Procédures sévères
Evaluation de stratégies de prévention et de traitement de l’infection par SARS-CoV-2 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
2 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour exprimer le récepteur ACE2 humain, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 dans un modèle décrit comme létal, avec une perte de poids pouvant atteindre 30 % et une survie moyenne de cinq jours, puis reçoivent en moyenne cinq injections et des prélèvements sanguins, une fraction subissant une chirurgie thoracique sous anesthésie sans réveil. Le porteur vise à tester vaccins, anticorps et antiviraux avant un passage chez l'humain. Il affirme que l'étude de la réponse immunitaire rend le recours à la souris "indispensable" et qu'il est "impossible" de la remplacer par un modèle "ne représentant que partiellement un organisme".
Objectifs
Depuis la fin de l'année 2019, la pandémie de COVID-19 s'est propagée dans le monde entier, causant plus de six millions de décès et affectant plusieurs centaines de millions de personnes. Cette maladie, causée par la transmission du virus SARS-CoV-2, se manifeste par différents symptômes. Les formes légères se caractérisent principalement par de la fièvre, de la toux, de la fatigue, des pertes de goût et d'odorat. Les formes les plus graves sont associées à un syndrome de détresse respiratoire aiguë, et une défaillance de plusieurs organes de très mauvais pronostic. Des recherches intensives ont permis des progrès importants dans la compréhension des mécanismes sous-tendant les manifestations cliniques. Cependant, il n’existe toujours pas de traitement totalement efficace contre la COVID-19. Le récepteur ACE2, nécessaire à l’entrée du virus SARS-CoV‑2 dans les cellules de l’hôte, est une protéine clé dans les mécanismes à l’origine de la maladie. Parmi les différents modèles d’étude précliniques utilisés dans la recherche de vaccins et molécules thérapeutiques, les modèles de souris génétiquement modifiées pour l’expression du récepteur ACE2 humain sont sensibles à l’infection par le virus SARS-CoV-2, et permettent une analyse expérimentale du comportement du virus dans l'organisme. Certains de ces modèles dits ‘sévères’ développent après infection une forme létale de la maladie causée notamment par une réponse hyper-inflammatoire hors de contrôle. D’autres, dits ‘modérés’, développent une forme légère de la maladie. L’objectif de ce projet vise à la mise en place de modèles souris d’infection (sévère et modérée) au SARS-Cov-2 pour permettre d’étudier l’infection d’une part, et d’évaluer d’autre part une large gamme de stratégies de prévention et de traitements potentiels (vaccins, anticorps, anti-viraux, anti-inflammatoires) avant passage en phase clinique chez l’humain. Ce modèle, génétiquement modifié pour exprimer le récepteur ACE2 humain, permettra le suivi des paramètres immunologiques de l’infection, y compris avec des variants d’intérêt récents du virus. Du fait de sa petite taille de l’accessibilité facilitée à des modèles génétiquement modifiés, le modèle murin permet d’évaluer une large gamme de candidats médicaments pour traiter la cause (l’infection par le virus SARS-CoV-2) et les symptômes de la maladie induite après infection. Il permet donc en première intention, d’éviter le recours à des modèles plus complexes à mettre en œuvre.
Bénéfices attendus
Dans le contexte actuel de la pandémie COVID-19, il est urgent de pouvoir procéder à l’évaluation de traitements contre le virus lui-même ou contre les atteintes conséquentes à l’infection (respiratoires, vasculaires, neurologiques, cardiaques, inflammatoires). En permettant d’accroitre la capacité d’accès à plusieurs modèles pertinents de la maladie induite par l’infection au SARS-CoV-2, ce projet permettra d’augmenter significativement les options d’évaluation de nouvelles stratégies de traitement variées et adaptées à des situations cliniques (modérées et sévères) diverses. Dans le cadre de ce projet, nous mènerons à bien les campagne d’évaluation de composés candidats, avec l’objectif de permettre l’identification rapide de nouveaux produits efficaces contre SARS-CoV-2. A plus long terme, et ce, dans le cadre du projet collaboratif entre les différents partenaires du projet, de nouvelles approches technologiques en imagerie seront établies, permettant d’accroitre nos connaissances sur la réponse immunitaire mise en œuvre chez la souris dans le cadre d’infections causées par des pathogènes aéroportés.
Procédures
Les animaux de chaque étude seront soumis à un campagne de traitement pouvant représenter plusieurs inoculations de composés tests, et ce, via diverses routes d’inoculation (moyenne de 5 injections avec des candidats médicaments et 2 injections avec des candidats vaccins ; durée des interventions
Impact sur les animaux
Deux types de modèles murins de l’infection au SARS-CoV-2 (sévère et modérée) seront établis. Tous les modèles seront suivis cliniquement de la même manière pour permettre une comparaison des critères d’évaluation. La grande majorité des études fera appel à un modèle d’infection sévère. Dans les modèles sévères, l’infection au SARS-CoV-2 induit une pathologie létale (aboutissant à la mort) qui s’accompagne d’une perte d’activité et de poids (jusqu’à 30%), avec une survie moyenne de 5 jours. Un traitement efficace devra permettre une amélioration significative des atteintes cliniques et de la survie au-delà de 5 jours post-infection. Dans les modèles modérés (moins bien décrits dans la littérature scientifique), l’infection au SARS-CoV-2 induit une pathologie limitée qui se résout d’elle-même en 1-2 semaines, sans signe clinique macroscopique particulier chez les jeunes animaux. Une perte de poids transitoire (de l’ordre de 10% à 3 jours post-infection) a été rapportée chez les animaux plus âgés (30 semaines). De plus, des effets indésirables peuvent être observés suite à des traitements (inflammation ou nécrose au site d’inoculation, intolérance et toxicité des traitements).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, afin de procéder à la collecte d’échantillons biologiques d’intérêt (notamment des tissues des voies aériennes).
Remplacement
L’utilisation des modèles de souris COVID-19, organismes vivant complexes à même de reproduire différents aspects de la maladie humaine, est indispensable pour faire progresser le programme d’évaluation de candidats thérapeutiques dans un contexte où la balance bénéfice/risque de nombreuses molécules peut se révéler négative in vivo malgré des résultats prometteurs obtenus in vitro. Le projet portant sur l’étude de la réponse immunitaire de l’organisme et l’évaluation de traitements, il est impossible de remplacer l’animal par un modèle ne représentant que partiellement un organisme. L’utilisation de ces modèles intervient en seconde ligne après l’évaluation des candidats médicaments in vitro dans plusieurs systèmes expérimentaux (biochimie, culture de lignées cellulaires, avec utilisation de plusieurs variants d’intérêt du SARS-CoV-2). En l’absence d’une efficacité auparavant démontrée in vitro, les candidats médicaments ne seront pas testés in vivo. La sélection préalable des candidats in vitro permet de réduire drastiquement le nombre de produits à tester in vivo.
Réduction
En nous basant sur nos études antérieures sur le modèle hamster COVID d’une part, et sur les études effectuées par nos collaborateurs académiques sur un modèle murin sévère d’infection d’autre part, nous avons établi des effectifs de lots de 15 animaux pour pouvoir observer des différences statistiques entre groupes. Dans chaque lot, une fraction des animaux sera utilisée pour évaluer la charge virale pulmonaire et des paramètres de réponse immunitaire, et une autre fraction sera utilisé pour évaluer la survie à long terme (2 semaines) prodiguée par le traitement en cours d’évaluation. Les comparaisons des données des différents groupes d’animaux seront réalisées au travers d’analyses statistiques adéquates.
Raffinement
L’hébergement des animaux sera réalisé dans des portoirs ventilés permettant l’hébergement maximal simultané de 405 animaux par portoir (5 souris par cage). Suivant nos observations, nous pourrons augmenter l’enrichissement des cages (deux cylindres au lieu d’un) ou diminuer le nombre d’animaux par cage (tout en évitant les individus seuls). Aucune anesthésie n’est prévue pour les inoculations par voie per os (risques de fausse route), sous-cutanée ou intrapéritonéale (allongement considérable de la durée de la procédure induisant plus de stress). Un suivi clinique quotidien (a minima sur les 7 premiers jours de l’infection) des animaux avec pesée & évaluation des paramètres cliniques permet de s’assurer de l’évolution des signes cliniques de l’infection. Une grille de score clinique sera mise en œuvre, en nous basant sur les observations et pratiques déjà établies par d’autres collaborateurs académiques. Les critères suivis incluent l’apparence physique, la perte de poids, la mobilité et le comportement et permettent de déterminer un score clinique non dommageable, léger, modéré ou sévère. Une euthanasie préventive sera effectuée pour éviter des souffrances inutiles si les animaux présentent une forte perte poids ou un score clinique sévère. En cas de perte de poids intermédiaire, la nourriture et de l’eau gélifiée seront disposées en fond de cage. Une réhydratation par injection sous-cutanée quotidienne sera effectuée à partir d’une perte de poids intermédiaire.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées pour l’expression du récepteur ACE2 humain permettent d’accéder à une gamme de modèles expérimentaux reproduisant une pathologie soit sévère, soit modérée, après infection au SARS-CoV-2. Elles présentent l’avantage de pouvoir être explorées expérimentalement grâce à de très nombreux outils de biologie cellulaire et moléculaire, ce qui n’est pas le cas du modèle hamster syrien doré. Du fait de sa petite taille, de son coût réduit et de l’accessibilité facilitée via des éleveurs agréés, le modèle permet, en première intention, d’éviter le recours à des modèles plus complexes à mettre en œuvre, comme les primates non-humains. Il est à noter que les modèles chez lesquels une pathologie sévère est obtenue n’ont pas d’équivalent dans d’autres espèces animales, et représentent donc une opportunité unique pour étudier une pathologie de type COVID. Ces lignées d’animaux ne présentent pas d’atteintes physiques et/ou de comportement sévère (phénotype dommageable) dans les conditions normales d’hébergement, et, dans le cadre de ce projet, ne montreront un phénotype dommageable que suite à une infection par le virus SARS-CoV-2. Les animaux utilisés pour ce projet seront âgés de 8 à 12 semaines (stade adulte), comme décrit jusqu’à maintenant dans la littérature scientifique disponible sur le sujet. Dans certains cas, il pourra être envisagé d’utiliser des animaux plus jeunes ou plus âgés, pour potentiellement reproduire des aspects de la maladie spécifiquement observés chez des individus humains jeunes ou âgés, respectivement.
