Procédures sévères

Prise de sang et écouvillons dans la gorge et le cloaque avant l'étude, infection par aérosol ou dépôt du virus dans le passage reliant le nez et la gorge, puis prélèvements répétés à huit reprises sur quatorze jours, tous sur animaux vigiles : 192 canes reproductrices Pékin sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la moitié d'entre elles et sévère pour l'autre moitié. L'infection peut provoquer abattement, torticolis, tremblements, paralysie, détresse respiratoire et hémorragies dès 24 à 48 heures, jusqu'à la mort spontanée. Il s'agit de comparer trois protocoles de vaccination à deux âges de ponte, chez des canes que le porteur qualifie de "particulièrement précieuses" parce qu'elles fournissent les 34 millions de canetons d'élevage produits chaque année. Toutes seront tuées à l'issue, l'arrêté du 25 septembre 2023 imposant l'abattage des animaux exposés au virus.

Objectifs

Les virus de l’influenza aviaire hautement pathogènes (VIAHP) de la lignée H5 ont provoqué ces dernières années des pertes majeures chez les volailles d’élevage. Leur impact se manifeste par l’abattage massif de troupeaux infectés, la mortalité d’espèces sauvages parfois menacées, et un risque croissant de transmission inter-espèces, notamment vers les mammifères et potentiellement l’Homme. La vaccination des canards d’élevage contre ces VIAHP H5 est effective en France depuis 2023. Elle a permis de considérablement réduire les dégâts dus aux VIAHP, mais l’optimisation des protocoles de vaccination est encore en cours, en particulier pour certains « types » de canards comme les canes reproductrices. Ces canes reproductrices d’élevage, de l’espèce « canard Pékin » produisent en effet les œufs qui donneront les futurs canetons d’élevage (34 millions de canetons par an), et ont donc un rôle crucial parmi les canards d’élevage. Ces canes sont particulièrement précieuses parce qu’elles sont issues d’une sélection génétique longue et coûteuse et sont peu nombreuses. Leur espérance de vie est de l’ordre de 70 semaines : il est donc important de s’assurer que leur protection vaccinale contre les VIAHP H5 est efficace tout au long de leur vie, en particulier durant la ponte. Les vétérinaires responsables d’élevages de canes reproductrices ont mis en place, dans le contexte des soins vétérinaires, des protocoles de vaccination renforcés pour optimiser la protection vaccinale chez ces animaux. Le présent projet vise à évaluer l’efficacité de ces protocoles sur le développement de la maladie et l’excrétion de virus en réalisant des épreuves virulentes, c’est-à-dire en infectant dans des installations confinées des animaux vaccinés ou pas. Ces épreuves sont l’approche la plus rigoureuse permettant de vérifier si la vaccination protège les animaux.

Bénéfices attendus

Le projet induira des bénéfices à court et moyen terme. A court terme, il permettra de déterminer quels sont les protocoles de vaccination optimaux protégeant de façon efficace et durable les canes reproductrices contre les VIAHP H5. Ces protocoles pourront donc être communiqués auprès des vétérinaires et professionnels de l’élevage pour être mis en œuvre sur le terrain. Des animaux avec une protection vaccinale optimale ne développent pas de maladie s’ils sont exposés au virus et produisent très peu voire pas de virus par rapport à des animaux non vaccinés. Cette production réduite ou disparue évite donc de contaminer d’autres animaux. A moyen terme, cette protection des canes reproductrices contribuera à réduire au minimum les dégâts engendrés par les VIAHP chez les volailles, oiseaux sauvages et potentiellement mammifères dont l’homme en protégeant les animaux et en « cassant » la chaîne de transmission de ces virus.

Procédures

Avant de commencer l'étude, une prise de sang et des écouvillons dans la gorge et le cloaque seront effectués. Au début de la procédure, les animaux vaccinés ou non seront infectés soit par inhalation d'un aérosol contenant le virus, soit en déposant une solution contenant le virus dans le passage reliant le nez et la gorge (voie intra-choanale). Après infection, des prélèvements seront réalisés à plusieurs moments (0, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14 jours après l'infection) : prises de sang (volume réduit à chaque prélèvement), écouvillons dans la gorge et le cloaque. Tous les prélèvements seront réalisés sur animaux vigiles. Chaque prélèvement durera moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Chez la volaille, la contention nécessaire aux prélèvements (écouvillons, prises de sang) peut induire un stress des animaux. Les prises de sang peuvent induire la formation d’hématomes sous-cutanés, notamment en cas de mauvaise manipulation. Un saignement prolongé au point de ponction est également possible, surtout si la coagulation est altérée ou si le site n’est pas correctement comprimé après le prélèvement. Les VIAHP peuvent entraîner un tableau clinique sévère pouvant aller jusqu’à la mort chez les espèces-cibles. Les signes cliniques observés sont susceptibles de varier en fonction des souches virales, de l’espèce cible et du statut vaccinal. Ainsi, certaines souches virales n’entraînent pas de signes cliniques notable chez les canards (mais demeurent hautement pathogènes pour les poulets). Au contraire, d’autres souches peuvent induire une symptomatologie sévère chez le canard. Les effets indésirables incluent : signes généraux d’abattement, des signes nerveux (torticolis, tremblement, paralysie), une détresse respiratoire, des hémorragies, une mortalité spontanée. Ces signes, lorsqu’ils surviennent, peuvent être observés dès 24 à 48 heures post-inoculation et s’intensifier jusqu’à la mort des animaux. Le score clinique en annexe 2 prend en compte ces données. Ces signes devraient être réduits voire absent chez les animaux vaccinés.

Devenir

À la fin de l’étude toutes les canes seront euthanasiées. Cette décision est conforme à l’arrêté du 25 septembre 2023 relatif aux mesures de surveillance, de prévention, de lutte et de vaccination contre l’influenza aviaire hautement pathogène qui impose l’abattage des animaux exposés à ce virus. En effet, ces animaux ne peuvent pas être réintroduits dans un élevage ou utilisés pour d’autres projets car ils représentent un risque sanitaire.

Remplacement

Le projet a pour but d’évaluer les paramètres cliniques, les paramètres d’excrétion, de transmission et de diffusion des VIAHP ainsi que l’impact de la vaccination sur ces derniers. Des épreuves virulentes sur animal (motif de la présente saisine) sont donc nécessaires et non remplaçables par un modèle ne reproduisant pas le sujet entier.

Réduction

Ce projet a été conçu pour utiliser un nombre de canards minimal nécessaire à l’obtention de résultats scientifiquement robustes. Une analyse statistique préalable a été réalisée afin de garantir une sensibilité suffisante pour détecter des différences biologiquement pertinentes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Un maximum de 192 oiseaux sera dont utilisé en tenant en compte deux facteurs majeurs : l’âge des animaux et le protocole vaccinal. Soit 32 animaux par procédure (8 individus par isolateur x 4 isolateurs) ; procédure répétée 6 fois pour tenir compte du facteur « âge » et du facteur « protocole vaccinal » (2 âges et 3 protocoles).

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, les mesures suivantes seront appliquées : 1. Période d’acclimatation de 72h en isolateur dès leur arrivée. 2. Enrichissement du milieu incluant cordelettes avec jouet de type bouchon suspendu, miroir avec clochette, possibilité pour les canards d’exprimer un comportement de toilettage à l’aide des dispositifs d’abreuvement. 3. Mise en place d’un suivi clinique quotidien, et biquotidien de 9h00 à 11h le matin ainsi qu’un second passage à 18h en phase d’infection précoce (5 premiers jours) avec grille de suivi et de notation clinique par le vétérinaire responsable de l’essai (annexe). Une caméra sera installée dans l’animalerie et à l’extérieur des isolateurs afin de surveiller les animaux plus régulièrement, notamment en phase d’infection précoce. 4. Utilisation d’une garde lors des prises de sang au sinus occipital ainsi qu’une compression au niveau du site d’introduction de l’aiguille après la prise de sang.

Choix des espèces

Les canards et notamment les canes reproductrices Pékin sont une espèce soumise à la vaccination déployée depuis septembre 2023 et jouent un rôle clef dans la filière avicole française en y constituant l’un des maillons primaires et dans l’écologie des VIAHP en excrétant le virus tout en présentant des degrés variables d’expression clinique (allant d’une absence de signes cliniques jusqu’à la mort selon les souches virales). À ce titre, il n’existe pas de meilleur modèle expérimental que l’espèce cible elle-même pour étudier l’impact des VIAHP et l’efficacité des mesures de prévention. Les canes Pekin domestiques (Anas platyrhynchos domesticus) utilisées seront des animaux adultes de 50 à 70 semaines d’âge et au maximum 3,5 kg. Ces animaux adultes étant sélectionnés selon des critères de production de viande et d’œufs ne volent pas en raison de leur poids corporel important en rapport au développement de leurs muscles pectoraux. L’objectif du projet étant d’évaluer la protection vaccinale chez des animaux de cet âge. Les oiseaux seront pesés avant le transfert de l’élevage vers l’animalerie. Les âges choisis correspondent respectivement au milieu et à la fin de la période de ponte. Cette dernière est une période à risque pour laquelle la protection vaccinale pourrait être moindre, du fait de la durée depuis la dernière injection vaccinale (datant d’avant l’entrée en ponte, soit à environ 25 semaines d’âge) et de l’impact cumulé de la période de ponte, cette dernière sollicitant la physiologie des animaux.

