Procédures sévères

Une souris qui ne réagit plus aux stimulations est tuée sur le champ, et celle dont l'état ne s'améliore pas rapidement l'est aussi. 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever le caillot. La veine cave inférieure de chaque animal est ligaturée au cours d'une opération de quarante minutes, puis une injection est faite six ou vingt-quatre heures plus tard, la mise à mort survenant quarante-huit heures après la chirurgie. Le porteur indique que l'intervention peut provoquer des saignements importants, une paralysie transitoire des pattes arrière et des difficultés de réveil, pour comparer une molécule expérimentale à un anticoagulant déjà utilisé en clinique.

Objectifs

L’hémostase, ou comment le corps arrête les saignements, est un mécanisme naturel qui permet de colmater une blessure. Pour ce faire, le corps forme un petit bouchon, appelé clou plaquettaire, fait de plaquettes sanguines et d’une protéine appelée fibrine. Ce bouchon stoppe le saignement. Mais quand ce système se dérègle, il peut provoquer une thrombose veineuse profonde : un caillot se forme dans une veine et cause une embolie pulmonaire. Pour traiter ces caillots, des médicaments anticoagulants sont utilisés, comme la tinzaparine, qui fluidifie le sang. Dans les cas les plus graves, on peut aussi injecter un médicament, qui dissout le caillot en détruisant la fibrine. Ce traitement s'appelle thrombolyse. Cependant, ces traitements ne sont pas toujours efficaces, et leur principal risque est d’augmenter les saignements ailleurs dans le corps. L’objectif de notre projet est de tester un nouveau type de médicament permettant de cibler son action directement au niveau du clou plaquettaire. Ce nouveau médicament permettrait de limiter grandement les risques de saignements associés aux anticoagulants et de traiter les patients avec des doses très faibles.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de mettre en évidence l’effet antithrombotique de la molecule-X et de montrer son efficacité en terme de traitement lors d’une thrombose veineuse. La molecule-X sera comparé à une molécule utilisée actuellement en clinique pour cette indication : la tinzaparine. Nous pourrons ainsi déterminer si la molecule-X pourrait avoir un effet antithrombotique plus important que la tinzaparine en traitement précoce et en traitement tardif, dans ce modèle de thrombose.

Procédures

Les animaux sont exposés à un prélèvement sanguin sous anesthésie (5 minutes), à une chirurgie sous anesthésie avec ligation de la veine inférieure cave (40 munutes). ils sont également exposés à une injection (5minutes) 6h ou 24h apres le chirurgie). 48 heures après la chirugie les animaux sont euthanasiés.

Impact sur les animaux

Lors de ces interventions, certains effets indésirables peuvent survenir. Par exemple, l’anesthésie peut parfois perturber la respiration des souris, la rendant irrégulière ou provoquant de courtes pauses. Il existe aussi un risque de saignement important au moment de l’intervention, notamment lorsqu’on sépare certains gros vaisseaux sanguins. Après l’opération, certaines souris peuvent avoir du mal à se réveiller ou ressentir de la douleur à l’endroit où l’incision a été faite. Dans certains cas, une faiblesse ou une paralysie transitoire des pattes arrière peut apparaître. De plus, les souris qui reçoivent un traitement peuvent présenter un risque accru de saignement.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. Nous devons prélever le thrombus pour étudier sa composition.

Remplacement

La capacité de la molecule test à cibler la fibrine in vitro a déjà été évaluée avec succès avec de la fibrine de souris et de la fibrine humaine, et a même été évalué en flux sur du plasma humain. Nous aurons uniquement 1 molécule à tester in vivo (sur les 5 synthétisées grace à ces tests in vitro). il est impossible à ce jour de reproduire in vitro l’intégralité du vaisseau (incluant la contractibilité, la perméabilité, les cellules souches musculaires lisses), ni l’activation des cellules endothéliales qui sont à l’origine de la formation de l’amas plaquettaire, ni de tester la molécule cible en présence de tous les éléments figurés du sang sans inhiber la formation de l’amas plaquettaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est le nombre minimal permettant d’obtenir une bonne interprétation statistique des résultats. L’analyse du thrombus et des composés sanguins seront réalisés dans les mêmes animaux afin de respecter la règle des 3R (Réduction).

