Procédures sévères

160 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. La moitié suivent un régime gras, puis toutes sont suspendues par la queue pour immobiliser leurs pattes arrière, ou centrifugées à deux fois la gravité, afin de mesurer la réaction de leurs os à l'inactivité ou à la surcharge. Le porteur situe l'intérêt de ces mesures pour la santé osseuse des personnes obèses au long terme. Il décrit la suspension et la centrifugation comme sources possibles de perte de poids, de vertiges et de baisse d'appétit.

Objectifs

Le projet vise à comprendre comment l’obésité modifie la façon dont nos os réagissent à l’activité physique ou à la sédentarité. L’obésité est un problème de santé majeur, associé à de nombreuses maladies, mais son impact sur la solidité et la régénération des os reste mal connu. Nous étudierons ce phénomène chez des souris nourries avec un régime standard ou un régime riche en graisses, soumises à deux conditions extrêmes : l’inactivité forcée (la suspension de la queue simulant la sédentarité ou la microgravité) et la surcharge mécanique (la centrifugation à 2G équivalent d’un effort intensif). Après ces expériences, nous analyserons la structure des os, ainsi que les changements cellulaires, moléculaires et génétiques. Ces travaux permettront de mieux comprendre comment l’obésité perturbe la réponse mécanique du squelette et d’identifier de possibles différences entre mâles et femelles. Les résultats constitueront une base de données pour la recherche sur la santé du squelette, avec des implications pour la prévention et les traitements adaptés à chaque profil métabolique.

Bénéfices attendus

Le projet cherche à comprendre en détail comment les cellules qui contrôlent la santé des os (les ostéocytes) réagissent aux mouvements ou au manque d’activité lorsque l’organisme est en situation d’obésité. Ces cellules jouent un rôle essentiel : elles resentent les pressions et les forces exercées sur les os et ajustent leur solidité en conséquence. En étudiant leur comportement dans un contexte d’obésité, nous espérons découvrir pourquoi les os des personnes obèses ne réagissent pas toujours de la même manière à l’exercice physique ou à l’inactivité. Les résultats de ce travail seront utiles à la communauté scientifique, en apportant de nouvelles données accessibles à tous dans les domaines de la physiologie osseuse et du métabolisme. À plus long terme, ces connaissances aideront les chercheurs et les médecins à mieux comprendre les effets de la sédentarité et de l’exercice sur le squelette des personnes obèses, et à adapter les traitements contre la perte osseuse selon le profil métabolique de chaque patient.

Procédures

Micro-tomographie aux rayons X : On réalise des images des os (tibia et fémur gauches) des souris pour observer leur structure. Les souris sont endormies, puis placées dans un appareil de scanner pendant environ 30 minutes. Ces acquisitions sont faits plusieurs fois (aux semaines 24 et 26, avant et après une contrainte mécanique). Après, les souris sont remises dans leur cage une fois réveillées. La dose de rayons X utilisée est faible et ne présente pas de danger pour leur santé ni pour leurs os. Injection de tétracycline : On injecte un produit (tétracycline) à deux moments précis (jours 7 et 12) pour marquer les zones où l’os est en train de se former. Cela permet ensuite de mieux étudier la croissance osseuse. Mesure de la glycémie : Le taux de sucre dans le sang est mesuré après 4 heures de jeûne. On prélève une petite goutte de sang au niveau de la mâchoire à l’aide d’une lancette, puis on nettoie et on comprime la zone. Ces mesures sont réalisées trois fois (semaines 18, 24 et 26).

Impact sur les animaux

Suspension : Les souris sont placées seules dans leur cage avec un aménagement simple. Cela permet de limiter l’utilisation de leurs pattes arrière pour les besoins de l’étude. On observe parfois une petite perte de poids au début, mais leur état se stabilise ensuite. Le dispositif est conçu pour éviter les blessures, notamment au niveau de la queue. Si une irritation apparaît, elle est soignée. Les souris en suspension peuvent se déplacer en utilisant leurs pattes avant et ont un accès facile à la nourriture et à l’eau. Centrifugation : La centrifugation en 2g (exposition à une force équivalente à 2 fois la gravité) ne provoque pas de stress important, mais peut entraîner des vertiges. Cela peut réduire temporairement leur appétit et leur consommation d’eau pendant 1 à 2 jours, et ralentir légèrement leur prise de poids. Les souris sont surveillées en continu (vidéo), et leur poids ainsi que leur alimentation sont régulièrement contrôlés avant, pendant et après l’expérience.

Devenir

Toutes les analyses complémentaires et les prélèvements d’échantillons sont réalisés à la fin de l’expérience. Les souris sont alors euthanasiées par du personnel qualifié, selon une procédure encadrée visant à éviter toute souffrance. Cette étape permet de prélever différents organes afin de réaliser des analyses approfondies (au niveau des cellules, des tissus et du fonctionnement de l’organisme).