Les souris paralysées par le modèle de sclérose en plaques peuvent être gardées jusqu'à trois semaines après l'apparition des premiers signes. 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Une partie subit une chirurgie de la moelle épinière de trente minutes pour qu'on y injecte un agent qui détruit la myéline, puis un traitement quotidien pendant quatre à dix-sept jours. Une autre est immunisée par quatre injections, ce qui installe une paralysie progressive des membres, une perte de poids et des difficultés à boire et à manger, pour évaluer des molécules censées régénérer la myéline, effet encore hypothétique quand la paralysie, elle, fait partie du protocole.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire du système nerveux central (cerveau, moelle épinière et nerfs optiques) du jeune adulte au cours de laquelle la gaine de myéline protégeant les axones est détruite (démyélinisation). Cette perte de myéline se traduit, à long terme, par des troubles sensitifs et moteurs (fourmillements, troubles de l’équilibre, troubles visuels, paralysies…). La SEP a une plus forte prévalence chez la femme (3/4 de femme) et touche plus de 100 000 personnes en France. Deux mille cinq cents nouveaux cas de SEP sont diagnostiqués chaque année. Cette maladie représente la première cause de handicap sévère non traumatique du jeune adulte. Elle est caractérisée par des épisodes inflammatoires et de démyélinisation pouvant affecter toutes les structures du système nerveux central. A ce jour, les traitements de la SEP ciblent uniquement la composante inflammatoire de la maladie mais ces traitements ont peu d’effets sur la remyélinisation (régénération de la gaine de myéline). Le développement de stratégies pharmacologiques visant à promouvoir la remyélinisation est donc un enjeu thérapeutique majeur pour le traitement de la SEP. L’objectif de ce projet vise à évaluer l’effet de molécules au potentiel myélinisant prometteur, dans des modèles murins de la sclérose en plaques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’évaluer l’effet de composés potentiellement capable de favoriser la régénération de la gaine de myéline endommagée. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre d’identifier une ou plusieurs molécules candidates permettant d’augmenter significativement la remyélinisation et donc de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de la sclérose en plaques. En effet ces traitements induisant une régénération de la gaine de myéline pourraient venir compléter les traitements actuels qui agissent principalement sur la composante inflammatoire de la maladie, et ainsi aboutir à une prise en charge plus globale de la sclérose en plaques.

Procédures

Nous utiliserons deux modèles expérimentaux de la sclérose en plaques chez la souris, afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de plusieurs molécules candidates. Le premier modèle consiste pour chaque animal en une injection d’un agent induisant une lésion de la myéline, au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Cette intervention dure environ 30 minutes et n’est réalisée qu’une fois par animal. Les animaux seront ensuite traités quotidiennement de 4 à 17jours avec les molécules d’intérêt (durée inférieure à 1 minute pour chaque administration). Le deuxième modèle est un modèle complémentaire où la perte de myéline est induite par immunisation. Pour cela les animaux recevront, sous anesthésie générale, 2 injections (durée inférieure à 1 minute par injection) et 2 injections espacées de 2 jours (durée inférieure à 5 minutes par injection). Pour cette partie de l’étude, les animaux vigiles seront traités quotidiennement durant 2 semaines avec les molécules d’intérêt (durée inférieure à 1 minute pour chaque administration). L’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire afin de réaliser des prélèvements d’intérêt.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux lors des procédures sont liées à la chirurgie et à l’immunisation. Lors de la chirurgie nécessaire à la réalisation de lésions de la moelle épinière, les risques sont l’hypothermie, des lésions musculaires, des saignements et des douleurs post-opératoires légères durant 48 heures. Pour l’immunisation: plaie au site d’injection, paralysie progressive et temporaire des animaux, suite à l’installation du modèle entrainant des difficultés à se déplacer et à s’abreuver. Les injections et le traitement peuvent entrainer respectivement un hématome au site d’injection et une irritation des voies supérieurs si le traitement est répété. La mise en place de notre modèle de lésion de la moelle épinière impliquera une chirurgie et une anesthésie générale. L’anesthésie sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardiorespiratoire. La chirurgie pourra entrainer une douleur et un inconfort post-opératoire durant 48 heures environ. Le modèle d’immunisation peut entrainer une paralysie progressive et temporaire des animaux, une perte de poids et des difficultés pour se nourrir et s’abreuver à partir de 10 jours environ après l’immunisation. Les animaux seront gardés maximum 3 semaines après l’apparition des premiers signes cliniques liés à ce modèle. Des lésions cutanées peuvent également survenir suite aux injections (en lien avec le produit injecté pour l’immunisation). Les administrations de composés d’intérêt pourront générer un stress et une brève et légère douleur. Les injections des composés pourront entrainer l’apparition d’hématome ou d’induration au site d’injection. Les gavages répétés pourront être associés à une irritation des voies supérieures.

Devenir

Une analyse post mortem de tissus d’intérêt est nécessaire pour évaluer le potentiel des molécules testées dans les deux modèles ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Après des essais préalables sur différents modèles cellulaires, seuls les meilleurs candidats seront retenus. Il sera ensuite nécessaire de recourir à un modèle animal pour évaluer l’effet des composés sur un organisme entier. Seul le modèle animal est pertinent pour cette étude car nous pouvons ainsi analyser l’effet de ces molécules dans un contexte in vivo reproduisant le mieux les caractéristiques des lésions observées dans la pathologie humaine.

Réduction

Des études seront menées en amont afin de raffiner et réduire au maximum le nombre de souris utilisées (détermination des doses à administrer par exemple). Les modèles de la pathologie qui seront utilisés ont déjà démontré leur pertinence pour l’analyse des mécanismes de réparation des lésions de la myéline et de la composante inflammatoire observée dans la maladie. Ils sont bien connus et reproductibles permettant donc l’évaluation de l’efficacité de composé. Le nombre d’animaux (600 au total) est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables.

Raffinement

Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie générale et analgésie pendant toutes les interventions qui le nécessitent. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par le vétérinaire. Ils seront hébergés dans une animalerie agréée dans des conditions de température et d’hydrométrie conformes à la réglementation. De plus, ils seront hébergés en groupe et bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement (un nid et un bâton de bois à ronger). Durant nos procédures expérimentales nous assurerons une surveillance adaptée en fonction des étapes, telle qu’une surveillance rapprochée en période post-chirurgicale et lors de l’expression des signes cliniques de notre modèle d’immunisation. Nous apporterons un soutien nutritionnel aux animaux lorsque nécessaire pour faciliter leur accès à la nourriture et à l’eau. Nous nous assurerons que l’état général des animaux soit compatible avec l’administration des composés à évaluer avant de commencer les traitements. Pour ces composés, nous vérifierons les données de d’études précédentes pour nous assurer de choisir les bonnes conditions d’administration et l’absence de toxicité attendue avant de les utiliser chez nos animaux. Pour toutes nos procédures, des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

La souris, grâce à sa forte homologie génétique avec l’homme, est un modèle de choix pour l’étude de nombreuses pathologies humaines. Dans le cadre de l’étude de la sclérose en plaques il existe 2 modèles bien connus et caractérisés qui permettent de reproduire les caractéristiques de la pathologie. Ainsi, pour ce projet le seul moyen à notre disposition pour analyser le processus de réparation de lésions de la myéline est d’utiliser des modèles murins bien établis du processus de démyélinisation (destruction de la myéline) et remyélinisation (régénération de la myéline). Il nous est donc impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas les animaux, et plus précisément la souris. Les animaux utilisés seront âgés d’au moins 12 semaines, afin d’avoir atteint une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes). De plus à ce stade du développement, la chirurgie est facilitée par la relative faible masse musculaire et de tissus graisseux des animaux, permettant ainsi une meilleure accessibilité à la moelle épinière lors de la chirurgie.

Ce sont des tests de toxicité commandés pour constituer des dossiers d'autorisation de mise sur le marché. 1 900 souris et 7 600 rats vont y être utilisés, tous tués à l'issue pour analyse anatomopathologique, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Ils reçoivent des molécules dont les effets toxiques sont par définition inconnus, subissent des prélèvements de sang répétés, des biopsies de peau sous anesthésie, jusqu'à seize heures d'isolement pour le recueil d'urine, et une partie est réutilisée d'une étude à l'autre après une période de repos. Sur le remplacement, l'établissement se borne à renvoyer aux lignes directrices des instances internationales, qui rendraient le recours in vivo "nécessaire".