Effets de l’exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques sur le lien entre lésions cérébrales et hépatiques en cas de surcharge en lipides : rôle des vésicules extracellulaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
Âgés de six semaines, 180 rats Sprague-Dawley reçoivent pendant 30 à 90 jours une alimentation standard ou riche en graisses, avec un gavage un jour sur deux en semaine, d'huile seule ou d'un mélange d'hydrocarbures aromatiques polycycliques à 80 ou 800 µg/kg. 84 sont exploités dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 96 un niveau sévère. Ils subissent des prises de sang, des prélèvements de poils et des passages de 24 heures, isolés, en cage à métabolisme, puis 96 rats passent entre J60 et J90 des tests d'anxiété et de cognition non nommés, 24 heures sur roue d'activité et le test de Porsolt. 36 autres subissent trois tests de tolérance au glucose de 180 minutes et une heure de contention pour mesurer leur réponse au stress, épreuves que le porteur associe à des prises de sang à la queue et à une sonde rectale à demeure, alors qu'il décrit le test au glucose comme une "procédure facile à mettre en œuvre et peu contraignante pour l'animal". Les rats sont tués à J60 ou à J90, 24 heures après leur dernière épreuve, pour prélever leurs tissus.
Objectifs
La stéatohépatite non alcoolique est une maladie chronique qui concernerait plus de 200 000 personnes en France chaque année. Elle correspond à une accumulation de graisses dans le foie sous forme de gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes (stéatose) associée à une inflammation de l’organe (hépatite). En dehors des altérations purement hépatiques, ces stéatoses peuvent aussi être reliées à des troubles fonctionnels cérébraux (anxiété, stress et dépression). Des études ont conduit à évaluer l’exposition aux polluants environnementaux comme facteur favorisant la progression de la stéatose vers la stéatohépatite, forme sévère de la maladie. Les études d’exposition ont montré que les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques sont les polluants prédominants en secteur résidentiel, ce qui rend leur exposition presque inévitable pour l’homme. L’alimentation est la principale source d’exposition en hydrocarbures aromatiques polycycliques. En raison de leur forte rémanence et de leur propriété lipophile, les hydrocarbures aromatiques polycycliques s’accumulent dans le foie et le cerveau, lieux principaux de métabolisation, avec pour conséquence de pouvoir entraîner des lésions hépatiques et des altérations cérébrales (troubles de l’anxiété liés à des altérations de la fonctionnalité cérébrale localisées dans des aires impliquées dans la régulation de ces comportements ainsi que des atteintes cognitives. L’exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques modifie également la quantité et les caractéristiques des vésicules extracellulaires (nanovésicules entourées par une membrane) physiologiquement libérées par des cellules au sein de tout type d’organes. Des travaux ont mis en exergue la capacité des hydrocarbures aromatiques polycycliques à déclencher la libération de vésicules extracellulaires modifiées provenant d’hépatocytes qui, une fois absorbées par d’autres hépatocytes sains, peuvent entraîner la mort de ces derniers. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons : 1) les effets hépatotoxiques et neurotoxiques induits par une exposition répétée à un mélange d'hydrocarbures aromatiques polycycliques dans un contexte de NASH ou non chez le rat adulte, et 2) Les modifications en terme de niveau de production et caractéristiques des vésicules extracellulaires libérées par le foie et le cerveau et isolées du plasma et des urines de ces mêmes animaux.
Bénéfices attendus
Nous espérons ainsi identifier de nouveaux biomarqueurs d’exposition et/ou d’effets des hydrocarbures aromatiques polycycliques et de nouvelles cibles thérapeutiques en décryptant le rôle des vésicules extracellulaires dans la physiopathologie de la stéatohépatite et le lien avec de possibles atteintes cérébrales. Cette étude devrait nous permettre : 1) d’évaluer les effets d’une exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques dans un contexte enrichi en lipide ou pas, sur le niveau de production et les caractéristiques des vésicules extracellulaires et l’impact de ces changements sur les pathologies hépatiques et cérébrales, 2) de comprendre si les vésicules extracellulaires libérées par les cellules hépatiques et de la microglie, suite à l’exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques peuvent être des vecteurs de toxicité pour les cellules réceptrices, 3) de déterminer la fiabilité de la caractérisation ces vésicules extracellulaires en tant que biomarqueurs d’exposition et/ou de toxicité précoces, modèle facilement transposable chez l’humain, 4) d’évaluer l’interaction avec un stress de nature différente et d’identifier des comorbidités (la libération de vésicules extracellulaires et l’inflammation dues à une surcharge en acides gras libres au niveau plasmatique pouvant être considérée comme un stress supplémentaire venant s’ajouter à l’exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques).
Procédures
Ce projet inclura 3 lots regroupant 6 groupes d'animaux : 3 groupes nourris avec la nourriture standard de l'animalerie et 3 groupes alimentés avec un régime riche en lipides. Dans chaque bras, un groupe sera utilisé comme contrôle en étant administré avec l'huile végétale (huile isio 4, Lessieur, exempt d'hydrocarbures aromatiques polycycliques) analysée comme servant de véhicule pour la solution d'hydrocarbures aromatiques polycycliques, les 2 autres lots recevant la solution d'hydrocarbures aromatiques polycycliques à 2 doses différentes (80 ou 800 µg/kg de poids corporel). Les animaux seront nourris avec l'une ou l'autre nourriture pendant 30, 60 ou 90 jours et recevront de façon simultanée une administration de la solution d'hydrocarbures aromatiques polycycliques ou d'huile à raison d'une administrations par gavage (une minute par animal) quotidienne un jour sur deux au cours de la semaine (n'est pas prévu d'administration le week-end). Les animaux du lot 1 d’un total de 48 rats (n=8 par groupe) se verront prélever des poils, du sang (à J0, J28 et J58) et de l’urine (à J30 et J60, cage à métabolisme pendant 24h) pour une mise à mort à J60. Les animaux du lot 2 d’un total de 96 rats (n=16 par groupe) se verront prélever des poils, du sang (à J0 et J88) et de l’urine (à J90, cage à métabolisme pendant 24h) pour une mise à mort à J90. De plus, ce lot servira à explorer les performances comportementales au plan de l'anxiété (mesurée pendant 5 minutes), de l'activité (mesurée pendant 24h), des performances cognitives (mesurée pendant 2 séances de 10 minutes chacunes) et de la résignation (mesurée pendant 5 minutes) entre J60 et J90. Enfin, Les animaux du lot 3 d’un total de 36 rats (n=6 par groupe) se verront prélever des poils, du sang (à J0 et J88) et de l’urine (à J90, cage à métabolisme pendant 24h) pour une mise à mort à J90. Ce lot sera dédié à l’étude de la réactivité à un stress psychologique (exposition à un stress pendant une heure) et la tolérance au glucose. Ces 6 animaux seront réutilisés au 3 stades (J30, J60 et J90) pour pouvoir suivre chez les mêmes individus l'évolution de la tolérance au glucose (test d'une durée de 180 minutes) en lien avec le développement de la stéatose puis la stéatohépatite. Une fois les mises à mort effectuées, les tissus d’intérêts seront prélevés pour analyses.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables identifiés attendus tout au long du projet que suivront les animaux sont les suivants : stress lié à l'administration par gavage des hydrocarbures aromatiques polycycliques, l'inconfort qui pourrait etre lié à la prise de poids du fait des régimes alimentaires qui seront utilisés, le stress généré par le passage en cage à métabolisme pour une durée de 24h pendant laquelle l'animal sera isolé, l'isolement de l'animal lors de son passage pendant 24h dans le test d'actvité avec une roue d'activité, le stress/mal-être généré par le passage dans le test de Porsolt, le stress voire douleur liés à l'épreuve de réponse au stress et le test de tolérance au glucose (stress lié à la contention, aux prises de sang à la veine de la queue, pose et maintien de sonde rectale à demeure pour prise de température).
Devenir
La mise à mort des animaux se fera 24h après le prélèvement des urines en cage à métabolisme pour 48 rats à J60 et 96 rats à J90 après passage dans les tests de comportement. La mise à mort des 36 derniers animaux se fera 24h après l'étude de la réactivité au stress induite par une contention à J90. Après chaque mise à mort, les tissus d’intérêts à l’étude seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
L'objectif du projet étant d'étudier le rôle des vésicules extracellulaires produites au niveau du foie dans un contexte d'exposition à un régime enrichi en lipides ou pas, associé à une exposition répétée longue aux hydrocarbures aromatiques polycycliques dans le dialogue entre le foie et le système nerveux, il n'est pas possible de procéder au remplacement des animaux par un système alternatif. Aucun système alternatif ne permet de simuler le niveau de complexité de l'organisme entier nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
Le nombre total d'animaux est le nombre estimé juste et nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs du projet dans des conditions de réalisation acceptables garantissant ainsi le bon déroulement de l'expérimentation, la prise en charge adaptée des animaux de façon à garantir au mieux leur bien-être et une exploitation statistique satisfaisante des résultats. Le nombre de 180 animaux prévu a été déterminé pour un calcul de puissance statistique de 80%, des effectifs égaux dans les 6 groupes expérimentaux (n=30/groupes) et la variation estimée la plus sensible dans l'ensemble des mesures effectuées. Par ailleurs ce nombre de 180 animaux est réparti en 3 lots de respectivement, 48, 96, et 36 rats destinés à des mesures à un stade déterminé pour chaque lot plutôt que d'avoir un seul lot nécessitant de répéter à chaque stade d'investigation un nombre conséquent de procédures contraignantes avec pour conséquence un risque en terme de mal-être des animaux tout au long de l'expérimentation et une prise en charge inadaptée compte-tenu d'un volume de travail trop important.
Raffinement
Le raffinement dans cette expérimentation tient dans la répartition des animaux en 3 lots distincts, destinés aux investigations prévues à un ou deux des 3 stades d'étude au cours de l'expérimentation (J30, J60 et J90). Il a été choisi de raffiner de la sorte l'expérimentation au détriment de la réduction du nombre total d'animaux pour garantir au mieux le déroulement de l'expérimentation et la prise en charge des animaux en matière de bien-être. Seuls les animaux destinés à l'étude de la réactivité au stress à J90 seront également sollicités à J30 et J60 pour la réalisation d'une épreuve de tolérance au glucose, procédure facile à mettre en œuvre et peu contraignante pour l'animal. Cette dernière sera réalisée de manière à suivre simultanément les niveaux de glucose et de corticostérone circulant, les hydrocarbures aromatiques polycycliques ayant un impact connu sur l’axe hypothalomo-hypophyso-surrénalien. Par ailleurs, les animaux qui seront achetés pour ce projet seront maintenus et élevés selon les conditions d’élevage habituelles en accord avec les contraintes fixées par la réglementation (installations agréées, conditions de température, d’hygrométrie et de lumière contrôlées, (22°C+/- 2°C, 55%+/-10%, cycle lumineux 12h:12h, allumage à 20h, eau et nourriture disponibles à volonté). Les animaux seront placés à 2 par cage selon les dispositions réglementaires en termes de rapport surface (900 cm2 et une hauteur de 18 cm minimum) / nombre d’animaux dans des portoirs ventilés avec une feuille de papier absorbant comme dispositif d'enrichissement. Leur comportement sera surveillé afin de s'assurer de l'absence de mal-être ou de comportement agressif entre les animaux. La croissance des animaux soumis au régime riche en lipide sera évaluée régulièrement de manière à pouvoir maintenir les animaux par 2 dans des cages de plus grande taille afin d’éviter l'isolement de ces derniers et l'impact qu'il pourrait avoir sur leurs performances comportementales et leur bien- être. La prise de poids des animaux traités au régime riche en lipide ne devrait pas excéder 10 à 12% comparativement au contrôle. En ce qui concerne les prélèvements vigiles à la veine caudale, la douleur sera contrée par badigeon à la lidocaïne. L’éventuel mal être lié à l’isolement en cage à métabolisme sera réduit en plaçant les cages les unes à côté des autres de manière à permettre une communication entre les animaux et sur une période limitée à 24 h et une seule fois.