Raffinement

Tout a été mis en place pour limiter la douleur et le stress des souris tout au long des procédures. Avant toute manipulation, les animaux disposent de quatre jours pour s’acclimater à leur nouvel environnement. Leur cage est enrichie avec du coton et du papier kraft, ce qui leur permet de construire un nid, un comportement naturel bénéfique pour leur bien-être. Elles sont également hébergées en groupe afin d’éviter l’isolement, source importante de stress. Pendant l’intervention chirurgicale, les souris sont maintenues au chaud pour prévenir toute hypothermie, et elles reçoivent une anesthésie complète ainsi qu’un traitement antidouleur adapté. Des soins spécifiques sont également prévus, comme la protection des yeux pendant l’anesthésie et l’application de collyre avant certaines injections. Après l’opération, un suivi attentif est mis en place : les souris reçoivent un traitement antidouleur régulier, des aliments enrichis en analgésiques sont mis à leur disposition, et leur état est évalué quotidiennement. Si une souris montre des signes de douleur ou de difficultés à se déplacer, des soins supplémentaires sont administrés. En l’absence d’amélioration rapide, l’animal est euthanasié pour éviter toute souffrance prolongée. De même, si une souris ne réagit plus aux stimulations, elle est immédiatement euthanasiée.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix de thrombose veineuse et reproduit au mieux les mécanismes de thrombose présents chez l'humain. Les animaux sont utilisés entre 5 et 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire et vasculaire fonctionnel et mature.

Des femelles gestantes sont soumises à un régime appauvri en fer, puis leurs petits sont tués par étapes, au stade embryonnaire, à un jour, quinze jours, vingt et un jours, trente jours et soixante jours de vie, pour prélever cerveau, duodénum, neurones de la moelle épinière, nerfs sciatiques, foie et peau du dos. 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, une partie des interventions se terminant par une exsanguination sous anesthésie profonde. Aucune ne sera réutilisée ni proposée à l'adoption, le porteur indiquant ignorer les effets tardifs que peut avoir la carence en fer sur ces lignées modifiées. Il écrit pourtant que le projet "ne propose aucune procédure pouvant nuire au bon développement et au bien-être des animaux", tout en classant les 400 souris au niveau de souffrance le plus élevé.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet IronTWIK1 est de montrer que le canal ionique TWIK1 joue un rôle central dans la maturation des fibres nerveuses et que cette fonction est liée au métabolisme du fer par les neurones concernés. Pour cela, nous souhaitons soumettre les femelles gestantes de 3 lignées de souris exprimant ou non des formes différentes du canal TWIK1 (absent, sélectif pour le potassium, non-sélectif pour le potassium) à deux régimes alimentaires se distinguant par des teneurs en fer différentes ; un dit « haut Fer » et un dit « bas Fer ». Nous sacrifierons les souriceaux à différents stades de leur développement pour analyser les niveaux de maturation des fibres nerveuses concernées ainsi que le développement du système nerveux de la peau.

Bénéfices attendus

Le canal TWIK1 participe avec les autres membres de la famille des canaux potassiques à deux domaines pore (K2P) au maintien du potentiel de repos des cellules excitables et à la protection neuronale. Les neurones liés au toucher et qui constituent les afférences principales des mécanorécepteurs de la peau et des poils sont caractérisés par la présence d’une couche de myéline. Bien qu'on ne s'explique toujours pas le rôle qu'il puisse y jouer, le canal TWIK1 apparait comme le mieux exprimé de sa famille dans ce type de fibres nerveuses. Or, ce canal potassique partage avec les protéines essentielles à la maturation et la myélinisation de ces même fibres nerveuses une localisation subcellulaire et une dépendance au pH qui laisse supposer qu'il pourrait en contrôler l’activité et la maturation. Une telle mise en évidence permettrait d’envisager un contrôle pharmacologique de cette maturation par le contrôle de l’activité ou de la sélectivité de ce canal potassique. Si cette hypothèse était avérée, ce projet, ouvrirait une porte encore jamais utilisée pour comprendre les mécanismes de la maturation des fibres nerveuses ni dans le traitement des maladies neurodégénératives par la pharmacologie liée à ces canaux ioniques.