Remplacement

Aujourd’hui, il n’existe pas de modèle en laboratoire (sur cellules) ni de simulation informatique capable de reproduire la complexité du fonctionnement de l’os dans un organisme vivant. L’os est influencé par de nombreuses cellules différentes et par plusieurs systèmes du corps (comme les hormones, le métabolisme ou le système immunitaire), qui interagissent en permanence. Les expériences réalisées sur des cellules permettent d’étudier certains facteurs séparément (comme l’obésité ou les contraintes mécaniques), mais elles ne reflètent pas l’ensemble des interactions qui se produisent dans un organisme entier. Dans notre étude, nous combinons ces facteurs pour observer leurs effets globaux sur l’os. Cela inclut des éléments importants comme les hormones, le métabolisme ou les molécules circulant dans le sang, qui ne peuvent pas être reproduits en laboratoire. La souris est donc utilisée comme modèle, car son fonctionnement osseux et son métabolisme sont proches de ceux de l’être humain et permet d’étudier de manière plus complète comment l’os réagit dans des conditions proches de la réalité. Enfin, les résultats obtenus chez la souris aideront à améliorer les futurs modèles en laboratoire, en apportant des données plus précises pour mieux reproduire le fonctionnement réel du corps.

Réduction

Il n’existe pas d’étude portant sur des souris femelles obèses soumises à des protocoles de suspension ou de centrifugation. Le nombre de souris utilisées a été calculé pour être le minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats fiables. Ce calcul s’appuie à la fois sur l’expérience du laboratoire et sur des données scientifiques déjà publiées. Des analyses statistiques ont permis d’estimer le nombre d’animaux requis, en tenant compte des variations entre individus et de la précision des mesures. Ainsi, 20 souris par groupe sont nécessaires pour réaliser l’ensemble des analyses. Enfin, l’étude est organisée de manière rigoureuse (plusieurs groupes, conditions identiques, répartition équilibrée selon le poids) afin de garantir des résultats fiables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Pendant toute l’expérience, les souris sont suivies de près par du personnel formé afin d’assurer leur bien-être. Elles reçoivent des soins attentifs tout au long du protocole. Elles sont hébergées dans des cages adaptées aux conditions de l’étude (suspension ou centrifugation). Pour la suspension, les souris sont placées seules dans des cages aménagées de façon à empêcher l’utilisation de leurs pattes arrière. Les souris sont surveillées tous les jours, et même deux fois par jour pendant les phases les plus contraignantes. Les chercheurs vérifient leur état général (poids, pelage, comportement, alimentation, digestion) ainsi que tout signe de stress ou de souffrance. Une légère perte de poids peut apparaître au début, mais elle est temporaire et le poids se stabilise ensuite. Si un animal présente des signes importants de souffrance (par exemple une perte de poids trop importante), il est immédiatement retiré de l’étude. Les manipulations sont réalisées de manière à limiter au maximum le stress : les souris sont endormies pour certaines procédures et se réveillent dans leur cage. Des dispositifs adaptés permettent d’éviter les irritations ou blessures, et tout problème éventuel est pris en charge rapidement. Enfin, leur poids et leur alimentation sont régulièrement contrôlés tout au long de l’étude pour s’assurer que leur état reste satisfaisant.

Choix des espèces

Les modèles invertébrés ne sont pas adaptés à l'étude de la physiologie osseuse car ils possèdent un exosquelette chitineux et non un endosquelette osseux. Pour les vertébrés, les rongeurs, et en particulier la souris, représentent modèles les plus pertinents et les moins exposés aux contraintes éthiques ou logistiques. La souris est un modèle robuste pour l'étude de l’os et des effets de la charge/décharge mécanique. Elle permet l’analyse fine des mécanismes moléculaires, cellulaires et tissulaires spécifiques impliqués dans l’homéostasie osseux. Le modèle murin utilisé ici pour simuler les contraintes mécaniques de décharge et charge mécanique, est particulièrement adapté, en raison de la petite taille et le poids de la souris qui limite l’impact des manipulations expérimentales. Ce modèle permet également le suivi in vivo de la cinétique de la perte osseuse par micro-tomographie aux rayons X ainsi que la récupération post-mortem des tissus et organes nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires. Nous utiliserons des souris femelles adultes, nous commenceront le régime riche en graisses à 8 semaine d’âge et les souris auront l’âge de 26 semaines quand protocole se termine (mise à mort et prélèvement de tissus par dissection). Le recours à des souris plus jeunes introduirait un biais de confusion important lié à la croissance active de la souris avec des retombées directes et indirectes sur le squelette. De plus, le choix est également dicté par le besoin d’utiliser des souris matures sur le plan squelettique au moment de la stimulation par charge et décharge mécanique. Concernant l’induction de l’obésité, les souris recevront un régime riche en graisses à partir de 8 semaines correspondant à 16 semaines avant la contrainte mécanique. Cette durée est nécessaire pour induire une obésité stable et reproductible. L’obésité étant un facteur clé de l’étude, ce délai est indispensable pour garantir la validité des comparaisons entre groupes et la robustesse des résultats obtenus.