Choix des espèces
Le projet de recherche nécessite le recours à des analyses physiologiques, cellulaires, biochimiques et moléculaires en lien avec des régimes nutritionnels spécifiques induisant une stéatose hépatique non alcoolique. Les rats Sprague- Dawley sont utilisés pour la recherche sur la physiologie et le métabolisme. De plus, il a été montré dans la littérature que les rats Sprague-Dawley constitue un meilleur modèle d’étude d’induction de stéatose hépatique non alcoolique par voie orale que la souche Wistar. Les animaux entreront dans l’étude à l’âge de 6 semaines et seront acclimatés à leur nouvel environnement pendant 8 à 10 jours. A ce stade ils auront atteint leur maturité sexuelle et sont donc considérés comme jeune adulte, ce qui est représentatif du profil de la population touchée.
Implication de la phospholipase D2 exosomale dans la métastase osseuse issue du cancer de la prostate
- Recherche fondamentale
- Oncologie
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Des exosomes puis des cellules de cancer de la prostate sont injectés dans leur tibia pour reproduire des métastases osseuses, connues pour provoquer douleurs et fractures chez l'humain, un suivi radiographique servant à anticiper le point limite de dégradation de l'os. Les souris sont ensuite tuées pour analyser la colonisation osseuse. Le porteur affirme que l'ancrage osseux des cellules cancéreuses ne peut être apprécié in vitro.
Objectifs
Le cancer de la prostate est une tumeur maligne qui peut se propager dans tout l'organisme : on dit alors que la tumeur a métastasé. Les cellules de cancer de la prostate atteignent préférentiellement l’os, ou elles vont être responsables d’une destruction massive de l’os. Ces métastases génèrent de grandes douleurs et des fractures pathologiques et pouvant même engager le pronostic vital des patients. A l’heure actuelle, les métastases osseuses sont incurables et les traitements sont donnés uniquement pour améliorer la qualité de vie des patients. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par le biais desquels les métastases osseuses dérivant d’un cancer de la prostate se forment afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les exosomes sont des petites vésicules produites par les cellules cancéreuses. Il a été observé récemment que les exosomes sont capables de préparer le terrain permettant un meilleur encrage des cellules cancéreuses dans le site métastatique. Cependant, le rôle de la protéine phospholipase D2 dans la formation des métastases osseuses n’est absolument pas connu. Notre projet vise à comprendre comment la présence de la phospholipase D2 dans les exosomes peut contribuer à la formation des métastases osseuses des cancers de la prostate.
Bénéfices attendus
A terme ce projet apportera des informations indispensables pour limiter la rechute métastatique à l’os des cancers de la prostate et d’améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Le projet comprend plusieurs étapes qui ne seront menées qu’après validation d’étapes précédentes. La prise en charge de la douleur sera appliquée de façon permanente avec les méthodes adaptées. Les animaux seront tout d’abord anesthésiés sous isoflurane pour une durée maximale de 10 minutes, maintenus à 37°C et un gel anesthésiant de lidocaïne sera placé sur leur dos. Au cours de cette période ils recevront une injection d’une suspension d’exosomes dans un vaisseau de la queue qui durera moins d’une minute. La durée totale de cette intervention sera de 1 jour. Cette étape a pour but de valider la dissémination à l’os d’une suspension d’exosomes provienant d’une lignée de cellules cancéreuses. Uniquement si cette intervention donne des résultats positifs une seconde intervention sera effectuée avec des suspensions d’exosomes d’origines différentes. Une intervention suivante se déroulera en deux étapes. Les animaux seront anesthésiés (anesthésie/analgésie chimique) par injection intra-péritonéale. Le geste d’injection durera moins d’une minute et la durée totale d’anesthésie durera au maximum de 30 minutes afin d'injecter une suspension de cellules tumorales directement dans le tibia dont le geste durera moins d’une minute. La durée totale de cette intervenrion sera de 28 jours. Uniquement si cette intervention donne des résultats positifs une seconde intervention sera réalisée. En début de cette intervention puis une fois par semaine pendant 4 semaines, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane pour une durée maximale de 10 minutes, maintenus à 37°C et un gel anesthésiant de lidocaïne sera placé sur leur dos. Au cours de cette période ils recevront une injection d’une suspension d’exosomes dans un vaisseau de la queue qui durera moins d’une minute. A l’issue de cette période de 4 semaines les animaux seront anesthésiés (anesthésie/analgésie chimique) par injection intra-péritonéale. Le geste d’injection durera moins d’une minute et la durée totale d’anesthésie durera au maximum de 30 minutes afin d'injecter les cellules tumorales directement dans le tibia dont le geste durera moins d’une minute. La durée totale de cette intervention sera de 56 jours. Dans ces deux dernières interventions les animaux seront anesthésiés pendant 10 minutes par anesthésie gazeuse 7 jours après l’injection des cellules cancéreuses puis chaque semaine pendant 4 semaines et en fin d’expérimentation afin de procéder à l’analyse non invasive du tissu osseux par radiographie
Impact sur les animaux
La formation de métastases osseuses a pour caractéristique chez l’homme d’induire des douleurs. On sait que ces douleurs sont dues à la dégradation de l’os. Dans le but de réduire la douleur des animaux les procédures 1 et 2 seront arrêtées 1 jour après l’injection des exosomes et pour les procédures 3 et 4, 28 jours après l’injection des cellules tumorales. La quantification des métastases osseuses sera suivie de façon hebdomadaire par radiographie afin d’anticiper le moment d’apparition du point limite de dégradation osseuse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir évaluer post-mortem in vitro la colonisation osseuse des exosomes et le developpement tumoral osseux.
Remplacement
L’influence que peut avoir la phospholipase D2 des exosomes sur des phénomènes tumoraux tels que la colonisation et l’ancrage osseux des cellules cancéreuses lors de la formation des métastases ne peut pas être appréciée par des tests in vitro. L’utilisation d’une lignée cellulaire d’origine humaine de la prostate que nous avons préalablement testée in vitro pour sa capacité à être invasive nous permettra de reproduire chez la souris le plus fidèlement possible la situation pathologique du cancer de la prostate chez l’homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, le projet comprend plusieurs étapes dont certaines seront menées uniquement après validation de certaines étapes précédentes. Notamment, la procédure n°2 ne sera réalisée que si la procédure n°1 donne les résultats attendus. La procédure 4 ne sera réalisée que si à la fois la procédure 1 et la procédure 3 donnent les résultats attendus. La taille des groupes a été déterminée à l’aide d’une analyse de puissance réalisée avec le logiciel BiostaTGV. Sur les 4 ans de réalisation du projet, un nombre total de 120 souris sera nécessaire.
Raffinement
Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi (maison rouge, coton) renouvelé une fois par semaine. Afin de permettre l’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, les souris seront placées en stabulation durant deux semaines au sein de l’animalerie d’accueil sous surveillance journalière. Tous les protocoles d’injection d’exosomes et de cellules tumorales seront réalisés sur des souris anesthésiées au moment des injections. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des principaux signes physiologiques, comportementaux et de l’apparence de l’animal. Les animaux seront pris en charge au premier signe d’inconfort.
Choix des espèces
La souris CB17 SCID est couramment utilisée en oncologie. Ces souris présentant une déficience du système immunitaire nos conditions d’hébergement dans un local à air contrôlé sont adaptées à cette spécificité des animaux. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 8 semaines. Nous utiliserons des souris mâles car notre étude porte sur le cancer de la prostate.
Evaluation écotoxicologique de substances et d’effluents dans un contexte réglementaire
- Protection de l’environnement
Saumons : 752
Loups de mer : 1242
3374 poissons, poissons zèbres, truites et bars, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères, la plupart tués à l'issue. Ils sont exposés en continu à une eau contaminée par des substances chimiques et des effluents industriels, de 96 heures à 30 jours, pour des tests réglementaires d'écotoxicologie. Les reproducteurs de poissons zèbres non exposés sont proposés à l'adoption et une partie des témoins réutilisée, mais les individus exposés sont tués en fin d'essai. Le porteur indique que les espèces et les méthodes sont imposées par les normes REACH et que les modèles alternatifs ne sont pas reconnus par les autorités.
Objectifs
Les évaluations des risques environnementaux sont basées sur l'étude de l'impact des composés anthropiques sur la survie et le développement de différents taxons représentatifs des écosystèmes. Pour être représentatives et exploitables ces évaluations des risques doivent inclure des organismes à différents niveaux d'organisation. Ainsi des études son classiquement menées sur des algues des crustacés et des poissons. Les tests réalisés au sein de ce projet sont des tests règlementaires qui suivent des normes d’essai nationales et internationales. Le but de ces essais est de générer des données qui entreront dans les dossiers d'évaluations des risques environnementaux, dans des dossiers d’homologation de produit ou dans des suivis industriels règlementaires. Les données générées par ces essais entreront dans des dossiers tels que demandés par la directive REACH, le CLP (étiquetage de produits), règlement phytosanitaires (dir. 91/414/EEC), la convention OSPAR (HOCNF), ainsi que les suivis industriels dans le cadre de la loi sur l'eau.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont la génération de données utilisées dans les évaluations des risques environnementaux. Ces évaluations des risques permettent de mieux gérer et utiliser les composés testés au regard de leur impact potentiel sur l'environnement.
Procédures
Les animaux (poissons) seront soumis à une exposition continue à un environnement contaminé via l'eau des aquariums sur des périodes de 96h à 30 jours. Les interventions réalisées sur animaux vivants seront du type observation.
Impact sur les animaux
Les effets attendus sur les animaux peuvent être une inhibition de la croissance, un mauvais développement larvaire, et des signes de stress et / ou de mauvais état de santé décrits dans l'annexe 1 "points limites".
Devenir
Procédure 1 relative à la production d'oeufs de Danio rerio : les animaux reproducteurs sont gardés en vie car ils n'ont pas été exposés à des produits toxiques et qu'ils ont été maintenus dans de très bonnes conditions favorisant la reproduction. Les individus non productifs sont écartés des reproducteurs dans un bac dit de "retraite" et sont ensuite proposés à l'adoption après approbation du vétérinaire référent. Procédures 2 relative aux tests de toxicité aiguë (mortalité) réalisés sur poissons juvéniles : les individus exposés aux produits testés sont euthanasiés en fin de procédure pour éviter toute souffrance à long terme. Les individus témoins (non exposés) sont réintroduits dans les bacs de réserve et réutilisés lors d'essais ultérieurs. Le nombre de poissons réutilisés dans ce cadre représente en moyenne 14% du contingent. Procédures 3 relative au test de toxicité chronique d'ihibition de la croissance des poissons juvéniles et procédure 4 relative au test de toxicité chronique aux premiers stades de la vie (impact sur le développement des larves de poissons) sur Danio : les individus témoins ne pouvant être réutilisés en raison des temps de tests l'ensemble des poissons utilisés dans ces procédures sont euthanasiés en fin d'essai.
