Procédures sévères

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation qui leur fait développer une sclérose latérale amyotrophique, elles reçoivent deux administrations nasales par jour pendant 98 jours, soit 196 gestes par animal, plus une pesée quotidienne, quatorze prélèvements sanguins sous anesthésie et des tests neuromoteurs répétés. Le porteur indique que la maladie leur fera perdre 20 % de leur poids initial puis les paralysera, la mise à mort intervenant à ce stade. Il écarte le poisson zèbre, pourtant disponible comme modèle de la maladie, au motif que la voie nasale et la durée du traitement ne s'y prêtent pas, et conclut que la souris transgénique est le choix "le plus rationnel".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de rechercher si la molécule étudiée est efficace dans un modèle animal de Sclérose Latérale Amyotrophique, ou maladie de Charcot. La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative des neurones qui permettent aux muscles de fonctionner et qui malheureusement conduit, à terme, au décès du patient. A ce jour, malgré plusieurs médicaments disponibles sur le marché, aucun n’est réellement efficace pour, ne serait-ce que, ralentir la progression de la maladie. Un modèle de souris transgénique est disponible pour étudier la pathologie et tester de nouveaux médicaments. La molécule étudiée est administrée par la voie nasale et va cibler spécifiquement les neurones pour y délivrer une molécule endogène permettant de restaurant l’équilibre énergétique des neurones. L'administration par le nez permet une mise en contact direct avec les neurones (dans un premier temps ceux liés à l'odorat et à la sensibilité de la face puis par diffusion de proches en proches aux autres neurones du cerveau). Cette distribution a déjà été démontré chez la souris et le primate non-humain. De plus, son efficacité a été objectivée dans d’autres modèles précliniques de maladies neurologiques comme une maladie rare appelée le Déficit en Transporteur de la Créatine et la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est donc de tester l’efficacité de cette nouvelle molécule donnée par la voie nasale pendant plusieurs semaines chez des souris transgéniques. L'efficacité sera mesurée par des tests de neuropharmacologie ainsi que par la mesure de biomarqueurs principalement dans le sang. Les atteintes neuronales des souris seront aussi étudiées. Cette étude permettra d'orienter les futures études de ce nouveau médicament chez les patients.

Bénéfices attendus

L’étude fait partie d’un projet plus large visant à développer une nouvelle molécule dans des maladies neurologiques. Cette molécule aide à réguler l'énergie des cellules en fournissant de la créatine aux neurones. Elle pourrait avoir de grands bénéfices pour les patients atteints de maladies neurologiques, notamment dégénératives, comme la maladie de Charcot ou SLA. A l’issue de la présente étude pré-clinique courant 2025, et en fonction des résultats, notamment de l'efficacité du produit à l’étude, une étude clinique pourrait être envisagée chez des patients atteints de SLA.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur toutes les souris: - L’administration se fera par voie nasale deux fois par jour du médicament ou du placebo à toutes les souris de l’étude dans la cavité nasale. Ce geste sera réalisé sur animal vigile tous les jours pendant toute la durée de l’étude (soit 98 jours donc réalisé 196 fois) et durera 1 minute. - La pesée quotidienne, réalisée sur animaux vigile, durera 2 minutes. - Le test neuromoteur Neuroscore sera réalisé 2 fois par semaine sur souris vigile et durera 4 minutes. - Le test motricité sera réalisé 5 fois au cours de l’étude sur animal vigile et durera 5 minutes. - Le test de tonus musculaire sera réalisé 5 fois au cours de l’étude sur animal vigile et durera 5 min. - Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 14 fois), sous anesthésie générale et durera une minute.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées sont des souris qui par nature ont un fond génétique qui va les conduire à développer une Sclérose Latérale Amyotrophique murine (Maladie de Charcot chez l’homme). Ainsi, elles verront l’apparition de symptômes neuromusculaires conduisant à la baisse de leur poids qui atteindra 20% de leur poids initial pendant plus de 24 h puis à une paralysie. L’euthanasie de l'animal sera alors réalisée. Un prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine, en sous-mandibulaire, ce qui pourraient engendrer des nuisances, telles que des hématomes et une légère douleur au point de piqure. L'anesthésie, la contention, les tests comportementaux peuvent provoquer un stress léger.

Devenir

Les animaux sont mis à mort car ils sont porteurs d’une maladie génétique qui va conduire à leur mort.

Remplacement

La maladie de Charcot ou Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative extrêmement complexe des motoneurones (les neurones qui partent du cerveau pour régir les activités périphériques, comme la respiration, la déglutition ou la préhension). Les études in vitro ne sont pas représentatives de la complexité de la maladie. C’est d’ailleurs le cas des maladies neurodégénératives pour lesquelles seuls des modèles animaux sont capable d’apporter des informations utiles pour ensuite pouvoir se projeter chez le patient. Parmi les modèle animaux, les modèles de souris génétiquement modifiées sont les plus représentatives de la maladie. Il existe aussi des modèles de poisson zèbre, mais ils sont plus largement utilisés pour étudier la physiopathologie de la maladie. Ce modèle de poisson est moins représentatif pour étudier l’effet d’un médicament qui, comme le nôtre, agit sur la mitochondrie et l’énergie apportée dans les neurones. De plus l’administration nasale de la molécule étudiées est limitante pour utiliser ce modèle. Le choix des souris transgéniques est donc le plus rationnel et le plus efficace pour atteindre l’objectif de tester la molécule administrée par la voie nasale dans un modèle de la Sclérose latérale Amyotrophique.