Procédures

Tous prélèvement prévus dans ce projet sera effectué sur animal euthanasié. Modification : Les actes chirurgicaux pratiqués sur une petite partie des effectifs seront réalisés souris anesthésie profonde et de façon terminale, sans réveil des animaux.

Impact sur les animaux

Outre l’exposition des mères gestantes à un régime appauvri en fer, ce projet ne propose aucune procédure pouvant nuire au bon développement et au bien-être des animaux. Il est possible toutefois qu’une des trois lignées étudiées soit plus sensible que les autres à cette diminution du taux de fer dans la nourriture et que cette sensibilité différente se manifeste par un déficit nerveux altérant le développement normal des souriceaux. Le cas échéant, nous procéderons à l’application des règles établies pour les points critiques qui peuvent aller jusqu’à l'arrêt de la procédure et l'euthanasie des animaux.

Devenir

Nous ne savons pas à l'heure actuelle les effets que peut avoir un régime appauvri en Fer sur les souris génétiquement modifiées pour le canal TWIK1. Même si ces effets ne sont pas visibles en fin de procédure, nous devons envisager que ceux-ci puissent se développer plus tard c'est pourquoi nous ne pouvons pas choisir l'option de réutiliser, replacer ou adopter les animaux.

Remplacement

Le remplacement des souris, par l’utilisation de cultures cellulaires par exemple, a déjà largement été employé dans l’étude de ce canal. L’observation de TWIK1 a débuté par son clonage en 1996. En 2012, les mécanismes de changement de sélectivité lors d'une exposition à des pH acides ont été étudiés dans les ovocytes de Xénopes. Le canal TWIK1 est un canal fonctionnel pour lequel il est à présent indispensable d’étudier le mode de fonctionnement in vivo et son rôle physiologique. L’implication de TWIK1 dans la maturation des fibres nerveuses liées au toucher et à la proprioception nécessite l’utilisation d’un modèle animal car pour le moment, aucun système in vitro ne permet de reproduire l’ensemble des mécanismes physiologiques d’un organisme entier. De par ses similarités avec la physiologie humaine, et parce ce que nous possédons trois modèles murin génétiquement modifié pour TWIK1, la souris constitue le meilleur modèle pour adresser cette question. De plus, la caractérisation de cette maturation doit tenir compte du développement de l'animal et doit donc se faire sur un animal entier.

Réduction

Les 4 lignées de souris concernées par ce projet sont déjà disponibles dans le laboratoire où elles font l’objet d’une étude sur le rôle du canal TWIK1 dans la perception de la douleur et dont les procédures ont été validées par les instances ministèrielles. Ici, nous utiliserons indifféremment les animaux mâles et femelles. Une large recherche bibliographique nous a permis d’optimiser le nombre d’animaux à utiliser afin d’obtenir une réponse statistiquement significative. La maturation du système nerveux périphérique s’évalue d’une part par la mise en place des fibres spécialisées et d’autre part par la mesure de l’épaisseur de la gaine de myéline des fibres myélinisées. Cette dernière mesure, comparée à l’épaisseur de la fibre nerveuse sans la myéline, constitue un paramètre appelé rapport-g (ou g-ratio). Celui-ci constitue dans ce projet notre variable d’intérêt. Une consultation de la littérature traitant de ce sujet nous a permis, par un calcul de puissance statistique de déterminer la taille d’effectif la plus juste en tenant compte des conditions expérimentales (2 régimes différents, 2 sexes, 4 génotypes). Le calcul effectué dans ces conditions renvoie des effectifs de 6 souris par groupe. Sur tout animal qui entrera dans l’étude nous prélèverons le cerveau, le duodénum, certains neurones de la moelle épinière, les nerfs sciatiques et une section de peau correspondant à la partie haute du dos. Modification : Nous prélèverons également le foie qui est le principal lieu de stockage du Fer chez les mammifères.