Remplacement
Le modèle poisson fait partie intégrante des évaluations des risques et des demandes d’autorisation de mise sur le marché / étiquetage. Les modèles alternatifs ne sont pas reconnus par les autorités compétentes. Cependant les essais de mortalité sur œufs de poissons sont proposés en remplacement des essais sur poissons adultes. L’acceptation ou non du modèle alternatif (œuf) revient aux autorités compétentes.
Réduction
Les essais sur gamme complète (généralement 5 concentrations d’exposition) classiquement utilisés dans les évaluations des risques sont réduits à des essais limites (1 seule concentration seuil). Ce procédé permet de vérifier que les modèle poissons n'est sont pas plus sensibles que les autres organismes testés sur la matrice (crustacés, végétaux…). Cette façon de procéder permet de réduire d'un facteur 5 le nombre de poissons utilisés.
Raffinement
Les poissons maintenus au laboratoire font l’objet d’un suivi régulier de leur état de santé et des caractéristiques physicochimiques de leur eau d'aquarium. Ils sont maintenus dans des salles dédiées et uniquement fréquentées par le personnel habilité. Des enrichissements des milieux tels qu'un apport de nourriture vivante, des caches ou des systèmes de remous permettent également d'améliorer les conditions de stabulation.
Choix des espèces
Les espèces utilisées sont celles préconisées dans les normes imposées par les règlementations. Les procédures N° 2 relative aux tests de toxicité aiguë (mortalité) et 3 relative au test de toxicité chronique d'inhibition de la croissance des poissons sont réalisées sur truite et bars. Le stade requis pour ces tests est le stade juvénile. Les individus doivent mesurer entre 2 et 4 cm d’après les exigences des normes suivies (OCDE 203 et 215). Pour la procédure n°1 relative à la production d'oeufs de Danio rerio, le stade requis est les stade adulte (mature et reproductif) les individus commandés sont âgés de 4 mois. Pour la procédure n° 4 relative au test de toxicité chronique aux premiers stades de la vie (impact sur le développement des larves de poissons) sur Danio le stade d’exposition est les stade œuf.
Effet paradoxal des anti-TNFalpha
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite est déclenchée par injection de lymphocytes, puis un anti-TNFα est administré deux fois par semaine pour reproduire le psoriasis paradoxal observé chez certains patients. Les souris atteignant un score de souffrance de 9 ou perdant 20 % de leur poids sont mises à mort par dislocation cervicale, les autres tuées en fin de procédure pour analyse immunitaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut mimer cet environnement inflammatoire et qualifie ce modèle d'"indispensable".
Objectifs
La maladie inflammatoire de l’intestin (MICI) est une maladie chronique dûe à une dysregulation du système immunitaire et féquement associée à une ostéopénie. Les biomédicaments anti-TNFα représentent un progrès majeur dans la prise en charge des patients atteints de MICI. Cependant, certains patients traités (plus de 30%) dévelopent du psoriasis (dit effet paradoxal). Cet effet paradoxal reste un problème de santé publique dont les mécanismes restent à déterminer. De façon intéressante, le modèl murin de colite traité par ces biomédicaments reproduit le psoriasis paradoxal observé chez les patients. Il represente donc un outil très important et prometteur pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués Nos résultats apporteront de nouvelles pistes pour le traitement ou le dépistage précoce des patients atteints de la maladie de Crohn ainsi que d'autres maladies inflammatoires pour lesquelles les mêmes effets paradoxaux sont décrits comme l’Arthrite Rheumatoide, Spondylarthrite et le Lupus érythémateux.
Bénéfices attendus
Notre objectif est de mieux caractériser le dialogue réciproque entre l’intestin et l’os et en particulier l’implication des cellules immunitaires et la modulation cytokinique de l’environnement tissulaire et ses conséquences. Cette étude nous permettra de mieux caractériser le nouveau modèle original de psoriasis paradoxal qui pourrait être utile pour d’autres pathologies inflammatoires comme l’Arthrite Rheumatoide et le Lupus érythémateux et voire le psoriasis classique. Nos résultats apporteront de nouvelles pistes pour le traitement ou le dépistage précoce des patients atteints de la maladie de Crohn ainsi que d'autres maladies inflammatoires pour lesquelles les mêmes effets paradoxaux sont décrits comme l’Arthrite Rheumatoide, Spondylarthrite et le Lupus érythémateux.
Procédures
I'nduction de la colite se fait par injection intra-péritoneale de 500000 lymphocytes T CD4+ naïfs (184 souris) pendant 7 semaines. Un autre groupe de souris inectées par les cellules T CD4+ (184) seront traitées par les anti-TNFa (250μg/souris dans 100μl de PBS) par injection intra-péritoneale 2 fois par semaine pendant 8 semaines.
Impact sur les animaux
L’injection des lymphocytes T naifs gènère une colite avec une perte de poids et une ostéopénie discrète évaluée par microscanner après l’euthanasie des souris. Ces animaux seront traités par des anti-TNFa (substance anti-inflammatoire), 2 semaines après l’injection des lymphocytes T naifs. En général, les plaques psoriatiques apparaîssent au bout de 7 à 8 semaines après le traitement. Les animaux seront suivis selon la grille de score (voir tableau en annexe) et pesés 2 fois par semaine.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les souris seront euthanisiés pour analyser leur système immunitaire
Remplacement
Les modèles de peau in vitro actuels servent à étudier uniquement les kératinocytes et les fibroblastes et ne répondent donc pas à nos questions. En plus, ces modèles ne récapitulent pas toute la complexité de l’organe et ne peuvent pas mimer l’induction du psoriasis. Pour l’instant, aucune méthode alternative in vitro n’est adaptée afin de remplacer totalement le modèle murin. Toutefois, nos résultats pourraient permettre à terme d’améliorer les modèles in vitro existants grâce à la meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Un tel modèle in vitro permettrait de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés pour l’étude de cette pathologie. Il n' existe pas de modèle cellulaire in vitro qui pourrait mimer le modèle murin de la maladie de Crohn. Ce type d'environnement inflammatoire ne peut pas être reproduit in vitro du fait de sa complexité. L‘utilisation de ce modèle est donc indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé en se basant sur nos études et expériences antérieures et d’un test à priori (G*power). Le nombre d’animaux par groupe a été choisi afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (test de type Anova) avec le nombre de souris minimum par groupe et on utilisera 3 groupes par expérience comme indiqué dans la section 4 : procédures expérimentales. De plus, un même animal servira pour isoler différents types cellulaires de différents organes (rate, ganglions, moelle osseuse et peau) dont nous aurons besoin et l’excédent de cellules sera congelé pour utilisation ultérieure ce qui nous permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.
Raffinement
Toutes les experiences et manipulations des animaux seront effectuées afin de respecter le bien être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Nous traiterons de façon préventive les souris avec colite par des analgésiques avec faible incidence anti-inflammatoires comme le paracetamol. Les animaux seront suivis selon la grille de score présentée " voir tableau en annexe et pesés 2 fois par semaine. Dès que les souris atteignent un score de 9 sur la grille de score ou qu'elles présentent une perte de 20% par rapport à leur poids au jour 0, elles seront immédiatement euthanasiées par dislocation cervicale "voir tableau en annexe".
Choix des espèces
Nos résultats précédents ainsi que la majorité des données de la littérature sur lesquelles nous nous appuyons ont été obtenus chez la souris. Il est à noter que les résultats que nous avons obtenu au niveau des lymphocytes Th17 dans le modèle de maladie de Crohn chez la souris nous ont permis de valider ce mécanisme chez les patients atteints de maladie de Crohn, ce qui démontre la pertinence des approches que nous utilisons. Enfin, il existe déjà des modèles de souris transgéniques dont l'utilisation permettra de répondre à certaines de nos questions. La souris représente donc un modèle particulièrement adapté à notre étude pour comprendre la spécificité de la réponse aux anti-TNFa dans l'intestin, l'os et la peau. Pour toutes les procédures, nous utiliserons des animaux au stade adulte, entre 8 et 12 semaines. A ce stade le système immunitaire des souris est mature et auquel nous avons déjà travaillé dans nos études précédentes
Etude d’un modèle de souris de maladie rare de syndrome de Kohlschütter-Tönz
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant une maladie rare humaine dont dix-neuf cas ont été décrits, elles reçoivent un produit pro-convulsivant qui déclenche des crises myocloniques, cloniques et toniques, dont la durée est mesurée. Elles meurent ensuite par exsanguination après perfusion intracardiaque, pour prélever le cerveau. Le porteur affirme qu'il est indispensable de disposer d'un modèle animal à l'échelle de l'"organisme entier", un système in vitro ne pouvant selon lui apporter le même niveau d'information.
Objectifs
Le syndrome de Kohlschütter-Tönz (ou Le syndrome amélo-cérébro-hypohidrotique) est une maladie dégénérative rare caractérisée par des atteintes neurologiques (épilepsie précoce, régression psychomotrice, autisme) et dentaire (une coloration jaune des dents due au défaut de l'émail). Quelques dix-neuf cas ont été rapportés jusqu'alors. Cette pathologie est due à une mutation d'un gène dont on a que très peu d'informations sur son rôle. Pour comprendre comment cette mutation génétique est responsable de la pathologie, nous avons généré une souris mutante de ce gène, dans le but est de comprendre à la fois la physiologie et la pathophysiologie et le rôle de la mutation dans la maladie. L’exploration par scanner, et la microscopie électronique montrent un émail dentaire hypominéralisé sans contenu calcique chez les souris mutantes. L'objectif de notre projet est l’étude de l’atteinte neurologique sur notre modèle de souris mutantes, et plus précisément de voir si les souris développent une épilepsie précoce de manière similaire aux patients. Pour cela, nous réaliserons un test de susceptibilité à l’épilepsie sur des souris adultes jeunes.
Bénéfices attendus
L'objectif de notre projet est l'étude de la susceptibilité à l’épilepsie dans le cadre d'une maladie rare (syndrome de Kohlschütter-Tönz). Nous souhaiterions comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène et son effet sur les crises épileptiques. À l'avenir, ce modèle pourrait être essentiel pour tester la pertinence thérapeutique des cibles moléculaires identifiées pour le traitement des patients.
Procédures
Injection d'un produit pro-convulsivant: durée moins d'une minute. Injection de produits anesthésiques: durée moins d'une minute
Impact sur les animaux
Suite à l’injection du produit, des crises myocloniques (contractions rapides et brutales des muscles), cloniques (spasmes rythmés), et toniques (augmentation accrue du tonus musculaire ou raideur) surviennent, la durée et la latence sont enregistrées.