Réduction

L’étude s’appuie sur la bibliographie déjà existante sur les effets de la créatine dans des modèles de cette maladie et de la distribution efficace de la molécule vers les neurones pour ne concevoir qu’une seule étude, là où il est souvent nécessaire d’en réaliser plusieurs ou alors de plus grande ampleur (avec plusieurs doses par exemple). Ainsi le nombre de bras a été réduit, puisque 1 seule dose sera testée. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum (16 par groupes avec 8 males et 8 femelles par groupe), considérant que les 2 sexes seront étudiés dans cette étude et que les tests neuromoteurs demandent statistiquement plus d’animaux que d’autres type de mesures (comme des études de pharmacocinétique, par exemple).

Raffinement

Les souris seront logées en groupes de quatre dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal, les souris seront manipulées quotidiennement par les mêmes expérimentateurs. Ces mêmes expérimentateurs feront les administrations de la molécule et les tests comportementaux tout au long du projet. Les expérimentateurs s’assureront quotidiennement du bien-être animal au moment des administrations de la molécule par une surveillance et une pesée. Des points limites seront mis en place. Les mises à mort seront effectuées sous anesthésie profonde. Enfin, pour limiter le stress des animaux lors des tests comportementaux, des phases d’acclimatations dans les différentes enceintes font partie intégrante du protocole.

Choix des espèces

Les souris transgéniques utilisées sont le modèle de référence de la maladie de Charcot ou Sclérose Latérale Amyotrophique. Les souris devront commencer le traitement avant l’arrivée des premiers symptômes autour de 12-14 semaines. Elles arriveront au laboratoire à 6 semaines, après 2 semaines d'acclimatation et d'entrainement elles recevront le traitement à 8 semaines. Il existe un modèle de poisson Zebra Fish (oui poisson zèbre) de la maladie, mais la voie d’administration (voie nasale), la fréquence (quotidienne) et la durée du traitement (plusieurs semaines voire mois) avec la molécule étudiée ne permettent d’utiliser ce modèle. De plus, la recherche de biomarqueurs sanguins et cérébraux ne serait pas possible, limitant une transposition ultérieure chez le patient.

Douze prélèvements de sang à la queue, huit injections, douze semaines de régime riche en gras et deux mises à jeun de six et seize heures : 2 452 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une perfusion intra-cardiaque termine le parcours de chaque animal, toutes étant tuées pour prélever leurs organes. L'objectif déclaré reste exploratoire, comprendre comment le réseau nerveux du pancréas répond à une hormone de croissance et contribue à la sécrétion des hormones qui règlent la glycémie. Le porteur justifie l'effectif en une phrase, le nombre ayant été "déterminé pour permettre l'analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés", et présente la souris comme le "modèle animal de référence" dans l'étude de l'obésité.

Objectifs

Le pancréas est central dans la régulation de la glycémie. Il produit les hormones permettant de réguler la glycémie. Comme tous les tissus, le pancréas est relié au cerveau par le système nerveux périphérique. Cependant, son rôle dans la fonction du pancréas n’est pas bien connu. Dans ce projet nous proposons d’étudier la contribution du réseau nerveux du pancréas et sa réponse à une hormone de croissance, dans la sécrétion des hormones régulant la glycémie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre l'implication d'une hormone de croissance dans la survie et la fonction des cellules neuronales et comment cela contribue à la sécretion des hormones glycémiques par le pancréas.

Procédures

1 biopsie de queue (10s), 1 régime riche en gras (12 semaines), 8 injections (20s), 2 jeûne (6h et 16h), 12 prélèvements de sang à la queue (3s), 1 gavage (1min), 1 perfusion intra-cardiaque (10min).

Impact sur les animaux

-Injections: douleur légère due à la piqûre. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment de l'injection. -Obésité : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 20 min avant la procédure. - Mise à jeun : gêne due à la sensation de faim. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure. -Biopsie de queue : douleur modérée.-Gavage : gêne modérée liée à la contention.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure pour permettre le prélèvement des organes d'intérêt.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier le rôle du système nerveux du pancréas en condition normale et de stress glycémique, tels que l'obésité et la mise à jeun. Le pancréas répond à la prise et la perte de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans un environnement enrichi. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères. Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’opioïdes (analgésie) et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement et font l'objet de points limites définis et associés à des décisions adaptées.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours (souriceaux) pour les tatouages qui ne peuvent pas être effectués à l'âge adulte et 22 semaines (adultes) pour la fin des expérimentations du régime riche en gras.

