalidité dans le monde. En permettant une meilleure compréhension des substrats neurobiologiques des effets à long terme du stress précoce, ce projet s’inscrit donc dans une démarche nécessaire pour établir de nouvelles pistes thérapeutiques afin de soigner ces maladies. Ce projet vise en outre à étudier le rôle des PNNs dans la consolidation des traces mnésiques, à travers une démarche expérimentale innovante, il s’aligne donc parfaitement avec les enjeux et défis actuels en neurosciences fondamentales, avec pour bénéfice une meilleure compréhension du fonctionnement du cerveau au niveau cellulaire. Finalement, si la stimulation cérébrale non-invasive a des potentiels thérapeutiques bien établis en clinique pour les pathologies liées au stress, en particulier le trouble de stress post-traumatique et la dépression, les bases neurobiologiques de cette action thérapeutique est actuellement inconnue. En caractérisant mieux comment la rTMS modifie les traces mnésiques du trauma et la plasticité cérébrale à travers le remodelage des PNNs, cette étude permettra donc de mieux comprendre le potentiel de cette approche.

Procédures

Procédure 1 : sélection de souris de la souche agressives (200 souris de la souche expérimentale non OGM, 300 souris de la souche agressive) Des souris de la souche expérimentale subissent 3 sessions de 5 minutes (1 session par jour) où elles sont potentiellement agressées physiquement par des souris agressives afin de sélectionner des agressives. Procédure 2 : optimisation du dosage du tamoxifène (84 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Agression physique unique de souris expérimentale OGM par une souris agressive pendant 10 minutes 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène sur les souris expérimentale OGM (2 secondes par animal) 3) Agression physique unique de souris expérimentale OGM par une souris agressive (10 minutes) Procédure 3 : visualisation des neurones participant à la mémoire de la défaite sociale juvénile (544 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Exposition à la défaite sociale juvénile 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène 3) Tests de comportement (interaction sociale, hypophagie induite par la nouveauté, open-field, labyrinthe en croix surélevé, test de préférence au sucrose, test de nage forcée, boîte claire obscure. Procédure 4 : Rôle des filets périneuronaux dans le rappel du trauma (344 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Exposition à la défaite sociale juvénile 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène 3) Injection unique intra-cérébrale de chondroïtinase ou de solution saline par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie gazeuse (durée de 2 heures par animal) 3) Tests de comportement Procédure 5 : effet de l’inhibition des neurones activés pendant la défaite sociale juvénile sur le rappel du trauma (216 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Exposition à la défaite sociale juvénile 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène 3) Implantation de fibres optiques par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie gazeuse (durée de 2 heures par animal) 3) Tests de comportement combinés à stimulation lumineuse Procédure 6 : Effet de la Stimulation Magnétique Transcrânienne répétitive (rTMS) sur les traces mnésiques du trauma visualisées par photométrie (216 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Exposition à la défaite sociale juvénile 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène 3) Implantation de fibres optiques 4) protocole de rTMS sous anesthésie gazeuse (durée 10mn, 5 jours consécutifs) 3) Tests de comportement combinés à stimulation lumineuse

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des différentes approches utilisées sont décrits ci-dessous : - Modèle de défaite sociale juvénile : Le modèle étant base sur des agressions physiques répétées, il induira de la douleur physique. Il induira également de la douleur psychique, un état de stress aigu pendant la procédure mais aussi durable, en induisant un phénotype anxio-depressif chez les souris exposées au modèle. Cette douleur psychique est la base du modèle, l’objectif étant d’étudier les substrats neurobiologiques des changements comportementaux induits par ce stress. - Injection IP de 4-OHT : La procédure peut avoir une conséquence négative sur le bien-être animal et induire une douleur aigue. -Tests de comportement : Basés sur des mesures quantitatives ou qualitatives d’exploration dans des dispositifs nouveaux et donc possiblement anxiogènes, les tests utilises peuvent induire un stress léger chez les animaux. - Injections intra-cérébrale et implantation de fibres optiques : La chirurgie stéréotaxique est susceptible d’induire douleurs physiques et inconfort chez l’animal, avec perte potentielle de poids et mobilité réduite dans les 2 jours qui suivent la procédure (pour l’implantation de la fibre optique, l’injection seule étant bien tolérée).

Devenir

Les animaux expérimentaux seront euthanasiés à l’issue des tests comportementaux en vue d’une perfusion transcardiaque permettant d’effectuer des procédures d’immunohistochimie après prélèvement des cerveaux. Les agresseurs, du fait de leurs caractéristiques agressives, seront euthanasiés étant donné l'impossibilité de réutiliser ces animaux ou de les faire adopter.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des zones cérébrales impliquées dans la réponse au stress et les émotions.