Raffinement

Nous savons que les 3 lignées de souris TWIK1 sont parfaitement viables, qu’elles se reproduisent normalement et que leurs descendances ne présentent aucun signe de mauvais développement. Néanmoins, il n’est pas exclu qu’en présence d’un régime appauvri en Fer la qualité du lait des mères soit modifiée et qu’en fonction de leur génotype, les souriceaux présentent des troubles visibles du développement. Les animaux seront donc observés de façon bihebdomadaire afin de rechercher des signes cliniques indicateurs des différentes conséquences d’un tel régime sur l’organisme. Une feuille d’observation, incluant une grille de score, a été établie qui permettra également d’identifier précocement tout signe de stress ou de douleur. Cette grille de score contient des points limites précis. La mort n’étant pas un point limite acceptable, nous sortirons les souris de l’étude lorsqu’un des points limites sera atteint. Modification : Concernant l’acte de chirurgie pratiquée, celle sera terminal puisqu’elle se termine par une exsanguination. Néanmoins, et durant toute la durée de cet acte, les individus concernés seront profondément anesthésiés pour prévenir les risques de sensations de douleur.

Choix des espèces

L'étude que nous souhaitons mener vise à déterminer l'impact d'un canal TWIK1 excitateur ou inhibiteur sur des structures cérébrales complexes (Cerveau, duodenum, nerfs sciatique et peau velue...). En outre, les analyses de tissus que nous souhaitons réaliser doivent être faites à différents stades du développement. Elles ne peuvent donc pas être faites in vitro au niveau cellulaire car elles requièrent l'intégralité de l'animal. L'espèce animale utilisée sera la souris (Mus Musculus) car c'est le modèle le plus classiquement utilisé pour les manipulations génétiques. De plus, ce modèle présente de fortes similitudes avec l'humain pour les fonctions étudiées. En outre, des souris transgéniques issues du fond génétique des C57Bl6-J exprimant des formes différentes du canal TWIK1, sont déjà disponibles dans notre institut. Celles-ci sont parfaitement viables et ne montrent aucun signe délétère de leur développement. Ce projet concerne 4 lignées. Chaque lignée sera soumise à deux régimes : un dit à « haut Fer » et un dit à « bas fer ». Pour chacune nous prélèverons les embryons au stade E15, les nouveau-nés à P1 puis à P15, à P30 et à P60. Dans les ganglions de la racine dorsale (DRG), la mesure des niveaux d’expression des gènes codant les marqueurs spécifiques des différents types de fibres sensitives montre que dès le stade E13 les neurones qui nous intéressent sont déjà différenciés. En choisissant le stade embryonnaire E15, nous pourrons facilement cibler les neurones où le canal TWIK1 est le mieux exprimé. Le stade P1 nous permettra de visualiser le niveau d’innervation et la maturation des fibres nerveuses au moment de la naissance. Nous proposons les stades P15 et P30 car une étude montre qu’en absence des transporteurs du Fer, la myélinisation des fibres nerveuses est altérée à ces deux stades P15 et P30 puis est compensée pour revenir à un niveau normal. Lors de nos observations de la croissance des souris TWIK1-KO, nous avons observé une alopécie transitoire entre la 3ème et la 8ème semaine après la naissance. En choisissant P60, nous sous assurons d’être au-delà de cette 8ème semaine et de pouvoir observer ces éventuels phénomènes de compensation. Modification: Nous souhaitons le stade P21, pour lequel le phénotype d’alopécie est le plus prononcé. Par ailleurs, des cultures de cellules hépatiques primaires issues des différentes lignées et régimes permettront d’évaluer leur capacité de métabolisation du fer in vitro.

Anesthésiés puis opérés trente à quarante-cinq minutes pour une section du ligament croisé antérieur et l'ablation d'une partie du ménisque, 1 000 rats développent une arthrose du genou dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une semaine plus tard commencent les traitements, jusqu'à une injection par articulation et par semaine, ou une injection par site et par jour en intramusculaire, certaines administrations se faisant sur animal vigile. S'y ajoutent des prélèvements sanguins hebdomadaires, également sur animal vigile, le porteur prévoyant cris, agitation, œdème articulaire et boiterie. Tous sont tués à la fin de chaque procédure pour prélever articulations et organes, et le porteur affirme à trois reprises que l'animal reste "indispensable", faute de méthode reproduisant la déstabilisation mécanique du genou.

