Procédures sévères

Pour cartographier les réseaux de neurones de la fonction sexuelle chez des animaux devenus paraplégiques, 225 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Chacun subit deux chirurgies d'une heure, une lésion de la moelle épinière puis, quinze jours plus tard, une injection de virus traceur, avant d'être perfusé quatre jours après. Quatre-vingt-dix rats sont soumis à des tests de fonction érectile de trente minutes, par réflexe de dorsiflexion, stimulation du pénis ou injection d'un composé inducteur, et soixante à des tests d'éjaculation par stimulation mécanique ou injection. Le porteur affirme que la stimulation du pénis est sans douleur en s'appuyant sur la bibliographie, tout en reconnaissant qu'une irritation reste possible, et prévoit la mise à mort de tout animal dont les signes de douleur persistent au-delà de quarante-huit heures.

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière sont un problème de santé important, avec une incidence annuelle de 15 à 52.5 cas par million, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Ces lésions causent une paralysie et une perte de sensations bien connues, mais également une dysfonction du système autonome, qui est la partie du système nerveux qui régule les fonctions autonomes telles que la respiration, les battements du coeur ou encore la digestion. Ces dysfonctions autonomes sont, entre autres, des dysfonctions cardio-vasculaires, génito-urinaires, gastrointestinales… et altèrent considérablement la qualité de vie ainsi que l’espérance de vie du patient. Des études de qualité de vie ont montré que pour la majorité des paraplégiques, la récupération de la fonction sexuelle augmenterait drastiquement leur qualité de vie. Les réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle ne sont pas encore bien compris, il est donc important d'étudier ces réseaux dans la physiologie et dans la pathophysiologie de manière à déterminer avec plus de précision de nouvelles cibles thérapeutiques, afin de restaurer la fonction sexuelle chez les paraplégiques.

Bénéfices attendus

Les lésions de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Les études de qualité de vie montrent que la restauration de la fonction sexuelle chez les paraplégiques et les tétraplegiques améliorerait considérablement leur qualité de vie. Par ce projet, nous espérons en savoir plus sur les mécanismes neuronaux de la fonction sexuelle, de manière à trouver un traitement compatible avec leurs deficits.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à deux chirurgies d’une durée maximale d’une heure chacune. Ils auront d’abord une lésion de la moelle épinière, puis, quinze jours plus tard, recevront une injection de virus avant d’être perfusés quatre jours après cette injection. Quatre-vingt-dix rats seront évalués pour la fonction érectile juste avant la perfusion : 30 seront testés pour le réflexe de dorsiflexion du pénis (réflexe évaluant la fonction sexuelle, durée maximale : 30 min), 30 seront testés à l’aide d’une stimulation douce du pénis (30 min max), et 30 seront testés après l’injection d’un composé connu pour induire une érection (30 min max). Soixante rats seront évalués pour la fonction éjaculatoire juste avant la perfusion : 30 seront testés après l’injection d’une molécule connue pour induire une éjaculation (30 min max) et 30 seront testés à l’aide d’une stimulation mécanique (30 min max).

Impact sur les animaux

La lésion de la moelle épinière va induire chez les animaux les mêmes problèmes que ceux rencontrés par les patients : des difficultés locomotrices du train arrière pouvant être largement compensées par les pattes avant et une cage d'hébergement adaptée. Les injections de virus peuvent conduire à de légères douleurs. L'infection au niveau des sutures est rare mais possible. L'utilisation de l'anesthésie gazeuse peut induire des anomalies cardiovasculaires et respiratoires qui seront monitorées visuellement lors des chirurgies. Les injections peuvent induire un léger stress transitoire, mais les composés injectés sont décrits dans la littérature pour ne pas induire d'effets délétères aux doses choisies. La contention des animaux peut également engendrer un stress chez l'animal. Enfin, la stimulation du pénis est sans douleur, les paramètres de stimulation proviennent de la bibliographie. Cependant, une irritation du pénis est possible.

Devenir

L'expérience que nous réalisons avec le virus nous permet de tracer les réseaux de neurones impliqués dans la fonction sexuelle. Afin de visualiser ces réseaux, nous avons besoin d'euthanasier les animaux pour récupérer les tissus d'intérêt.

Remplacement

Les réseaux neuronaux impliqués dans la fonction sexuelle étant pas ou peu connus, aucune modélisation n'est possible, donc l'utilisation d'animaux est indispensable. De plus, cette fonction est possible grâce à l'intéraction de multiples systèmes : hormonal, sensoriel, autonome et moteur. L'étude de cette fonction nécessite donc un organisme entier.

Réduction

Afin de reduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, plusieurs étapes de cette pré-étude seront faites sur les mêmes animaux. Le nombre d'animaux utilisés dans chaque procédure a été déterminé de manière à avoir des résultats statistiquement significatifs, avec les tests adaptés, et le moins d'animaux possible. En cas de surestiation du nombre d'animaux dans une procédure, nous n'inclurons évidemment pas d'animaux supplémentaire dans la procédure.