Réduction

Les effectifs sont optimisés pour prendre en compte qu’une partie des animaux (~15 à 30% selon nos données préliminaires et la littérature) sera résiliente au protocole de défaite sociale juvénile (DSj), ces effectifs sont donc nécessaires pour pouvoir comparer statistiquement les groupes expérimentaux pour les différentes variables comportementales (témoins, DSj susceptibles, DSj résilients). Dans le cas où aucune raison préalable ne laisse supposer un dimorphisme sexuel dans la variable mesurée l’expérience ne sera faite que sur des males. S’il est essentiel de pouvoir identifier des souris « aggresseurs », ce qui est un prérequis au protocole de DSj, les aggresseurs sélectionnés peuvent être réutilisés par la suite en tant qu’agresseurs au cours des procédures suivantes. Etant donné que les tests statistiques utilisés seront non-paramétriques, et donc ne seront pas basés sur des comparaisons de moyennes mais de rangs, une analyse de puissance cohérente dans ces conditions sans une connaissance a priori précise de la distribution des variables est difficile. Le choix des effectifs est basé principalement sur les données préliminaires comportementales et histologiques obtenues.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux qui subissent la DSj seront suivis quotidiennement, dans l’heure suivant l’épisode de défaite sociale, avec une attention particulière portée à l’état général, l’état de chair et aux plaies cutanées potentielles des animaux tests, ce qui sera facilite par des formulaires de sante précis pour chaque souris. Des points limites énoncés plus bas seront mis en place avant intervention ou exclusion du protocole.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, et finalement la possibilité d’utiliser des animaux transgéniques permettant l’utilisation d’outils de neurosciences intégratives font de la souris le modèle animal le plus pertinent. Les souris expérimentales sont utilisées le lendemain du sevrage, a P21, a un stade juvénile, et les expérimentations continuent jusqu’à l’âge adulte. Les souris CD1 servant d’agresseurs dans le modèle de DSj sont d’anciens reproducteurs adultes. Les souris C57BL/6 utilisées comme sentinelles pour tester l’agressivité des CD1 sont utilisées à un stade juvénile (P21).

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Modèles génétiques d'une ataxie cérébelleuse, elles passent six tests de coordination et un test musculaire répétés à cinq âges, et une partie reçoit un agent déclenchant une crise d'épilepsie, avant mise à mort. Le porteur qualifie ces tests de non "générateurs de souffrance" tout en les classant en gravité modérée à sévère selon l'intensité de la phase d'épilepsie. Il indique que les cultures cellulaires ne peuvent remplacer l'étude du phénotype comportemental des souris.

Objectifs

Ce projet vise à étudier une ataxie cérébelleuse d’origine génétique qui se manifeste chez les patients par une ataxie cérébelleuse avec une évolution lente et progressive pouvant être associée à une intolérance à l’exercice, un retard mental faible à modéré, des crises d’épilepsie et des pseudo-épisodes vasculaires cérébraux. L’objectif de ce projet est de comprendre les processus pathologiques de cette ataxie cérébelleuse en étudiant le phénotype de deux modèles de souris génétiquement différents. • Le premier possède une délétion totale du gène responsable de la maladie et développe une forme modérée de la maladie. Ce modèle sera étudié dans son nouvel environnement. • Le deuxième possède une mutation ponctuelle retrouvée chez un patient qui est censée reproduire la forme la plus symptomatique de la maladie. Nous obtiendrons ainsi de bons modèles capables de reproduire les différentes atteintes cliniques rencontrées chez les patients. Si le deuxième modèle reproduit la forme la plus symptomatique, avec la présence non seulement des signes cliniques mais aussi des lésions histologiques, ce nouveau modèle remplacera le premier modèle.

Bénéfices attendus

Bénéfices attendus : - A court terme, ce projet spécifiquement consacré à l’étude d’une ataxie cérébelleuse récessive, permettra tout d’abord de valider et d’approfondir le phénotype identifié dans le modèle avec délétion totale du gène, précédemment validée sur un autre site, ainsi que celui du nouveau modèle avec la mutation ponctuelle. - A moyen terme, l’ensemble des expériences réalisées sur ces deux modèles murins permettront d’obtenir une vision intégrée et globale du fonctionnement du gène responsable et de la physiopathologie de cette ataxie. Elles permettront de mettre en place des essais pré-cliniques afin de tester l’efficacité d’agents pharmacologiques sur le modèle le plus pertinent. - A plus long terme, une bonne compréhension de la physiopathologie de cette ataxie et l’identification de solutions thérapeutiques efficaces permettront le transfert de ces données vers la clinique pour une meilleure prise en charge et prévention de la maladie.