Objectifs

Alors que les affections ostéoarticulaires chroniques touchent tout particulièrement les adultes de plus de 50 ans, il n’existe actuellement aucun traitement permettant de guérir l’ensemble des signes cliniques associés aux rhumatismes, comme la dégradation du cartilage dont l’évolution conduit assurément à la pose de prothèse articulaire. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer l’efficacité de différents traitements dans un modèle d’arthrose chez le rat, modèle d’arthrose très largement décrit dans la littérature et obtenu par chirurgie déstabilisatrice de l’articulation du genou chez le rat. L’arthrose est causée par une altération des articulations liée à une usure progressive du cartilage associée à un remodelage des os situés à proximité, la formation d’excroissances osseuses, un affaiblissement des ligaments et des muscles et peut également s’accompagner d’une inflammation articulaire. Si les traitements médicamenteux actuels soulagent en partie les douleurs intenses et l’inflammation de ces maladies aucun de ces traitements n’est capable de freiner la dégradation du cartilage ou guérir la maladie. Aujourd’hui, seuls les traitements chirurgicaux très invasifs, comme la pose de prothèse permettent de retrouver la mobilité perdue due à l’arthrose. Ainsi, la découverte et le développement de nouveaux traitements agissant de façon globale sur l’inflammation, les atteintes osseuses et cartilagineuses ainsi que la douleur, caractéristiques de l’arthrose, est un enjeu majeur de santé publique alors que le vieillissement de la population ne fait qu’augmenter. L’objectif du projet est d’évaluer la capacité de traitements à limiter la dégradation du cartilage et/ou régénérer le cartilage dégradé dans un modèle d’arthrose chez le rat, dont les signes cliniques sont proches de ceux observés chez l’homme, obtenu par section du ligament croisé antérieur et ménisectomie partielle. Différents types de traitements seront testés.

Bénéfices attendus

Chaque protocole réalisé au sein de ce projet permettra de générer des informations sur l’efficacité des nouveaux traitements, tant sur l’inflammation que sur la reconstitution du cartilage ou le ralentissement de l’apparition des lésions dans un modèle d’arthrose induit par chirurgie au niveau du genou. A plus long terme, ce projet permettra d’obtenir des données importantes dans le cadre du développement de nouvelles approches pour le traitement des lésions arthrosiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une opération chirurgicale unique réalisée sous anesthésie et avec analgésie afin de réaliser la section du ligament croisé ainsi que l’ablation d’une partie du ménisque. Cette opération dure 30 à 45 min par animal, et la prise en charge analgésique s’étale les jours suivant l’opération. Les traitements seront réalisés au plus tôt 1 semaine après la chirurgie. Ces traitements durent moins de 5 min par animal, et sont réalisées sous anesthésie et après traitement anti-douleur. Elles pourront être répétées au maximum 1 fois par articulation et par semaine au cours du protocole ou 1 fois par site et par jour si administration intra-musculaire. Les traitements pourront également être réalisés au plus tôt 1 semaine après la chirurgie. Ces traitements durent moins de 5 min par animal, et sont réalisés sur animal vigile. Elles pourront être répétées tous les jours. Des prélèvements sanguins pourront également être réalisés. Ces prélèvements auront lieu sur animal vigile, et dureront moins de 5 min par animal. Ils pourront être répétés une fois par semaine tout au long du protocole.

Impact sur les animaux

La réalisation de la chirurgie peut s’accompagner d’une possible réaction inflammatoire transitoire au niveau de l’articulation opérée. De la même manière, l’apparition progressive des lésions arthrosiques est susceptible d’entrainer gène ou douleur. Les effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être un traumatisme exprimé par des cris/agitation pendant l’administration des traitements, ou le prélèvement de sang, une inflammation au niveau du site d’injection, un œdème articulaire ou une boiterie. Par ailleurs les prélèvements de sang peuvent entrainer du stress et de la douleur au site de prélèvement chez les animaux vigiles. Pour prévenir ces différents cas de figure, les animaux seront suivis avec précaution et des grilles d’évaluation clinique associée aux conduites à tenir en cas d’observation de ces signes ont été prévues.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Les organes d'intérêts, dont les articulations, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour évaluer les modifications de différents marqueurs induits par les traitements. Les organes et articulations prélevés seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques, histopathologiques et/ou d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les traitements que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, dans le cadre des pathologies comme l’arthrose, il est pour le moment impossible de reproduire in vitro les mécanismes de déstabilisation mécanique de l’articulation à l’origine de l’apparition des lésions. De la même façon, les interactions entre les différentes cellules et tissus composants l’articulation ne peuvent être mimées par un modèle simple de culture cellulaire. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de cette procédure.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours d’un protocole. Etant donné la variabilité probable des réponses aux produits, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données d’études similaires, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu (par exemple : traitement de référence utilisé comme comparateur), et après analyse des résultats d’études préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente). Lors des traitements et selon la voie d’administration, nous utiliserons un anesthésique, et des antalgiques dès l’apparition des premiers signes cliniques. Lors des traitements expérimentaux et lors des prises de mesures, nous maintiendrons les animaux dans une situation d’inconfort et de douleur pendant un minimum de temps. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine minimum. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus tôt possible au moment des suivis et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera pris en charge ou euthanasié