Devenir
Les 24 animaux meurent par exsanguination, suite à une perfusion de PBS par voie intracardiaque, afin de pouvoir prélever les cerveaux en vue des analyses post-mortem
Remplacement
Cette étude a pour but l'étude de la susceptibilité à l’épilepsie dans le cadre d'une maladie rare syndrome de Kohlschütter-Tönz. Nous souhaiterions comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation de notre gène et son effet sur les crises épileptiques. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multisystémique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible, et en cherchant à atteindre une puissance statistique de 80%. Un total de 24 souris est nécessaire pour notre étude. L’analyse statistique de la latence d’apparition des crises tonico-cloniques ainsi que leur durée sera réalisée en utilisant le test t de Student ou le test de Mann-Whitney en fonction de la normalité des données. Le facteur de comparaison sera le génotype (comparaison des mutants Vs contrôles). Comme on s'attend à avoir le même phénotype chez les mâles et les femelles, nous utiliserons les 2 sexes en veillant à avoir la même proportion entre les mutants et les contrôles, ce qui éviterait de dédoubler les effectifs
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. La mutation provoquant des malformations dentaires, de la nourriture gélifiée sera mise à disposition des animaux. Si l’état de santé d’un animal est dégradé, le personnel formé et compétent décidera de ne pas réaliser le test et de soigner ou mettre à mort l’animal. Chaque animal sera ainsi suivi avant l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation et son euthanasie.
Choix des espèces
La souris est l'animal de choix pour l'études des modifications des gènes à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique. Notre objectif est d'étudier l’importance de la mutation du gène ROGDI dans l’atteinte neurologique et plus précisément sur le développement des crises d'épilepsie. Aucun modèle d’expérimentation in vitro ne peut mimer ou refléter toute la complexité des phénomènes neurologiques comme les crises d'épilepsie. Le test sera réalisé sur des animaux jeunes adultes (8 semaines d'âge), afin d'être dans des conditions d'age similaire à la clinique humaine (apparition des symptomes dans l'enfance / adolescence)
Etude de l’effet de principes actifs dans un modèle de colite induite chimiquement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite est induite chimiquement par TNBS ou DSS pour reproduire la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, puis un candidat médicament est administré par gavage pendant dix jours avec prélèvements sanguins quotidiens. Le porteur reconnaît que de fortes doses peuvent entraîner nécrose et perforation du côlon, les souris perdant plus de 25 % de leur poids étant mises à mort. Il s'agit d'une société de prestation testant les molécules de ses clients, qui affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut mimer ces maladies et conclut que l'étude ne peut se faire que sur animaux vivants.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (ou MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Toutes deux se caractérisent par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, due à une dérégulation du système immunitaire intestinal. Cette inflammation incontrôlée est responsable de lésions tissulaires et de la chronicité de la maladie. Les MICI sont le plus souvent diagnostiquées entre 20 et 30 ans. Toutefois, elles peuvent survenir à tout âge et 15% des cas concernent des enfants. Leur fréquence varie considérablement d’un pays à l’autre, les incidences les plus importantes étant retrouvées dans les pays industrialisés, notamment en Europe du Nord-Ouest et aux Etats-Unis. Il n’existe pas de traitement curatif des MICI, mais les médicaments anti-inflammatoires actuels permettent dans la grande majorité des cas un contrôle durable de la maladie, pendant plusieurs années, associé à une qualité de vie satisfaisante. Toutefois, la recherche est très active afin de trouver de nouveaux traitements plus efficaces. Les modèles murins de colite sont très utilisés pour étudier sa physiopathologie et pour le développement de nouvelles modalités de traitement des maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). Pour ces derniers, il est essentiel de sélectionner un modèle de souris qui présente de nombreuses caractéristiques qui se chevauchent avec les MICI humaines. L’objectif de notre projet est de mettre en place des modèles de MC et RCH aigue et semi-chronique chez la souris afin de tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour les MICI chez les patients.
Bénéfices attendus
Le premier but de notre étude sera de trouver des doses de TNBS et de DSS qui ne soient pas trop toxiques mais soient quand même capables d’induire des lésions intestinales quantifiables et reproductibles. Cette étape préalable est très importante car il est bien connu que la severité de l’inflammation induite par ces protocoles expérimentaux est très variable entre une zootechnie et une autre car dépendant, en partie, du microbiote de chaque animal mais aussi liées à d’autres facteurs de l’environment de travail. Il est donc nécessaire de valider dans notre propre zootechnie les protocoles décrits en littérature. Le but ultime de notre projet est de mettre en place des modèles expérimentaux qui seront utilisés pour tester l’efficacité de nouveau médicaments ayant un effet anti-inflammatoire, afin de contribuer à identifier de nouveaux traitements plus efficaces pour ces maladies chroniques, notamment la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH).
Procédures
Pendant 10 jours et une fois par jour, une administration du produit test (candidat médicament ) ou de son solvant sera effectué par gavage. Chaque jour, si nécessaire, un échantillon de sang sera prélevé 1 fois par jour pendant 10 jours par la veine de la queue afin de collecter des données de pharmacocinétique.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale décrite dans ce projet a pour but d’induire une inflammation intéstinale chez la souris qui puisse mimer la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH). Le TNBS et le DSS induisent des dommages intestinaux dose-dépendants, des doses élevées peuvent entraîner des taux de mortalité non négligeables en raison de la perte de poids, de la nécrose et de la perforation du côlon. En revanche, des doses faibles peuvent provoquer une activité de colite de courte durée, faible ou même complètement absente. Par contre, les médicaments et les candidats médicaments que nous testerons une fois le protocole expérimental établi, sont censés réduire le degré d’inflammation du colon, donc pourraient avoir un effet bénéfique sur la santé des souris traitées. Au pire, ces médicaments ne seront pas responsables d’induire une aggravation de l’état de santé des animaux.
Devenir
A la fin de l’expérimentation les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale sur animal vigil. En effet, il n'est pas possible, vu les procédures sevères appliquées, de réutiliser ces animaux pour d'autres expérimentations.
Remplacement
Le but de notre étude est de quantifier l’effet de candidats médicaments ayant des mécanismes d’actions différents sur l’inflammation intestinale chez la souris, donc l’étude ne peut se faire que sur des animaux vivants. En effet, il n’y a pas de modèles in vitro prédictifs capables de mimer la maladie de Crohn (MC) ou la rectocolite hémorragique (RCH).
Réduction
Notre société réalise des études scientifiques externalisées par l'industrie pharmaceutique. Le nombre de groupes expérimentaux peuvent varier en fonction des demandes de nos clients. Pour la mise au point de chaque protocole (DSS et TNBS), nous utiliserons 4 groupes expérimentaux avec n=12 animaux par groupe ; au total il s'agit donc de 96 animaux. Ensuite pour les tests de nouveaux médicaments notre prévision est de réaliser 2 études par an et pour chaque protocole expérimental (DSS et TNBS). Chaque étude aura pour but de tester un candidat médicament, donc sur 5 ans nous testerons 20 candidats médicaments. Pour ces études, nous utiliserons 8 groupes expérimentaux avec n=12 animaux par groupe. Pour chaque modèle nous utiliserons donc 192 souris/an, donc 960 sur 60 mois. En total, y compris une mise au point du modèle, nous utiliserons donc (960+96=1056) x2= 2112 souris en 60 mois. Le nombre d'animaux utilisés est réduit au minimum nécessaire pour pouvoir obtenir des données suffisamment robustes et permettant une analyse statistique appropriée. Du point de vue statistique, les groupes expérimentaux seront comparés entre eux en utilisant un test one-way ANOVA.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les animaux seront hébergés 6 par cage, avec des morceaux de coton et de bois à grignoter. Les cages sont de type IVC en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les cages resteront à une place fixe sur le portoir et seront bougés le moins possible. Les animaux seront manipulés à des fins expérimentales uniquement dans le laboratoire et non dans leur pièce d’hébergement pour éviter de stresser les autres animaux présents dans la pièce. En cas d’administration de médicaments par voie orale, les animaux seront gavés par un technicien expérimenté. Le jour de d’administration intrarectale de TNBS les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane. L'examen quotidien des animaux permettra d'évaluer plusieurs paramètres de santé et bien-être, notamment changement de couleur et d'aspect des poils (poils hérissés), diminution de la prise de boisson et de nourriture, diminution du toilettage et de l'activité exploratoire dans la cage, perte de poids. Si la perte de poids est supérieure à 25 % du poids initial, l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Il existe d’autres modèles animaux de MICI mais le modèle murin donne des avantages car il y a la possibilité d’utiliser des animaux présentant des modifications génétiques spécifiques, d’utiliser des cohortes de plus grande taille et de diminuer la quantité de candidat médicament requis. Les souris seront de souche C57BL/6 ou BALB/c, car ces souches sont largement utilisées pour les études d’induction de la colite (nombreuses références bibliographiques). D'autres modèles expérimentaux, notamment chez le rat, le chien et les primates, posent de nombreux problèmes éthiques et/ou d’infrastructures d’hébergement. Animaux adultes car les jeunes ne sont pas assez sensibles à l’action du DSS et du TNBS. De plus, les maladies inflammatories de l’intestin sont le plus souvent diagnostiquées entre 20 et 30 ans, les patients pédiatriques sont assez rares.
Role des cellules dendritiques dans les infections virales locales et systémiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
5046 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, 860 d'entre elles en gravité sévère. Elles sont infectées par trois virus, un cytomégalovirus, un virus de la chorioméningite et un virus de la grippe, administrés par voie intrapéritonéale, intraveineuse ou nasale, pour étudier le rôle d'un type de cellule immunitaire dans la défense antivirale. Le porteur indique surveiller la perte de poids et euthanasier les souris atteignant un point limite. Il affirme que la mesure de la réponse immunitaire "nécessite" un organisme vivant et complet, et que la souris est le modèle "le mieux approprié" du fait de sa génétique.