Procédures

Dans ce projet, les animaux seront soumis à 6 tests comportementaux permettant de mesurer la coordination des animaux et 1 test musculaire répartis sur 4 jours. Ils seront répétés à 5 âges différents. Ces tests ne sont pas générateurs de souffrance pour les souris. La durée de ces tests est comprise entre 30 secondes et 5 minutes. Une partie de ces animaux seront soumis, sur une durée de 20 minutes, à un agent pharmacologique inducteur d’épilepsie. A la fin de chaque étude, une anesthésie générale sera pratiquée précédant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les tests comportementaux ont une classe de sévérité modérée à sévère. Les effets indésirables rencontrés comprennent : Classe modérée : - Une courte période de fatigue musculaire, - Une courte période où les souris seront mouillées après passage dans un bassin de nage à 27°C. Classe sévère possible: - Une courte phase d’épilepsie. Aucun effet nuisible de cette phase épileptique n’a été observé lors de nos précédentes expérimentations. La sévérité dépendra de l’intensité de la phase d’épilepsie.

Devenir

Dans ce projet, les animaux qui seront étudiés à différents âges seront replacés dans leur cage entre chaque série de tests. A la toute fin des études, les animaux seront mis à mort.

Remplacement

L’utilisation de cultures cellulaires primaires, nous permet de tester différentes hypothèses en réduisant le nombre d’animaux requis pour la caractérisation des deux modèles. Le nombre de souris proposé dans les différentes procédures tient compte de ce remplacement. En aucun cas, l’utilisation de modèles cellulaires ne peut remplacer en totalité l’utilisation d’animaux contenus dans les différentes procédures. L’information apportée par les modèles cellulaires ne permet pas d’apprécier le phénotype général, comportemental ou encore cognitif des souris.

Réduction

Il est estimé que le projet mobilisera sur 5 ans un maximum de 480 animaux hors animaux reproducteurs et maintien de la lignée. Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant compte du nombre minimum nécessaire pour appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (20 souris par condition pour les tests de comportement et 10 souris par condition pour les analyses biochimiques et histologiques). Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, autant que possible, les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les analyses fonctionnelles, histologiques, moléculaires et biochimiques. Enfin, si le modèle avec mutation ponctuelle ne présente pas un phénotype comportemental, histologique et biochimique différent du modèle avec délétion totale du gène, la procédure 3 ne sera pas effectuée afin de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans les conditions standard d’hébergement et l’environnement sera enrichi (igloo polycarbonate, rouleau de cellulose,…). Aucune des procédures que nous réaliserons sur les animaux ne devrait entraîner de douleur ou de stress aux animaux. Tout au long de la procédure 1 , un suivi régulier des animaux sera réalisé (une à deux fois par semaine). Il nous permettra de s’assurer du bon vieillissement des animaux au fil des mois. Ce suivi est basé sur la mise en place de points limites et méthodes de prise en charge de la douleur spécifique pour notre projet.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. Les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris génétiquement modifiée est liée à l'absence de modèle mammifère naturel correspondant à la maladie humaine. Par ailleurs, les premières données de l’étude du modèle murin avec une délétion complète montrent que ce modèle reproduit les caractéristiques pathologiques étudiées dans ce projet mais ne reconstruisent pas tous les aspects de la maladie. C’est pourquoi, le deuxième modèle avec une mutation ponctuelle a été généré et sera étudié pour voir s’il reproduit la symptomatologie la plus étendue de la maladie. Notre étude préalable a été faite sur le modèle avec une délétion complète dans leur ancien environnement et après validation du projet par le comité d’éthique. Cette étude nous a permis de préciser les âges auxquels la validation du phénotype des modèles avec délétion complète (dans son nouvel environnement) et avec une mutation ponctuelle sera faite. Les âges étudiés sont 5, 10, 20, 30, 52 semaines. Seule l’étude de la sensibilité à l’épilepsie sera effectuée à un seul âge, qui dépendra de la chronologie d’apparition du phénotype des souris modèles.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent selon les groupes une chirurgie sous anesthésie ou une injection dans la patte de carraghénane ou de zymosan pour induire une douleur inflammatoire, neuropathique ou post-opératoire, puis des tests de sensibilité mécanique et thermique (Von Frey, Hargreaves), avant mise à mort au CO2. Le porteur décrit une hypersensibilité "de courte durée et réversible" mais reconnaît une perte de poids et une mobilité réduite après chirurgie. Les bénéfices tiennent en une phrase, développer "de nouvelles stratégies thérapeutiques", et il affirme que l'expérimentation sur souris est "indispensable".