Gavées une fois par jour, trente-cinq fois au total, sous contention manuelle, 768 souris reçoivent de l'alcool et des mycotoxines puis un agent inflammatoire pendant cinq jours pour déclencher une colite. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et tuées à l'issue pour prélever les organes. Le porteur décrit des diarrhées importantes, des déshydratations, une inflammation généralisée et une perte de poids qui durent jusqu'à la mise à mort, l'objet du projet étant de démontrer que l'alcool et les mycotoxines aggravent la sévérité des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. Il classe pourtant le gavage en nuisance modérée, tout en décrivant le risque de fausse route avec détresse respiratoire et hypersalivation.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin touchent un nombre croissant de patients en Europe. L’analyse des données du registre qui répertorie les cas de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin dans le nord de la France montre que le nombre de cas est en forte augmentation, en particulier chez les jeunes et adolescents (10 à 16 ans). Les prédictions pour 2030 sont alarmantes puisque la prévalence des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin pourrait atteindre 0,5% à 1% de la population générale. Ces maladies, marquées par des poussées inflammatoires récurrentes, sont influencées par des facteurs environnementaux, notamment l’alcool et les mycotoxines (toxines naturelles produites par les champignons). L’alcool, en altérant la barrière intestinale, et les mycotoxines, principaux contaminants naturels de notre alimentation, exacerbent l’inflammation intestinale et pourraient aggraver la progression et la sévérité des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Des études ont montré que les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin conservaient une consommation d’alcool équivalente à celle de la population générale et que, malgré les contre-indications, l’abstinence ne fait pas partie des recommandations actuelles. D’autre part, le réchauffement climatique favorise la prolifération des mycotoxines qui contaminent de plus en plus notre alimentation. L’objectif de cette étude vise à démontrer les effets combinés de l’alcool et des mycotoxines sur la sévérité des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin dans un modèle expérimental de colite (inflammation du colon).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mettre en évidence l’aggravation de la sévérité des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin chez les patients consommateurs d’alcool co-exposés aux mycotoxines. Tandis que l’impact de la consommation d’alcool sur l’incidence de la maladie inflammatoire chronique de l’intestin est débattu, aucune étude n’a, à ce jour, examiné son impact sur la sévérité de ces pathologies. Or une étude démontre une augmentation de la sévérité de la colite dans un modèle expérimental suite à une exposition à l’alcool. Dans ce contexte, aucune donnée à ce jour n’a évalué l’interaction entre la consommation d’alcool et l’exposition aux mycotoxines. Mettre en évidence l’effet de l’interaction alcool/mycotoxines dans ce modèle de colite permettrait d’améliorer les connaissances scientifiques sur cette co-exposition et encourager la prise en compte de ces deux facteurs dans le suivi et la prise en charge des patients. Nos résultats pourraient contribuer à faire évoluer les recommandations actuelles. L’abstinence à l’alcool pourrait devenir une recommandation pour les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Par ailleurs, l’identification des aliments fréquemment contaminés par les mycotoxines permettrait de mieux définir les aliments à risque et d’affiner les conseils nutritionnels destinés à ces patients.

Procédures

Les animaux seront tous exposés aux interventions suivantes : Gavage tous les jours (= 35 gavages) sur animal vigile tout au long du protocole expérimental. Pour cette intervention, les animaux seront maintenus en contention manuelle pour une durée inférieure à 1 minute par administration. Les animaux recevront un agent inflammatoire pendant 5 jours. Anesthésie (2 fois ; moins de 3 minutes). Prélèvement sanguin à la fin du protocole. Le prélèvement sanguin se fera sur animal anesthésié. Le prélèvement sanguin dure moins d’une minute. Ces interventions seront réalisées sur l’ensemble des 768 animaux.

Impact sur les animaux

Lors de cette procédure, plusieurs nuisances pouvant affecter le bien-être des animaux sont identifiés : - Les gavages peuvent générer des nuisances modérées liées au stress de la contention et à la procédure. En cas de fausse route, accident pouvant survenir lors de la procédure de gavage, l’animal peut présenter des signes de souffrance tels que détresse respiratoire et une hypersalivation. - D’après notre expertise, la consommation orale d’alcool peut induire des nuisances importantes. L’administration d’une forte dose d’alcool par gavage peut réduire l’activité motrice et limiter la prise alimentaire pendant quelques heures. Sur le long terme, jusqu’à la mise à mort de l’animal, des signes de déshydratation, de diarrhée et de perte de poids liées à l’exposition répétée à l’alcool peuvent être observés. - Les mycotoxines utilisées devraient induire des nuisances légères. La concentration de mycotoxines choisie pourrait induire une diminution de l’alimentation des souris associées à une légère perte de poids. Quelques modifications des selles pourraient survenir occasionellement jusqu’à la fin de la procédure. - L’induction de la colite est associée à des nuisances sévères jusqu’à la mise à mort de l’animal. L’exposition à l’agent inflammatoire peut entraîner d’importantes diarrhées et donc des déshydratations. De plus, une inflammation généralisée et d’importantes atteintes intestinales sont attendues pouvant entraîner des douleurs. - Le prélèvement de sang entraîne des nuisances légères principalement liées au stress induit par l’anesthésie gazeuse.