Raffinement

Pour une pratique plus éthique, les chirurgies ont été mises au point préalablement sur des cadavres récupérés auprès d’autres chercheurs. Cette formation a été réalisée sous la tutelle de notre vétérinaire. Les premières chirurgies seront également effectuées en sa présence afin de limiter les erreurs pouvant engendrer des douleurs. Une analgésie pré-opératoire est prévue, ainsi qu’une analgésie post-opératoire pendant trois jours. Les animaux seront surveillés quotidiennement, et des soins appropriés seront apportés en cas de signes de mal-être ou de douleur, avec un contact du vétérinaire et de la structure de bien-être animal le jour même ou le lendemain selon la gravité. Si un animal présente des signes de douleur persistants au-delà de 48 h, ou sur recommandation du vétérinaire, il sera euthanasié. Des points limites ont été définis et seront systématiquement appliqués pour garantir l’arrêt immédiat des procédures en cas de signes de souffrance ou de détresse non contrôlables. L’environnement des animaux sera enrichi avec des tunnels et du matériel de nidification. Pour la contention, une phase d’habituation quotidienne avec récompense sera mise en place avant le début de l’expérimentation.

Choix des espèces

Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologique reste malgré ses différences proches de celle l'humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies. De plus il existe de nombreux points communs entre le rat et l'humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Enfin nous avons choisi le même modèle que sur l'ensemble des précédents projets scientifiques. Nous utiliserons des animaux adultes car ils doivent être sexuellement actifs (8 à 10 semaines au début des expérimentations)

Quatre heures de chirurgie pour implanter des électrodes dans le cerveau, dix-huit heures d'enregistrement avec privation de sommeil, une épreuve d'endurance inspiratoire d'une heure : 69 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un état de mal épileptique leur est d'abord induit, avec isolement, baisse de la prise alimentaire et hypothermie transitoire, et les implants peuvent provoquer des plaies de grattage, une réouverture de la suture ou un œdème sous-cutané. Une stimulation électrique de l'amygdale de cinq secondes doit reproduire la mort subite qui frappe certains patients épileptiques, le porteur cherchant les paramètres pour lesquels la mortalité reste "minime". Tous les rats sont tués et leur cerveau prélevé, alors que le porteur reconnaît que cet effectif ne permettra aucune analyse statistique.

Objectifs

Plusieurs complications de l’épilepsie sont associées au sommeil, telles que les troubles respiratoires du sommeil ou la mort subite et inattendue (SUDEP). Les crises sont modulées par les états de vigilance des patients, avec une interaction entre le sommeil et l’épilepsie. La mort subite et inattendue fait généralement suite à une crise convulsive généralisée nocturne, résultant principalement en un dysfonctionnement respiratoire central post-crise. Cette altération de la commande respiratoire induit une apnée centrale, provoquant un décès non-traumatique, non lié à un état épileptique documenté. Cette interaction entre dysfonctionnement respiratoire et l’état de sommeil pourrait jouer un rôle dans la pathophysiologie de la mort subite et inattendue. La répétition chronique des crises, associée au développement d'altérations respiratoires inter-crises dans plusieurs modèles d'épilepsie chez les rongeurs et les données post-mortem chez les patients de mort subite et inattendue ont montré une altération des populations neuronales impliquées dans le contrôle respiratoire. À ce jour, il n’existe aucune stratégie de prévention spécifique de la mort subite et inattendue. Les stratégies pharmacologiques visant à réduire la sévérité du dysfonctionnement respiratoire post-crise sont donc apparues comme l'un des moyens les plus prometteurs de prévenir la mort subite et inattendue. Cette étude porte sur l'ajustement de paramètres expérimentaux chez des rats épileptiques, présentant ou non des altérations respiratoires. Les résultats obtenus permettront d’ajuster nos protocoles d’expérimentations afin de raffiner les paramètres d’une étude plus globale et poussée portant sur le co-dysfonctionnement de l’éveil et de la respiration dans l’épilepsie pharmaco-résistante.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de cette étude pilote est de pouvoir déterminer dans un premier temps l’endurance inspiratoire chez le rat épileptique. Cette caractérisation nous permettra d’ajuster notre protocole si celle-ci diffère des animaux sains dont les données sont déjà connues. Dans un second temps, cette étude permettra de déterminer les paramètres optimaux de stimulation de l’amygdale afin que le taux de mortalité associé à ces paramètres soit minime et comparable à ce qui est observé chez l’Homme. À moyen terme, ces données préliminaires seront indispensables pour l’optimisation des procédures d’un deuxième projet plus global. De plus, les résultats de cette étude pilote pourront être incrémentées à ce deuxième projet, nous permettant de réduire le nombre d’animaux à utiliser. À plus long terme, ces résultats seront essentiels dans la compréhension du co-dysfonctionnement entre l’éveil et l’altération respiratoire due à la survenue de crises d’épilepsie et pourront servir de base dans de futures pistes de prévention voir de thérapie dans le cadre du SUDEP.