Objectifs

Ce projet vise à d’évaluer la sécurité et la toxicité de molécules avant leur utilisation, selon les recommandations internationales des instances médicales et pharmaceutiques, chez deux espèces de rongeurs : la souris et le rat. Leur évaluation est effectuée conformément aux exigences des autorités réglementaires et nécessaire pour leur mise sur le marché et avant tout utilisation chez l’humain. Pour chaque molécule, afin de caractériser ses potentiels effets toxiques, d’identifier ses organes cibles et de définir ses marges de sécurité, plusieurs études complémentaires et séquentielles sont nécessaires : - Des études préliminaires qui permettent d’identifier la dose appropriée pour les études réglementaires ultérieures. Elles aident également à déterminer les effets du xénobiotique afin de confirmer les études règlementaires et de garantir le succès du dépôt d'une demande d'autorisation de mise sur le marché. - Des études de toxicologie, qui ont pour objectif de déterminer le niveau sans effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé, en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale. Elles permettent aussi de collecter des données de toxicité et de pharmacocinétique du xénobiotique avant que son utilisation soit autorisée. Le projet s’inscrit dans une démarche d’amélioration continue du bien-être animal en appliquant les principes des 3R. Les procédures sont optimisées pour limiter le nombre d’animaux requis, agir en étapes progressive pour raffiner le choix des doses et réduire la douleur et la contrainte, notamment par l’utilisation de techniques moins invasives et la validation d’approches alternatives.

Bénéfices attendus

Les études de toxicologie ont pour objectif de déterminer le niveau sans effets toxiques ou le niveau sans effet indésirable observé en fonction de la durée du traitement et de l’espèce animale, et de collecter des données de toxicité et de pharmacocinétique nécessaire à leur autorisation d’utilisation. Ces données sont des prérequis avant le passage aux essais cliniques chez l’humain ainsi que pour la constitution du dossier d’autorisation de mise sur le marché. Par ailleurs, le projet favorisera l’application des principes des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner), en optimisant les protocoles d’étude et en limitant l’impact sur le bien-être animal, ce qui renforcera la qualité scientifique des résultats et la conformité aux normes éthiques et réglementaires.

Procédures

Les animaux sont soumis dans ce projet : - des prélèvements de sang réguliers réalisés dans le cadre de recommandations vétérinaires, vigiles (sauf en cas d'anesthésie prévus pour d'autres prélèvements, cf ci-dessous). Chaque prélèvement dure quelques minutes, le nombre total est établi en fonction des caractéristiques du produit testé et limité en suivant les recommandations vétérinaires internationales. -des prélèvements d'urine, de manière passif (isolement jusqu’à recueil d'urine ou bien de 16h maximum), ou échoguidé sous sédations (quelques minutes). Généralement, un prélèvement au début et un prélèvement en fin d’étude sont suffisants. - prélèvement d’autres fluides biologiques (autres que le sang) : jusqu’à une fois par semaine, sous anesthésie d’une quinzaine de minutes environs - des biopsies de peau par ponction échoguidée (mini invasive), sous anesthésie (10 minutes environ) - des contention manuelle, notamment dans le cadre d'examen clinique pour détecter des effets toxiques, d’environ 10 minutes. Afin d’éviter la répétition d’actes anesthésiques, les prélèvements peuvent être réalisés au cours d’une même anesthésie, permettant, en 10 à 15 minutes, de recueillir plusieurs échantillons de tissus et liquides biologiques. A chaque étude, tous ces prélèvements ne sont pas effectués, à l’exception des prélèvements de sang qui sont systématiques. Ils sont choisis selon la nature du produit testé et les données préliminaires déjà connues (in vivo ou in vitro).

Impact sur les animaux

Trois catégories de nuisances peuvent être provoqués chez les animaux utilisés dans ce projet. Elles sont toutes prises de manière préventives pour réduire leur impact. - Liées aux manipulations vigiles : en cours d’étude, les observations cliniques, ainsi que certaines voies d’administration, peuvent nécessiter d’une manipulation et une contention manuelle des animaux. Elles sont faites selon les bonnes pratiques vétérinaires mais cela peut néanmoins engendrer un stress. - Liées aux prélèvements/administration : la réalisation de prélèvements de tissus biologiques (principalement de sang) et l’administration répétée de la molécule testée peut provoquer des lésions et un stress des animaux en cas de réalisation incorrectes, d’individus plus fragiles ou bien de l’immobilisation nécessaire pour certaines voies d’administration. De plus,, les animaux sont placés en cage individuelle pendant la phase d’évaluation de prélèvement d’urine. - Liées à une toxicité de la molécule testée : les études de toxicologie visent à évaluer la toxicité d’une molécule. Ce type de nuisances est difficilement estimable : selon le mécanisme d’action (anticorps, anticancéreux, neurologique, etc), la voie d’administration, ou encore la biodistribution, divers effets toxiques sont possibles (neurologique, immunologiques, inflammation, métabolique, etc).

Devenir

Les études de toxicologie nécessitent généralement une analyse pathologie et donc la mise à mort des animaux d'après les recommandations des instances pharmaceutiques et médicales internationales.

Remplacement

Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives permettant d'obtenir toutes les informations collectées grâce à ces études. Suivant les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques internationales, il est nécessaire de recourir à des modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est fixé au minimum permettant de garantir la fiabilité des données obtenues d’après les lignes directrices des instances médicales et pharmaceutiques internationales. Ce nombre est considéré comme le minimum acceptable permettant une interprétation pertinente des données et la caractérisation correcte des effets toxiques potentiels. Afin de le réduire, des animaux peuvent faire plusieurs études préliminaires (ou de pharmacocinétique) après une période de repos (wash-out, dépendant de la demi-vie du xénobiotique testé), dans le cadre d’une utilisation continue. Des études pilotes sont menées, lorsque cela est pertinent, afin d’optimiser les conditions expérimentales et d’affiner les protocoles, ce qui permet de réduire le besoin en animaux pour les études principales. De plus, les tissus et échantillons biologiques collectés au cours des études sont réutilisés pour des analyses complémentaires (histopathologie, biomarqueurs, etc.), ce qui évite de recourir à des animaux supplémentaires pour des tests additionnels. L’ensemble de ces mesures s’inscrit dans une démarche proactive de réduction du nombre d’animaux, en accord avec les principes des 3R et les exigences des bonnes pratiques de laboratoire. La réutilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales de gravité réelle ‘’légère’’ ou ‘’modérée’’ est possible tant que ces animaux n’ont pas reçu de xénobiotique en cours de test et après une période de repos d'au moins 2 semaines. Cela permet de réduire le nombre global d’animaux utilisé au sein de l’établissement et d’utilisés des animaux bien habitués aux manipulations liées aux études. Cette réutilisation est validée par un vétérinaire et la structure en charge du bien-être animale.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 5 jours minimum pour les rongeurs est respectée à réception des animaux. Pendant cette période d’acclimatation, les animaux peuvent bénéficier d’un programme d’habituation adapté aux procédures qu’ils vont subir, afin de réduire leur stress et de favoriser leur coopération. Ce programme inclut des manipulations progressives et régulières, permettant aux animaux de s’habituer au contact humain et aux équipements utilisés. Un programme d’enrichissements validé par la structure en charge du bien-être animale. est appliqué quotidiennement pour garantir des conditions de vie optimales/minimiser les impacts des expérimentations.. Les animaux sont hébergés collectivement, sauf exceptions (bagarre, blessure), avec des enrichissements adaptés à leurs besoins. L’isolement est validé par un vétérinaire et fait l’objet d’un suivi structure en charge du bien-être animale.. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe clinique anormal et prendre rapidement les mesures nécessaires (réhydratation, isolement pour soin). Toute anomalie est rapportée au vétérinaire, qui prescrit un traitement si nécessaire. Un suivi clinique est en place, un fois par semaine pendant la phase d’administration du principe actif. L’examen clinique complet est effectué par un personnel formé pour évaluer les fonctions motrices, nerveuses, cardiaques, respiratoires, la température et l’état général des animaux. Un vétérinaire est présent aux heures ouvrées, et une astreinte vétérinaire est disponible 24h/24 et 7j/7. Une traçabilité des animaux/des actes est assurée pour permettre leur suivi et analyse. L’établissement développe des techniques les moins invasives possibles comme des gilets de télémétrie permettant d’analyser les fonctions cardiaques, respiratoires et l’activité sans contrainte physique ou pose d’implants par chirurgie. Les volumes prélevés/administrés respectent lesrecommandations vétérinaires.