Devenir

Afin d’étudier les atteintes induites par le protocole, un prélèvement d’organes est nécessaire, ce qui implique la mise à mort de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Le modèle souris de colite est la méthode de référence dans l’étude des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Dans ce modèle souris de colite expérimentale, nous souhaitons étudier l’interaction entre l’alcool et les mycotoxines qui ont la capacité d’influencer aussi bien le microbiote intestinal que le système immunitaire ce qu’il n’est pas possible d’analyser par les méthodes alternatives. De plus, des effets différents peuvent être observés en fonction du sexe. Pour cela, l’étude chez la souris nous permettra la comparaison entre mâles et femelles, que l’on ne peut pas réaliser in vitro ou in silico. Le développement de la colite va générer des modifications physiologiques, telles qu’une perte de poids, une déshydratation et également des changements de la température corporelle qui peuvent affecter les conditions physiologiques de l’animal. Enfin, l’animal nous permet de mimer le mode de contamination observée chez l’Homme avec une administration par voie orale. Il rend donc possible de prendre en compte la diffusion des contaminants, leur capacité à affecter et traverser la barrière intestinale ainsi que leur métabolisation. Ces variables physiologiques ne peuvent être observées sur des modèles d’explants biologiques ou sur les animaux non vertébrés ou vertébrés moins sentients. Dans ce contexte, les méthodes alternatives actuelles ne sont pas suffisantes pour tenir compte de la complexité des mécanismes de cette pathologie multifactorielle et l’utilisation de modèles animaux expérimentaux demeure essentielle.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, des tests préliminaires in vitro sur cultures cellulaires seront réalisés pour sélectionner 4 mycotoxines d’intérêt à étudier dans le modèle souris de colite. Dans le cadre de cette étude et pour déterminer l’impact de la co-exposition alcool/mycotoxine sur la sévérité de la colite induite chimiquement, des analyses statistiques seront effectuées. Après calcul, le nombre d’animaux nécessaire est de 24 dans chaque groupe pour atteindre la puissance statistique souhaitée. Notre étude comprend 4 groupes différents : colite, alcool/colite, mycotoxine/colite, alcool/mycotoxine/colite 4 mycotoxines x 2 sexes x 4 groupes x 24 animaux par groupe = 768 souris. Ainsi 768 animaux sont nécessaires pour réaliser l’ensemble du protocole. Afin de prendre en compte le principe de réduction, chaque groupe de 24 animaux sera divisé en trois sous-groupes de 8 animaux. A la fin de chaque expérience, une évaluation statistique intermédiaire sera réalisée. Si les résultats sont satisfaisants, nous ne réaliserons pas les expériences sur les sous-groupes suivants afin de limiter et réduire le nombre total d’animaux utilisé.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie et jusqu’à leur mort, nos animaux seront surveillés individuellement et quotidiennement, pesés 2 fois par semaine à l’exception de la 5ème semaine pour laquelle la surveillance sera renforcée et la pesée sera quotidienne. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 afin de garantir un enrichissement social suffisant. Les animaux auront accès à volonté à l’eau et à la nourriture en présence d’enrichissement (litière foisonnante, roue d’activité, dôme, copeaux de bois compactés) tout au long du projet. Afin de réduire le nombre de manipulations désagréables pour les animaux, l’administration des molécules par voie orale se fera de façon conjointe. Les opérateurs sont régulièrement entraînés à l’administration orale sur des mannequins de souris afin de perfectionner le geste. L’alcool pouvant altérer le bien-être animal, les cages sont placées, immédiatement après le gavage et pendant quelques minutes, sur tapis chauffant. Des point limites ont été établis pour évaluer la souffrance des animaux. Ils sont relatifs à l’apparence physique, la variation de poids, la déshydratation, et au comportement social. Ces indicateurs sont présentés dans une grille d’évaluation affichée dans les locaux d’hébergement et complétée chaque jour après l’inspection de chaque animal. Toute atteinte de point limite conduira à mener une action corrective. Tout animal présentant des signes de douleur ou de souffrance jugés excessifs, sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

Nous avons choisi de réaliser l’étude sur des souris pour les raisons suivantes : - Modèle de référence pour analyser l’impact d’une alcoolisation importante sur la perméabilité intestinale et la colite expérimentale - Expertise sur les concentrations d’alcool et de mycotoxine utilisables ce qui limite l’utilisation d’animaux pour des protocoles préliminaires. Le protocole sera réalisé sur des jeunes souris adultes de 9 semaines en adéquation avec le mode de consommation d’alcool et l’apparition des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin chez l’Homme.

Une perte de poids de 15 % fait partie des critères qui déclenchent la mise à mort. 420 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour prélever le sang et les organes. Chacun subit une chirurgie rénale de trente minutes classée sévère, l'administration du traitement par gavage, un prélèvement sanguin quatre semaines après l'opération et cinq échocardiographies. Le projet vise à ralentir la calcification de la valve aortique en bloquant un mécanisme épigénétique, et le porteur décrit le passage par l'animal comme une "étape indispensable" avant tout développement chez l'être humain.

Objectifs

Le rétrécissement aortique calcifié (RAC) est une pathologie fréquente touchant environ 2 % de la population âgée de plus de 65 ans. Cette maladie se caractérise par une calcification des tissus et une réduction de la surface valvulaire, ce qui entrave l’éjection du sang. Au stade avancé, elle se traduit par des symptômes tels que dyspnée, insuffisance cardiaque et angor, responsables d’une morbi-mortalité cardiovasculaire élevée. Actuellement, aucun traitement pharmacologique ne permet de stopper le développement des calcifications valvulaires. La seule option thérapeutique consiste en une intervention chirurgicale visant le remplacement de la valve aortique. Des études préliminaires in vitro ont montré l’intérêt de cibler un mécanisme épigénétique impliqué dans la régulation des monocytes-macrophages, afin de réduire les processus menant à la calcification des feuillets valvulaires et, par conséquent, de ralentir la progression de la maladie. L’objectif principal de ce projet est d'évaluer l'effet d'inhibteurs pharmacologiques de ce mécanisme épigénétique afin de réduire la calcification valvulaire aortique dans le contexte du RAC, en utilisant un modèle biologique complet.