Procédures

Chirurgie (4h), injection intrapéritonéale de médicaments (moins de 1 min), enregistrement de l'activité de l'animal +/- privation de sommeil (18h), épreuve d'endurance inspiratoire (1h), stimulation électrique intra-cérébrale (5 secondes), enregistrement pléthysmographie (1h)

Impact sur les animaux

Stress lié à l'isolement des animaux suite à l'induction du statut épileptique, en post-chirurgie, à la privation de sommeil et à la contention lors de l'épreuve d'endurance inspiratoire. Diminution de la prise alimentaire suite à l'induction du statut épileptique. Hypothermie transitoire suite à l'administration de la molécule stoppant le statut épileptique. Perturbations transitoires survenant lors d'une crise d'épilepsie. Les chirurgies d’implantation peuvent entraîner des plaies de grattage, une déhiscence de la suture entrainant une réouverture de la plaie, une désunion du dispositif en ciment dentaire permettant le branchement des électrodes filaires, du stress dû à l’isolement jusqu’à cicatrisation ou encore la formation d’un œdème sous-cutané suite à l’implantation de l’implant de télémétrie sans fil.

Devenir

À l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort et le cerveau sera récupéré pour des investigations ex-vivo

Remplacement

Le caractère inattendu de la SUDEP chez le patient rend les expériences prévues dans ce projet non envisageables chez le sujet humain. L’étude des rythmes cérébraux et cardio-respiratoires au cours ou en dehors d’une crise épileptique nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et ne permet pas l’utilisation de méthodes substitutives à l’expérimentation animales telles que des modèles in vitro ou des analyses informatiques de par notamment les interactions entre différents organes (système respiratoire et système nerveux) et ce en fonction de deux états très différents de l’organisme (la veille et le sommeil) dans la physiopathologie de la SUDEP.

Réduction

Cette demande est réalisée chez un faible nombre d’animaux afin de pouvoir mettre au point différents paramètres et réduire par la suite le nombre total d’animaux pour de futurs projets. Nous avons estimé un nombre suffisant d’animaux pour mettre au point notre protocole, en comparaison des données de la littérature et celles obtenues par le laboratoire. Ce nombre ne permettra pas de réaliser d’analyses statistiques, mais ces animaux pourront être incrémentés à un deuxième projet plus global et se basant sur les résultats de cette étude pilote.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l’esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux. L’évaluation et la prise en charge de la douleur, la souffrance et l’angoisse seront effectuées tout au long des procédures, assurée à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être. Des critères de points limites gardés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal…). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. L’expérience sera stoppée si les points limites définis dans la grille de score sont atteints. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, une pesée hebdomadaire, l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu et le recours à de l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgies. Toutes les mesures seront prises pour limiter la souffrance et la douleur. L’utilisation d’analgésiques par voie i.p. sera systématique avant la chirurgie puis quotidiennement et durant les 3 jours qui suivent le jour de la chirurgie. Afin de réduire au maximum le stress lieu au changement d’environnement entre le fournisseur et l’animalerie, les animaux seront commandés dès l’âge de 3 semaines, permettant une adaptation à l’animalerie ainsi qu’à l’expérimentateur de 4 semaines. Cette adaptation est essentielle car il a été observé que plus les animaux étaient stressés et moins l’injection de pilocarpine induisait un statut épileptique. Les animaux sont hébergés en groupe de deux ou trois avec accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et à un enrichissement (bandes de papier, des cubes de bois et une maison en plastique semi-opaque) pour assouvir leur besoin naturel de ronger. Les animaux qui auront été isolés seront manipulés quotidiennement pendant 5 minutes. Le stress lié à la nouveauté sera diminué par l’habituation de l’animal aux différents appareils (non fonctionnels). La mise en place du SE induisant une diminution de la prise alimentaire, un massage abdominal quotidien sera effectué pour réinitier la motilité intestinale. Ce massage sera maintenu jusqu’à l’évolution positive de la masse corporelle.

Choix des espèces

Le projet sera réalisé sur le rat pour les raisons suivantes : 1) Le modèle d’épilepsie chez le rat fait partie des modèles les plus utilisés dans le domaine de la recherche préclinique en épilepsie, dès lors que des études comportementales et électrophysiologiques doivent être couplées 2) La caractérisation de ce modèle sur le plan respiratoire est à ce jour spécifique à l’espèce « rat » permettant ainsi de réduire l’effectif des animaux que nécessiterait une nouvelle caractérisation de la fonction respiratoire chez une espèce différente de celle du rat. L’utilisation de la souche Sprague-Dawley est utilisée car il s’agit de l’espèce la plus pertinente pour l’étude combinée du sommeil et de la fonction respiratoire. La lignée Sprague-Dawley a été choisi en raison d’une variabilité inter-individuelle faible et des données déjà disponibles. Nous travaillerons sur des rats pubères (âgés de 7 semaines, poids entre 180 et 200 g) au moment de l’induction de l’état de mal épileptique, car la grande majorité des cas d’épilepsie acquise (non-génétique) chez l’humain se déclarent chez l’adolescent et le jeune adulte.

Les souris utilisées naissent avec une amyotrophie spinale, les plus atteintes étant incapables de se déplacer, de s'alimenter ou de respirer normalement et mourant vers dix jours. 2 168 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever muscles, cœur, cerveau et moelle épinière. Elles reçoivent des injections répétées dans la veine, dans le bas du dos ou directement dans le cerveau, jusqu'à une par semaine pendant six mois. Le porteur décrit chez la lignée moins atteinte des nécroses sèches qui gagnent la queue puis les oreilles, et affirme qu'elles n'entravent pas le comportement normal de l'animal.

Objectifs

L’amyotrophie spinale (SMA) est une maladie génétique rare qui touche les muscles et les mouvements. Elle est causée par la mutation d’un gène qui impacte la production d’une protéine importante pour la survie des cellules nerveuses responsables des mouvements. Sans cette protéine, ces cellules nerveuses se détériorent, ce qui entraîne une faiblesse musculaire et des complications graves. Il existe un autre gène dans le génome de la souris qui permet de produire une petite quantité de cette protéine. Plus le nombre de copies de ce second gène est grand, moins la maladie est grave. Pour mieux comprendre la SMA et tester de nouveaux traitements, nous utilisons des modèles de souris génétiquement modifiées. Certaines souris ont peu de copies du second gène, ce qui imite les formes les plus graves de la maladie, tandis que d’autres ont plus de copies de ce gène, représentant des formes moins graves. Ces modèles permettent d’évaluer l’efficacité des traitements et de développer de nouvelles thérapies. Ces traitements pourraient aider à produire la protéine manquante et ainsi améliorer la qualité de vie des patients atteints de la SMA.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de notre projet est d’identifier une ou plusieurs molécules thérapeutiques prometteuses pour de futurs essais cliniques destinés au traitement de l’amyotrophie spinale (SMA). Les bénéfices attendus incluent la sélection des molécules candidates ayant le plus grand potentiel thérapeutique ainsi que la détermination de la voie d'administration optimale, avec l'objectif à long terme d'apporter des bénéfices similaires aux patients traités

Procédures

Chaque animal recevra un seul type de procédure (injection intraveineuse, injection au niveau lombaire ou injection cérébrale). Les animaux pourront recevoir des injections chroniques (maximum une injection par semaine pour l'intraveineuse, ou maximum toutes les 2 semaines pour les injections cérébrales), sur une durée maximale de 6 mois. Les injections intraveineuses se feront sous anesthésie générale, avec un délai maximal de 10 minutes entre l'anesthésie et le réveil. Un analgésique local sera administré avant chaque injection. Les injections lombaires et cérébrales se feront également sous anesthésie générale. Compte tenu de la complexité de ces injections, le délai entre l'anesthésie et le réveil est compris entre 30 minutes et 1 heure. Un analgésique global et un analgésique local seront administrés avant chaque injection.

Impact sur les animaux

Les souris SMA type 1 ont une espérance de vie très courte (environ 10 jours). Cela limite les études à long terme sur la maladie ou les traitements. Ces souris présentent des anomalies sévères dès la naissance (faiblesse musculaire extrême, incapacité à se déplacer, à s’alimenter ou à respirer normalement, poids moindre), donc les manipuler n'est pas un acte anodin car elles sont extrêmement fragiles. Le modèle SMA type 3 (forme modérée à légère) présente une progression plus lente. À partir de 3 à 4 semaines de vie environ, ces souris présentent des nécroses sèches au bout de la queue, puis les nécroses évoluent au niveau des oreilles, et beaucoup plus tard (1 an environ) à quelques orteils. Ces nécroses sèches sont attendues chez ces animaux, sans automutilation et n’entravent pas le comportement normal de l’animal (alimentation, déplacements, survie …). Les injections intraveineuses et lombaires peuvent entraîner des douleurs, une légère perte de poids et un risque d’infection au point d’injection. Les injections dans le système nerveux (dans le cerveau avec chirurgie sont des actes nécessitant une chirurgie. Elles peuvent entraîner chez l’animal des douleurs, une perte de poids, des infections, des modifications du comportement (comme une diminution de l’activité, des prostrations, des paralysies en cas de complications).

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés afin d’analyser les différents tissus (muscles squelettiques, cœur, cerveau, foie, rein, cerveau, moelle épinière …).

Remplacement

Dans le cadre de notre engagement envers la règle des 3R, nous procédons systématiquement à une évaluation in vitro de nos molécules actives afin de ne retenir que les meilleurs candidats thérapeutiques, non toxiques pour les cellules, et ainsi minimiser le recours aux méthodes d'évaluation in vivo. Cependant, pour le développement préclinique de ces molécules, l’utilisation de modèles animaux est essentielle pour identifier celles qui ont le meilleur potentiel thérapeutique.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous avons utilisé un outil informatique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire eu utilisant les données préliminaires.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées avec une anesthésie et une analgésie appropriée. Les souris recevront si nécessaire un régime alimentaire additionnel (nourriture gélifiée). Les souris seront inspectées quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. Des mesures précoces pour prévenir toute souffrance ou stress de l’animal seront mises en place grâce à l’utilisation d’une grille scorée pour le suivi des animaux. Ceci permet également d’avoir des points limites précoces permettant de mettre en place des actions avant que les animaux ne souffrent.

Choix des espèces

La souris est l'espèce modèle de référence en recherche biomédicale, notamment pour les pathologies neurodégénératives et les maladies génétiques humaines. Elle présente une grande similitude génétique avec l’humain (environ 95 % de conservation des gènes) et une reproductibilité expérimentale élevée. Par ailleurs, des modèles bien caractérisés de la maladie de l’amyotrophie spinale (SMA) existent chez la souris, permettant une transposition pertinente des résultats précliniques. Le modèle type 1 reproduit une forme grave de la SMA, caractérisée par un déficit de la protéine impliquée, une faiblesse musculaire progressive, une perte rapide de motoneurones. Il permet de tester l’efficacité de traitements précoces et d'étudier les mécanismes pathologiques initiaux de la SMA. Ces souris seront utilisées au stade nouveau-né, car l’injection doit avoir lieu précocement, afin d’étudier les effets du traitement, sur ce modèle présentant une mortalité précoce (souvent avant l'âge de 10 jours sans traitement). Le modèle de SMA type 3 repose sur une mutation génétique similaire mais moins sévère, induisant une forme plus modérée de la maladie, avec une apparition tardive des symptômes et une espérance de vie normale. Il permet d'étudier les effets à long terme des traitements, la récupération fonctionnelle et les conséquences chroniques de la pathologie. Pour toutes ces raisons, ces animaux seront utilisés à partir de l’âge de 3-4 semaines, correspondant au moment d’apparition des symptômes.

Les souris dont l'état dépasse les points limites définis par la grille de score sont tuées avant la fin du protocole. 870 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever le sang et les tissus nerveux. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par injection d'un peptide de myéline et d'un adjuvant, ce qui provoque une hypotonie de la queue puis une faiblesse voire une paralysie des membres postérieurs, un repli social et une réduction du toilettage, sur environ 30 jours dans les modèles aigus et jusqu'à 45 jours dans les modèles rémittents. Le suivi passe par des tests de sensibilité à la douleur d'environ cinq minutes, répétés selon la progression de la maladie, et le porteur justifie le recours à la souris par des raisons scientifiques et par un "intérêt pratique", faibles coûts, cycles de reproduction courts et facilité de manipulation.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie auto-immune chronique qui affecte le système nerveux central en détruisant la gaine de myéline entourant les axones. Cette démyélinisation entraîne l’apparition de lésions dispersées dans le cerveau et la moelle épinière, conduisant à une dégénérescence des neurones. Les symptômes varient selon les patients et les zones du système nerveux atteintes, et comprennent des troubles moteurs, sensitifs, visuels, urinaires ou encore des douleurs neurogènes pouvant être associées à des symptômes dépressifs. La maladie évolue souvent par poussées inflammatoires suivies de périodes de rémission plus ou moins marquées. Bien que des traitements existent, leur efficacité est parfois limitée et ils sont associés à des effets secondaires importants, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Ce projet vise à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques en utilisant un modèle murin bien établi d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, qui reproduit plusieurs caractéristiques de la sclérose en plaques humaine. Les animaux reçoivent une injection d’un peptide dérivé de la myéline associé à un adjuvant, ce qui déclenche une réponse inflammatoire du système nerveux central entraînant des symptômes moteurs et sensoriels. L’évolution de la maladie est ensuite suivie par des tests comportementaux pour mesurer la sensibilité à la douleur et les troubles moteurs. Des analyses complémentaires, notamment histologiques et biochimiques, permettent de mieux comprendre les mécanismes en jeu. Le projet inclut également une approche d’imagerie in vivo, non invasive, permettant d’observer l’inflammation et la progression de la pathologie chez l’animal vivant. Cette stratégie globale permettra d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules et d’identifier des biomarqueurs associés à la maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules ou associations de molécules dans un modèle murin de sclérose en plaques, en se concentrant sur la réduction des déficits moteurs et des douleurs neuropathiques associés à cette pathologie. En combinant des approches comportementales, biochimiques et d’imagerie non invasive sur l’animal vivant, il permettra de caractériser l’impact de ces traitements sur l’inflammation et la neurodégénérescence. Il s’inscrit dans une perspective de recherche translationnelle avec pour finalité l’identification de traitements plus efficaces et mieux tolérés pour les patients atteints de sclérose en plaques. À court terme, c’est-à-dire pendant la durée du projet, les bénéfices attendus concernent l’identification de molécules ou formulations prometteuses ainsi que l’évaluation comparative de leur efficacité dans des protocoles d’administration variés. Cela permettra de déterminer les doses optimales et les fenêtres thérapeutiques pertinentes, qu’il s’agisse d’une administration préventive ou curative. Le projet favorisera également la détection de synergies d’action entre composés, qui pourraient aboutir à des stratégies thérapeutiques combinées plus performantes. Par ailleurs, l’utilisation d’outils d’imagerie innovants sur l’animal entier contribuera à mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs de la maladie, exploitables pour le suivi non invasif de la réponse au traitement. À long terme, les connaissances générées dans le cadre de ce projet pourraient contribuer au développement de nouveaux traitements destinés à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de sclérose en plaques. Ces avancées pourraient également être transposables à d’autres maladies neuroinflammatoires chroniques, pour lesquelles les approches thérapeutiques actuelles restent limitées. En affinant notre compréhension des mécanismes d’action des molécules testées et en enrichissant les modèles de suivi préclinique, ce travail vise à renforcer le lien entre la recherche fondamentale et les applications cliniques, dans le respect des principes éthiques de l’expérimentation animale et au service d’un enjeu de santé publique majeur.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à un ensemble d’interventions techniques brèves, non chirurgicales, nécessaires à l’induction et au suivi du modèle EAE. Les interventions réalisées lors de l’induction du modèle EAE sont les suivantes : 2 injections sous-cutanées (1 minute au total) sous anesthésie gazeuse et 2 injections intrapéritonéales (15 secondes par injection). Les interventions réalisées lors du suivi du modèle EAE sont les suivantes : manipulation quotidienne des animaux (1 minute), test de la sensibilité à la douleur (animal vigile, sur une durée d’environ 5 minutes et répétée à différents temps selon la progression de la maladie), contention pour administrations de molécules à visée thérapeutique (durée d’intervention de 30 à 60 secondes en fonction de la voie d’administration et à une fréquence établie en fonction du protocole et du schéma thérapeutique choisi), examens d’imagerie non invasive par fluorescence sous anesthésie gazeuse (une à deux fois par animal ; injection du traceur par voie intraveineuse d’une durée de 30 secondes maximum ; durée de la session d’imagerie par fluorescence : 60 secondes maximum), un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (une fois par semaine maximum à partir du 18ème jour, durée d’environ 3 minutes). Chaque intervention est conduite par un personnel qualifié, en conditions contrôlées, afin de garantir à la fois le bien-être animal et la qualité des données produites.

Impact sur les animaux

Le modèle EAE utilisé dans ce projet entraîne inévitablement des effets indésirables, dont la nature, l’intensité et la durée varient selon la phase de la maladie induite et la sensibilité individuelle des animaux. Les premiers signes cliniques apparaissent généralement entre 8 et 14 jours après immunisation. Ils se traduisent initialement par une hypotonie de la queue, évoluant vers une faiblesse progressive voire paralysie des membres postérieurs, et dans les formes les plus sévères, des atteintes des membres antérieurs, voire un état prostré. Ces troubles neurologiques sont associés à une réduction significative de la mobilité, pouvant générer une inactivité prolongée. Des pertes de poids significatives sont régulièrement observées durant la phase aiguë de la maladie, liées à une réduction de la prise alimentaire et à l’état général affaibli de l’animal. Des troubles du comportement peuvent également apparaître, comme un repli social, une réduction de la toilette ou un stress accru lié à la manipulation ou à la douleur chronique. La durée des effets varie selon les procédures : dans les modèles aigus, les effets s’étendent sur environ 30 jours, tandis que dans les modèles rémittents, les effets peuvent s’étendre sur 45 jours avec une phase de rémission suivie d’une rechute. Tout au long de l’expérimentation, une surveillance clinique quotidienne est assurée selon une grille de score précise. En cas de dépassement des points limites prédéfinis, les animaux sont euthanasiés immédiatement. L’administration de molécules thérapeutiques peuvent engendrer des effets indésirables qui sont difficiles à anticiper. En effet, la plupart des molécules testées sont des molécules en cours de développement dont nous n’avons pas la connaissance. Les injections par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale peuvent entraîner une douleur légère et transitoire. Une surveillance clinique étroite permettra d’en adapter les modalités en fonction des réponses observées. La manipulation, l’administration de la sonde fluorescente et l’anesthésie pour l’imagerie non invasive par fluorescence peuvent provoquer du stress chez l’animal.

Devenir

A l’issue du protocole, les animaux seront mis à mort pour prélever le sang total et/ou pour prélever les tissus nerveux d’intérêt.

Remplacement

L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’efficacité pharmacologique de nouvelles molécules ou formulations thérapeutiques dans un modèle murin de sclérose en plaques, en se concentrant sur les troubles moteurs et les douleurs neuropathiques associés à la pathologie. L’utilisation de modèles animaux de sclérose en plaques est incontournable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. De plus, si nous voulons préciser les mécanismes sous-jacents à son développement et l’efficacité de nouveaux développements ou molécules thérapeutiques, l’utilisation d’animaux vivants est, à ce jour, indispensable. Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro, ex vivo ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de la maladie chronique. Des approches alternatives sont toutefois intégrées dans la stratégie globale du projet : - Criblages préalables ex vivo (tests cellulaires sur lignées ou cultures primaires) sont réalisés pour évaluer la cytotoxicité, l’activité anti-inflammatoire ou neuroprotectrice des composés avant toute expérimentation in vivo. Ces tests permettent de réduire le nombre de candidats à tester chez l’animal. - Les données issues de modèles informatiques (in silico) et de banques de données moléculaires sont utilisées pour orienter la sélection des molécules candidates, en amont des procédures expérimentales. Cependant, ces approches ne permettent ni de reproduire l’interaction complexe entre système nerveux et système immunitaire, ni d’évaluer de façon fiable les manifestations cliniques fonctionnelles de la maladie (déficit moteur, sensibilité douloureuse, réponse à un traitement sur l’organisme entier). Ainsi, bien que la réflexion sur le remplacement des modèles animaux soit constante, les connaissances disponibles et les limitations techniques actuelles rendent l’utilisation de modèles murins vivants incontournable pour ce projet. Ces modèles sont, en outre, reconnus pour leur validité scientifique dans le domaine de la sclérose en plaques, et sont largement utilisés dans les recherches précliniques ayant conduit aux traitements aujourd’hui disponibles pour les patients.

Réduction

La stratégie d’expérimentation proposée est basée sur des expériences en mesures répétées (études longitudinales). Cette approche permet à chaque animal d’être son propre contrôle et d’être évalué à plusieurs reprises au cours du temps. Une approche statistique est envisagée par une comparaison des groupes d’animaux. Le nombre d’animaux sera de 10 par groupe de traitement (groupe d’animaux recevant une molécule à tester ou un traitement thérapeutique) et permet dans ces conditions d’obtenir une significativité suffisante pour conclure. L’utilisation d’imagerie sur animal vivant en suivi longitudinal permettra de préciser la nature des modifications physiologiques qui se mettent en place lors du développement de la pathologie et de limiter de manière significative le nombre d’animaux utilisés sur la durée. Les analyses post mortem des tissus prélevés en fin d’étude permettront d’optimiser les résultats obtenus in vivo et d’éviter les répétitions d’expériences. Cette stratégie globale vise à garantir une recherche de haute qualité scientifique tout en respectant les principes éthiques d’utilisation raisonnée des animaux.

Raffinement

Le principe de raffinement est intégré à chaque étape du protocole expérimental et repose sur une combinaison de mesures préventives, d’adaptations techniques et de suivi quotidien individualisé. Avant le début de la procédure les animaux bénéficient de séances d’habituation à l’environnement expérimental, au matériel et aux expérimentateurs. Ces périodes d’adaptation permettent de réduire le stress induit par les manipulations et de faciliter les évaluations comportementales. L’environnement d’hébergement est enrichi avec des matériaux adaptés (igloo, coton, accès facilité à la nourriture) afin de favoriser le confort, le repos et les comportements naturels, en particulier pour les animaux présentant un score clinique élevé. Les animaux sont suivis quotidiennement selon une grille d’évaluation fondée sur des critères comportementaux et physiologiques précis incluant l’état d’hydratation, la posture, la mobilité, la réactivité, l’aspect du pelage et la perte de poids. Cette grille permet une détection précoce des signes de souffrance et une prise de décision rapide quant à la poursuite de la procédure ou à l’application des points limites conduisant à l’euthanasie. La nourriture est adaptée à la condition de l’animal et fournie sous forme de gel pour faciliter la prise alimentaire même en cas de mobilité réduite. L’induction de la maladie et les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress. La manipulation est effectuée par un personnel expérimenté et formé spécifiquement aux procédures utilisées dans le cadre du modèle EAE. L’évaluation de la douleur neuropathique est restreinte aux animaux présentant des scores cliniques faibles afin de ne pas surcharger ceux qui présentent déjà un état avancé de la maladie. L’utilisation de techniques non invasives d’imagerie permet de limiter le nombre d’interventions et d’examens post mortem en suivant les mêmes individus tout au long de l’étude. Cette stratégie contribue à réduire l’inconfort global tout en préservant la qualité des résultats. Un comité de pilotage interne est chargé du suivi scientifique et éthique du projet. Il permettra d’intégrer de nouvelles méthodes de raffinement en fonction des avancées techniques ou des recommandations éthiques récentes. Une veille méthodologique active sera assurée afin d’adapter les procédures en continu et d’améliorer le bien-être animal sans compromettre les objectifs scientifiques.

Choix des espèces

La souris s’est rapidement imposée au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Dans le domaine particulier de la recherche fondamentale et appliquée sur la sclérose en plaques et les pathologies associées (déficit moteurs, douleurs neurogènes...), l’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces, (majoritairement chez la souris) pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales, l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine de la douleur aujourd’hui ont été évalués et validés. Des animaux adultes (8-12 semaines) seront utilisés dans ce projet. Il s’agit d’animaux adultes qui sont généralement choisis dans les études de pharmacologie et qui répondent bien à l’expérimentation. Tous les animaux auront le même âge au début de chacune des études. L’induction de la pathologie chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible, fournissant ainsi des résultats satisfaisants. Ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques.

55 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun subit une chirurgie de 30 minutes sous anesthésie générale pour se faire implanter un biomatériau phosphocalcique, puis jusqu'à deux séances d'imagerie de 15 minutes sur un second site, atteint après un transport routier de huit kilomètres à l'aller comme au retour. Les tissus osseux sont prélevés après mise à mort, et le porteur prévoit d'abandonner la procédure complète si la mortalité liée à la chirurgie dépasse 10 %. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative non animale efficace" pour étudier la régénération osseuse, l'implantation dans un "animal complet" apparaissant dès lors "nécessaire".

Objectifs

La prise en charge des grandes pertes osseuses survenant à la suite d’une pose de prothèse, d’un accident, d’une infection ou de l’ablation d’une tumeur, se heurte aujourd’hui encore à des difficultés dans la récupération des fonctions de l’os, ce qui entraîne des hospitalisations prolongées et des coûts importants pour le système de santé. Les biomatériaux à base de phosphate de calcium sont largement utilisés en chirurgie orthopédique comme substitut osseux ou revêtement de surface en raison de leurs propriétés similaires à celles de l’os. Cependant, des progrès restent encore à faire pour limiter l’inflammation et le risque infectieux associés à leur utilisation. La modification de ces matériaux avec du zinc, du strontium ou du cuivre, apparaît comme une stratégie prometteuse pour contrôler l’inflammation induite par les biomatériaux et favoriser la reconstruction osseuse. Par ailleurs, réaliser une mise en forme 3D des matériaux est un paramètre fondamental à considérer pour améliorer la régénération osseuse. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de matériaux contenant du cuivre, du zinc et du strontium, mis en forme en 3D par deux procédés différents, sur la régénération ossseuse chez le rat. Ce travail permettra, par l’implantation de ces matériaux, d’accéder à l’ensemble des réactions de l’hôte afin de valider leur efficacité clinique. Le projet sera réalisé sur deux sites, l’EU1 pour la chirurgie et l’EU2 pour l’imagerie.

Bénéfices attendus

La stratégie de référence actuelle pour favoriser la régéneration osseuse consiste en une greffe d’os provenant du patient lui-même ce qui nécessite un second site d’intervention chirurgicale et induit une augmentation de la morbidité ainsi qu’une période de convalescence plus importante pour le patient. De plus, la faible disponibilité de ce matériel biologique rend cette approche inenvisageable pour les grands défauts osseux. Les autres approches de greffe (tissu provenant d’un autre individu ou d’une autre espèce) permettent de disposer de plus grandes quantités de matériel mais posent de sérieuses questions quant aux risques d’infections et de transmission de maladies. Dans ce contexte, le recours aux matériaux contenant des ions augmentant leurs capacités a emergé comme une alternative prometteuse aux greffes de tissus. Ils permettraient, grâce aux ions notamment, de limiter l’inflammation et le risque infectieux associés à l’implantation du matériau et à la procédure chirurgicale. Les résultats de cette étude permettront d’évaluer concrètement l’effet des matériaux testés sur la régénération osseuse et ainsi d’obtenir de meilleurs résultats pour les patients en clinique.

Procédures

Les animaux auront une intervention chirurgicale de 30 min sous anesthésie générale pour la procédure au sein du premier établissement utilisateur. Ils seront également soumis au maximum à deux séances d’imagerie de 15 min, sous anesthésie générale, au sein du second établissement utilisateur.

Impact sur les animaux

Toute approche chirurgicale implique un risque de mortalité lors de l’intervention et après. Néanmoins, si la mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie est supérieure à 10% la procédure complète sera abandonnée. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée après les interventions chirurgicales est attendue dans les tous premiers jours avant une reprise de poids classique ensuite. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. A notre connaissance, aucun autre effet indésirable n’est attendu.

Devenir

A l’issue de la procédure tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus osseux et observer la régénération osseuse par scanner à haute résolution et analyses histologiques et immunohistochimie.

Remplacement

A notre connaissance, il n’y a pas d’alternative non animale efficace pour étudier la régénération osseuse et la récupération des fonctions motrices associée. Les modèles d’étude mimétiques d’organes isolés ne peuvent pas fournir une réponse pertinente. Les mécanismes complexes de régulation des différents tissus et du système immunitaire ne sont pas accessibles en dehors de modèles impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse. L’implantation chez l’animal apparait ainsi nécessaire pour étudier la réaction de l’intégralité de l’hôté vis-à-vis du biomatériaux et de conclure quant à ses propriétés de régénération.

Réduction

Sur la base de nos expériences précédentes, un nombre optimisé d’animaux (10 par groupe) sera employé pour ces procédures afin que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique en fin d’expérimentation. Une logique d’arrêt des procédures est de plus mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux par groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Des tests statistiques adaptés à nos effectifs seront utilisés.

Raffinement

Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de d’acclimatation d’une semaine minimum sera appliquée afin que les rats s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies de matériaux (kraft, carton…) permettant aux animaux d'améliorer leur cage. A chaque intervention les animaux seront endormis afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’intervention chirurgicale, une douleur après l’opération sera anticipée avec l’utilisation de médicaments antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les trois premiers jours et si des signes d’inconfort étaient détectés. Le suivi des animaux se fera ensuite 1 fois par jour. . Des points limites ont été mis en place afin de suivre le bien être animal tout au long de la procédure. Les animaux seront finalement euthanasiés après anesthésie générale. Afin de réaliser les analyses par imagerie, sur un site distant abritant la plateforme dédiée, les animaux seront transportés par véhicule personnel climatisé afin de consevrer une température optimale pour les animaux de 20°C, (8 km, environ 10 minutes). Le transport sera effectué dans des cages de transport propres, spécifiquement préparées, et les animaux seront remis dans des cages habituelles avec eau et nourriture à volonté dès leur arrivée. Le retour s’effectuera de la même manière.

Choix des espèces

La réalisation de ce type d’études chez le rat est décrite et validée dans la littérature. Le modèle est adapté pour correctement répondre à notre question scientifique en lien avec la régénération osseuse. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine et permettre une technique chirurgicale reproductible, les rats utilisés seront des rats adultes âgés de 12 semaines au moment de la procédure.