Objectifs
Le système immunitaire protège l’hôte contre les infections microbiennes. Les cellules dendritiques (DC) appartiennent au système immunitaire et agissent comme sentinelles du système immunitaire Lorsqu’un pathogène est détecté, elles transmettent des signaux qui initient et orchestrent les réponses immunitaires. Les DC se divisent en conventionnelles (cDC) et plasmacytoïdes (pDC). Les cDC agissent principalement comme présentatrices d’antigènes aux lymphocytes T, qui à leur tour contrôlent l’infection et génèrent des cellules ayant mémoire du pathogène. Les pDC sont la principale source de molécules, dites Interférons (IFN), produites au cours des infections virales. Presque toutes les cellules du corps répondent aux IFN en produisant des molécules capables de bloquer les différentes phases du cycle virale (immunité intrinsèque). De plus, la réponse aux IFN est indispensable pour activer les cellules des systèmes immunitaires inné et adaptatif. Les pDC sont ainsi considérées clef dans l’immunité antivirale. Notre hypothèse est que les pDC exercent des fonctions différentes selon le type de virus et/ou d’infection qu’il engendre. Après infection, la réplication du virus peut rester limitée à l’organe d’entrée (infection locale) ou s’étendre à tout l’organisme (infection systémique). Généralement, les virus sont éliminés par l’hôte, mais, parfois, ils persistent sous forme latente ou génèrent une infection chronique. Notre objectif principal est de déterminer quelles fonctions exercent les pDC dans ces différents types d’infection. Nous étudierons la localisation et l’état d’activation des pDC présentes dans les tissus infectés dans les souris pDC-Tomato, qui permettent d’identifier spécifiquement les pDC par fluorescence. Ensuite, nous évaluerons l’impact de la perte des pDC au cours de l’infection en utilisant les souris pDC-less, qui ont un déficit sélectif en pDC. Nous infecterons nos modèles murins avec les trois virus suivants: le cytomégalovirus murin (MCMV), le virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV) et la souche A du virus de la grippe (IAV). IAV induit une infection locale restreinte au système respiratoire, alors que MCMV et le LCMV induisent des infections systémiques. Le MCMV persiste dans l’hôte, mais sous forme latente. En revanche, LCMV est éliminé par l’hôte, sauf dans le cas de certaines souches qui établissent des infections chroniques.
Bénéfices attendus
Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les fonctions des pDC dans l’immunité anti-virale. L’identification des mécanismes moléculaires qui instruisent les différentes fonctions des pDC murines ouvriront des perspectives de nouveaux traitements pharmacologiques visant à inhiber ou promouvoir l’activation des pDC humaines selon les différents contextes pathologiques. Nous pourrons étendre nos études à l’homme car nous avons développé dans notre laboratoire des cultures de pDC humaines dérivées de précurseurs hématopoïétiques du sang de cordon. Nous pouvons ainsi étudier dans ces pDC les conséquences fonctionnelles de la perte d’expression d’un gène candidat grâce à des technologies d’ingénierie génétique. Nous déterminerons si les mécanismes moléculaires identifiés chez la souris sont conservés dans les pDC humaines et, si oui, quel est l’impact de leur inactivation.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des procédures chirurgicales. L'infection systémique par MCMV sera effectuée par voie intraperitoneales sur des souris vigiles. Cette infection dure une minute/souris. Les infections LCMV clone Armstrong et IAV seront effectuées par voie intranasale sur des animaux anesthésiés au préalable avec un mélange de kétamine/xylasine (injection intraperitonéale). L'infection par voie intranasale dure 1 minute/souris et les souris se réveillent 30 minutes après l'injection de l'anesthésie. L'infection LCMV clone 13 sera effectuée par voie intraveineuse sur des souris anesthésiées avec de l'isofluorane. L'infection par voie intraveineuse dure 1 minute/souris, le traitement par anesthesie dure 5 minutes/souris. Dans certaines expériences nous prélèverons le sérum des souris infectées. Cela sera effectué une seule fois par prélèvement retrorbitale et sur animaux anesthésiés avec isoflurane. L'anesthésie plus le prélèvement durent en totalité 5 minutes. Le volume de sang prélevé sera de maximum 200µl.
Impact sur les animaux
Nous surveillerons différents paramètres, comme la perte de poids, la douleur, le stress, l’inactivité, une mobilité réduite, ainsi que tout comportement anormal, induits dans toutes les procédures sévères de notre projet. Nous définirons une grille de score spécifique à chaque modèle d’infection et nous surveillerons quotidiennement les souris infectées. Lorsque les souris auront atteint un score correspondant à un point limite nous procéderons à l’euthanasie immédiate des souris souffrantes.
Devenir
Mise a mort de tous les animaux
Remplacement
Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire au cours des différents modèles d’infections virales in vivo. Ainsi, l’intégration d’un système vivant et complet est indispensable. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire chez l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Ainsi le modèle murin est un modèle de choix pour notre étude.
Réduction
Nous utiliserons 5046 souris pour mener à bien cette étude. Tous ces animaux seront sous fond génétique homogène C57BL/6J pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités interindividuelles des animaux sous fonds génétiques mixtes. Ainsi, chaque expérience devrait pouvoir être répétée indépendamment deux fois, avec 4-5 animaux par groupe, minimum requis pour s’assurer de la bonne reproductibilité des résultats.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, les souris seront élevées dans des animaleries conventionnelles exemptes d'organisme pathogène spécifique (EOPS). La température, l’hygrométrie et la photopériode sont contrôlées et régulées. Un animal bénéficiera d’au moins 100 cm2 de surface. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs, notamment pour les animaux placés en hauteur car trop exposés à la lumière. Pour les animaux affaiblis, l’accès à la nourriture et à l’eau sera favorisé. Les points limites ont été définis dans chaque procédure et des grilles de score spécifiques à chaque modèle d'infection seront utilisées pour le suivi des souris infectées. Sur la base de ces points limites un système de scoring de la douleur sera scrupuleusement appliqué pour évaluer les signes de souffrance relatifs à l’expérimentation en cours, et les animaux atteignant les points limites définis seront immédiatement euthanasiés.
Choix des espèces
La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces. Nous avons maintenant formellement établi ce point en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Nous utiliserons des souris adultes dont le système immunitaire est mature. Elles auront entre 6 et 12 semaines. Dans le cas spécifique de chimères de moelle osseuse appellées « shield » nous utiliserons des souris agées de 4 semaines au moment de la reconstitution (voir procédure 1).
Mise en place de modèles de lymphomes, de cancer du sein et des LAM (leucémie aigue myéloïde), et caractérisation de thérapies ciblées dans ces modèles murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, 135 d'entre elles en gravité sévère. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales sous la peau, dans le sang ou en intra-lymphatique, avec des prélèvements sanguins rétro-orbitaux répétés et des séances d'imagerie, pour créer des modèles de lymphomes, de cancer du sein et de leucémie aiguë et tester des thérapies ciblées. Le porteur indique que la dissémination tumorale peut provoquer une perte de poids et fixe un point limite quand la masse tumorale dépasse un certain volume. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro reflétant la pathologie humaine, seul l'animal permettant selon lui d'appréhender la tumeur et son microenvironnement.
Objectifs
Malgré les progrès permanents dans la compréhension des cancers et dans les traitements disponibles, de nombreux patients ne répondent pas aux traitements classiques ou rechutent après différentes périodes de rémission. L’objectif est de proposer de nouveaux traitements contre les lymphomes, les cancers du sein et les LAM. Le microenvironnement tumoral (MET) dans les cancers est aujourd’hui reconnu comme ayant un fort impact sur la résistance des cancers aux thérapies. Parmi les composantes cellulaires du MET, il y a les cellules du système immunitaire qui, même si au départ du développement tumoral sont anti-tumoral, peuvent devenir pro-tumorales ou être désactivées. Parmi ces cellules immunitaires, il y a les macrophages et les lymphocytes T (LT) auxquels nous nous intéressons plus particulièrement dans l’équipe. Nous cherchons à activer les LT et désactiver les macrophages associés aux tumeurs (TAM). Le rôle des LT qui sont cytotoxiques, est en effet d’éliminer la tumeur. Cependant, ils peuvent être inhibés par les cellules tumorales et les différentes cellules du MET au niveau par exemple des « immune checkpoints » (ICP). Le but est alors de lever cette inhibition avec des anticorps ou des molécules qui ciblent ces ICP. Les macrophages au sein de la tumeur sont sensés au départ éliminer les cellules tumorales par phagocytose par exemple, cependant, à un certain stade de la tumeur ils reçoivent des signaux les transformant en macrophages pro-tumoraux. Le but est alors d’inhiber la fonction de ces TAM. L’objectif de ce projet est donc d’optimiser des traitements classiques et/ou de proposer de nouveaux traitements contre les lymphomes, les cancers du sein et les LAM.
Bénéfices attendus
L’inoculation des différentes molécules dans les modèles murins considérés permettra de réduire les masses tumorales et/ou d’activer les cellules immunitaires cytotoxiques impliquées dans l’éradication de la tumeur. Le but est de mieux comprendre le développement tumoral , d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, ou de comprendre les mécanismes d'action de certains médicaments, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro reflétant la pathologie humaine. L'utilisation d'animaux permet d'appréhender tous ces mécanismes au niveau de la tumeur mais également au sein de son microenvironnement.
Procédures
Procedure n°1: après anesthésie, injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée (SC) . La prise tumorale sera ainsi évaluée au pied à coulisse 2 fois/semaine. Des prélèvements sanguins en rétro-orbital (50μl) seront réalisés au moment de l'injection (T0) et à différents temps pendant la durée de l'expérimentation (J10, 15, 20, 30). Ces prélèvements seront faits sous anesthésie gazeuse et nous alternerons l’oeil prélevé. Afin de visualiser les anticorps thérapeutiques monoclonaux, l’injection se fera par voie IP. L’efficacité thérapeutique sera évaluée par mesure au pied à coulisse de la tumeur ainsi que par imagerie à l’IVIS (pendant 3 min). Procédure n°2: Afin que la souris développe une LAM (leucémie aigue myéloïde) humaine, après anesthésie, les cellules primaires de patients seront injectées très doucement par voie intraveineuse dans la veine caudale. Procédure n°3: l’anticorps anti-TAM couplé à une molécule fluorescente ou à une drogue ou couplé à des nanoparticules, sera injecté seul ou en combinaison avec un anti-PD1 à des souris xénogréffées. Après anesthésie, les cellules tumorales seront injectées par voie SC ou en orthotopique. La tumeur sera mesurée au pied à coulisse 2 fois/semaine. Des prélèvements sanguins seront faits de la manière que la procédure 1. Procédure n°4: Après anesthésie, les cellules tumorales seront injectées par voie SC dans le flanc, en intra-veineuse (IV) dans la veine caudale ou en intra-lymphatique (IL) dans le talon . Afin d’évaluer in vivo l’effet indirect des ACM anti-CD20, les cellules immunitaires de type NK ou lymphocytes T préalablement marquées avec des sondes fluorescentes afin de les visualiser à l’IVIS, seront injectées en IV . Les ACM, également préalablement marqués, seront quant à eux injectés en IP comme indiqué dans la procédure 1. la tumeur sera mesurée au pied à coulisse 2 fois/semaine et les souris seront pesées 2 fois/ semaine. des prélèvements sanguins seront effectués comme dans la procédure 1. Procédure 5: injection en IV, IP, SC ou intramusculaire d'une molécule à T0 puis les souris sont observées et pesées pendant 5 semaines tosu les 3 jours.