Bénéfices attendus

Le Rétrécissement Aortique Calcifié (RAC) est la valvulopathie la plus fréquente chez l’adulte dans les pays développés. Sa prévalence augmente avec l’âge et constitue un problème de santé majeur dû au vieillissement de la population En effet, il est estimé que le nombre de sujet souffrant de RAC doublera en France d'ici 2050. Actuellement, il n’existe aucun traitement pharmacologique permettant de ralentir, à défaut de stopper, le développement des calcifications valvulaires. Seuls, le remplacement valvulaire et l'implantation d'une bioprothèse valvulaire aortique par voie percutanée aussi appelée TAVI (Transcatheter aortic valve implantation) peuvent être proposé aux patients souffrant de la pathologie mais cela nécessite une intervention à l'hôpital. Dans cette étude nous souhaitons démontrer l'intérêt thérapeutique du ciblage d'un mécanisme épigénétique pour réduire et ralentir le développement des calcifications valvulaires aortique associées au développement du RAC in vivo.

Procédures

1.Chirurgie rénale : durée approximative 30 minutes, classée comme procédure sévère, réalisée une seule fois au cours de l’étude. 2. Prélèvement sanguin : effectué à la 4ᵉ semaine post-chirurgie pour vérifier la réussite de l’intervention et mesurer les paramètres plasmatiques de la dysfonction rénale (créatinine, urée) chez 420 rats ; classé comme procédure modérée. 3. Échocardiographie (évaluation de la fonction cardiaque) : durée approximative 30 minutes, classée comme procédure légère, réalisée cinq fois au cours de l’étude.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins peuvent entraîner une fatigue temporaire chez les animaux, et l’administration des traitements par gavage peut provoquer une prostration passagère. La procédure chirurgicale est considérée comme sévère et peut entraîner une perte de poids corporelle après l’intervention. Les traitements pourraient provoquer certains effets secondaires, même si l'un d'entre eux est bien documenté et est autorisé par la Food and Drug Administration (FDA) aux États-Unis pour le traitement des patients adultes atteints d'un cancer depuis 2020

Devenir

La mise à mort sera réalisée dans le but de prélever du sang les organes et d’étudier, sur le plan histologique, les effets de la maladie ainsi que la réponse aux différents agents pharmacologiques utilisés. Ces analyses permettront de mieux comprendre le développement du rétrécissement aortique et d’évaluer l’efficacité des substances testées pour ralentir ou prévenir le processus pathologique.

Remplacement

Des résultats non publiés de notre laboratoire ont montré que le ciblage in vitro d'un mécanisme épigénétique dans les cellules inflammatoires réduit leur potentiel à contribuer au développement de la calcification de la valve aortique. Dans cette étude, nous souhaitons évaluer, in vivo et dans un organisme complet, l’effet du ciblage de ce mécanisme sur les processus impliqués dans le développement du RAC. De plus, l’utilisation d’un modèle animal constitue une étape indispensable avant de pouvoir envisager le développement d’un traitement chez l’Homme.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous avons mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo, à la fois pendant la procédure et au moment de la mise à mort. Des mesures non invasives de la fonction cardiaque ainsi que des analyses histologiques seront réalisées. Le choix des inhibiteurs pharmacologiques d’Ezh2 repose sur des expériences préalablement réalisées dans des modèles de RAC in vitro. Le nombre d’animaux nécessaires est ajusté à l’aide d’un logiciel prenant en compte la variabilité statistique des résultats obtenus. Des animaux des deux sexes seront utilisés afin d’éviter tout biais lié au genre. Pour chaque sexe, la procédure comprend 6 groupes expérimentaux, soit un total de 12 groupes correspondant à 420 rats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés selon les normes requises, avec un enrichissement des cages pour favoriser leur bien‑être. Des points limites adaptés sont définis à l’aide d’une grille de score basée sur le comportement de l’animal, son apparence, sa perte de poids (≥15 %) et des signes cliniques spécifiques. Cette stratégie est combinée à un suivi quotidien incluant anesthésie (gazeuse à l'isoflurane induction à 4 % d’isoflurane + O₂, maintien entre 1,5 et 2 % d’isoflurane + O₂), analgésie (xylazine 10 mg/kg, buprénorphine 0,05 mg/kg) et réhydratation. Pour favoriser une récupération optimale après la chirurgie, les animaux seront placés sous lampe chauffante jusqu’à leur réveil dans une cage contenant de la nourriture en gel. De plus, les expérimentateurs auront des contacts plurihebdomadaires avec les animaux afin de faciliter leur habituation et réduire le stress.

Choix des espèces

Le choix du rat Sprague Dawley se justifie par l’expérience du laboratoire à la fois pour la chirurgie de néphrectomie mais également pour l’étude de la fonction cardiaque par échocardiographie. Par ailleurs, le rapprochement des espèces humaines et des rongeurs sur le plan phylogénétique rend pertinent le choix de cette espèce en garantissant une bonne extrapolation des résultats chez l’Homme. Nous allons inclure des rats mâle et femelle (sexe ratio 1/1) de 10 semaines pour l'étude. La taille des rats à cet âge permet une réalisation facilitée des chirurgies et correspond à un âge habituel dans la littérature pour l'induction du modèle.

Un test de nage forcée et un test d'alimentation inhibée par la nouveauté précédé de sept heures sans nourriture attendent 480 souris, dont une partie âgée de 19 mois, dans des procédures classées en souffrance sévère. Toutes sont tuées pour prélever leurs cerveaux et y chercher des marqueurs de neuroinflammation, l'ensemble ne démarrant qu'après "validation formelle par le donneur d'ordre". L'extrait d'algue testé, incorporé aux croquettes pendant deux à trois mois, est censé prévenir l'anxiété, la dépression et le déclin cognitif liés à l'âge. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu de cette supplémentation, dont l'innocuité est "garantie", et décrit deux paragraphes plus loin un test de nage forcée qui "génère un stress très important".