Choix des espèces

Il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer les lésions ostéoarticulaires. L’animal demeure indispensable à l’évaluation de produits. De plus le modèle d’arthrose par chirurgie chez le rat, utilisé depuis de nombreuses années, est maintenant reconnu pour être un modèle très prédictif pour la recherche médicale humaine et vétérinaire. En effet, le rat est l’espèce mammifère dont les caractéristiques physiologiques et réponses tissulaires sont proches de celles observées chez l'homme. Le rat, est fréquemment utilisé à des fins de recherche, car les résultats de produits thérapeutiques sont facilement transposables à l'homme, par simple approche/méthode statistique. La taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques analysables. Enfin, le rat est préféré à la souris pour l’étude de lésions cartilagineuses car le cartilage est plus épais et les effets d’une chirurgie chez le rat s’approchent de la pathologie humaine. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté au schéma thérapeutique des traitements étudiés. Bien que les pathologies rhumatiques puissent toucher des patients à n’importe quel âge, chez les rongeurs, la modélisation de ces maladies donne des résultats plus homogènes avec des rats adultes âgés de 8 à 10 semaines au début du protocole.

Créées par croisements pour porter un phénotype dommageable, les souris de deux nouvelles lignées mutantes sont tuées pour prélever leurs muscles. 316 souris vont être utilisées, toutes au niveau de souffrance sévère, sans être réutilisées, replacées ni adoptées. Aucune intervention ne leur est appliquée : l'atteinte tient à la mutation elle-même, dont le porteur indique qu'elle pourrait provoquer des ruptures musculaires sévères, des défauts de régénération ou la mort de l'animal. Il affirme que les cellules musculaires cultivées in vitro ne forment pas de jonction myotendineuse et conclut que "l'utilisation de l'animal reste nécessaire".

Objectifs

Nos muscles sont reliés aux tendons, qui eux-mêmes sont attachés aux os. Le point de connexion entre le muscle et le tendon, appelé jonction myotendineuse (JMT), est essentiel pour permettre le mouvement. Lorsque cette jonction est faible ou endommagée, cela peut entraîner des déchirures musculaires importantes ou une mauvaise récupération après une blessure. Pourtant, les scientifiques comprennent encore mal comment cette jonction se forme ou se régénère. Dans ce projet, nous étudions deux protéines spécifiques, qui semblent jouer un rôle crucial pendant la formation précoce de la jonction muscle–tendon. Ces protéines sont actives uniquement au début de la vie, puis cessent d’être exprimées. Pour comprendre leur rôle, nous utilisons des souris génétiquement modifiées chez qui nous pouvons les supprimer dans le muscle pendant le développement. Nous cherchons à savoir si leur absence empêche la bonne formation de la jonction.

Bénéfices attendus

À terme, cette étude pourrait nous aider à comprendre pourquoi certaines personnes subissent des blessures musculaires graves ou récupèrent mal après un effort physique, et elle pourrait ouvrir la voie à de meilleurs traitements pour favoriser la réparation musculaire.

Procédures

Les animaux ne subiront aucune intervention ou procédure, ils seront mis à mort pour analyses des tissus musculaires. Ce projet repose sur la création de 2 lignées de souris mutantes à phénotype dommageable par croisement.

Impact sur les animaux

Si les 2 protéines d’intérêts de ce projet jouent effectivement un rôle très important, leur perte dans le muscle ou au niveau de la jonction myotendineuse, pourrait entraîner des ruptures musculaires sévères, des défauts de régénération ou la mort de l’animal.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

Bien qu’il soit possible de différencier des cellules musculaires in vitro, celles-ci ne possèdent pas de jonction myotendineuse et restent immatures. Par conséquent, cet aspect de la biologie musculaire ne peut pas être étudié de manière pertinente à l’aide de modèles en culture cellulaire. L’utilisation de l’animal reste nécessaire pour cette application.

Réduction

Nous recueillerons tous les tissus musculaires pertinents de chaque souris, ce qui réduira considérablement le nombre de souris utilisées. Nous avons déterminé, dans des études précédentes, que 6 souris (3 femelles et 3 mâles) par groupe et par type d’analyse seraient nécessaire afin d’obtenir une robustesse statistique. Pour chaque lignée de souris mutante, nous commencerons par tester le dernier point temporel de l'étude afin de vérifier s'il existe un phénotype dommageable, observable à l’œil nu, chez les animaux mutants pour nos 2 protéines d’intérêt. Ce n'est que lorsque ce sera le cas que nous procéderons à la collecte des points temporels plus précoces. Si les animaux ne présentent pas de phénotypes à 2 mois, alors les procédures prendront fin prématurément. Nous utiliserons les tests statistiques appropriés pour l’analyses des résultats.

Raffinement

Nous n’attendons pas de nuisances pour les animaux simples et doubles mutantes, mais comme ces lignées seront nouvelles dans notre EU, elles seront évaluées pour un éventuel phénotype dommageable d’après nos procédures. Par contre nous attendons un phénotype pour les triples mutants étudiés, ils seront donc aussi évalués. Ils seront observés quotidiennement et pesés 1x/semaine de leur naissance jusqu’à la fin de la procédure (2 mois). Si chez les 1ères portées observées et pesées, au minimum 2 portées d’au moins 2 couples différents avec un total d’au moins 14 femelles et 14 mâles, nous ne voyons pas de différence de poids avant l’âge de 6 semaines par exemple, alors nous ne pèserons pas les animaux des portées suivantes avant cet âge. Si par contre nous constatons une différence de poids et/ou l’apparition de phénotype alors le suivi des animaux sera renforcé en fonction des recommandations de notre vétérinaire. Le suivi comprend l’observation de l’état de santé général en fonction de l’âge (problème de croissance, motricité, apathie, aspect du pelage, aspect physique, vigilance, interaction sociale, toilettage) (Fiche d’évaluation en annexe). Un carré de chanvre sera placé dans chaque cage. Si lors de l’évaluation des lignées simples ou doubles mutantes, un phénotype dommageable devait être mis en évidence, alors nous rédigerons une demande d’autorisation de projet pour la maintenance des lignées concernées. Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Le niveau de douleur correspondra au niveau de sévérité du phénotype si un phénotype dommageable est constaté grâce à la procédure d’évaluation de notre EU (en annexe). La présence de douleur sera aussi confirmée par l’échelle d’évaluation des expressions faciales de la souris du NC3Rs (en annexe). Toute douleur sera traitée par l’administration d’un anti-inflammatoire ou d’un analgésique. Si 2h après la 1ère injection d’analgésique l'animal est toujours en souffrance (niveau de douleur 1, 2 ou 3) alors il sera mis à mort (traitement inefficace). Si après 2 jours d’analgésique à raison d'une injection par jour efficace sur la douleur (retour à un niveau 0), la douleur revient le 3ème jour (douleur chronique) alors l'animal sera mis à mort. Si les souris ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes) ou à accéder au biberon, de la nourriture en gel sera placée dans le fond de la cage.

Choix des espèces

Le modèle murin a permis de découvrir le schéma d'expression de nos 2 protéines d’intérêt. De plus, toutes les lignées exprimant la protéine Cre recombinase sous le contrôle de promoteurs spécifiques pour le muscle ou pour la jonction myotendineuse ont été développés uniquement chez la souris. Par conséquent, les souris sont le modèle le plus approprié pour ce projet. Pour nos 2 lignées de souris mutantes étudiées, nous avons fixé l’âge de 2 mois comme point final, car c’est à ce stade que la maturation musculaire est considérée comme pleinement achevée. Si aucun phénotype dommageable, observable à l’œil nu, n’apparaît d’ici là, nous pourrons conclure que nos protéines d’intérêt ne jouent probablement pas un rôle majeur.