Impact sur les animaux
L'injection de cellules tumorales peut avoir un impact sur les animaux: une injection en sous-cutané pourra conduire à une croissance tumorale importante mais les animaux seront sacrifiés avant que la tumeur ne soit trop grosse, l'injection en intra-veineux sera la dissémination tumorale très importante partout pouvant induire perte de poids. Les prélevents de sang et l'analyse de la fluorescence par imagerie se feront sous anesthésie et peuvent engendrer un stress due à l'anesthésie. L'injection de molécules en intrapéritonéal ou en intraveuineux peut engendrer un stress.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de prélever les organes, le sang et les tumeurs afin d'étudier l'impact du traitement appliqué.
Remplacement
La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées par observation en imagerie in vivo non invasive dans la mesure du possible. Ainsi, nous remplacerons dans la mesure du possible les mesures invasives par de l'imagerie, permettant de réduire le nombre d'animaux nécessaires.
Réduction
Le nombre d’animaux sera de 5 animaux maximum par groupe. Dans le cas d'une étude d'efficacité de thérapies anti-cancéreuses, il s'agira de distinguer les groupes d’animaux recevant la molécule à tester ou le traitement thérapeutique de référence. Nous respecterons ainsi la règle des 3R. Nous utilisons les tests statistiques adéquats en fonction des conditions variables d'expérimentation (t-test ou Wilcoxon ou Mann Withney).
Raffinement
Concernant les mesures de raffinement, les animaux, quelque soit le mode d'injection, seront observés tous les jours afin d’évaluer leur état général. Tout animal présentant une souffrance ou une détresse sera euthanasié. Pour cela, le comportement général de l’animal sera observé (posture, réaction à un stimulus externe tel que le bruit, manque d’appétit, hérissement des poils) et des mesures seront réalisées (poids, taille de la tumeur). Si l’animal perd du poids ou si la taille de la tumeur correspond à une prise de charge tumorale supérieure à 10% (volume max: 1600-1800 mm3) ou si la tumeur est nécrosée, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension de la pathologie cancéreuse et sont devenus les modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Ils sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’Homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. Ils présentent de plus des avantages pratiques tels que la croissance rapide, le cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales ainsi qu’un coût peu élevé. Enfin, ils ont déjà été décisifs pour la découverte de plusieurs molécules qui sont utilisés en clinique. La procédure utilise des animaux âgés d’environ 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes.
Endometriose : validation de modèles souris et évaluation de l’efficacité de candidats médicaments
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Des souris donneuses reçoivent trois injections d'œstradiol puis sont tuées pour récupérer leur tissu utérin, dont les fragments sont injectés dans l'abdomen de souris receveuses, porteuses d'une mini-pompe implantée sous anesthésie qui diffuse de la substance P, censée entretenir l'inflammation, ou du sérum physiologique. 2 400 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes et de grands volumes de sang. Il s'agit de provoquer une forme profonde d'endométriose puis d'y tester des candidats médicaments, par voie veineuse, vaginale, abdominale, sous-cutanée ou par gavage, et le porteur s'attend à une douleur "persistante modérée ou sévère transitoire" et à une perte de poids d'environ 15 %. Avec 8 à 16 receveuses par groupe et une donneuse pour deux receveuses, il ne dit pas combien de molécules ni de groupes justifient un effectif de 2 400 souris.
Objectifs
L’endométriose est une maladie touchant environ 10% des femmes en âge de procréer. En France, il est estimé que 2.5 millions de femmes sont touchées. Il s’agit d’une maladie inflammatoire chronique de l’appareil génital féminin se caractérisant par une dissémination et un développement de muqueuse utérine (endomètre) en dehors de l’utérus. Les lésions peuvent se situer au niveau de la paroi musculaire de l’utérus (myomètre), des ovaires, ou dans la paroi abdominale sur le péritoine. Ces lésions sont associées à de la fibrose. Cette maladie entraîne des douleurs cataméniales importantes (dysménorrhée), des douleurs pelviennes, abdominales, ombilicales, lombaires chroniques, et une infertilité. Il n’existe pas à ce jour de traitement de l’endométriose, d’où l’importance de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet a pour but de développer un modèle murin (souris) d’endométriose profonde, la forme la plus grave d’endométriose. L’objectif est donc d’obtenir des lésions d’origine endométriale, encapsulées dans les tissus et/ou organes abdominaux environnants, et présentant des signes de métaplasie en muscles lisses, et des signes de fibrose importants. Une étude pilote sera réalisée afin de vérifier l’induction d’endométriose et que ces lésions remplissent les critères de l’endométriose profonde. Dans un second temps, des candidats de traitement de l’endométriose seront administrés aux animaux afin de tester leur efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouveaux agents chimiques ou biologiques candidats pour une utilisation en préventif ou en curatif sur l’endométriose profonde. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées voire absentes.
Procédures
Ce projet vise à tester des molécules chimiques ou biologiques dans un modèle d’endométriose chez la souris. Pour mettre en place l’endométriose, un groupe de souris donneuses recevra trois injections de benzoate d’estradiol à D-7, D-5, D-3 qui développeront l’endomètre, puis ce groupe sera euthanasié pour récupération du tissu utérin. Plusieurs groupes de souris receveuses seront implantés avec une mini-pompe osmotique délivrant de la substance P ou du sérum physiologique à D-1,. La pose sera réalisée sous anesthésie générale, avec administration d’analgésiques : dérivé morphinique (Buprénorphine) et alpha2. La plaie sera ensuite désinfectée régulièrement et un cicatrisant (Dermaflon crème) pourra être appliqué. Si besoin, la suture sera reprise sous anesthésie à l’isoflurane. Ces souris recevront ensuite à D0 une injection intrapéritonéale de fragments utérins issus des souris donneuses. La substance P participera à la mise en place de l’inflammation caractéristique de l’endométriose. Les souris receveuses pourront recevoir un composé chimique ou biologique à tester, ou un placebo : Administrations intra veineuses, intra vaginales, intrapéritonéales, sous cutanées sous anesthésie générale si nécessaire ; intra musculaires, intra dermiques sous anesthésie générale avec analgésie systématique (buprénorphine) Administration per os : gavage sous contention Des prélèvements de sang et de tissu (après la mort) pourront être réalisés in vivo afin de doser des paramètres d’intérêt de la maladie et donc d’évaluer l’efficacité des composés administrés sur le développement de l’endométriose. Tous les animaux seront euthanasiés en fin de protocole.
Impact sur les animaux
Dans ce modèle, nous suspectons une douleur persistante modérée ou sévère transitoire, et des pertes de poids transitoires, c’est pourquoi il sera classé en sévère. Ce degré sera revu suite à l’étude pilote. Nous nous attendons à observer une perte de poids transitoire chez les animaux du fait de l’inflammation générée, environ 15%, au début de l’induction de la maladie (pendant la première semaine), avec ensuite une reprise de poids. Nous nous attendons aussi potentiellement à observer des signes de douleur chez les animaux, en particulier au début de l’induction de la maladie. En début d’étude, les animaux seront randomisés pour créer des groupes homogènes en poids, ce qui sera à l’origine de remaniements des groupes. La pose de mini pompe osmotique nécessitera une cicatrisation de la plaie chirurgicale suturée.
Devenir
Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur la maladie d’intérêt.
Remplacement
Les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront dans la mesure du possible été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité apparente. Elles auront si possible aussi été sélectionnées sur leurs propriétés pharmacocinétiques in vivo. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez la femme.
Réduction
Un nombre minimum de 8 souris receveuses adultes par groupe sera nécessaire pour pouvoir observer une réduction significative de l’étendue des lésions et de leur fibrose suite à un traitement. Ce nombre pourra monter jusqu’à 16 en cas d’ajout d’autres paramètres devant être mesurés comme le dosage des cytokines, d’autres colorations en histologie et/ou l’expression de gènes dans les lésions, certaines analyses étant incompatibles les unes avec les autres. Par ailleurs, on comptera une souris donneuse pour deux souris receveuses.
Raffinement
Le poids des animaux sera suivi au moins deux fois par semaine, et quotidiennement en cas de perte de poids >10%. Des mesures adaptées seront mises en place pour les animaux perdant du poids. En cas de perte de poids constatée supérieure à 10% sur certains animaux, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Une grille de scoring de douleur a été mise en place et sera raffinée après la première étude sur ce modèle. Elle sert à évaluer la douleur et le comportement des animaux.
Choix des espèces
- Les modèles d’endométriose sont bien documentés chez la souris. - Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées a minima sur une espèce rongeur (par exemple la souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur (par exemple la souris) est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Des femelles sevrées (jeunes adultes de plus de 6 semaines) seront utilisés, le modèle d’endométriose profonde étant bien décrit chez les animaux adultes.
Rôle des enzymes du métabolisme des phosphoinositides dans l’hémostase primaire et la thrombose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 84 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Selon les groupes, elles subissent des sections répétées du bout de la queue pour chronométrer le saignement, des prélèvements de sang à la veine cave, des lésions provoquées de la carotide ou de la jugulaire et une ligature de la veine cave, sous anesthésie pour les actes chirurgicaux. Le porteur affirme que les composés injectés ne sont ni irritants ni délétères et que les souris génétiquement modifiées n'ont pas de phénotype dommageable. Il étudie le rôle d'enzymes plaquettaires dans la coagulation et juge le modèle murin "irremplaçable" faute d'approche in vitro.
Objectifs
Les plaquettes sont des acteurs essentiels du maintien de l’intégrité vasculaire. Elles sont les premiers éléments cellulaires à intervenir dans l’arrêt du saignement lors d’une blessure vasculaire en participant à la formation d’un thrombus, ceci constituant l’hémostase physiologique dite primaire. Les plaquettes représentent cependant des cibles majeures en clinique dans la prévention de pathologies cardiovasculaires comme les maladies artérielles thromboemboliques, l'athérosclérose ou la resténose après angioplastie (première cause de mortalité dans les pays industrialisés). De nombreux anti-thrombotiques efficaces sont utilisés en clinique mais ils ont généralement des effets relativement drastiques pouvant entraîner des complications hémorragiques. Des problèmes de saignements plus ou moins graves peuvent aussi être dus à des défauts de production plaquettaire. Ainsi, la mise en évidence de cibles pharmacologiques et/ou de biomarqueurs plaquettaires est nécessaire pour une meilleure prise en charge des thromboses et des syndromes hémorragiques chez le patient. Le rôle des phosphoinositides et des enzymes régulant leur taux dans les diverses étapes qui sous-tendent la production et l’activation des plaquettes reste encore mal étudié. Pourtant, ils ont un rôle majeur à jouer dans les plaquettes sanguines car ils occupent une place de plus en plus centrale dans la régulation spatiotemporelle de la signalisation cellulaire, la dynamique cellulaire notamment le remodelage du cytosquelette et des membranes et le trafic vésiculaire, processus majeurs dans la production et les fonctions plaquettaires. Ainsi, ce projet vise à mettre en lumière comment le métabolisme de phosphoinositides régulent la physiopathologie des plaquettes sanguines.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra un meilleure compréhension du rôle des différents phosphoinostides et de leur métabolisme dans un contexte intégré visant à identifier de potentiels biomarqueurs et/ou cibles pharmacologiques dans les syndromes hémorragiques et thrombotiques dûs à des défauts de plaquettes sanguines.