Objectifs

Le projet vise à évaluer l’effet d’une supplémentation alimentaire en extrait d’algue, incorporé dans des croquettes à différentes doses, sur les troubles de l’humeur, notamment l’anxiété et la dépression, ainsi que sur les fonctions cognitives. Parallèlement, nous analyserons les mécanismes sous-jacents à ces effets, en particulier les phénomènes de neuroinflammation. Cette étude s’inscrit dans le cadre du vieillissement et mobilisera des souris adultes et âgées afin d’appréhender les effets de la supplémentation selon l’âge. Toutes les procédures expérimentales seront mises en œuvre uniquement après validation formelle par le donneur d’ordre. Il est important de préciser que l’extrait d’algue utilisé a déjà fait l’objet d’évaluations concernant sa sécurité alimentaire et sa validité nutritionnelle, garantissant ainsi son innocuité pour les animaux. Enfin, les protocoles prévus dans cette demande sont exclusifs et ne recouvrent aucune procédure déjà en cours ou prévue dans d’autres projets, évitant ainsi tout doublon.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de démontrer qu’une supplémentation nutritionnelle en extrait d’algue permet 1) d’une part, de limiter et prévenir le déclin cognitif lié à l’âge, favorisant ainsi un vieillissement en bonne santé, qui constitue un enjeu majeur de santé publique dans une population en constante augmentation d’âge avancé ; 2) et d’autre part, de réduire les symptômes des troubles de l’humeur (anxiété, diminution des interactions sociales, dépression) fréquemment associés au vieillissement. Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche sur la nutrition préventive et personnalisée. Les résultats attendus sont une amélioration significative des troubles cognitifs et de l’humeur au cours du vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions destinées à évaluer l’impact d’une supplémentation nutritionnelle sur la santé cognitive et mentale. Des tests comportementaux seront réalisés afin de mesurer leurs capacités cognitives ainsi que d’éventuels troubles de l’humeur. Les tests comportementaux pouvant provoquer du stress vont jusqu’à 6 minutes maximum, et la période de restriction alimentaire pour un test est de 7h. Ces évaluations comportementales s’étaleront sur une période d’environ trois semaines, chaque test étant séparé du suivant par un intervalle d’au moins deux jours afin de préserver le bien-être des animaux. Parallèlement, les souris recevront une supplémentation en extrait d’algue incorporée dans leurs croquettes pendant une durée de 2 deux à trois mois.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n’est attendu à la suite de la supplémentation en extrait d’algue, puisque la sécurité alimentaire de ce produit a déjà été démontrée. Cependant, les tests comportementaux prévus peuvent induire un stress de courte durée chez les animaux. En particulier, le test de nage forcée qui génère un stress très important et le test d’alimentation inhibée par la nouveauté qui génère un stress temporaire lors de leur réalisation. Pour limiter cet impact, une manipulation quotidienne des animaux sera effectuée pendant une semaine avant le début des tests comportementaux, afin d’atténuer leur stress et d’habituer les souris à la manipulation. Toutes les procédures expérimentales seront conduites dans le strict respect des réglementations en vigueur relatives à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les cerveaux et réaliser des analyses biochimiques ou immunohistologiques.

Remplacement

L’étude des comportements de type cognitifs et troubles de l’humeur ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au mieux en se basant sur des expériences préalablement menées au laboratoire qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. La significativité de différence statistique entre plusieurs groupes sera déterminée en fonction des comparaisons souhaitées. D’après les études déjà menées au laboratoire sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 16 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.

Raffinement

Pour chaque procédure, des points limites et des critères d’arrêt spécifiques ont été définis et sont précisés dans les sections correspondantes. Toutes les précautions seront prises afin de raffiner les procédures et de réduire au maximum la douleur (administration d’antalgiques et/ou de sédatifs avant la mise à mort) ainsi que l’inconfort (manipulations régulières et enrichissement de l’hébergement) des animaux. Les souris seront hébergées en cages collectives, dans un environnement enrichi comprenant notamment un igloo et un carré de coton. Les différents tests comportementaux seront toujours espacés d’au moins deux jours pour limiter le stress. L’ensemble des expérimentateurs et soigneurs impliqués sont titulaires d’un certificat d’expérimentation animale de niveau concepteur et/ou opérateur. Ils disposent d’une solide expérience de travail avec les animaux et sont particulièrement sensibilisés au bien-être animal, compte tenu de leur domaine de recherche (stress, anxiété, bien-être cérébral) et de l’engagement actif de la cellule SBEA (Structure de Bien-Être Animal). La SBEA réalise des contrôles réguliers afin de vérifier le respect des procédures et la bonne application des mesures de bien-être animal. Enfin, des points limites précoces et des critères d’arrêt spécifiques ont été établis pour chaque procédure afin de prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. Ce modèle présente l’avantage de permettre la mise en œuvre aisée et maîtrisée, au sein du laboratoire, de traitements nutritionnels et d’évaluations comportementales. De petite taille, les souris sont faciles à manipuler et peuvent être hébergées sans difficulté dans l’animalerie de l’unité. De plus, il s’agit du modèle le plus couramment utilisé dans notre domaine de recherche, ce qui facilite la comparaison avec des données expérimentales déjà publiées et limite la duplication des expériences. Les souris seront utilisées soit adultes (2 mois) pour valider les déficits comportementaux des animaux âgés, soit âgées (19 mois) pour évaluer l’impact de la supplémentation sur la prévention des troubles cognitifs et de l’humeur liés à l’âge.