Génétiquement modifiées pour développer une forme de sclérose latérale amyotrophique, 3 030 souris perdent progressivement l'usage de leurs membres postérieurs, jusqu'à la paralysie pour l'une des lignées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des administrations répétées de candidats médicaments par voie orale, intraveineuse ou intrathécale sous anesthésie, des prélèvements de sang mensuels et une pose de pompe sous-cutanée. Toutes sont tuées, une partie dès l'atteinte d'un point limite avant la fin, pour prélever leurs organes. Le porteur revendique le recours à l'animal comme "incontournable", faute de méthode évaluant les symptômes moteurs de la maladie.

Objectifs

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), appelée couramment maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative qui se caractérise par une dégénérescence progressive des neurones du cortex moteur, des motoneurones du tronc cérébral et de la moelle épinière. On distingue des formes sporadiques et des formes familiales. Quelle que soit la forme de la maladie, les signes cliniques sont identiques. Cependant, en fonction de la région initiale d’atteinte, on distingue deux variétés de SLA : (1) une forme spinale qui affecte tout d’abord les motoneurones de la moelle épinière et qui est caractérisée par une atteinte de la motricité des membres supérieurs et inférieurs; et (2) une forme bulbaire, affectant les motoneurones du tronc cérébral et provoquant des troubles de la parole et de la déglutition. Au cours des 25 dernières années, la recherche sur les patients SLA a révélé des mutations dans plus de 20 gènes, dont 2 d’entre eux sont les plus affectés et ont été associés à des cas familiaux de la SLA. Des mutations de ces 2 gènes ont été associées à la neurodégénérescence observée dans la SLA. Par conséquent, ces deux gènes font actuellement l’objet de nombreuses recherches, notamment pour le développement de stratégies thérapeutiques. Afin d’étudier la progression de la maladie et d’aider au développement de nouveaux candidats médicaments, des modèles de souris transgéniques ont été générés pour mettre en évidence les mécanismes physiopathologiques responsables de la dégénérescence moto-neuronale observée dans la SLA. Par conséquent et pour étudier deux voies fortement représentés chez les malades de la SLA, nous utiliserons dans ce projet deux modèles de souris transgéniques dont les deux gènes d'intérêt ont été modifiés et présentant des signes pathologiques qui reprennent la pathologie humaine sous sa forme spinale avec une dégénérescence progressive des motoneurones entraînant un déficit moteur progressif. Les souris présentent, à partir de 6 semaines, des tremblements des membres inférieurs, des signes de faiblesse musculaire ainsi que des déficits moteurs qui s’aggrave avec l’âge. Ces deux modèles fournissent des outils précieux pour identifier les mécanismes sous-jacents à la pathogenèse SLA et pour étudier les stratégies thérapeutiques à mettre en place pour arrêter la maladie, et dans notre cas, d’étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Bénéfices attendus

La sclérose latérale amyotrophique (SLA), ou maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte des motoneurones à la fois centraux et périphériques. Il s'agit de la plus fréquente des maladies du motoneurone de l'adulte (environ 2.5 malades pour 100000 habitants en France). Son diagnostic repose avant tout sur des éléments cliniques et l'exclusion d'autres pathologies. Ainsi, le délai entre l'apparition des symptômes et la pose du diagnostic est souvent long (9 à 13 mois), alors même que l'évolution de la maladie est rapide, avec un décès survenant généralement dans les 3 à 5 ans (le plus souvent par détresse respiratoire). Il s'agit d'une pathologie complexe et hétérogène dont les processus physiopathologiques sont encore mal compris. Les seuls traitements actuellement utilisés chez les patients atteints de SLA ne permettent, tout au plus, qu'une amélioration mineure de la survie, avec des résultats controversés. Ainsi, ce projet est utile pour avancer dans le traitement de cette maladie et donc le développement de nouveaux candidats médicaments.