Choix des espèces

D’un point de vue réglementaire, ces animaux sont des espèces reconnues pour leur aptitude à prédire les effets pharmacologiques, indésirables et/ou toxiques de xénobiotiques. Les lignes directrices instances médicales et pharmaceutiques internationales requièrent généralement deux espèces (rongeurs et non rongeurs) selon la nature du produit à tester (molécule chimique de synthèse, peptide, protéine, anticorps monoclonal ou produit de thérapie génique ou cellulaire). Des demandes d’autorisations de projet pour des espèces non rongeurs ont déjà été déposées par l’établissement. Selon ces lignes directrices, il convient d’utiliser de jeunes animaux sains après sevrage. Les rongeurs sont inclus en étude en général à partir de 6 semaines.

Injectées dans la glande mammaire, dans la veine ou derrière l'œil, 1 826 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Une partie reçoit des cellules tumorales, dont la croissance peut gêner les déplacements et faire ulcérer la peau, et la taille de la tumeur est mesurée de façon répétée sous anesthésie. Il s'agit de comprendre comment une catégorie de cellules immunitaires, les cellules dendritiques de type 1, coordonne la défense contre le cancer du sein. Le porteur écrit que les interventions se limitent à des manipulations courtes réalisées sous anesthésie, tout en déclarant pour une partie des animaux un niveau de souffrance sévère.

Objectifs

Ce projet prolonge un travail précédent qui vise à mieux comprendre comment certaines cellules du système immunitaire, appelées cellules dendritiques de type 1, aident le corps à se défendre contre le cancer. Ces cellules ne détruisent pas directement les cellules cancéreuses. Leur rôle est plutôt de coordonner la réponse immunitaire, un peu comme un chef d’orchestre. Elles activent d’autres cellules du système immunitaire, notamment : • Des globules blancs capables de tuer les cellules cancéreuses ; • D’autres cellules qui participent aussi à cette défense. Sans elles, le système immunitaire a plus de mal à repérer et attaquer les tumeurs, même avec l’aide de traitements comme l’immunothérapie. Leur rôle important a été démontré dans des études chez l’animal, et des recherches chez des patients, notamment atteints de cancer du sein, suggèrent qu’elles peuvent aussi avoir un effet protecteur. Des traitements qui ciblent ces cellules sont actuellement en test, et les résultats sont prometteurs. Ces cellules sont efficaces car elles montrent aux globules blancs ce qu’ils doivent attaquer, en leur présentant des fragments de cellules cancéreuses, appelés antigènes. Elles envoient aussi des messages chimiques qui attirent d’autres cellules immunitaires vers la tumeur et les aident à mieux fonctionner. Mais certaines questions restent encore sans réponse : • Comment aident-elles les globules blancs à s’installer dans la tumeur ? • Ont-elles aussi un effet sur d’autres cellules immunitaires ? Pour y répondre, nous utilisons des modèles expérimentaux chez la souris, dans lesquels nous induisons le développement de tumeurs en injectant des cellules cancéreuses. Ces outils nous permettent de : 1. Voir si ces cellules aident les globules blancs à bien se positionner pour attaquer la tumeur ; 2. Comprendre comment elles les activent ; 3. Étudier si elles influencent aussi d’autres cellules impliquées dans la défense contre le cancer. En comprenant mieux leur fonctionnement, nous espérons contribuer au développement de traitements anticancéreux plus efficaces et mieux ciblés.

Bénéfices attendus

Notre projet identifiera à court terme chez la souris des marqueurs, groupes de gènes et mécanismes associés aux fonctions protectrices des celles dendritiques conventionnelles de type 1 contre le cancer. Leur conservation chez l’homme sera évaluée en déterminant leur valeur pronostique par réanalyse des données publiques provenant de patientes atteintes de cancer du sein. Cela pourrait nous aider à identifier de nouvelles caractéristiques des réponses immunitaires associées à une évolution plus favorable de la maladie et à mieux comprendre comment cela fonctionne. Une autre étape importante sera à moyen terme de transposer les résultats obtenus chez la souris aux cellules humaines. Pour ce faire, nous allons utiliser nos techniques de culture de cellules souches humaines, qui nous permettent de générer et de manipuler en laboratoire un grand nombre de cellules dendritiques de type 1. Ces recherches devraient nous aider à mieux comprendre comment ces cellules fonctionnent chez l’homme et comment elles peuvent être exploitées pour améliorer les traitements du cancer, notamment dans le cadre du développement de vaccins thérapeutiques basés sur l’activation optimale de la réponse immunitaire antitumorale.

Procédures

Les interventions prévues dans le cadre de ce projet se limitent à des manipulations courtes, réalisées sous anesthésie, et classées au-dessus du seuil réglementaire. Elles sont décrites ci-dessous. Les animaux recevront une ou plusieurs injections d’anticorps et/ou de cellules, effectuées sous anesthésie générale dont la durée est inférieure à une minute. Certaines souris recevront également une injection unique de cellules tumorales, réalisée sous anesthésie générale. Cette intervention, d’une durée d’environ cinq minutes. Au cours du suivi expérimental, la mesure de la taille tumorale sera réalisée de manière répétée, sous anesthésie légère. Cette manipulation, très brève (quelques secondes), permet de suivre l’évolution de la tumeur tout en limitant le stress pour l’animal.

Impact sur les animaux

L’anesthésie utilisée pour les injections dans les souris est de courte durée (5 minutes). Elle est appliquée avant des injections dans la glande mammaire ou intraveineuse. Cela peut provoquer un léger stress pendant quelques secondes. Dans de rares cas, surtout avec une certaine lignée de cellules tumorales, la taille de la tumeur peut gêner la mobilité des souris et présenter des signes d’ulcération au niveau de la tumeur..L'injection dans la veine située derrière l'œil, même sous anesthésie peut causer de la douleur legère de courte durée qui sera réduit au minimum à l’aide d’un anesthesiant local.

Devenir

Dans le but de réaliser les analyses histologiques, immunologiques et moléculaires sur les différents organes d’intérêt, la mise à mort des animaux est nécessaire afin de permettre leur prélèvement. Cette étape est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Au total, l'ensemble des animaux du projet sera concerné.

Remplacement

Ce projet nécessite de mesurer différents éléments de la réponse du système immunitaire lors de la lutte contre le cancer. Les interactions entre les cellules du système immunitaire entre elles et avec les cellules tumorales sont très nombreuses et complexes, et pour mieux les comprendre il est indispensable de les étudier dans des modèles in vivo et aucun modèle in vitro ou ex vivo disponible à l’heure actuelle ne permet d’étudier la complexité des interactions (mobilisation et activation) entre cellules dendritiques et autres cellules de l’immunité.

Réduction

Le nombre de souris pour chaque groupe et chaque procédure a été soigneusement calculé en cohérence avec les principes éthiques de réduction, c’est-à-dire pour ne pas être excessif, mais être suffisant à permettre une analyse statistique fiable des résultats, en fonction de notre expérience sur la variabilité des réponses au sein de chaque groupe expérimental et entre groupes.

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux, ceux-ci seront maintenus en groupes sociaux stables, formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Les injections de molécules ou de cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie gazeuse de facon à limiter au maximum le stress des animaux. L’apparence des animaux et leur activité, la taille de la tumeur , seront observées quotidiennement et le poids des souris mesuré tous les 3 jours, afin de determiner un score permettant de d’identifier de manière précoce et prédictive des signes de souffrance et mettre en places de mesures correctives adéquates comme l’accès à la nourriture et à l’eau facilité grâce à la mise à disposition de gel diététique, l’ajout d’enrichissements supplémentaires pour nidation, une fréquence d’observation augmentée, ou une mise à mort précoce. L’ensemble des manipulations réalisées sur animaux vigiles (examen du site d’injection, suivi du poids) sera realisé par du personnel compétent et experimenté afin de réduire au maximum le stress lié à ces gestes.

Choix des espèces

Les souris sont le modèle idéal pour ce type d'études parce qu'elles se reproduisent rapidement, ont une taille pratique pour les expériences, et leur génétique est bien connue. Pour les recherches que nous prévoyons, il est parfois nécessaire d'utiliser des souris génétiquement modifiées. Le corps des souris fonctionne de manière assez similaire à celui des humains, ce qui permet de transposer les conaissances acquises sur le fonctionnement chez l’Homme. Des souris âgées de 8 à 15 semaines seront utilisées car elles ont un système immunitaire mature et leurs glandes mammaires sont pleinement développées. Pour éviter que des différences d’âge ne faussent les résultats, nous veillons à ce que l'écart d'âge entre les souris d'un même groupe ne dépasse pas 2 semaines.