Huit semaines de tapis de course, cinq jours par semaine et jusqu'à une heure par jour : 360 souris subissent cet entraînement dans des procédures classées en souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leurs cerveaux. Elles développent le comportement anxieux ou de type dépressif que le porteur annonce comme attendu, puis passent jusqu'à six tests comportementaux, dont un précédé de sept heures sans nourriture et un autre imposant 72 heures en cage séparée. La société de compléments alimentaires qui cofinance le projet veut démontrer qu'un extrait d'algue réduit la fatigue cognitive liée à la pratique sportive intense. Deux de ces tests sont nommés, les autres non, et c'est bien l'ensemble des 360 souris qui relève de la gravité sévère.

Objectifs

L'exercice intense et répété est associé à une fatigue cognitive. Un des objectifs de la société qui cofinance ce projet est de développer des compléments alimentaires qui réduisent la fatigue cognitive associée à la pratique sportive intense et régulière. Ainsi, l'objectif de ce projet est de démontrer l’efficacité d’un extrait d’algue sur les performances cognitives et la fatigue après un entrainement physique intense chez la souris ainsi que les mécanismes d’action. Le milieu marin constitue la plus grande partie de la biosphère et contient les formes les plus anciennes et variées de la vie. Cette diversité de vie et d'environnements atypiques ouvrent des perspectives pour le développement de nouvelles molécules bio- actives. Les organismes marins, et notamment les algues marines possèdent un immense potentiel de molécules originales d'intérêt biologique. Ainsi, les extraits d’algues, qui contiennent des molécules bioactives anti-inflammatoires et anti-oxydantes, représentent une stratégie nouvelle. Nous avons identifié dans un projet précédent un extrait d'algue qui améliore les comportements anxieux ou la mémoire chez la souris. L'admissibilité et l'innocuité de cette fraction d'algues ont été vérifiées dans un projet précédent. Ainsi, l'objectif de ce nouveau projet sera de tester si une supplémentation en extrait d’algue incorporé dans les croquettes chez la souris permet de prévenir les troubles émotionnels et mnésiques associés au surentrainement sportif.

Bénéfices attendus

Nous anticipons que ce projet permette de mettre en évidence un effet protecteur d'un ou plusieurs extraits d'algue sur les troubles de la santé cérébrale associés au surentrainement physique.

Procédures

Les animaux seront entrainés à courir sur des tapis de course 5 jours par semaine (pendant une période de 15 min jusqu'à 1h par jour) pendant 8 semaines avant de réaliser des tests comportementaux ( maximum de 6 tests ) permettant d'étudier leur anxiété et mémoire. Les tests comportementaux pouvant provoquer du stress sont de l’ordre de 6 min maximum. La période de restriction alimentaire pour le test de supression à la nouveauté (NSF) est d’une durée de 7h. Durant le test de préférence au sucrose, le temps d’isolement des animaux en cage avec séparateurs sera de 72 heures. Un prelèvement mandibulaire sera réalisé une seule fois, d'une durée de moins de 10 sec.

Impact sur les animaux

L’entrainement physique pourra être cause de nuisance pour les souris (fatigue). Un comportement anxieux et/ou de type dépressif (modélisé ici) est attendu chez les souris soumises à l’entrainement physique intense. Les tests comportementaux induisent un stress modéré à sévère de courte durée (le temps du test) chez l’animal. Les prélèvements sanguins à la veine mandibulaire présentent un degré de sévérité modéré durant la période du prélèvement. Ce prélèvement va générer une légère douleur et un stress dus à la contention pendant une période de 10 à 15 secondes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les cerveaux pour des analyses biochimiques qui permettront d'étudier les mécanismes neurobiologiques des extraits d'algue.

Remplacement

Le modèle d’entrainement physique ne peut pas être développé in vitro. L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives et de la fatigue ne peuvent être réalisées que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. L'étude de l'effet de régimes alimentaires ne peut pas non-plus être modélisé in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au mieux en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. La significativité de différence statistique entre plusieurs groupes sera déterminée en fonction des comparaisons souhaitées. D’après les études scientifiques sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 18 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique et sédation avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. Les tapis de course que nous avons acquis insufflent de l’air pour encourager les animaux à courir et n’induisent pas de choc électrique comme la majorité des tapis utilisés. L’hébergement se fera à 5 souris/cage et l’environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. Les expérimentateurs et soigneurs sont titulaires de leur certificat d’expérimentation animale niveau concepteur et/ou opérateur. Les expérimentateurs travaillent avec des animaux depuis de nombreuses années et sont très fortement sensibilisés au sujet du bien- être animal de par leur thématique de recherche (stress, anxiété, bien-être cérébral) et de par le travail de la SBEA (structure du bien-être animal). La SBEA procède à des contrôles réguliers de respect des procédures et de bien-être des animaux. Des points limites précoces ont été définis afin de limiter au mieux la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. La souris est un mammifère comme l’Homme, avec des cycles de reproduction rapides. Il est largement utilisé dans le champ de la cognition et de l'entrainement physique, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec les études antérieures. C’est un animal sur lequel les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Les souris mâles et femelles arriveront à l’animalerie à l’âge adulte (3 mois). L'industriel qui finance ce projet est intéressé par l'étude de la cognition chez le sportif adulte. C'est pour cette raison que les expérimentations seront réalisées sur des souris adultes.