Procédures

Dans ce projet, 2 lignées d’animaux génétiquement modifiés à phénotype dommageable sont étudiées. Les deux lignées sont des modèles de la sclérose latérale amyotrophique (ou maladie de charcot) mais ne développent pas la maladie de la même façon puisque les voies altérées dans les deux lignées sont différentes. Pour la lignée SOD1, les animaux développent des déficits moteurs qui évoluent tout au long de la vie de l’animal pour atteindre une paralysie des membres postérieurs et une diminution significative du poids (points limites définis dans le projet). Pour la lignée TDP-43, les animaux développent des déficits moteurs qui évoluent assez rapidement et se limite au bout de quelques semaines à une atteinte des membres postérieurs induisant une démarche laborieuse. Contrairement à la lignée SOD1, aucune paralysie des membres postérieurs n’est observée, les animaux ne montrent pas de perte de poids significative et il n’y a pas de mort prématurée observable sur la durée de notre projet. Des administrations seront réalisées sur animaux vigiles (1 à 2 minutes selon le type d’administration hormis pour les administrations intrathécales (MODIFICATION) ET SOUS-CUTANÉES CONTINUES PAR POMPE OSMOTIQUE. Les fréquences d'administration dépendront des caractéristiques pharmacologiques des candidats médicaments. La fréquence et la durée maximales d'administration sont définies selon le type d'administration utilisée de la façon suivante : -Administration orale, intrapéritonéale ou sous-cutanée : 1 administration par jour pendant 3 mois -Administration intraveineuse : 2 administrations par semaine pendant 3 mois -Intranasale : 1 administration par jour pendant 6 mois -Intrathécales 3 administrations maximum réalisées sous anesthésie générale à une fréquence d’une par mois (temps minimal entre chaque administration). La durée de l’administration sera de 15-20 min environ. MODIFICATION : -SOUS CUTANÉE CONTINUE PAR IMPLANTATION DE POMPE OSMOTIQUE 15 MINUTES ENVIRON PAS PLUS DE 3 RENOUVELLEMENT AVEC 2 SEMAINES ENTRE CHAQUE RENOUVELLEMENT MINIMUM. Des prélèvements de sang à la veine mandibulaire seront réalisés tous les mois (durée environ 2 min). MODIFICATION : UN PRELEVEMENT DE LIQUIDE CEPHALO-RACHIDIEN POURRA ETRE REALISE SOUS ANESTHESIE GENERALE ET ANALGESIE JUSTE AVANT LA MORT DE L’ANIMAL (DUREE DU PRELEVEMENT 20 MIN MAXIMUM).

Impact sur les animaux

Ces modèles de souris transgéniques présentent des phénotypes dommageables avec une dégénérescence progressive des motoneurones entraînant un déficit moteur. Pour une des lignées, les animaux développent des difficultés progressives de mouvements des membres postérieurs, de perte de poids significative ou de mort prématurée avant la fin de l’étude. Les animaux issus de l'autre lignée utilisée dans ce projet développent également des difficultés progressives de mouvements des membres postérieurs allant jusqu’à la paralysie complète. Chez le fournisseur, les animaux à l'âge de 10 jours sont soumis au prélèvement d'un petit morceau de queue utilisé comme matériel biologique pour le génotypage. Lors du transport des animaux par avion d'une durée maximale de 5 jours (entre le moment où les animaux sortent de l’animalerie du fournisseur et celui où ils arrivent dans nos locaux), les animaux jeunes (3-4 semaines au minimum soit après sevrage) peuvent présenter un déficit moteur précoce léger dans le cas de la première lignée. Lors de l’administration d’une nouvelle molécule, différents effets indésirables peuvent être observés tels que : l’inconfort dû à l’injection, une diminution ou une augmentation de l’activité. Dans notre projet, des études in vivo ont déjà été réalisées au préalable avec les candidats médicaments et ne montrent aucune toxicité particulière de ceux-ci. Les futurs candidats médicaments peuvent avoir différents mode d’administration. Une administration (intra-veineuse, per os, sous-cutanée, intrapéritonéale ou intranasale) d’un candidat médicament entraîne une contention de l’animal qui peut induire un stress particulier. L’administration dans la colonne vertébrale sous l'arachnoïde au niveau lombaire (intrathécale) (MODIFICATION) ET L’IMPLANTATION D’UN DISPOSITIF DE DIFFUSION DE CANDIDAT MÉDICAMENT EN SOUS-CUTANÉ seront réalisées sous anesthésie générale précédée d’une analgésie. Ces actes peuvent entrainer une perte de poids des animaux ainsi qu'une légère déshydratation durant 24 à 48h. Un risque de lésion de la moelle épinière est possible dans moins de 5% des cas (MODIFICATION) POUR L’ADMINISTRATION INTRATHÉCALE. Un stress peut également être présent lors de la manipulation des animaux pour leur passage dans les différents tests moteurs. Des prélèvements de sang au niveau de la veine submandibulaire seront réalisés avec un intervalle minimal d’un mois sur animaux anesthésiés.

Devenir

En fin d’étude, pour des analyses sérologiques, histologiques, moléculaires et immunohistochimiques, les animaux seront soumis à différents types de prélèvements (organes) post mortem. L’ensemble des animaux arrivant au point limite avant la fin de l’étude comportementale sera mis à mort.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte d’un grand nombre de ces phénomènes, et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer les symptômes moteurs de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc incontournable pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.

Réduction

Les études internes précédemment réalisée dans notre EU sur les tests moteurs utilisés dans ce projet avec d’autres lignées ont montré qu’un nombre d’animaux égal à 15 par groupe est nécessaire pour observer des effets significatifs des candidats médicaments dans les tests comportementaux utilisés dans cette étude. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés. Les données seront présentées en moyenne et erreurs standard à la moyenne (SEM). Les différences entre les groupes seront évaluées à l’aide de tests paramétriques. Les tests paramétriques seront utilisés car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Des tests non paramétriques pourront être utilisés en deuxième intentions. Le choix des tests paramétriques ou non paramétriques sera fait en fonction des résultats obtenus dans le test de normalité. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, en plus des analyses comportementales, des prélèvements de sang et d’organes seront réalisés sur les animaux pour des études complémentaires.

Raffinement

(MODIFICATION) L’éleveur des animaux a obtenu la certification AAALAC et ISO9001. La certification AAALAC oblige à suivre une réglementation internationale très stricte en matière de bien-être animal et du principe des 3R. Une période d’habituation sans expérimentation est laissée aux animaux d’au minimum une semaine après leur arrivée. Durant cette période d'habituation, les animaux sont soumis à une évaluation journalière suivant la grille scoring mais aucune pesée de sera réalisée pour éviter un stress supplémentaire lié à la préhension de l'animal en surplus du stress récent induit par le transport et le changement d'environnement. Les souris seront ensuite pesées une fois par semaine. Lorsqu’une perte de poids sera observée, la fréquence des pesée pourra être augmentée en fonction de la perte de poids et de l‘apparition des déficits moteurs. Par ailleurs, leur état général sera évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un des points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Des procédures particulières seront mises en place suivant l’atteinte moteur des animaux (alimentation hydratée et hydrogel placé dans le fond de la cage). Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale afin de réduire le stress des animaux. Pour les procédures chirurgicales, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Après ces chirurgies et afin de faciliter leur convalescence, de l’hydrogel sera placé dans le fond de la cage pour les premières 24h et plus si besoin. Le poids des animaux sera suivi quotidiennement pendant une période minimale de (MODIFICATION) 48 OU 72h SELON LA CHIRURGIE et jusqu’à reprise du poids initial. Des procédures particulières pourront être mise en place en cas d’altération de l’état physique des animaux après la chirurgie (mise en place d’une analgésie, alimentation hydratée et hydrogel dans le fond de la cage en concertation avec le vétérinaire). Une période d’au moins (MODIFICATION) 7 À 10 jours de récupération sera respectée (MODIFICATION) SELON la chirurgie avant que les animaux ne soient soumis à un autre test de comportement.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. La souris est le modèle le plus courant en première intention pour évaluer les effets de candidats médicaments, et les données obtenues nous permettent maintenant de calculer les doses administrables à l'homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle animal et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette pathologie dans toute sa complexité. En effet, les animaux sont essentiels pour modéliser les mécanismes physiopathologiques de la SLA. Ils sont donc nécessaires pour évaluer l'efficacité des candidats médicaments. Au minimum 5 semaines pour la lignée TDP-43 et 12-13 semaines pour la lignée SOD1 au début de l’analyse comportementale. Dans ce projet, l’expérience et l’administration de traitements sont initiés à un moment où les animaux sont jeunes, avant le début des premiers symptômes pour pouvoir commencer à administrer le candidat médicament au moment où les premiers symptômes de la maladie apparaissent. Le génotypage est effectué chez le fournisseur à l'âge de 10 jours. Ils partiront de chez lui, après sevrage, à l'âge de 3-4 semaines pour la lignée TDP-43 (au minimum) et plus tardivement pour les souris SOD1 (au minimum 10 semaines).

Pour tester quatre peptides antimicrobiens sur des bactéries résistantes, 2700 souris vont être utilisées, dont 2220 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles sont infectées par des bactéries injectées, ce qui peut provoquer douleur, perte de poids et affaiblissement, avec suivi de la température par voie rectale. Les organes sont prélevés après mise à mort pour mesurer l'effet et la toxicité des molécules. Le porteur qualifie l'étape animale d'"indispensable" et affirme qu'"aucune méthode alternative n'est disponible", après avoir reconnu l'efficacité déjà obtenue in vitro.

Objectifs

Chaque année, en France et dans le monde, des milliers de patients présentent une infection à bactérie multi ou hautement résistante aux antibiotiques et les patients se trouvent souvent dans une impasse thérapeutique. Deux phénomènes ont été identifiés comme responsables de l’échec de traitement : la résistance et la récalcitrance aux antibiotiques. La résistance se définit par l’acquisition bactérienne de nouveaux mécanismes permettant leur croissance en présence d’antibiotiques. L'Organisation mondiale de la Santé (OMS) a publié un rapport stipulant que plus de 40 % des antibiotiques surveillés montrent une résistance accrue sur plusieurs types de bactéries . La résistance aux antimicrobiens est donc devenue un problème majeur de santé publique. Plusieurs études réalisées dans notre laboratoire ont prouvé l'efficacité in vitro de 4 nouveaux peptides anti-microbiens sur ces bactéries. Point majeur : aucune résistance bactérienne n’a pu être mise en évidence. Démontrer maintenant leur efficacité in vivo, dans un modèle murin d’infection représente une étape indispensable dans leur validation thérapeutique. La récalcitrance se définit par la capacité d’une population bactérienne, sensible à un antibiotique donné, à entrer en dormance, survivre au traitement et se remultiplier une fois le traitement arrêté, causant des rechutes infectieuses. Nous sommes capables au laboratoire d’induire de la récalcitrance et nous avons à notre disposition 10 couples isogéniques. Ces souches sont isolées de patients ayant développé une infection (souche initiale) puis une rechute (souche de rechute) après traitement antibiotique. De nouvelles données sur les changements phénotypiques transistoires dans la population bactérienne pourront être ainsi collectées et nous renseigneront sur les niches qui pendant l’infection, permettent à certaines bactéries normalement sensibles de survivre aux traitements antibiotiques, découlant sur des phénomènes de rechute et de récurrences infectieuses à l’arrêt du traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche représente une étape indispensable dans la validation de nouvelles molécules antibiotiques. L’antibiorésistance et la récalcitrance sont des phénomènes qui concernent à la fois la santé animale et la santé humaine. En France, chaque année 125 000 infections et 5 500 décès sont attribuables aux échecs de traitement des infections. Ce projet implique des bactéries pathogènes du groupe ESKAPE qui constituent un ensemble de bactéries conduisant à des infections nosocomiales qui, selon l’organisation mondiale de la santé (OMS), représente une menace planétaire du fait de leurs multiples résistances aux antibiotiques et leur diffusion au sein des hôpitaux. Une étude chez l’animal permettra d’analyser et d’envisager, dans un second temps, une étude d’évaluation de différents protocoles thérapeuthiques chez l’Homme. La recherche préclinique sur l'animal est en effet une étape indispensable, permettant de s'assurer que les médicaments ou les protocoles de soin sont sûrs et efficaces, avant de les proposer aux malades.

Procédures

Les gestes techniques pratiqués sur animal vigile sont : injection par voie peritoneale, injection par voie intraveineuse ou injection en sous-cutané, pesée ds animaux et prise de température rectale. Ces gestes ne durent que quelques secondes chacun, les injections sont limitées à un seul par animal et par jour.

Impact sur les animaux

L'injection de bactéries chez la souris peut provoquer de la douleur et de la souffrance. Elle peut engendrer également une baisse d'activité, une perte de poids et un affaiblissement général. Les doses de bactéries injectées seront calibrées pour minimiser ces effets. Les antibiotiques que nous utilisons dans le modèle de récalcitrance ont déjà été testés sur l’animal et ne provoquent pas d’effets secondaires

Devenir

Afin de caractériser l'effet de nos traîtements, notemment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les organes des animaux traîtés et non traîtés. Nous devons pour cela procéder à l'euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire des tissus des organes est indispensable pour évaluer les effets de nos nouvelles molécules ainsi que leur toxicité.

Remplacement

Les modèles ex vivo apportent des informations intéressantes puisqu’ils renseignent sur la capacité de ces molécules à être actives sur des bactéries cultivées in vitro. Mais ils ne permettent pas de renseigner sur l’évolution in vivo, donnée essentielle pour mesurer leur efficacité réelle. Dans cette étude, l’utilisation d’animaux est nécessaire en raison de la complexité du sepsis, qui affecte plusieurs organes en même temps. Pour bien comprendre cette maladie, il est indispensable d’étudier ses effets sur un organisme entier. Par ailleurs, les résultats obtenus chez les rongeurs, lorsqu’ils sont cohérents entre différents modèles, reflètent généralement bien ce qui se passe chez l’Homme. Aucune méthode alternative n'est disponible actuellement.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, nous nous sommes basés sur les travaux précédents menés dans notre laboratoire, ainsi que sur une analyse approfondie de la littérature scientifique sur cette maladie. Nous avons optimisé les prélèvements de tissus après l’euthanasie de chaque animal. De plus, nous avons effectué un test statistique appelé calcul de puissance (avec une puissance de 90 % et un seuil d’erreur de 5 %) pour déterminer précisément le nombre d’animaux nécessaires par groupe.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées: locaux confinés, portoirs ventilés, eau et nourriture ad libitum avec un maximum de 5 animaux par cage (Chaque animal est identifié à l’aide d'une bague numérotée). Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage sauf en cas d’agressivité ou si des soins particuliers sont nécessaires. De l'eau gélifié, du coton pour faire leur nid, des jouets type tunnel pourront être ajoutés dans la cage. Une attention particulière sera porté au bien-être des animaux tout au long de l'étude. Nous surveillerons régulièrement les rongeurs pour détecter toute douleur excessive. L’état physique, le comportement seront vérifiés visuellement. Le poids sera suivi à l’aide d’une balance. La température corporelle sera mesurée avec un thermomètre rectal adapté aux rongeurs. Le suivi quotidien, pendant 7 jours permettra d'avoir un contrôle continu sur leur état de santé.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle souris dans l’évaluation thérapeutique de nouvelles molécules est largement détaillée dans la littérature scientifique. Ce modèle simple est facilement reproductible. Les animaux seront âgés de 4 à 8 semaines. A ce stade de développement, les animaux sont de jeunes adultes avec un système immunitaire mature et une stabilisation de la croissance et du poids. Ce qui permet d'exclure des paramètres susceptibles d'interférer avec les résultats de l'expérimentation. Depuis plusieurs années un grand nombre d'études ont été publiées sur le sepsis en utilisant des rongeurs comme modèle animal. Leur utilisation nous permet de mieux situer nos résultats dans un contexte scientifique global. Ces modèles de rongeurs ont été largement étudiés, et l’on connaît bien leur cycle de vie ainsi que leurs éventuels impacts sur les expérimentations. Les rongeurs sont compatibles avec un large éventail de techniques pour analyser différents paramètres et mécanismes, y compris ceux que nous utiliserons dans cette étude. L’utilisation de souris est donc recommandée.

Souris humanisées et immunodéficientes, 100 d'entre elles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées, dont dix classées sévères. Chaque animal reçoit une greffe rénale sous anesthésie, des injections de la thérapie cellulaire testée et des prélèvements sanguins répétés. Le rejet du greffon peut provoquer perte de poids, œdèmes et détresse métabolique. Le porteur aligne des chiffres sur l'insuffisance rénale humaine, le bénéfice pour les patients restant au conditionnel et à long terme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre pourquoi le corps rejette un organe greffé et de développer des traitements pour éviter ce rejet. Nous étudions une approche thérapeutique innovante utilisant des macrophages, des cellules du système immunitaire, que nous modifions pour qu’elles aident l’organisme à accepter la greffe plutôt que de la rejeter. Notre équipe a déjà testé cette méthode en laboratoire, sur des cellules cultivées in vitro, et les premiers résultats sont encourageants. Cependant, avant d’envisager son utilisation chez l’humain, il est indispensable de la tester sur des modèles animaux. Les expériences en laboratoire ne permettent pas, en effet, de reproduire tout ce qui se passe dans un organisme vivant. Par exemple, elles ne montrent pas comment les macrophages modifiés se déplacent jusqu’au greffon, comment ils interagissent avec les autres cellules de l’organe greffé, ni comment les médicaments anti-rejet influencent ces processus. Ces tests sur des modèles animaux nous permettront donc de valider notre approche et de mieux comprendre ces mécanismes complexes, avant de pouvoir passer à des essais chez l’humain.

Bénéfices attendus

L’insuffisance rénale chronique est une des causes de décès qui augmente le plus rapidement dans le monde, touchant 850 millions de personnes en 2023. D’ici 2040, elle pourrait devenir la cinquième cause de mortalité mondiale. En France, cette maladie concerne environ 10 % de la population, dont 90 000 patients atteints d’insuffisance rénale terminale nécessitant soit une hémodialyse, soit une transplantation rénale. Bien que la transplantation rénale améliore nettement la qualité de vie des patients, son efficacité est limitée par le rejet de greffe. Pour prévenir ce rejet, les patients doivent suivre un traitement immunosuppresseur quotidien qui inhibe leur système immunitaire. Cependant, malgré ces traitements, les rejets à long terme restent fréquents. Environ 45 % des greffons cessent de fonctionner après 10 ans, et ce taux n’a pas diminué depuis 20 ans. Cela s’explique en partie par le fait que les traitements actuels présentent une toxicité rénale à long terme. Notre projet a pour objectif principal de tester in vivo une nouvelle thérapie cellulaire basée sur le macrophage dans le rejet des greffes, notamment en explorant leurs récepteurs spécifiques. À moyen terme, ce travail fournira des informations clés sur les mécanismes impliqués. En optimisant la survie des greffons, ce projet pourrait significativement améliorer la durée de vie des greffes rénales à long terme et, par conséquent, la qualité de vie des patients.

Procédures

Greffe rénale sous anesthésie générale et analgésie en condition aseptique (30 minutes). Les souris vigiles subiront une injection intraveineuse (douleur légère et de courte durée) pour recevoir la thérapie cellulaire et/ou l’immunosuppression. Un prélèvement de sang à J2, J4 et J7 et 1 fois par semaine ensuite en changeant de côté à chaque fois sera effectué au niveau mandibulaire pour suivre la fonction du greffon rénale.

Impact sur les animaux

La greffe rénale est considérée comme une procédure de gravité modérée. Le rejet du greffon rénal peut entraîner une détérioration importante de l’état général de l’animal. Cela se manifeste notamment par une perte de poids, une accumulation anormale de liquides et de sel dans l’organisme (pouvant provoquer des gonflements ou des difficultés respiratoires), des démangeaisons, ainsi que des signes de détresse métabolique, tels qu’une augmentation des déchets toxiques dans le sang (urémie) ou une déshydratation. Par ailleurs, les contentions répétées, nécessaires pour le suivi post-opératoire (injections, prélèvements sanguins, évaluation clinique), sont susceptibles d’induire un stress modéré chez les souris vigiles, pouvant aggraver leur état physiologique et comportemental.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées pour prélèvement des organes et analyses.

Remplacement

Pour étudier le fonctionnement du système immunitaire lors de greffes, de traitements contre le rejet ou de l’utilisation de médicaments qui modulent l’immunité, il est indispensable d’utiliser un modèle animal, en particulier un mammifère doté d’un système immunitaire complexe. Les expériences sur des cultures cellulaires en laboratoire apportent des informations utiles, mais elles ne suffisent pas à reproduire la complexité du système immunitaire tel qu’il fonctionne dans un organisme vivant. Le modèle animal est donc essentiel pour vérifier que les thérapies développées dans ce projet sont réellement efficaces, car il inclut tous les acteurs cellulaires qui interagissent dans des conditions naturelles.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans nos expériences est calculé avec précision grâce à un outil en ligne appelé EDA (Experimental Design Assistant). Cet outil, développé par le NC3Rs, une organisation scientifique basée au Royaume-Uni, aide les chercheurs du monde entier à appliquer les principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner). En suivant les standards recommandés pour les études sur les animaux, l’EDA calcule le nombre minimum nécessaire d’animaux pour obtenir des résultats fiables. Il s’assure que nous pourrons mettre en évidence l’efficacité de nos traitements tout en limitant autant que possible l’utilisation d’animaux.

Raffinement

Les souris humanisées issues d’un fond immunodéficient seront maintenues dans des cages avec couvercles filtrants pour les protéger des infections. Toutes les manipulations sont effectuées sous un poste microbiologique stérile pour garantir leur sécurité. Lors de la greffe rénale (procédure de gravité modérée), la gestion de la douleur comprend une anesthésie générale et une analgésie pendant et après l’intervention chirurgicale. Un suivi quotidien avec des critères précis (points limites) est mis en place pour surveiller leur état durant cette période. Pour réduire le stress physique, les souris reçoivent une alimentation sous forme de gel hydraté déposé au fond de la cage pour faciliter leur accès à la nourriture et à l’eau. Les animaux sont dès que les points limites définis dans la procédure sont atteints, garantissant leur bien-être autant que possible.

Choix des espèces

La Souris est un modèle de choix dans ce projet pour plusieurs raisons. Son système physiologique est très proche de celui de l’humain, ce qui permet d’étudier les réponses immunitaires et d’évaluer des thérapies cellulaires dans des conditions représentatives. Par rapport à d’autres espèces, la Souris présente des avantages pratiques et scientifiques. Elle est petite, facile à manipuler et nécessite moins d’espace et de ressources que des modèles plus grands comme les primates ou les porcs. De plus, les modèles murins utilisés dans ce projet sont validés par la communauté scientifique internationale, garantissant leur pertinence pour des études de pointe. Ils offrent une combinaison unique de complexité biologique, accessibilité expérimentale et pertinence pour des applications cliniques, ce qui les rend particulièrement adaptés aux recherches sur les thérapies innovantes. Enfin, la Souris est l’une des espèces les mieux caractérisées génétiquement. Les outils de modification génétique disponibles pour cette espèce sont très avancés, permettant de créer des modèles sur mesure adaptés à des questions de recherche spécifiques. Par exemple, des souris immunodéficientes sont utilisées ici pour étudier les thérapies cellulaires humaines en leur injectant des cellules souches humaines. Cela permet de recréer un environnement proche du système immunitaire humain, ce qui serait difficilement réalisable chez d’autres espèces. Ici, des souris immunodéficientes âgées de 6 semaines au maximum seront utilisées pour l’injection des cellules souches car le développement du système immunitaire humain prend environ 11 semaines post injection