Greffés d'un glioblastome dans le cerveau au cours d'une opération de trente minutes, 3 510 souris et 705 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, tous tués pour les prélèvements. Chaque animal peut subir jusqu'à cinquante-six injections, vingt-huit prélèvements sanguins, cinquante et une séances d'imagerie, huit ouvertures de la barrière hémato-encéphalique, une résection de la tumeur et une séance de radiothérapie, avec un transport entre deux établissements. Le porteur indique que la tumeur provoque des troubles neurologiques et des difficultés de déplacement, et que les animaux immunodéficients attrapent plus facilement des infections. Les bénéfices restent formulés comme une ambition, identifier des traitements qui pourront ensuite être évalués chez l'humain, quand les 4 215 greffes, elles, sont programmées.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales primitives et en particulier les glioblastomes sont des cancers très résistants aux traitements anti-tumoraux conventionnels (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie cytotoxique). En effet, la survie globale médiane des patients est comprise entre 12 et 24 mois. De nouveaux traitements sont donc indispensables pour améliorer le pronostic des patients souffrant de glioblastome. Les traitements candidats sont évalués dans le cadre d’essais cliniques longs et coûteux, et le plus souvent négatifs, avant leur approbation pour une utilisation en pratique clinique chez les patients. Compte tenu du nombre important de traitements candidats, notre projet vise l’accélération de l’évaluation de ces traitements innovants candidats et leur hiérarchisation en vue d’essais cliniques chez l’Homme. En effet, une évaluation préclinique rigoureuse permet de réduire le taux d’attrition des essais cliniques. Le projet se déroulera dans deux établissements en raison de la nécessité d'utiliser des appareils d'imagerie spécifiques disponibles seulement dans le second établissement.

Bénéfices attendus

Les gliomes et en particulier les glioblastomes (GBM) sont les cancers cérébraux les plus fréquents et les plus graves chez l’adulte. Le pronostic des patients souffrant de glioblastome est réservé (12-24 mois de survie médiane) malgré des traitements lourds. De nouveaux traitements sont donc nécessaires. Le projet présenté ici vise donc à évaluer de nouvelles thérapies dans un contexte le plus biologiquement pertinent grâce à nos modèles de glioblastome qui sont en quelque sorte des avatars de patients atteint de cette maladie. Ultimement, nous visons à identifier de nouveaux traitements actifs contre le glioblastome qui pourront être évalués dans le cadre d'études cliniques chez l'homme.

Procédures

Les animaux auront tous une greffe tumorale cérébrale (30minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) ou une greffe tumorale cutanée (1minute, 1x, animal anesthésié). Tous les animaux auront un suivi par prélèvement sanguin (2minutes, 28x maximum, animal vigile ou anesthésié et analgésié si l'animal est en fin de procédure) et certains par imagerie également (5minutes à 4h, 51x maximum, animal anesthésié). Certaines imageries nécessiteront un transfert d'un établissement à un autre (transfert de 10 minutes, 1 fois, animal vigile). Une partie des animaux auront également des traitements administrés par injections simples (1min, 56x maximum, animal vigile) ou par injections nécessitant une chirurgie (30min maximum, 1x, animal anesthésié et analgésié). Les administrations pourront être couplées à une ouverture de la barrière hémato encéphalique (pour que le traitement atteigne le cerveau) (1h maximum, 8x, animal anesthésié) ou à une résection tumorale (30 minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) et;ou à de la radiothérapie (10 minutes, 1 fois, animal anesthésié).

Impact sur les animaux

La greffe de cellule tumorale induit une croissance tumorale qui peut donner des troubles neurologiques ou des difficultés de déplacement. Les chirurgies pourront engendrer une douleur modérée post opératoire ainsi que des risques d’infection. Les anesthésies peuvent engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire. Les traitements pourront avoir des effets secondaires comme des diarrhées ou des inflammations aux sites d’injection engendrant une perte de poids. Les piqûres peuvent induire une douleur légère de courte durée au point d’injection. Les prélèvements sanguins pourraient induire une douleur légère de courte durée ainsi qu’un hématome. Les imageries pourront induire un léger stress chez les animaux. Certaines imageries devront être réalisées dans un autre établissement, les animaux pourront ressentir un stress lié au transport entre les deux établissements et aux changements d'environnement. Le phénotype dommageable des animaux immunodéficients ou immunodéprimés induit une sensibilité accrue aux infections.

Devenir

Pour toutes les procédures, tous les animaux sont euthanasiés à un temps défini (ie quelques jours/heures post traitement etc) ou dès qu’ils atteignent les points limites décrits afin de faire des prélèvements post mortem.

Remplacement

Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes. Il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro ; que ce soit par le biais de cultures de cellules tumorales issues de patients (PDCLs) ou bien de culture 2D ou encore 3D. Ces approches in vitro sont réalisées en amont des procédures in vivo pour justifier l'intérêt scientifique. De plus, cet environnement module la biodisponibilité d’une molécule thérapeutique au sein de la tumeur. Aussi, positionner les cellules tumorales cérébrales chez l’animal, dans un microenvironnement tissulaire et moléculaire complexe (cérébral) constitue un modèle d’étude pertinent. Ce dernier se rapproche au maximum des conditions observées chez les patients souffrant de tumeur cérébrale et chez qui les cellules cancéreuses prolifèrent dans du tissu nerveux central complexe.

Réduction

4215 animaux seront utilisés dans ce projet. Les efforts fournis afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sont: i) Seuls les composés efficaces in vitro par rapport aux traitements standards, seront testés in vivo. ii) Les cellules tumorales cérébrales greffées chez l’animal sont visibles par fluorescence ce qui permet de suivre le développement tumoral, cela évite l'euthanasie à différents temps et réduit donc le nombre d’animaux utilisé (iii) La fluorescence des tumeurs permet également de suivre l’efficacité des traitements testés en temps réel ce qui apporte une information supplémentaire à la survie. (iv) Une étude statistique détermine le nombre d’animaux nécessaire minimum pour atteindre un niveau de significativité acceptable. Cela permet de limiter le nombre d’animaux et d’éviter les études ne permettant pas de répondre à une question posée par manque de puissance statistique.

Raffinement

Durant toute la durée de leur vie, les animaux sont logés en groupe afin de favoriser leur bien-être social, l’isolement étant évité autant que possible. Cette approche groupée est cruciale, car les souris, comme de nombreux rongeurs, sont des animaux sociaux et leur isolement peut entrainer un stress psychologique et des comportements anormaux. Elles sont hébergées sur des portoirs ventilés, qui permettent une circulation d'air optimale et un environnement propre. Chaque cage est équipée d’un système d'abreuvement automatique garantissant un accès constant à l’eau et d’un approvisionnement ad libitum en nourriture, ce qui répond à leurs besoins nutritionnels et hydriques tout en permettant une gestion optimale des ressources. Le milieu de vie est enrichi avec au moins deux éléments, tels que des objets manipulables ou des matériaux permettant d'explorer et de satisfaire les comportements naturels des souris, comme le grattage, le fouissage ou la nidification. Cet enrichissement environnemental est essentiel pour prévenir l’apparition de comportements stéréotypés liés à l'ennui ou au stress et pour assurer une qualité de vie optimale tout au long de l’étude. Les animaux sont suivis quotidiennement par des vétérinaires et du personnel qualifié. Lors de procédures susceptibles de provoquer des douleurs modérées à sévères, comme des interventions chirurgicales, les animaux reçoivent une anesthésie générale appropriée et en complément, un analgésique leur est administré en préopératoire et postopératoire pour prévenir toute douleur et minimiser l'inflammation. Pour prévenir les risques d'infections des souris immunodéprimées, les animaux sont hébergés dans des cages propres avec litière, aliment et enrichissement irradiés ainsi que de l'eau osmosée pour boisson. Les injections seront toujours réduite au minimum suivant le composé testé (fréquence et volume), l'alternance des sites sera privilégiée quand cela est possible et les animaux seront anesthésiés si nécessaire pour leur bien être. Un système de points limites est mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’inconfort, tant à court qu'à long terme. Ces points limites prennent en compte des critères variés : l’observation du comportement, l'aspect général de l’animal, son niveau d'activité, ainsi que son poids corporel. Si un animal présente des signes de détresse, des mesures immédiates sont prises pour garantir son confort et sa santé.

Choix des espèces

Les souris sont choisies dans nos études thérapeutiques en raison de leur petite taille et de leur poids faible. Cette caractéristique permet l’utilisation de quantités réduites de composés cytotoxiques. De plus, ces modèles permettent l’utilisation de volumes expérimentaux limités, facilitant ainsi les études tout en respectant les principes de réduction des animaux dans la recherche. Les souches de rongeurs telles que les souris immunodéficientes sont particulièrement utiles pour leur incapacité à rejeter les cellules tumorales humaines. En parallèle, les souches immunocompétentes sont indispensables pour étudier la croissance tumorale dans un contexte immunologique complet. Les modèles animaux immunodéprimés sont utiles pour explorer l’impact d’un système immunitaire humanisé dans les réponses thérapeutiques contre les cancers. Enfin, les rats, sont choisis ici pour des scénarios nécessitant une plus grande précision chirurgicale. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 mois car le glioblastome est une tumeur de l’adulte chez l’Homme.