Injectées vingt jours de suite avec une molécule qui accélère la ménopause, soumises à un frottis vaginal quotidien jusqu'à ce qu'elle s'installe, puis à deux prélèvements sanguins, 400 souris femelles de trois à cinq semaines subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Viennent ensuite des tests comportementaux de cinq à dix minutes censés mesurer l'anxiété, la dépression et la mémoire, que le porteur n'énumère pas. Le modèle sert à démontrer l'efficacité du complément alimentaire d'un industriel partenaire, avant une étude clinique chez des femmes ménopausées. Toutes les souris sont tuées pour que leurs cerveaux soient prélevés.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’une collaboration avec un industriel du complément alimentaire afin de démontrer l’efficacité de leur produit sur la prévention ou l’atténuation des symptômes associés à la ménopause (troubles de l’humeur, de la mémoire) chez des souris adultes femelles ainsi que les mécanismes d’action mis en jeu dans ces processus. Pour ce faire, un modèle de ménopause chez la souris sera utilisé grâce à des injections d’une molécule accélérant la mise en place de la ménopause chez les murins tout en laissant les ovaires et les autres organes (foie, rate, reins, cerveau) intacts. Ce modèle est couramment utilisé pour mimer le processus de ménopause chez la femme car il permet une transition progressive similaire à celle observée chez les femmes en péri-ménopause et ménopause. De plus, la ménopause est associée à l’apparition de symptômes chez la femme tels que des troubles anxieux, dépressifs ou encore cognitifs, que l’on retrouve également dans ce modèle de souris, justifiant son utilisation.

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de démontrer qu’une supplémentation nutritionnelle permet de limiter et de prévenir les symptômes associés à la ménopause tels que les comportements de type anxieux, dépressifs et les troubles cognitifs, fréquemment observés chez les femmes ménopausées et affectant significativement leur qualité de vie. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre de recherche portant sur la nutrition préventive et personnalisée. En effet, les compléments alimentaires constituent une alternative intéressante aux traitements hormonaux de substitution de la ménopause, souvent prescrits pour réduire les symptômes associés (bouffées de chaleur, troubles de l’humeur) mais dont l’efficacité est contrebalancée par des risques bien documentés : augmentation du risque de cancer du sein, de thrombose veineuse et d’accidents cardiovasculaires. Les résultats attendus sont une amélioration des symptômes associés à la ménopause chez les souris (comportements de type-anxieux et dépressifs, troubles de la mémoire), et serviront de résultats préliminaires pour la conduite d’une étude clinique chez les femmes ménopausées.

Procédures

Les souris femelles seront soumises à des injections (20 jours consécutifs, durée de 1 minute), des prélèvements de sang (2 prélèvements, durée de 1 minute) ainsi qu’à des frottis vaginaux (tous les jours jusqu’à la ménopause, durée de 1 minute). Les femelles réaliseront ensuite une série de tests comportementaux qui dureront entre 5 et 10 min chacun afin d'étudier leurs comportements anxieux et dépressifs et leurs capacités cognitives.

Impact sur les animaux

- Injections : irritation ou inflammation au niveau du site d’injection, douleurs faibles liées aux injections pendant la durée des injections. - Frottis vaginaux : induction d’un stress de courte durée (le temps du test) chez l’animal. - Tests comportementaux : induction d’un stress de courte durée (le temps du test) chez l’animal. - Troubles anxieux/dépressifs et troubles cognitifs liés au modèle. - Prélèvements sanguins : douleur locale, présence d’hématomes.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les cerveaux et réaliser des analyses biochimiques ou immunohistologiques.

Remplacement

L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, les troubles cognitifs et le modèle de ménopause ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. La sélection des nutriments à tester ne peut être réalisée sans recours à des modèles animaux, car les approches de modélisation ou les essais in vitro, bien qu’informatifs, ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions physiologiques systémiques nécessaires à l’évaluation précise de leur biodisponibilité, de leur métabolisme et de leurs effets à l’échelle de l’organisme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence 1) des altérations des performances cognitives et une hausse des troubles de l’humeur (anxiété, dépression) liés à la ménopause et 2) la prévention ou la réduction de ces altérations grâce aux supplémentations nutritionnelles.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique/sédatif avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. Les signes de stress ou d’inconfort chez la souris (changements comportementaux, posture voutée, diminution de l’activité) seront observés pendant toute la durée des injections et des analgésiques seront administrés si nécessaire.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris femelle âgée entre 3 et 5 semaines puisque ces dernières doivent avoir un cycle œstral mis en place. C’est un animal sur lequel les traitements nutritionnels et les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille qui peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Ce modèle de ménopause est pertinent pour étudier les symptômes associés chez la femme car il permet de mimer la perte graduelle de la fonction ovarienne (et donc les variations hormonales associées) classiquement observée chez la femme. De plus, il permet également d’étudier certains troubles liés à la ménopause tels que les modifications métaboliques, les troubles de l’humeur (anxiété, dépression) ou encore cognitifs (déficits d’attention, troubles de la mémoire).