Procédures
Pour la procédure 1, une coupure (de 3 secondes) de 3 mm du bout de la queue de la souris anesthésiée par injection IP (intra-péritonéale) est réalisée. Le temps d'arrêt de saignement (évalué à 50μl maximum de sang avant l’arrêt du saignement) sera évalué jusqu’à 20 minutes maximum. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé au niveau de la veine cave inférieure après anesthésie par injection IP . La prise de sang dure 1-2 minutes et un volume de sang de 800 à 1000 μl est prélevé. Pour la procédure 2, la souris est anesthésiée par anesthésie gazeuse et injectée en IP avec un anti-douleur pour un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) suite à une coupure de 1 mm (de 3 secondes). Nous réalisons ensuite une injection IP du composé d’intérêt inoffensif et non irritant. Six prélèvements sanguins à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute), suite à une coupure de 1 mm (durée de 3 secondes) est réalisé après anesthésie gazeuse et injection d’un anti-douleur sur une durée de 280h. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. Pour la procédure 3, une injection d’un composé inoffensif et irritant est réalisé en intra-veineux durée de 10 secondes sur souris anesthésiée en IP. 1 heure après l’injection, puis toutes les 24 heures pendant 4 jours, un prélèvement sanguin à la queue (environ 30μl, durée de 1 minute) par coupure de 1 mm (durée de 3 secondes), est réalisé sur l’animal sous anesthésie gazeuse et injecté en IP avec un anti-douleur. 10 jours après, un prélèvement sanguin est réalisé comme décrit plus haut. En fonction des résultats obtenus , les procédures 4, 5 et 6 seront effectuées sur certains ou tous les groupes. Pour la procédure 4, la souris est anesthésiée par injection IP pendant toute la procédure. L’acte expérimental d’induction d’une lésion thrombogène à la carotide dure 10 minutes et l'enregistrement dure 30 minutes. Pour la procédure 5, la souris est anesthésiée et traitée par injection IP d’un anti-douleur . L’acte de ligature partielle de la veine cave dure 10 minutes. La souris est ensuite retraitée par injection IP d’un anti-douleur . Pour la procédure 6, la souris est anesthésiée et traitée par injection IP d’un anti-douleur . L’acte expérimental d’induction d’une lésion thrombogène à la jugulaire dure 15 minutes. Toutes les injections IP dure 10 secondes et se font sur animaux vigiles. Les autres actes expérimentales se font sur animaux anesthésiés.
Impact sur les animaux
Les modèles génétiquement modifiés ne présentent pas de phénotypes dommageables de la vie à la mort. Pour les actes expérimentales, les composés injectés ne sont pas irritables ou/et délétères. Aucune données n'existent quant à des conséquences néfastes des produits injectés qui ont déjà été utilisés par différents laboratoires, dont le notre, sans aucun effets indésirables. Chaque acte expérimentale de chaque procédure est maitrisée par les responsables du projet et est réalisée sous anesthésie/analgésie sauf pour les injections intra-péritonéales qui sont des actes rapides de moins de 10 secondes sur animaux vigiles.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort car toutes les procédures nécessitent des prélèvements de sang et/ou d'organes.
Remplacement
Le recours au modèle murin est irremplaçable pour le déroulement de ce projet pour deux raisons majeures : (i) la complexicité des mécanismes mis en jeu dans un contexte physiopathologique intégré d’hémostase et thrombose non modélisable par des approches in vitro et (ii) l'utilisation des modèles génétiquement modifiées.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum : en suivant des protocoles expérimentaux déjà établis dans le laboratoire, en tenant compte d’expériences déjà réalisées dans l’équipe qui nous ont montré que nous pouvons obtenir des résultats statistiquement corrects en faisant des groupes de 12 souris selon la procédure réalisée. Nous limiterons aux seules expériences considérées comme absolument indispensables en évitant la répétition d’études antérieures déjà réalisées et/ou publiées et en fonction des résultats obtenus au cours des différentes procédures expérimentales. En effet, le nombre de souris sera diminué en fonction des résultats obtenus lors des procédures expérimentales 1 à 3, en réalisant ou pas les procédures expérimentales 4 à 6. Nous obtiendrons dans un premier temps des résultats préliminaires sur 1 lot de 4 animaux nous permettant de définir s'il peut exister des différences statistiquement quantifiables entre les différents groupes, qui si elles existent seront statistiquement affinées avec des groupes de 12 souris selon la procédure réalisée.
Raffinement
Les souris ont un accès illimité à la nourriture et boisson avec du papier sopalin, du carton et/ou des cubes de bois dans la cage. Une observation quotidienne des souris est réalisée par les zootechniciens en terme de comportement général (prostration, activité anormale, isolement) et d'apparence (poils hérissés, plaies/blessures, amaigrissement anormal). Toutes les procédures expérimentales se font sur souris anesthésiées et analgésiées par inhalation ou injection de composés. Un contrôle permanent de l'état d'anesthésie des souris sera réalisé par les expérimentateurs tout au long de la procédure. Tout au long des procédures, les animaux seront surveillés par les zootechniciens et les expérimentateurs. En cas de blessure, l'animal sera isolé et la blessure sera nettoyé 2 fois par jour pour favoriser une cicatrisation propre. Une mise à mort rapide de la naissance à la mort ou lors d'une procédure expérimentale sera effectuée.
Choix des espèces
Les effets pléiotropes dans un contexte d’hémostase et thrombose font intervenir des fonctions et types cellulaires multiples dans l’organisme non modélisables à ce jour par des approches in vitro. Le recours à l’expérimentation animale est donc l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiopathologiques dans un contexte intégré. Nous utilisons des souris car les mécanismes d’hémostase et thrombose sont transposables de la souris à l'homme mais aussi car nous disposons de modèles murins génétiquement modifiées invalidés pour nos protéines d'intérêt car il n'existe pas à ce jour d'inhibiteurs pharmacologiques. Stade adulte de 8 à 24 semaines car de part et d'autre de cette fourchette d'âge les réponses fonctionelles en hémostase et thrombose peuvent être modifiées.
Rôle de la signalisation IL-2 dans le lymphocyte B dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris : l’Encéphalite Auto-immune Expérimentale (EAE).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection déclenchant une maladie proche de la sclérose en plaques, subissent jusqu'à quatre prélèvements sanguins éveillées puis un prélèvement de liquide céphalorachidien avant la mise à mort. Le porteur indique que la maladie provoque une paralysie progressive évaluée sur une échelle de 0 à 6, les animaux dépassant un point limite étant tués. Il étudie le rôle d'une molécule immunitaire, bénéfice renvoyé au conditionnel, et affirme que le recours à l'animal est "nécessaire" faute de modèle in vitro reproduisant le microenvironnement.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire qui attaque le système nerveux central et pour laquelle il n'existe pas de traitement curatif. C'est la principale cause de handicap non traumatique chez les jeunes adultes. Le dérèglement du système immunitaire est impliqué dans cette maladie. Dans ce projet nous nous intéressons au role de l'IL-2 dans le controle des populations lymphocytaires B et les réponses immunes dans le contexte pathologique de la sclérose en plaques. L'objectif est de démontrer, dans un modèle de maladie chez la souris: l'Encéphalite Auto-immune Expérimentale (EAE), le lien entre l'IL-2 et le role des cellules B dans le developpement de la maladie.
Bénéfices attendus
A terme, cela pourrait permettre une meilleure compréhension des risques accrus de développer la sclerose en plaques et envisager le développement de thérapies ciblant l’expansion de cellules régulatrices avec l'IL-2.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une injection sous cutanée du peptide immunogène (336 souris). La procédure dure 5 minutes par souris (temps d'anesthesie et d'injection). Des prelevements sanguins sur ces animaux vigiles seront réalisés pour le suivi immunologique, maximum 4 prelevements par animal distants au minimum de 5 jours. La procédure de prelevement dure maximum 3 minutes par animal. Un prélèvement unique de LCR sera réalisé sur ces animaux avant mis à mort de ceux-ci (15min).
Impact sur les animaux
La procédure 1 entraînera une paralysie progressive des animaux suite aux injections des agents déclenchant la maladie. Les symptômes seront évalués sur une échelle de 0 à 6 et des actions adaptées seront mises en œuvre pour soulager l'inconfort selon le score établit. Tout au long de l’étude, un suivi rigoureux du bien-être animal sera également effectué. Si l'un des points limites décrits dans ce projet est atteint, l’animal sera mis à mort selon une méthode réglementaire.
Devenir
Les animaux seront mis à mort selon une méthode autorisée.
Remplacement
Lors de nos précédents travaux nous avons utilisé un modèle de culture in vitro pour étudier l’effet de l’IL-2 sur le lymphocyte B. Cependant, l’étude des réponses immunes par le biais de cultures in vitro reste difficile car ces réponses sont étroitement liées à la présence d’un microenvironnement (cellulaire et moléculaire) qui ne peut être reproduit in vitro. Le recours à un modèle animal est donc nécessaire pour déterminer l’implication de l’IL-2 dans le devenir des lymphocytes B au cours de réponses auto-immunes. Aucun autre modèle ne permet d'étudier la sclérose en plaque et le role du système immunitaire dans cette maladie.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été réduit au strict minimum nécessaire à une interprétation statistiquement significative des résultats. Les statistiques seront réalisés à l'aide de tests non paramétriques, le test de Mann et Whitney sera appliqué pour deux échantillons et celui de Kruskal et Wallis pour un nombre quelconque d'échantillons. Les expérimentations sont mises en place de manière à extraire le plus d'informations possible sur le même animal, notamment en analysant plusieurs tissus.
Raffinement
Les animaux seront surveillés et suivis quotidiennement. Une grille précise d'évaluation sera utilisée. Les souris seront élevées dans des conditions adaptées : locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture au sol dans la cage pour favoriser l'hydratation et l'alimentation. Les animaux qui ont contracté l'EAE présenteront des déficits moteurs significatifs, les cages comporteront donc des refuges et des matériaux de nidification adéquats. L'inconfort provoqué par la maladie sera soulagé quand cela est possible (vidange de la vessie, hydratation par injection, séparation des souris pour éviter les traumatismes et assurer l'accès à la nourriture). Le modèle EAE étant dépendant du stress, les souris ne seront manipulées que par un nombre réduit de personnes parfaitement formées, les cages changées au moment du suivi des animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier les maladies auto-immunes et inflammatoires mettant en cause un déréglement du système immunitaire. L'utilisation de souris modifiées pour un acteur de la communication cellulaire et dans lesquelles sera induit la maladie mimant la sclérose en plaque permettra d'étudier l’implication de la protéine IL-2 dans les mécanismes physiopathologiques de la maladie. Le système immunitaire étant optimale à l’âge adulte, l’ensemble des expérimentations seront menées sur des animaux adultes (8-12 semaines).