Objectifs

Récemment, nous avons pu identifier des différences sexuelles dans la récupération post-lésionnelle de plusieurs modèles de douleur. Afin de comprendre la physiologie de la douleur, des études comportementales seront réalisées. En effet, le comportement est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers le cerveau. Notre étude nécessite donc l’utilisation de souris adultes génétiquement modifiées (mâles et femelles) sur lesquelles des tests comportementaux de sensibilité mécanique et thermique, en conditions normales et pathologiques devront être réalisés (inflammatoire, neuropathique et post-opératoire). L’hypersensibilité mécanique et thermique induite lors de la mise en place des conditions pathologiques est de courte durée et réversible dans le temps (sauf procédure 2).

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude pourraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées aux hommes et aux femmes.

Procédures

Pour les chirurgies (procédures 1 et 2), les souris seront sous anesthésie générale (soit 88 animaux au total). Chaque souris ne subira qu’une seule chirurgie et donc une seule anesthésie (chirurgie de courte durée donc une seule injection suffit). Pour les modèles inflammatoires, l’injection intraplantaire de Carraghenane ou de Zymosan ne sera réalisée qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Il est possible qu’après la chirurgie il y ait une perte de poids. D’autre part, une mobilité réduite est engendrée lors des deux premières procédures. Ces effets dureront jusqu’à la fin du comportement douloureux (voir pour chaque procédure).

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort par inhalation de CO2 (concentrations croissantes). En effet, ces animaux ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures.

Remplacement

La thématique principale de notre laboratoire est de comprendre comment et pourquoi une personne a mal. Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in-vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. Il est donc nécessaire de réaliser une étude comportementale afin d’étudier l’intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie jusqu’au cerveau. Cette approche globale est d’autant plus nécessaire que ces différences comportementales mâle/femelle peuvent émaner de différences génétiques. Celles-ci peuvent impacter la circuiterie comme la signalisation moléculaire à différents niveaux de l’intégration de l’information sensorielle. Ainsi, l’expérimentation sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Des stratégies seront mises en place afin de limiter l'utilisation subséquente d'animaux supplémentaires tout en obtenant suffisamment de données pour répondre aux questions liées à l'étude. Ainsi, l’élaboration précise des protocoles de comportement et le choix pertinent des contrôles sont des éléments déterminants. De plus nous procèderons à une utilisation maximale des données obtenues en réalisant toute une série de tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, sans pour autant compromettre le bien-être animal. Par ailleurs, l’utilisation d’outils statistiques permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. Pour les tests en « time course », les résultats obtenus seront analysés en utilisant la Two-way Repeated Measure ANOVA, avec comme facteurs le génotype, le sexe et l'évolution au cours du temps. Enfin, le contrôle des paramètres environnementaux mais également du statut sanitaire et génétique des animaux permettra de limiter la variabilité des résultats expérimentaux obtenus, et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement valables. Les procédures décrites sont appliquées depuis plusieurs années au sein de notre équipe et sont maitrisées par les expérimentateurs. Nous avons donc l'expérience nécessaire concernant la réalisation des procédures et l’évaluation de l'impact sanitaire sur les animaux. La qualité de notre plan expérimental ainsi que l’étude détaillée du nombre d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat scientifique statistiquement valable nous permettent d’optimiser le nombre d’animaux utilisés. Ce projet nécessitera au maximum 168 souris.

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet seront élevées en groupes sociaux, dans un environnement enrichi (coton et/ou dôme) pour optimiser les conditions d’hébergement et favoriser un comportement normal afin de diminuer au maximum le stress des animaux. Les élevages sont effectués au sein de notre établissement agréé et 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. De ce fait, l’état sanitaire et environnemental des animaux sont contrôlés tous les jours. Nous avons recours à l'anesthésie/analgésie lors du procédé chirurgical et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Les procédures expérimentales seront planifiées (disponibilité des locaux d'expérimentation, du matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation), ce qui permettra de diminuer le stress des animaux et de favoriser la validité des expériences. Avant les tests de Von Frey et de Hargreaves, les animaux sont habitués pendant 1h dans l’enceinte. Enfin, des points limites les plus précoces possibles seront établis en fonction des tests de comportements utilisés. Un examen clinique est effectué quotidiennement afin de vérifier la cicatrisation et l’état général de l’animal. Toutes ces stratégies d’optimisation sont mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.

Choix des espèces

Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. Travaillant sur la physiologie d’animaux adultes, nos tests comportementaux et nos analyses moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines.