Procédures sévères

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux chirurgies successives d'une heure leur infligent une lésion haute de la moelle épinière, suivies de 48 heures d'hébergement individuel sans enrichissement, d'un test moteur sur tapis roulant et, pour la moitié d'entre eux, de vingt sessions de dysréflexie autonome provoquée en environnement restreint. Le porteur décrit des difficultés locomotrices du train arrière, une tachycardie et une hypotension orthostatique, et affirme que les crises d'hypertension provoquées n'induisent pas de douleur puisque les stimuli se situent sous la lésion. Sur le remplacement, il indique qu'aucun modèle ne permet de prédire les effets d'une telle lésion, et sur la réduction que le capteur de télémétrie permet de cribler toutes les molécules sur chaque rat.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière posent un véritable défi médical, en particulier parce qu’elles touchent souvent des personnes jeunes en bonne santé. Si les pertes de mouvements ou de sensations sont bien connues, on parle moins souvent des troubles du système nerveux autonome qu’elles entraînent. Parmi eux, la dysréflexie autonome est l’un des plus graves : il s’agit de crises soudaines de très forte tension artérielle, souvent accompagnées d’un ralentissement du cœur, qui peuvent mettre en danger la vie du patient. Ces épisodes, imprévisibles et difficiles à maîtriser, nuisent fortement à la qualité de vie. Des recherches chez le rat ont montré que certaines molécules agissant sur les systèmes de communication du cerveau, notamment celui impliquant la sérotonine, peuvent améliorer la récupération motrice. Or, ce même système joue aussi un rôle dans la régulation du cœur et de la pression artérielle. Nous avons donc élargi notre approche pour tester si ces traitements pouvaient aussi agir sur les fonctions autonomes. Les premiers résultats sont encourageants : en plus de l’amélioration des mouvements, on observe une régulation partielle de la pression artérielle au repos. Mais cela ne suffit pas : pour vraiment évaluer l’efficacité d’un traitement, il faut aussi le tester dans des situations où le système nerveux est fortement sollicité, comme pendant une crise de dysréflexie. Ces crises traduisent un déséquilibre brutal du système nerveux autonome, en l’absence de contrôle normal venant du cerveau. En testant des traitements dans ce contexte, nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes impliqués, à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques, et à terme, à prévenir ces crises dangereuses. L’objectif est clair : améliorer la stabilité et la sécurité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Les lésions situées dans la partie haute de la moelle épinière ont un impact majeur sur la vie des personnes concernées. En plus des paralysies et pertes de sensation bien connues, elles provoquent aussi des troubles importants du système cardiovasculaire. Parmi eux, la dysréflexie autonome — une réaction excessive et incontrôlée du système nerveux — peut parfois mettre en danger la vie du patient. Certaines molécules qui agissent sur les voies de communication du cerveau, notamment celles impliquant la sérotonine, ont montré qu’elles pouvaient limiter certains effets liés à ces lésions. À court terme, notre objectif est d’améliorer l’état général des patients en stabilisant leur tension artérielle et en diminuant la gravité de ces crises. Cette approche ouvre la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour mieux accompagner les personnes vivant avec une lésion de la moelle épinière.

Procédures

80 animaux seront soumis à 2 chirurgies successives de maximum 1h chacune. Ils seront soumis ensuite à un hébergement individuel sans enrichissement pendant 48h pour permettrait leur traitement post-lésionnel, puis encore 5 jours pour suivre leur reprise de la fonction disgestive. 15 jours après la 2ème chirurgie, ils seront soumis à un test de scoring moteur de 3 minutes sur un tapis roulant. Enfin encore 1 semaine après, 40 animaux seront isolés temporairement 1h maximum tous les jours où ils subiront des épisodes de dysreflexies autonomes (réponse spinale reflexe entrainant une hypertension et une bradycardie). Ces sessions seront au maximum de 20. 40 autres animaux ayant subit les 2 chirurgies seront aussi hébergés temporairement seuls pour subir des épisodes de dysreflexies autonomes, pendant 2h maximum mais un seul jour. Ces mêmes rats seront injectés quotidiennement (moins d’une minute) en sous-cutanée et sous lésionnel (traitement chronique). Enfin, ils subiront 4 sessions d’1h30 d’enregistrement où leur fréquence cardiaque intrinsèque sera enregistrée entrainant un stress et un inconfort transitoire.

Impact sur les animaux

La première chirurgie peut induire une douleur transitoire pendant les jours suivant l’intervention, malgré une analgésie. Puis la lésion de la moelle épinière (2ème chirurgie) va induire chez les animaux les mêmes problèmes que ceux rencontrés par les patients ; des difficultés locomotrices du train arrière pouvant être largement compensées par les pattes avant et une cage d'hébergement adaptée en hauteur et des problèmes cardiovasculaires (tachycardie et hypotension orthostatique). Les sessions de dysréflexie ne doivent pas induire de douleurs (stimuli sous la lésion – absence d’intégration sensorielle) mais induisent un stress limité (environnement restreint pendant 30 minutes) et peuvent entraîner un inconfort lié à la réponse spinale reflexe associée à une bradycardie et une hypertension transitoire. Les injections quotidiennes ne devraient pas induire de nuisances car sous lésionnelle. Par contre les 4 sessions pour évaluer l’implication des systèmes autonomes dans les paramètres cardiovasculaires (test dit de la balance) peuvent induire du stress ou de l’inconfort pour les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort après chaque procédure. Nous avons besoin des tissus pour faire des analyses immunohistochimiques d'organes cibles

Remplacement

Ce projet éthique s’inscrit dans un programme de recherche plus large. Des premières études ont montré que certaines voies de communication entre les neurones, notamment celles impliquant des messagers comme la sérotonine, jouent un rôle dans les troubles cardiovasculaires observés après une lésion haute de la moelle épinière. Ces systèmes de régulation sont complexes, car ils font intervenir de nombreux types de récepteurs, présents à la fois dans le cerveau et dans le reste du corps. À ce jour, il n’existe pas de modèle permettant de prédire précisément les effets de ce type de lésion sur ces mécanismes.

Réduction

Nous avons déterminé le n des lots en fonction des premiers résultats obtenus dans de précédents projets et grâce à la bibliographie. Nous ferons des séries de 6 animaux maximum afin de pouvoir évaluer au fur et à mesure les données et ne pas avoir à utiliser plus d'animaux que nécessaire. L’utilisation du capteur de télémétrie permet de faire le criblage de l’ensemble des molécules sur chacun des rats et donc de réduire le nombre utilisé.

Raffinement

Les soins apportés aux animaux après la chirurgie (lésion de la moelle épinière) s’appuient sur notre expérience et sur des recommandations publiées par d’autres équipes travaillant sur des modèles similaires. Ces soins ont été validés par la structure de bien-être animal et l’équipe vétérinaire. L’anesthésie est réalisée par voie gazeuse et une analgésie multimodale est mise en place lors des deux interventions chirurgicales, combinant des médicaments morphiniques, des anti-inflammatoires et des anesthésiques locaux. Un traitement contre la douleur est ensuite maintenu pendant au moins trois jours. Après la lésion, les cages ont été spécialement aménagées pour tenir compte de la paralysie : abreuvoirs et mangeoires à hauteur accessible, tapis antidérapants pour faciliter les déplacements, alimentation liquide pendant les quatre premiers jours pour limiter les troubles digestifs, et vidange manuelle de la vessie plusieurs fois par jour selon l’état de récupération. Une antibiothérapie est également administrée pour prévenir les infections urinaires. Des points limites stricts, validés par l’équipe vétérinaire, permettent de suivre étroitement l’état des animaux. Dans le cadre de l’étude des dysréflexies autonomes, nous avons choisi d’utiliser de petites cages plutôt que les tubes de contention classiquement décrits, afin de réduire le stress pendant les enregistrements. Enfin, toutes les injections quotidiennes sont réalisées sous le niveau de la lésion pour éviter toute douleur ou inconfort.

Choix des espèces

Le rongeur est un modèle dont la physiologique reste malgré ses différences proches de celle l'humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies. De plus il existe de nombreux points communs entre le rat et l'humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Enfin nous avons choisi le même modèle que sur l'ensemble des précédents projets éthiques Les animaux doivent être adultes pour le projet. De plus, le founisseur de capteur des mesures cardiovasculaires impose un poids minimum de 225-275gr à l'implantation (soit à 7/8 semaines d'âge environ) permettant au capteur d'être supporté par l'animal (ratio poids capteur/poids de l'animal).

Jusqu'à 30 % des souris pourraient devoir être retirées de l'étude avant son terme, atteintes d'une inflammation pulmonaire, de difficultés respiratoires, d'une perte de poids ou d'un affaiblissement général. 280 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Une instillation unique sous anesthésie déclenche la fibrose, suivie de cinq à six injections espacées de trois jours, d'une ponction sanguine et de collectes d'urine hebdomadaires. Le porteur annonce des effets bénéfiques persistant plusieurs mois chez des souris âgées et espère prévenir des maladies humaines liées au vieillissement, quand la fibrose pulmonaire est ici provoquée volontairement chez chaque animal.

Objectifs

Des études récentes ont montré que certaines cellules abîmées par le vieillissement (cellules sénescentes) peuvent s’accumuler dans les tissus, notamment les poumons, et qu’elles échappent à la surveillance du système immunitaire. Un traitement expérimental a permis de réactiver les défenses immunitaires contre ces cellules dans des modèles de fibrose pulmonaire, une maladie qui entraîne une perte progressive de la fonction respiratoire. Ce traitement a permis de réduire l’accumulation de ces cellules, d'améliorer la fonction des défenses naturelles de l’organisme, et de ralentir, voire d’inverser, l’évolution de la maladie. Chez des souris âgées, les effets bénéfiques ont persisté plusieurs mois après l’arrêt du traitement, suggérant que le système immunitaire avait conservé une forme de "mémoire". Hypothèse : Ce traitement pourrait entraîner une réponse immunitaire de longue durée, en apprenant à l’organisme à reconnaître et éliminer les cellules endommagées liées au vieillissement. Objectif expérimental : Tester si des cellules immunitaires prélevées sur des animaux ayant reçu ce traitement peuvent, une fois transférées à d’autres animaux, les protéger contre une nouvelle atteinte pulmonaire provoquée. L’objectif final est de mieux comprendre comment stimuler les défenses de l’organisme pour prévenir ou ralentir certaines maladies liées à l’âge. Cette approche pourrait à terme déboucher sur de nouvelles stratégies thérapeutiques pour des maladies chroniques comme la fibrose ou certains cancers.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre comment le système immunitaire réagit face aux cellules endommagées qui s’accumulent avec l’âge dites cellules sénescentes. Elle aidera à clarifier les mécanismes par lesquels ces cellules sont reconnues, ciblées et éliminées, notamment dans le contexte de maladies chroniques liées au vieillissement. Les résultats obtenus pourraient aussi montrer si un traitement capable de renforcer cette réponse immunitaire pourrait être utilisé pour prévenir ou ralentir certaines maladies associées à la sénescence. À terme, cette approche pourrait contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour mieux vieillir en bonne santé.

Procédures

Chaque animal sera soumis aux interventions suivantes : • Instillation: 1 fois, durée < 5 minutes (sous anesthésie). • Traitement ou anticorps : jusqu’à 5 ou 6 injections selon les groupes, espacées de 3 jours, durée < 1 minute par injection. • Ponction sanguine : 1 fois par procédure, 200 µL maximum, durée estimée : 3 à 5 minutes. • Collecte d’urine : 1 fois par semaine, durée maximale 5 minutes, sans contention forte. • Pesée et observation clinique : 1 fois par semaine (ou quotidiennement pendant les périodes critiques), durée estimée : 1 minute par animal. • Manipulations pour transfert cellulaire (dans le cas de la procédure 2) : 1 injection intraveineuse unique, durée < 5 minutes. Chaque intervention est réalisée par du personnel expérimenté, dans le respect du bien-être animal.

Impact sur les animaux

L’administration du produit qui provoque la maladie peut entraîner une inflammation pulmonaire importante, à l’origine de difficultés respiratoires, d’une perte de poids ou d’un affaiblissement général. Dans certains cas, ces atteintes peuvent obliger à retirer l’animal de l’étude avant la fin, en respectant les seuils de souffrance définis. D’après notre expérience et les publications sur ce modèle, jusqu’à 30 % des animaux pourraient être concernés. Les injections nécessaires au traitement, tout comme les prélèvements urinaires ou sanguins, peuvent provoquer un stress modéré lié à la contention. Des inflammations locales (au site d’injection) ou un risque faible d’infection (après prélèvement de sang) sont également possibles. Pour limiter ces effets indésirables, des mesures de suivi et de confort seront mises en place tout au long du protocole : manipulation douce, surveillance quotidienne, arrêt immédiat en cas de signes de souffrance, et matériel stérile pour toutes les procédures.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude. Cela est nécessaire pour pouvoir récupérer leurs organes et analyser les effets du traitement sur les tissus. Ces analyses permettront d’évaluer la gravité des lésions pulmonaires, d’observer les cellules immunitaires présentes, et de mieux comprendre les mécanismes liés au vieillissement. Ce type d’étude ne peut pas être réalisé sur des animaux vivants. Nous veillerons à limiter la souffrance en suivant les points limites et la fiche de score décrite et en assurant une surveillance étroite tout au long du protocole.

Remplacement

Avant d'utiliser des animaux, nous avons testé le traitement sur des cellules en laboratoire. Ces tests ont montré un effet prometteur. Cependant, pour comprendre l’effet global du traitement sur le système immunitaire dans un organisme vivant, il est indispensable d’utiliser un modèle animal. Aucune méthode alternative ne permet aujourd’hui d’étudier cette complexité de manière fiable.

Réduction

Pour cette étude, nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Cela garantit des résultats fiables, tout en minimisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : Nous mettons en place plusieurs mesures pour réduire la douleur, le stress et la souffrance : Suivi quotidien : Les animaux seront observés chaque jour à l’aide d’une grille clinique. En cas de dégradation de leur état, la fréquence du suivi sera augmentée. Cohésion sociale : Les animaux seront hébergés par petits groupes compatibles, afin de préserver leur bien-être social tout au long de l’étude. Habituation : Une phase d’habituation à la manipulation est prévue avant les interventions, afin de limiter le stress lors des gestes expérimentaux. Points limites précoces : Des seuils d’arrêt clairement définis seront appliqués dès l’apparition des premiers signes de souffrance, pour éviter toute douleur inutile. Suivi longitudinal : Un suivi dans le temps permettra de détecter précocement d’éventuels signes de mal-être, notamment par le contrôle du poids, du comportement et de l’état général. Alimentation adaptée : En cas de difficultés de déplacement ou de prise alimentaire, de la nourriture humidifiée sera mise à disposition directement dans la cage. Enrichissements supplémentaires : matériaux à manipuler (copeaux de bois compacts) et des objets à déplacer (bâtonnets). Utilisation d'une méthode d'anesthésie (la plupart des animaux expérimentaux). Toutes ces mesures sont mises en place pour limiter la souffrance, améliorer le confort des animaux, et garantir des conditions expérimentales éthiques et rigoureuses.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus adaptée pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Elle présente une organisation physiologique proche de celle de l’être humain, notamment au niveau des poumons et du squelette, ce qui permet de reproduire fidèlement certaines pathologies liées à l’âge, comme la fibrose pulmonaire. Son cycle de vie court constitue un atout majeur : un animal est considéré comme âgé à partir de 18 mois, ce qui permet d’étudier rapidement les effets du vieillissement dans un contexte contrôlé. Les mécanismes de réparation et de dérégulation des tissus sont bien décrits chez la souris, et de nombreux outils existent pour analyser les cellules immunitaires et sénescentes au cours de l’évolution des maladies. Ce modèle permet donc une approche globale, intégrant à la fois les réponses immunitaires, l’accumulation de cellules vieillissantes et la progression des atteintes tissulaires. Le marqueur ciblé par le traitement testé dans ce projet est présent de façon identique chez la souris et chez l’humain, ce qui renforce la pertinence du modèle et facilite l’interprétation et le transfert des résultats vers la recherche clinique. De plus, la souris dispose d’un système immunitaire bien connu, avec de nombreux réactifs et outils disponibles, ce qui est indispensable pour étudier les réponses de l’immunité innée induites par les cellules sénescentes. Enfin, la large disponibilité d’outils biotechnologiques (souches transgéniques, analyses cellulaires, tests moléculaires) fait de la souris un modèle de référence pour explorer les mécanismes du vieillissement et les stratégies thérapeutiques ciblant ses effets.

1 242 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant recevoir jusqu'à douze injections de complexes ARN et dix-huit injections directement dans la tumeur. L'implantation tumorale se fait sous la peau du flanc au trocart de 3 mm, suivie de séances d'imagerie par fluorescence de quinze à trente minutes sous anesthésie gazeuse et d'un prélèvement de sang à la veine mandibulaire sur animal vigile. Le porteur décrit des ulcérations cutanées possibles, des pertes de poids, de la prostration et un risque accru d'hypothermie lié aux anesthésies répétées, les souris nude étant par ailleurs plus vulnérables aux infections. Toutes sont tuées par dislocation cervicale pour prélever tumeurs et organes, quand le bénéfice annoncé se limite à l'hypothèse que la stratégie, si elle fonctionne, pourrait ensuite être testée sur d'autres cancers.

Objectifs

Le cancer demeure une pathologie complexe et difficile à traiter. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amenés à développer des traitements personnalisés à base d’ARN, car l'utilisation de petits ARN interférents et de petits ARN d'activation pour réguler l’expression des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeur émerge comme un traitement précis et efficace. Dans ce projet, nous allons étudier des traitements anticancéreux utilisant ces ARN, qui sont transportés par des nanoparticules appelées dendrimères, via des petites vésicules naturelles produites par les cellules tumorales in situ, afin d’améliorer la pénétration dans la tumeur. Objectifs spécifiques : 1.Évaluer la toxicité des ARN/nanoparticules complexes 2.Observer comment ces complexes se déplacent dans le corps et s’accumulent dans les tumeurs 3.Tester l’efficacité de ces traitements chez des souris ayant une tumeur principale 4.Tester leur efficacité chez des souris avec des tumeurs métastatiques 5.Étudier comment ces traitements se déplacent entre les tumeurs principales et secondaires dans le corps via les vesicules transporteurs. La réalisation de ces objectifs nous permettra de développer et de valider la thérapie anticancéreuse basée sur des acides nucléiques, délivrés par des nanoparticules exploitant les vésicules-transporteurs générées in situ.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est l'évaluation et la validation d'un nouveau traitement pour le cancer, une maladie très complexe et difficile à traiter. Si notre stratégie thérapeutique se révèle efficace sur ces modèles tumoraux, nous pourrions envisager de tester cette approche sur d'autres cancers résistants à la thérapie actuelle, ou sur d'autres maladies pour lesquelles il n'existe pas de traitement efficace.

Procédures

-Surveillance des souris et mesure des tumeurs (durée : 5 à 10 minutes par séance). - Prélèvement sanguin par ponction de la veine mandibulaire, une seule fois par animal en état vigile, dédié à l’évaluation spécifique de la toxicité des complexes ARN/nanoparticules (durée : 5 à 10 minutes). -Injections sous- cutanées ou intraveineuses, sous anesthésie gazeuse, des complexes ARN/dendrimère pour le traitement des tumeurs (2 fois par semaine, pendant 2 à 6 semaines selon le protocole, durée : environ 2 minutes par injection). - Injections intra-tumorales de l’inhibiteur de vésicules extracellulaires (3 fois par semaine, pendant 2 à 6 semaines selon le protocole, durée : environ 2 minutes par injection). -Contention et injection intrapéritonéale d’agent utilisé pour visualiser la tumeur (2 injections par souris, dédiées aux procédures spécifiques nécessitant cet agent, durée : environ 5 minutes par injection). -Intervention chirurgicale pour l’établissement du modèle de xénogreffe tumorale sous-cutanée (durée : 30 à 60 minutes, sous anesthésie). -Imagerie par fluorescence des tumeurs, réalisée chez les souris sous anesthésie gazeuse, avec une durée d’environ 15 à 30 minutes par séance. -Euthanasie des animaux par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse en fin d’étude, procédure terminale (durée : 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sur les animaux comprennent les implantations de tumeurs effectuées en sous-cutané au niveau du flanc, sous anesthésie, à l’aide d’un trocart de 3 mm de diamètre. Le développement de tumeurs sous-cutanées peut générer un certain inconfort ou être la source d’ulcérations cutanées. Les injections de cellules cancéreuses en IV pour générer un modèle de cancer métastatique, ainsi que les injections de molécules en IP ou en IV et la prise de sang, peuvent générer une douleur. Ces traitements peuvent provoquer différentes manifestations du phénotype dommageable, telles que : diminution du poids, prostration, altération de l’état général ou troubles de la mobilité. La contention de l’animal vigile nécessaire pour les diverses injections, les mesures des volumes tumoraux ou la prise de poids corporel, ainsi que les anesthésies répétées, peuvent être des facteurs de stress supplémentaires, avec un risque accru d’hypothermie ou de dépression respiratoire. De même, les injections intra-tumorales de l’inhibiteur sont susceptibles de provoquer une nuisance locale transitoire. Il est également pris en compte que les souris NUDE, en raison de leur immunodéficience, présentent une vulnérabilité accrue aux infections et au stress expérimental, ce qui contribue à leur phénotype intrinsèquement sensible et justifie une surveillance rapprochée tout au long des procédures expérimentales.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de permettre la récupération d’organes, ainsi que des tumeurs, en vue d’analyses biochimiques et histopathologiques nécessaires à l’évaluation des effets des traitements étudiés.

Remplacement

Bien que nous ayons déjà utilisé des modèles cellulaires 2D et 3D, l’utilisation de la souris reste essentielle pour comprendre les mécanismes d’action dans un organisme entier, y compris des éléments comme l’environnement autour de la tumeur et la manière dont le traitement se répartit dans le corps, qui ne peuvent pas être reproduits en laboratoire.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au strict minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, les tumeurs et organes des souris seront conservés afin de permettre des analyses complémentaires.

Raffinement

À leur arrivée, les souris bénéficieront de 10 jours d’acclimatation avec familiarisation à la manipulation afin de réduire le stress et favoriser l’adaptation à leur nouvel environnement. Elles seront hébergées en groupes sociaux avec un environnement enrichi (papier, dôme de cellulose, coton), litière changée chaque semaine, eau et nourriture ad libitum, afin de préserver leur bien-être et limiter les effets négatifs liés à l’isolement ou au stress. Toutes les procédures expérimentales (implantation tumorale, traitements, imagerie, prélèvements sanguins) seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse pour minimiser douleur et stress. Les animaux seront maintenus au chaud jusqu’au réveil pour prévenir toute hypothermie. Si nécessaire, une analgésie appropriée sera administrée par voie sous-cutanée et complétée, si besoin, par une prise continue via l’eau d’abreuvement, afin d’assurer un confort durable des animaux. Un suivi quotidien sera assuré, avec un examen clinique approfondi deux fois par semaine (ou plus si nécessaire), permettant de repérer précocement toute manifestation du phénotype dommageable (diminution du poids, prostration, altération de l’état général, troubles de la mobilité ou inconfort local). Une grille de score permettra d’évaluer la souffrance, de repérer les points limites et de définir la conduite à tenir, garantissant ainsi que tout effet indésirable soit pris en charge rapidement et efficacement.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère facilement manipulable, avec une durée de vie courte qui permet le développement rapide de tumeurs. Ce projet, utilisant des cellules cancéreuses humaines, nécessite des souris immunodéficientes pour éviter le rejet lors des xénogreffes. Ces souris qui sont des modèles bien établies en cancérologie expérimentale et qui ont fait l’objet de plusieurs centaines de publications, permettent la prise des xénogreffes de tumeurs, le maintien des caractéristiques moléculaires des tumeurs, et d’étudier au sein d’un organisme entier la stabilité et l’efficacité des molécules Les animaux auront 5 semaines à leur réception (>20 g), afin d’obtenir des souris adultes, en bonne santé, et jeunes pour éviter le rejet de greffe. Un délai d’acclimatation de 10 jours est prévu pour l’adaptation. À l’issue, les souris auront entre 6 et 7 semaines.

Conditionnés à boire de l'alcool au cours de près de 80 sessions de trente minutes, 240 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils vivent seuls en cage individuelle de 129 à 138 jours, subissent une chirurgie du cerveau en deux sites, puis quatre injections intracérébrales à deux jours d'intervalle. Six sessions associent la recherche d'alcool à un signal désagréable, pour séparer les rats qui continuent de boire malgré ce signal de ceux qui s'arrêtent. 192 sont tués pour prélever leur cerveau, et le porteur prévoit d'orienter les 48 autres, ceux qui n'ont pas montré assez d'appétence pour l'alcool, vers des formations à l'expérimentation animale.

Objectifs

Démontrer qu’en modulant spécifiquement l’activité de certaines populations de neurones sensibles à la dopamine (une substance active du cerveau) dans le cerveau par des approches génétiques et pharmacologiques chez le rat - on peut moduler une prise compulsive d’alcool (une consommation irrépressible d’alcool en dépit des conséquences négatives que ces prises d’alcool peuvent avoir sur l’individu).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de comprendre une partie des mécanismes liés à la prise compulsive d’alcool en lien avec le rôle de deux neurotransmetteurs (le GABA et le Glutamate) dans le cerveau. La prise compulsive d’alcool est à la base de nombreux troubles psychiatriques et comprendre son fonctionnement est un préalable indispensable au développement de stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces.

Procédures

La production des animaux transgéniques nécessitera une biopsie de tissu. La recherche envisagée s’étale sur une durée d’environ 20 semaines. Des rats adultes seront conditionnés à consommer de l’alcool de façon compulsive au cours d’un total cumulé de près de 80 sessions de 30 minutes chacune. Après habituation à consommer de l’alcool (environ 60 sessions), 6 sessions seront associées à des stimuli pour associer la recherche d’alcool à un signal négatif et ainsi distinguer les rats compulsifs ne pouvant pas stopper leur consommation d’alcool malgré ce signal, de ceux non compulsifs. Des animaux utilisés dans ce projet auront une chirurgie du cerveau (sous analgésie et anesthésie générale en deux sites, pour une durée d’opération n’excédant pas 40 minutes) qui, permettront au bout de trois semaines, d’injecter à 4 reprises (une fois tous les 2 jours) des drogues permettant d’étudier les mécanismes de régulation de la prise compulsive d’alcool (durée d’injection n’excédant pas 5 minutes). Les animaux seront hébergés en cages individuelles au cours de cette recherche pour une durée de 129 à 138 jours.

Impact sur les animaux

L’effet du modèle de consommation d’alcool que nous allons utiliser et l’hébergement individuel des animaux pour cette expérimentation induisent des effets indésirables chez l’animal, augmentant son niveau d’anxiété mais n’induisant pas par exemple de symptômes physiques de manque. Des nuisances sont attendues liées à la procédure de chirurgie, la procédure d’injection intracérébrale aiguë et à la procédure des stimuli aversifs. Des effets indésirables sont également attendues pour ce qui est des injections dans l’abdomen et/ou sous-cutanées des traitements antalgiques et anesthésiques.

Devenir

Les animaux ayant suivi l'ensemble des expériences auxquels ils sont destinés seront tous mis à mort afin de prélever les cerveaux pour analyses. Cependant, dans notre projet, nous estimons à vingt pour cent au maximum les animaux ne satisfaisant pas au critère comportemental (appétence pour l'alcool) nécessaire à la poursuite des expériences. Ceux-ci seront proposés pour être réutilisés dans le cadre de formations à l’expérimentation animale ou autre formation d’enseignement. La décision sera prise en concertation avec le vétérinaire réfèrent et/ou un membre de la Structure chargée du Bien Être des Animaux

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettront l’évaluation d’un comportement compulsif de prise d'alcool (comportement pour lequel on observe une continuation de la prise en dépit des conséquences négatives, un des critères de l’addiction).

Réduction

Chez les animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool différents scores d’activité́ comportementale seront relevés et en fin d'expérimentation, après la mise à mort des animaux, les cerveaux seront prélevés pour être analysés. Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe estimé sur la base de procédures similaires. Pour une question d’organisation et de gestion des expérimentations, l’ensemble des animaux dont nous étudierons le comportement compulsif à la prise d’alcool sera traité au cours de sessions distinctes et successives pour n’avoir à suivre simultanément qu’un nombre restreint d’animaux à la fois.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans les conditions répondant aux critères légaux relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Nous serons cependant obligés de les maintenir en hébergement individuel par rapport à la procédure expérimentale, mais en cages ouvertes, ce qui limitera toutes nuisance associée à un isolement plus strict. Ils seront hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations (pendant une semaine) afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux contentions et aux manipulations. Les chirurgies du cerveau seront réalisées sous anesthésie générale, après analgésie préalable des sites d’incision. Les yeux seront protégés du dessèchement par application d’un gel ophtalmique. La température de l’animal sera maintenue constante par une couverture chauffante. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Des injections d’eau glucosée seront réalisées pour faciliter le processus de récupération post-chirurgical. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par un antalgique. L’intégrité du processus cicatriciel en post-opératoire sera renforcé par application d’une solution iodée après suture de la peau. A leur réveil les animaux seront retournés dans leur cage. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites adaptés permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être animal.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce adéquate car il existe un degré́ de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux de neurones sur lesquels portent notre étude, tant du point de vue anatomique que physiologique. Les registres comportementaux explorés sont facilement appréhendables dans cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (de 8 à 10 semaines, de 200 à 240 g), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui pourront, pour certaines, prendre plusieurs mois.

Des cellules de glioblastome sont implantées dans le cerveau de chaque animal, puis la tumeur est en partie retirée par une seconde chirurgie, avant cinq jours de radiothérapie et quatre à cinq semaines de chimiothérapie. 384 souris et 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la tumeur peut s'accompagner de nécrose, de cachexie et de perte de poids, et que les molécules testées, nouvelles par définition, peuvent produire des effets délétères inconnus. L'objet réel est de comparer les anesthésiques employés pendant la chirurgie du glioblastome, et le résumé annonce un suivi des signes cliniques et des points limites liés à la croissance tumorale et à la radiothérapie sans en donner un seul seuil.

Objectifs

Le glioblastome (GB) est une tumeur cérébrale primaire de très mauvais pronostic. Le traitement standard comprend une résection chirurgicale suivie d’une combinaison de radiothérapie et chimiothérapie et enfin de plusieurs cycles de chimiothérapie. Malgré ce traitement agressif, la rechute est quasi systématique, conduisant à une survie médiane des patients de l’ordre de 18 mois post-diagnostique. La procédure chirurgicale implique une anesthésie générale qui est classiquement réalisée avec le propofol. Il existe actuellement une forte interrogation sur les effets de l’anesthésie sur l’évolution de la pathologie cancéreuse et, par conséquent, le choix du protocole d’anesthésie à utiliser dans ce contexte. Les études cliniques sont peu nombreuses et souvent rétrospectives. En revanche, les études précliniques qui sont de plus en plus nombreuses semblent souligner un effet antitumoral du propofol. Le domaine de l’onco-anesthésie a débuté par des études cliniques rétrospectives critiquables méthodologiquement et des études in vitro qui ont mis en évidence de propriétés antitumorales du propofol dans différents types de tumeurs). Dans cette étude, nous souhaitons associer cet anesthésique à nos inhibiteurs afin de voir le gain de survie sur des animaux ayant subit la même prise en charge que les patients.

Bénéfices attendus

Les glioblastomes sont responsables de nombreux décès, à ce jour, une résection de tumeurs avec un traitement adapté permet une survie des patients de 6.9 à 14.6 mois. L’objectif est donc de prolonger ces délais, mais aussi et surtout améliorer le confort des patients. A ce jour les traitements pour les patients souffrants (GB) incluent la chirurgie (pour un peu plus de 60% des cas) et la combinaison de radio- et chimiothérapie (principalement appliquée par l’utilisation de l’agent alkylant temozolomide (TMZ). L’utilisation du propofol et d’un inhibiteur passant la barrière hématoencéphalique et potentialisant la combinaison radio- et chimiothérapie et ceux en diminuant les doses de TMZ ont pour objectif d’améliorer la survie, mais aussi le confort de vie des patients.

Procédures

Lors de l'implantation tumorale nous réalisons une analgésie en sous-cutanée (2 secondes) 30 minutes avant l’anesthésie qui elle est en intrapéritonéale (2 secondes) puis nous procédons à l’implantation intracérébrale de cellules tumorales (10 minutes). La suture de la peau est réalisée à la fin de l’implantation avec du fil de suture (2 minutes). Lors de la résection tumorale, nous procédons à une analgésie en sous-cutanée (2 secondes) 30 minutes avant l’anesthésie qui elle est en intrapéritonéale (2 secondes) et à l’injection dans la veine caudale (2 secondes), puis nous réalisons la chirurgie afin de réduire la tumeur (15 minutes). La suture de la peau est réalisée à la fin de l’implantation avec du fil de suture (2 minutes). Pour les traitements, les animaux subissent de la radiothérapie pendant 5 jours (2 minutes par irradiation) de la chimiothérapie en intrapéritonéale toutes les semaines hors week end pendant 4 à 5semaines (2 secondes) des injections intrapéritonéales d’inhibiteurs antimoraux toutes les semaines pendant 4 à 5 semaines (2 secondes)

Impact sur les animaux

Stress lié à l’anesthésie par agent chimique en inhalation (ex: isoflurane) lors des administrations/imageries. Le développement de tumeurs chez la souris et le rat pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: présence d'une tumeur associée ou non à de la nécrose, cachexie, perte de poids). Traitements par différentes voies d'administration (i.p=intrapéritonéale / s.c=sous cutanée/ iv =intra-veineux) (douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille) - De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les procédures chirurgicales d'implantation de cellules et les procédures chirurgicales d'exérèse induiront des douleurs suite à l'incision et à la cicatrisation.

Devenir

En fin de procédure les organes seront prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux inhibiteurs, ce projet est réalisé chez la souris et le rat, car il n’existe pas de méthode de substitution (in-vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les cancers. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : classiquement 12 par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu. L’analyse statistique sera par la comparaison des groupes d'animaux en fonction du traitement réalisé. Afin de mener à bien notre projet, nous souhaitons tester 4 inhibiteurs différents sur ces trois modèles d'animaux avec 7 groupes de 12 animaux par groupe soit un nombre total de 192 souris immunodéprimées, 192 immunocompétentes et 192 rats.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • des conditions d'hébergement garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, notamment liés à la croissance tumorale, liés à la radiothérapie (diarrhée) et/ou liés à l'utilisation de traitements de références et novateurs. • Un protocole d'anesthésie adapté à la chirurgie. • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie (exérèse tumorale) et la période post-opératoire et un suivi postopératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Dans cette étude nous allons tester de nouvelles molécules, afin d'améliorer la survie et le confort des animaux tout en combinant radiochimiothérapie. L’utilisation des modèles souris, déjà en place dans le laboratoire sera complétée par celle de rat, avec pour but des approches confirmatoires (modèles différents) mais aussi l’utilisation d’animaux modifiés. Nous utiliserons des souris et des rats de 8 à 10 semaines pour avoir une croissance tumorale optimale. En effet, les expériences peuvent s’étaler sur plusieurs semaines dans un modèle immunocompétent ou immunodéprimé, donc l’implantation sur des jeunes animaux permet de s’affranchir de l’affaiblissement d’individus plus âgés.

Une grille de score décide du moment de la mise à mort des souris dont la diarrhée devient sanglante, qui se déshydratent, maigrissent fortement et se recroquevillent de douleur. 650 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Une rectocolite hémorragique leur est provoquée par une molécule dissoute dans l'eau de boisson pendant six jours, ou une maladie de Crohn par injection sous anesthésie, avant mesure de la perméabilité intestinale et prises de sang tous les trois jours. Le porteur écrit qu'aucun traitement anti-inflammatoire ni anti-douloureux n'est possible, "car le but du modèle est d'induire une inflammation".

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI) telles que la rectocolite hémorragique et la maladie de Crohn sont des maladies évoluant par poussées inflammatoires de durée et de fréquence extrêmement variables en fonction des patients, alternant avec des phases de rémission. En France, plus de 200 000 personnes sont atteintes d'une MICI et 2,5 millions en Europe. De plus, il est reconnu que l’inflammation chronique est un facteur de risque de survenue de cancer, notamment au niveau du colon. Aujourd’hui, nous ne disposons pas de traitements permettent de maintenir durablement l’homéostasie intestinale. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer l’effet d’approches pharmacologiques, nutritionnelles ou de thérapies cellulaires sur l’inflammation chroniques intestinales et leurs mécanismes d’action dans des modèles de MICI chez la souris permettant d’étudier le développement des MICI dans un contexte physiologique.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’évaluer l’effet des traitements (approches pharmacologiques, nutritionnelles ou thérapies cellulaires) et d’identifier des stratégies thérapeutiques contre les MICI

Procédures

Dans ce projet, nous souhaitons évaluer l’effet d’approches pharmacologiques, nutritionnelles ou de thérapies cellulaires sur l’inflammation chroniques intestinales et leurs mécanismes d’action dans des modèles de maladies inflammatoires digestives (rectocolite hémorragique ou une maladie de Crohn). La stratégie expérimentale consiste à induire une rectocolite hémorragique par une molécule dissoute dans l'eau de boisson ad libitum sur 6 jours ou une maladie de Crohn induite par une injection sous anesthésie (10 min) et évalué pendant 3 jours. Les traitements sont administrés soit par injection sur animaux vigiles (intervention de 10s) ou injection sous anesthésie (10 min), soit par voie orale 1 fois par jour (intervention de 10s) ou ad libitum. Selon les traitements, ils seront donnés 3 jours avant l’induction du modèle de MICI, en même temps ou 3 jours après le début du modèle de MICI. Nous évaluerons la perméabilité intestinale un jour avant l'induction des modèles et 3 jours après en administrant par injection (intervention 10s) d’une molécule fluorescente non toxique que nous rechercherons dans le sang après 4h (prélèvement de sang sous anesthésie 1min). Les animaux seront suivis journalièrement afin de mesurer leur poids, de prélever les selles et les urines (1 min lors de la préhension des animaux) et assurer une surveillance. Du sang pourra être prélevé sous anesthésie (1min) tous les 3 jours pour suivre l’effet des traitements. Une grille d'évaluation permet au personnel en charge de la surveillance et/ou du suivi des procédures d'évaluer de manière objective la douleur chez l’animal et de mettre en place des mesures pour limiter leurs souffrances.

Impact sur les animaux

Les modèles de rectocolite hémorragique (RCH) et la maladie de Crohn, tout comme les signes cliniques observés chez l'homme, entrainent des diarrhées qui vont devenir sanglantes au cours du traitement, pouvant entrainer une déshydratation et un fort amaigrissement et ainsi le décès de l’animal. Les animaux peuvent présenter des signes de cachexie, des signes de douleurs en se recroquevillant et en limitant leurs déplacements. Bien que les animaux soient habitués à la préhension, leur manipulation pour les injections ou pour le prélèvement d’urine et de selles peuvent stresser les animaux. Toutes les administrations en dehors de la douleur de l'aiguille ne présentent pas de nuissances particulières lorsqu'elles sont correctement effectuées. Une attention particulière sur les signes de douleurs sera portée. Pour les administrations par voie orale, irritation de l'oesophage avec possible perte de poids par manque d'alimentation seront à surveiller. Pour les injections, le point d’injection sera désinfecté et surveillé journalièrement. Les prélèvements de sang seront alternés d’un côté et de l’autre. Aucune nuisance des produits administrés ou injectés n'est attendue du fait de leur innocuité.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort ce qui permettra de réaliser différents prélèvements d’organes

Remplacement

Nous testerons plusieurs approches pharmacologiques, nutritionnelles ou de thérapies cellulaires qui sont susceptibles de moduler l’inflammation au cours de la progression des MICI. Il n’est pas possible de remplacer ces animaux car les mécanismes de la réponse immunitaire et de l'inflammation sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires de l’immunité qui ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches.

Réduction

Les traitements pour les approches pharmacologiques ou nutritionnelles , auront été présélectionnés via des résultats préliminaires basés sur des tests in vitro qui permettent d’appréhender les effets potentiels d’une molécule. Cette démarche permet de sélectionner les molécules et de limiter le nombre d’animaux utilisé. Concernant la thérapie cellulaire, l’effet immunomodulateur et anti-inflammatoire des cellules utilisées pour la thérapie cellulaire aura été validé préalablement in vitro. Cependant, les mécanismes de l’inflammation sont complexes et nécessitent la mobilisation de différents effecteurs cellulaires qui ne peuvent pas être mimés par une approche de culture cellulaire. Les souris nous permettront d’étudier ces mécanismes dans leur contexte pathologique que nous ne pouvons pas réaliser par d’autres approches. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Le modèle est bien maitrisé au laboratoire. Chaque animal est observé journalièrement. Les résultats actuels ont permis de valider des groupes d’animaux constitués de 6 à 10 individus pour acquérir des données fiables (projet antérieur ayant reçu l’accord du comité d’éthique et du ministère) et permettre une étude statistique. Un suivi individuel des animaux est réalisé afin de receuillir le maximum de données et de garantir la fiabilité des données. Des analyses post mortem sur différents organes seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possibles sur les animaux.

Raffinement

L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux. Les conditions d’hébergement permettront de conserver le comportement social des souris et de limiter le stress par l’enrichissement (papier pour la nidification, tunnel). Ceci permettra de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux en collectant le plus de données possibles. Il n’y a pas de possibilité de réaliser un traitement anti-inflammatoire ou anti-douloureux car le but du modèle est d’induire une inflammation. L'anesthésie par inhalation pour les actes nécéssitant une contention pouvant stresser l'animal et une analgésie locale en collyre seront utilisées pour les traitements intra_veineux. Les animaux anesthésiés seront maintenus jusqu'au réveil sur un support chauffant. Nous avons noté lors de protocoles précédents que les souris se recroquevillaient suite aux douleurs abdominales. Afin d’éviter la déshydratation des animaux, des biberons avec des embouts longs sont disposés au-dessus des cages permettant d’éviter aux souris de trop se relever. Les croquettes seront mises au fond de la cage afin de faciliter la prise alimentaire. Plusieurs sources d’enrichissement dans la cage (tunnel, papier) permettront d'améliorer leur environnement et leur confort d'hébergement. Une grille de scoring est utilisée afin d’évaluer précisément la douleur chez nos animaux permettant d'éviter toutes souffrances inutiles.

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Les modèles de maladies inflammatoires digestives utiliseés dans ce projet permettent de mimer la physiopathologie dans toute sa complexité. Ce modèle nous permettra d'étudier l'impact de traitements tant au niveau physiologiue que au niveau cellulaire avec toutes les populations présentes (cellules de la muqueuse digestive, les cellules immunitaires...). Adultes, souris âgées de plus de 8 semaines afin d'avoir des souris avec un système immunitaire mature.