1 782 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Des cellules de cancer du pancréas leur sont injectées sous la peau ou directement dans le pancréas au cours d'une opération de quarante-cinq minutes, puis elles passent des séances d'IRM d'une heure et de TEP sous anesthésie avant d'être irradiées. Le porteur décrit une tumeur pancréatique qui peut gêner la prise alimentaire, une tumeur sous-cutanée qui peut se nécroser et entraver la marche, et annonce une preuve de concept transférable en clinique. Les souris qui perdent 20 % de leur poids sont mises à mort immédiatement, et les tumeurs sous-cutanées sont mesurées au pied à coulisse deux fois par semaine pour surveiller le volume à partir duquel l'animal sera tué.

Objectifs

L’un des objectifs majeurs de la recherche en cancérologie est l’amélioration de l’efficacité des traitements anticancéreux. Cette amélioration combine un meilleur ciblage de la tumeur avec une meilleure efficacité tout en limitant les dommages qu’ils peuvent causer au tissu sain (effets secondaires). Un des axes de recherche développé dans cet objectif est la fabrication de composés théranostiques (qui provient de la contraction des mots thérapie et diagnostic). Ces composés moléculaires permettent la cartographie des cellules cancéreuses dans le corps et leur traitement de façon ciblée. Dans le cadre de ce projet, nous utiliserons des composés chimiques en cours de validation in vitro (toxicité, activation par les radiations ionisantes). Les composés les plus prometteurs, une fois injectés, sont détectés par des techniques d’imagerie (cartographie de la tumeur) puis activés par radiothérapie de façon à induire les effets thérapeutiques souhaités, tels que la destruction des cellules cancéreuses, l’activation du système immunitaire, etc ... L’action thérapeutique est donc contrôlée de façon à limiter l’impact sur les tissus sains et les effets secondaires associés à une chimiothérapie classique. Dans ce projet nous nous intéresserons particulièrement à des tumeurs solides du pancréas dont les traitements actuels sont peu efficaces. L’objectif de ce projet est donc d’étudier la biodistribution de nos composés théranostiques les plus prometteurs, de déterminer l’efficacité de leur effet thérapeutique sous radiothérapie dans des modèles de cancers du pancréas chez la souris avec pour finalité une utilisation dans le domaine clinique.

Bénéfices attendus

La grande majorité des composés activables par stimulations externes actuellement décrits dans la littérature ne permettent pas une application dans le domaine clinique. Notre projet vise à combler ce manque en caractérisant des composés théranostiques développés pour une application clinique. Ces composés représentent un outil innovant dans la recherche en cancérologie, car ils permettent à la fois une visualisation de la tumeur et une amélioration de l’efficacité de la radiothérapie. Si la preuve de concept se fera sur des tumeurs du pancréas, la non-spécificité de nos molécules pour un type de cancer donné ouvre la perspective d’une application à d’autres types de tumeurs solides. A court terme, ce projet permettra de valider ce concept innovant de traitement qui pourra par la suite être transféré en clinique.

Procédures

Dans un premier lot d’animaux, des cellules tumorales pancréatiques seront injectées en sous-cutané (durée du geste inf à 10 sec) ou dans le pancréas de souris placés sous anesthésie générale, analgésiques et antalgiques (durée du geste 45 min). La croissance des tumeurs est observée via des imageries de bioluminescence réalisées au maximum toutes les semaines (durée de l’acquisition d’image : 1 min, avec les animaux sous anesthésie générale gazeuse). Dans un second lot d’animaux sains, la toxicité des composés sera étudiée. Plusieurs formulations de composés à différentes concentrations seront injectées aux souris saines par plusieurs voies d’administrations (durée des injections inférieur à 1 min par animal, réalisé une seule fois). Dans un troisième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, des imageries seront réalisés (IRM : réalisé une seule fois, durée d’une heure par animal sous anesthésie générale gazeuse ; TEP : réalisé plusieurs fois si nécessaire avec un délai minimal de 15 jours entre chaque imagerie, durée de 10min par animal sous anesthésie générale gazeuse) afin de visualiser l’anatomie de la tumeur et caractériser son activité métabolique. Ensuite, nous ferons de prélèvements d’organes afin de doser la quantité de composé accumulée dans les organes vitaux. Dans un quatrième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, plusieurs doses d’irradiation seront testées sur différents animaux afin de vérifier la dose la plus appropriée pour nos futurs traitements (durée d’irradiation de 15 min maximum par animal, sous anesthésie générale gazeuse). Dans un cinquième lot d’animaux implantés avec les tumeurs, les composés seront injectés (la formulation, la concentration et la voie d’administration seront choisies en fonction des résultats obtenus sur le 2ème lot d’animaux, la durée des injections reste inférieur à 1 min par animal) puis un traitement par radiothérapie sera réalisé (la dose d’irradiation sera choisie en fonction des résultats obtenus sur le 3ème lot d’animaux, avec une durée d’irradiation de 15 min maximum par animal). Nous étudierons ainsi l’efficacité de nos composés sur les tumeurs pancréatiques.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales comprenant des implantations tumorales peuvent occasionner des douleurs. Le développement tumoral dans le pancréas peut engendrer des difficultés dans la prise alimentaire ou encore une perte de poids. Le développement tumoral sous-cutané peut engendrer de la nécrose ou une gêne lors de certains mouvements, notamment pour la locomotion. Lors des tests de toxicité, une perte de poids peut être observée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour les analyses post-mortem

Remplacement

Avant toute étude chez l’animal, les composés théranostiques (famille appelée radioswitch) ont subi de nombreux tests préliminaires in vitro., notamment pour valider leur capacité à se fixer sur leurs cibles présentes à la surface des cellules tumorales. Ces travaux ont montré des résultats très concluants in vitro, qui nécessitent à présent d’être confirmés in vivo. En effet, il s’agit d’étudier la capacité de ces composés à se fixer sur leurs cibles lorsque les cellules tumorales sont présentes dans un organisme et également à délivrer après activation un signal conduisant à la mort de la cellule (directement ou bien grâce à l’intervention du système immunitaire)

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d’un test logrank sur logiciel G*power.

Raffinement

Pour limiter le stress des animaux, l’attention est portée sur leurs conditions d’hébergement. Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Pour limiter la souffrance des animaux, la procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale avec recours aux anesthésiques locaux et aux analgésiques. Les animaux sont également observés après les greffes afin de détecter tout signe de souffrance ou de mal être. Les animaux sont observés quotidiennement et pesés 5 fois par semaine durant la 1ère semaine suivant les chirurgies. Puis, les animaux sont observés et pesés 3 fois par semaine afin de détecter tout signe de mal être ou de détérioration de leur état durant le développement des tumeurs. Si une souris présente une perte de poids de 20% par rapport à son poids initial, elle sera immédiatement mise à mort. Les tumeurs en sous-cutanée, sont mesurées au pied à coulisse au minimum 2 fois par semaine afin de suivre leur vitesse de pousse. Nous serons particulièrement attentifs à l’atteinte du point limite éthique lié au volume de la tumeur selon le site d’implantation. Pour les tests de toxicité, les animaux sont observés et pesés 7 fois par semaine durant la 1ère semaine suivant l’injection des composés, puis ils sont pesés 3 fois par semaine. Si les animaux présentent des effets secondaires suite à l’injection des composés, les symptômes seront identifiés et traités de façon adéquat. Les irradiations ne sont pas douloureuses et sont réalisées sous anesthésie gazeuse afin d’éviter les mouvements de l’animal. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Nous serons attentifs à tout signe de mal-être tel que décrit dans la grille de score et prendrons les mesures adéquates pour arrêter la souffrance de l’animal notamment la mise en place de soins de support. En cas d’atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort

Choix des espèces

La souris est le modèle communément utilisé pour les expériences menées en biologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de biodistribution / biopharmacocinétique et de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique largement utilisé pour les études impliquant des molécules et/ou de la radiothérapie ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes car les tumeurs du pancréas chez l’homme touchent quasi exclusivement l’adulte.. Les souris arriveront à l'animalerie, âgées de 6 semaines. Après une période d'adaptation de 7 jours à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 7/8 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats Des animaux adultes et ayant fini leur développement sont nécessaires auquel cas, lors des implantations, les tumeurs pourraient migrer et nos études seraient alors inexploitable.

Toutes tuées à l'issue, à la fin du suivi par IRM, à un point limite ou, faute de métastase visible à six semaines, pour fournir des tissus témoins, 144 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Sous anesthésie, chacune reçoit dans le cœur une injection de cellules humaines destinée à provoquer des métastases cérébrales, puis passe de la deuxième à la sixième semaine deux séances d'IRM par semaine, d'une heure à une heure quinze chacune. Le porteur décrit des tremblements, une incoordination et des paralysies partielles, et prévient qu'au-delà de quatre semaines un envahissement massif du cerveau peut survenir, avec "un risque élevé de souffrance sévère et de décès spontané". Le projet compare un nouvel agent de contraste IRM à des produits de référence, et le porteur décrit comme "indispensable" l'absence de rejet des cellules humaines, d'où le choix de souris immunodéficientes.

Objectifs

L’imagerie IRM (imagerie par résonnance magnétique) avec administration d’un agent de contraste permet de mieux détecter de nombreuses pathologies cérébrales, notamment en cancérologie, en en rehaussant le signal de la lésion. Outre le dépistage de la maladie et la pose du diagnostic, l’IRM avec agent de contraste permet le suivi de l’évolution de la pathologie et le suivi de l’efficacité thérapeutique mise en place pour le patient. L’enjeu est particulièrement important dans la détection de métastases cérébrales où le pronostic du patient (par exemple : taux de survie à 5 ans) est étroitement corrélé au stade de développement tumoral. Un diagnostic le plus précoce possible de l’ensemble des lésions a un impact direct sur la bonne prise en charge du patient. Le nombre de tumeurs et/ou de métastases ainsi que les caractéristiques de ces lésions (infiltrantes, vascularisées…), leur localisation et l’identification de leurs marges tumorales sont d’autant d’éléments importants pour proposer le meilleur traitement au patient (chirurgie, radiothérapie ciblée, etc..). Dans cet objectif final, le projet vise à évaluer les performances diagnostiques d’un nouvel agent de contraste IRM dans la détection précoce de tumeurs et/ou de métastases cérébrales. Les agents de contraste faisant partie de la classe des médicaments injectables, il s’agira de trouver le meilleur compromis entre la nature et la dose de produit de contraste injectée et l’apport diagnostique pour le patient. Le présent projet sera conduit sur un modèle de souris reproduisant la maladie. Des produits au stade prototype ou déjà commercialisés et considérés à l’heure actuelle comme des références serviront de comparatifs. Cette étude préclinique nous permettra d’obtenir des éléments de réponse avec des paramètres quantitatifs (rehaussement de contraste, nombre et temporalité des lésions détectées) et d’estimer au plus juste la dose qui apportera le meilleur compromis entre performance de détection des lésions et réduction de l’agent de contraste administrée au patient.

Bénéfices attendus

A l’issue de ce projet, nous aurons une idée cliniquement pertinente de la performance diagnostique du produit testé et de la dose à administrer (comparativement à des produits de référence) pour une détection précoce des métastases cérébrales tout en proposant la dose efficace la plus faible possible (compromis entre dose de gadolinium administrée au patient et efficacité du rehaussement à détecter, caractériser et suivre l’efficacité du traitement mis en place). Nous aurons une idée précise, pour une dose donnée, si le nombre de métastases détectées est augmenté par rapport au produit de référence, si la taille minimale de détection et ou le délai d’apparition est réduit, permettant un diagnostic plus précoce, et évaluerons la facilité de délimitation tumorale. Ces résultats permettront d’éclairer les choix de la dose à tester en étude clinique dans l’objectif de mettre à disposition des radiologues un produit de contraste plus performant, en termes de détection et de précocité de détection, améliorant ainsi la prise en charge des patients et, potentiellement, leur taux de survie à 5 ans.

Procédures

Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux anesthésiés et sédatés. Le projet se déroulera en trois phases : Phase A – Mise en place du modèle expérimental Chaque animal recevra une intervention unique, d’une durée d’environ 10 à 15 minutes, visant à simuler un processus de dissémination tumorale. Cette étape sera réalisée une seule fois par animal, au début de l’étude. Phase B – Suivi par imagerie cérébrale À partir de la semaine 2 et jusqu’à la semaine 6, les animaux seront suivis par imagerie cérébrale deux fois par semaine. Chaque séance durera environ 1h à 1h15 par animal, incluant la préparation, l’installation et l’acquisition des images. Ce suivi permettra d’observer l’évolution des lésions et de comparer différents protocoles d’imagerie. Une semaine supplémentaire de suivi pourra être ajoutée selon l’état de santé des animaux. Phase C – Fin de l’étude L’euthanasie sera pratiquée : • à la fin du suivi par imagerie, • ou plus tôt en cas de problème ou selon les critères de fin d’étude.

Impact sur les animaux

L’administration de médicaments, tels que les analgésiques morphiniques ou l’anesthésie générale, chez l’animal vigile peut provoquer une douleur aiguë au moment de l’injection, ainsi qu’un stress lié à la contention. L’injection intra-cardiaque, utilisée pour l’induction du modèle, est une procédure invasive pouvant entraîner des nuisances importantes. Elle est susceptible de provoquer des douleurs transitoires, des arythmies, des lésions myocardiques, des réactions inflammatoires ou infectieuses, ainsi que des hémorragies internes. Au cours de la phase de développement des métastases cérébrales, les animaux peuvent présenter des troubles neurologiques modérés à sévères : tremblements, incoordination, paralysies partielles, apathie, diminution de la prise alimentaire, perte de poids et déshydratation. Ces signes traduisent une altération progressive de l’état général. L’imagerie par IRM, nécessitant des anesthésies répétées et prolongées, peut induire une hypothermie et une déshydratation. Ces effets sont d’intensité modérée mais peuvent s’accumuler au fil des séances, entraînant une réduction des prises alimentaires et hydriques. Enfin, au-delà de quatre semaines après l’injection tumorale, un envahissement métastatique massif du cerveau peut survenir, provoquant une dégradation rapide de l’état de l’animal, avec un risque élevé de souffrance sévère et de décès spontané.

Devenir

Les souris ayant développé des lésions métastatiques au niveau cérébral (ou dans d’autres territoires si cela arrivait) seront euthanasiées à l’issue du suivi par imagerie IRM, ou à l’atteinte des points limites. Eventuellement, le cerveau des animaux sera prélevé et une analyse histologique ou imagerie élémentaire/moléculaire de coupes cérébrales seront réalisées. Les souris n’ayant pas eu de pousse métastatique (visible en IRM) au bout de 6 semaines post-induction seront euthanasiées et des tissus prélevés pour être utilisés comme matrices biologiques témoins (vierges de certains produits) ou pour des mises au point de bioanalyses.

Remplacement

Si les paramètres physico-chimiques d’un agent de contraste peuvent être déterminés in vitro, l’ensemble des paramètres d’internalisation (entrée dans les cellules cérébrales) et d’extravasation (sortie des vaisseaux) / élimination dans une lésion tumorale sont directement dépendants des caractéristiques intrinsèques de la lésion étudiée et ne peuvent donc être évalués que sur des modèles in vivo. En effet, l’accès à celle-ci dépend directement de l’état d’ouverture de la barrière sang-cerveau et de sa localisation dans le territoire cérébral, ainsi que des caractéristiques propres à chaque lésion (perméabilité, taille, état de vascularisation, tortuosité des vaisseaux, grade, structure du tissu… etc…).

Réduction

L’étude, réalisée en cross-over (comparaison des performances diagnostiques de deux agents de contraste ou doses différents chez un même animal à 24h d’intervalle) permet de diminuer le nombre d’animaux de moitiéen permettant également d’augmenter la puissance statistique d’analyse comparative car : - Chaque lésion métastatique est son propre témoin entre deux comparaisons, permettant de comparer les deux produits sur des lésions avec exactement les même propriétés (taille, perméabilité, accessibilité, nécrose, type…) - Un animal peut présenter plusieurs métastases cérébrales augmentant ainsi le nombre de lésions métastatiques analysé sans augmenter le nombre d’animaux Enfin, selon notre retour d’expérience, le rendement d’animaux répondeur étant variable, l’étude sera réalisée par lot d’implantation de seulement n = 12 animaux à la fois, avec une phase de mise au point afin d’ajuster ce chiffre, de façon à s’approcher au plus juste de l’effectif attendu, c’est-à-dire n = 8 animaux avec lésion(s) métastatique(s) au niveau cérébral. Les animaux ne présentant pas de lésions métastatiques ni signes cliniques pourront servir de matrices biologiques en vue de mises au point d’imagerie moléculaire ou élémentaire.

Raffinement

L’implantation tumorale mise au point sous échographie évite toute ouverture de la peau au niveau du crâne, réduisant de façon importante la souffrance et favorisant la récupération de l’animal. Elle ne sera effectuée qu’une seule fois, avec un volume faible. Par rapport à l’étude antérieure, le protocole d’imagerie a été optimisé afin de réduire les temps d’acquisition des séquences IRM, permettant une anesthésie totale plus brève (de la pose de la voie intraveineuse au réveil, environ 1h contre 1h30 lors de la précédente étude), tout en conservant une bonne qualité de détection des lésions en imagerie réhaussée. D’autre part, une administration d’anti-douleur sera mise en place avant toute intervention invasive afin d’assurer une bonne analgésie. L’administration d’anti-douleur pourra être renouvelée si l’état des animaux le nécessite. Lors des anesthésies générales, les muqueuses oculaires des animaux seront protégées par du gel oculaire pour prévenir de la déshydration. Un appareil de mesure de la respiration nous permettra de suivre la profondeur de l’anesthésie qui sera adaptée en fonction de la réponse de chaque animal. Afin de lutter contre une hypothermie éventuelle, une plaque thermostatée ou un circuit d’eau chaude thermostatée passant sous l’animal seront utilisés lors des anesthésies. Lors des phases de réveil, les animaux seront placés sous lampe rouge (chauffante). Pour le suivi clinique des animaux, une grille de scoring avec différents paliers sera mise en place. Au besoin, nous consulterons un vétérinaire et des mesures seront prises : système particulier d’alimentation ou d’hydratation, analgésie supplémentaire, traitement médicamenteux, etc. Enfin, par retour d’expérience, l’étude menée en interne en 2014 a montré qu’un suivi journalier rigoureux à l’aide de la grille de scoring minimisait fortement les dommages inhérents au modèle et que l’imagerie IRM permettait de détecter les lésions cérébrales avant que celles-ci n’engendrent une souffrance animale sévère ou un décès spontané.

Choix des espèces

Le modèle murin reste le plus utilisé dans la recherche en neurologie et cancérologie et largement reconnu pour apporter robustesse et prédictivité. Les grosses métastases observées chez la souris sont très comparables (tailles, vascularisation, localisation spatiale) à de petites métastases humaines. Sa faible taille remplit tous les critères d’accessibilité pour les administrations d’agents de contraste, taille suffisante pour les implantations tumorales et analyses robustes des images acquises en imagerie IRM. L’attraction importante des cellules pour le cerveau permet qu’aucune lésion tumorale ne soit observée dans d’autres organes. Ce modèle repose sur des souris immunodéficientes, c’est-à-dire qu’elles de possèdent pas ou peu de système immunitaire fonctionnel. Cela évite le rejet des cellules humaines implantées, ce qui est indispensable pour que ces cellules puissent survivre, proliférer et former des métastases dans l’animal et qui serait impossible avec un modèle de souris ayant une immunité classique. Les animaux seront adultes (au minimum âgés de 6 semaines) au moment de l’induction du modèle. En effet, la population d’étude visée est l’adulte.

Une chirurgie du nerf à la cuisse pour 140 souris, dix injections de vincristine en deux semaines pour 140 autres, 21 jours de contention, de suspension et de chocs pour les 210 dernières : 490 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. La souffrance déclarée est modérée pour 280 d'entre elles et sévère pour 210. Le porteur mesure ensuite leurs réactions par des tests de retrait de la patte, de préférence entre espace clair et sombre et de nage forcée, pour évaluer un composé ciblant les récepteurs de l'ocytocine face à la duloxétine, la prégabaline et la fluoxétine. Il décrit ces contraintes comme de "petits stresseurs" et des "chocs très légers", et avance que les souris "pourraient donc être soulagées de leurs symptômes douloureux".

Objectifs

Ce projet de recherche préclinique vise à caractériser les effets thérapeutiques d’un nouveau composé ciblant les récepteurs de l’ocytocine dans des contextes pathologiques pertinents. Plus précisément, il s’agit d’évaluer son potentiel analgésique dans deux modèles murins de douleur neuropathique (chimio-induite et lésionnelle), ainsi que son potentiel antidépresseur dans un modèle de dépression induite par un stress chronique variable. Les effets de ce composé seront comparés à ceux de traitements de référence déjà utilisés en clinique (duloxétine, prégabaline, fluoxétine).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité d’un nouveau candidat thérapeutique dans des pathologies à fort impact clinique et sociétal : les douleurs neuropathiques chroniques et la dépression. Il pourrait ouvrir la voie à l’utilisation de nouvelles approches pharmacologiques ciblant le système de l’ocytocine comme alternative ou complément aux traitements actuels.

Procédures

Les animaux de ce projet participeront à différentes interventions : • Douleur neuropathique pour 140 d'entre eux: une petite chirurgie est réalisée sur la cuisse de l’animal sous anesthésie (environ 30 minutes) pour provoquer une légère douleur similaire à celle observée après certaines atteintes nerveuses. Après une semaine de récupération, les animaux sont suivis régulièrement avec des tests simples et non invasifs (par ex. réaction de retrait de la patte à une stimulation légère). • Douleur liée à la chimiothérapie pour 140 animaux : les animaux reçoivent un traitement par vincristine, un médicament anticancéreux connu pour causer des douleurs nerveuses. Dix injections sont administrées sur deux semaines (deux séries de 5 jours, séparées par une pause de 2 jours). Les réactions nociceptives sont mesurées chaque jour avec des tests courts (5 à 20 minutes). • Stress chronique pour les 210 autres: pendant 21 jours, les souris sont soumises à différents petits stresseurs (contention, suspension, chocs très légers), chacun durant environ une heure. À la fin, leur comportement est évalué avec 4 tests (par ex. préférence pour un espace lumineux ou sombre, nage forcée), réalisés sur 4 jours consécutifs. Les traitements sont donnés chaque jour sous forme liquide, que les animaux apprennent à boire spontanément au bout d’une micropipette. Cela évite de les contraindre et réduit le stress. Enfin, à la fin de l’étude, certains animaux sont profondément anesthésiés pour un prélèvement de tissus (système nerveux) afin de réaliser des analyses scientifiques.

Impact sur les animaux

Les souris pourront ressentir des douleurs nerveuses, provoquées soit par une petite chirurgie sous anesthésie, soit par l’administration répétée d’un médicament anticancéreux (vincristine). Ces douleurs peuvent durer plusieurs semaines. Dans un autre modèle, les animaux seront exposés à des situations de stress pendant 21 jours afin de reproduire des symptômes de type anxieux ou dépressif. Pour évaluer ces symptômes, les souris seront soumises à des tests comportementaux courts (3 à 20 minutes), réalisés une ou deux fois par jour au maximum, sur plusieurs semaines selon le modèle. Des limites précises sont établies pour arrêter immédiatement la procédure si un animal présente des signes persistants de souffrance. L’objectif de ce projet est de tester un nouveau traitement qui pourrait soulager à la fois la douleur chronique et les troubles anxio-dépressifs. Les animaux pourraient donc être soulagés de leurs symptômes douloureux et/ou anxio-dépressifs.

Devenir

Toutes les procédures : Les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des analyses post-mortem des tissus nerveux.

Remplacement

Le remplacement par des méthodes in vitro ou in silico n’est pas envisageable dans ce projet. Les comportements de douleur, anxiété ou dépression nécessitent l’observation de l’animal vivant et vigile dans un contexte environnemental contrôlé.

Réduction

Toutes les expériences seront menées en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaire pour garantir la fiabilité scientifique des résultats. Pour cela, des calculs ont été réalisés à partir de données déjà obtenues afin de déterminer combien d’animaux sont indispensables, sans excès. Chaque souris sera testée sur plusieurs comportements, ce qui permet de recueillir un maximum d’informations avec un même individu. Dans les modèles de douleur, 10 animaux par groupe et par sexe suffisent pour obtenir des résultats fiables. Dans le modèle de stress chronique, où tous les animaux ne développent pas les mêmes symptômes, il est nécessaire d’avoir jusqu’à 15 animaux par groupe et par sexe afin d’assurer une analyse statistique robuste.

Raffinement

Les souris seront hébergées collectivement dans des cages enrichies avec du coton pour la nidation et des bâtonnets de bois à ronger, afin de favoriser leur bien-être. Avant le début des expériences, elles bénéficieront d’une période d’habituation aux manipulations et aux dispositifs expérimentaux, y compris aux tests comportementaux, ce qui permet de réduire leur peur et leur stress. Pendant toute la durée du projet, les animaux seront observés quotidiennement pour vérifier leur état de santé. Lors des chirurgies, ils seront placés sous anesthésie, installés sur un tapis chauffant et protégés par un gel ophtalmique. Après l’opération, ils retrouveront leur cage d’origine, avec un accès facilité à la nourriture et à l’eau. Les traitements seront administrés par une méthode volontaire : les souris boiront une solution appétente au bout d’une micropipette, ce qui évite les injections et réduit fortement le stress. Les tests comportementaux réalisés sont courts et espacés dans le temps afin de limiter la fatigue et la contrainte pour les animaux. Enfin, si de nouvelles méthodes moins invasives apparaissent au cours du projet, elles seront adoptées après validation avec la Structure Bien-Être Animal.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé en neurosciences et dans l’étude de la douleur. Ses systèmes biologiques sont proches de ceux de l’humain, ce qui permet de tirer des conclusions transposables aux maladies étudiées. Elle présente aussi l’avantage de disposer de nombreuses données de référence et de lignées bien caractérisées, ce qui facilite la comparaison avec d’autres travaux scientifiques. Les animaux utilisés seront des adultes (8 semaines, > 20 g), stade nécessaire à la maturité comportementale.