Procédures sévères

576 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour mettre leurs tumeurs en culture et y chercher des bactéries. Chacune peut subir une greffe de cellules tumorales pancréatiques par chirurgie, une à cinq prises de sang sous anesthésie, jusqu'à huit gavages, sept injections et quinze séances d'imagerie de vingt minutes. Le porteur reconnaît que la croissance d'un adénocarcinome pancréatique peut entraîner douleurs, troubles digestifs et ascite, et que la déplétion des cellules immunitaires augmente les risques d'infection. Sur le remplacement, il écrit ne disposer d'aucune alternative parce que le modèle est encore trop récent dans son laboratoire, en évoquant des organoïdes pour de futures expériences.

Objectifs

Le cancer du pancréas est généralement associé à un taux de survie relativement bas par rapport à d'autres types de cancer. Cette situation s'explique par plusieurs facteurs, notamment le diagnostic tardif, la nature agressive de la maladie et le manque de traitements efficaces dans les stades avancés. Le pancréas joue un rôle clé dans la digestion, en libérant des enzymes digestives, et dans la régulation de la glycémie, un élément crucial du métabolisme des glucides. Les traitements actuels pour le cancer du pancréas incluent la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie, les thérapies ciblées et l'immunothérapie, mais leur efficacité dépend du stade de la maladie. L'immunité innée et acquise protège généralement l'organisme, y compris contre les bactéries qui peuvent envahir les tumeurs. Dans ce projet, des bactéries ont été trouvées dans des tumeurs pancréatiques, même si elles étaient en petit nombre, suggérant qu'elles ont survécu aux divers composants du système immunitaire (cellules dendritiques, macrophages, neutrophiles, cellules NK, lymphocytes B et T). L'analyse métagénomique a révélé la présence de plusieurs ADN bactériens (impactant négativement le traitement contre le cancer) non détectés en culture, suggérant que ces bactéries ont pu être éliminées par le système immunitaire du patient, affaibli par le cancer. Deux études utilisant la transplantation de microbiote fécal (FMT) chez des souris ont montré que la modulation du microbiote influence la réponse immunitaire et la progression tumorale. FMT a permis d'améliorer la réponse à l'immunothérapie et de réduire la croissance tumorale dans un modèle de cancer du pancréas. Cela renforce l'hypothèse selon laquelle les bactéries intratumorales jouent un rôle dans la progression du cancer. L'objectif n°1 du projet est de démontrer que, dans un modèle de souris où l'immunité est complètement déplétée, la tumeur sera plus envahie par les bactéries par rapport à une souris immunocompétente. La validation de la 1ère expérience nous a permis d’observer une invasion bactérienne plus importante au niveau de la tumeur, notamment d’une prénommée Staphylococcus epidermidis dont certaines souches sont commensales comme pathogènes. Alors, l’objectif de la 2ème partie de ce projet est de déterminer comment cette bactérie parvient de l’intestin jusqu’à la tumeur et d’étudier son impact sur le dévelopement tumoral et l’immunité associée.

Bénéfices attendus

Nous essayerons de comprendre ici si l’immunosurveillance, même affaiblie, empêche l’invasion bactérienne dans la tumeur. De plus, cela nous permettrait de mieux comprendre le rôle de l’invasion bactérienne dans le microenvironnement tumoral et son rôle dans la progression du cancer. Cela pourrait aider à identifier des biomarqueurs du statut immunitaire et orienter le développement de nouvelles thérapies, notamment en modulant le microbiome tumoral. Cette compréhension permettrait également d’optimiser l’utilisation de l’immunothérapie et de réduire les risques de complications infectieuses chez les patients. De plus, cela éclaire les interactions entre l’immunité et les bactéries, pouvant ainsi influencer la réponse aux traitements et les décisions cliniques.

Procédures

Les souris pourront avoir entre 1 et 5 prises de sang, sous anesthésie générale (durée 5 minutes). La greffe des cellules tumorales se fera par chirurgie sous anesthésie générale et analgésie et durera environ 5 min par souris. Le gavage oral dure moins d'une minute par souris et se renouvelle tous les 2 jours (nombre maximal = 8) . Des injections seront faites 7, 3 et 1 jour avant l'implantation de la tumeur et à 5, 9, 13 jours après l'injection de la tumeur, par injection (anesthésie locale, durée 10 secondes). Des animaux auront des séances d'imagerie sous anesthésie générale (n maximal = 15, durée 20 minutes).

Impact sur les animaux

Douleur post-opératoires : l'ouverture de la cavité abdominale peut entraîner des douleurs post-opératoires modérées. Le prélèvement des fecès implique d'isoler l'animal pour une très courte durée, cela peut provoquer un léger stress temporaire (inférieur à 3 minutes). Le gavage oral est un geste technique car il nécessite de faire passer une sonde jusqu'à l'estomac, une gêne légère sera ressentie par l'animal mais sera très passagère (durée inférieure à 10 secondes). La déplétion des monocytes, macrophages et neutrophiles accroît légèrement les risques d'infections, altère la réponse immunitaire, entraîne des perturbations métaboliques (sasn effet clinique) et augmente modérément les risques d'inflammation intestinale. La croissance d'un adénocarcinome pancréatique peut éventuellement entraîner des conséquences sévères (douleurs, problèmes digestifs, ascite).

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure, le but étant de cultiver les tumeurs pour évaluer la présence de bactéries intratumorales.

Remplacement

Nous n'avons pas de modèle de remplacement pour le moment, car ce modèle est encore trop récent dans notre laboratoire. Il est possible qu'à l'avenir, si le projet apporte des éclaircissements pertinents sur les cancers pancréatiques chez la souris (PDAC), nous générions des organoïdes afin de perfectionner les expériences futures. Actuellement, nous utilisons des anticorps déplétants, et dans ces conditions, un système vivant complet est nécessaire pour obtenir une déplétion efficace et observer les changements dans le comportement tumoral. Le principal problème étant que nous voulons savoir s'il y a également des bactéries communes dans l'intestin et les bactéries que nous trouverons dans le pancréas, dans ce cas-là, il est impossible à l'heure actuelle d'avoir un modèle nous permettant d'étudier cette possible interaction in vitro.

Réduction

Pour ces études, nous utilisons un modèle tumoral validé et déjà publié. Afin de mener à bien cette étude, nous avons prévu de regrouper les expérimentations de manière à minimiser le nombre d’animaux témoins. Le nombre d’animaux est rigoureusement contrôlé pour optimiser les ressources tout en garantissant des résultats fiables. Pour garantir la fiabilité des données, les expériences seront réalisées en triplicata indépendants, avec des groupes de 4 souris chacun. Cependant, si des différences très significatives sont observées lors de la première répétition, les groupes suivants seront réduits, ce qui permettra de limiter l'utilisation d'animaux, tout en maintenant la robustesse statistique des résultats. Ce plan d'étude concilie l'exigence éthique et scientifique en optimisant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions garantissant leur bien-être avec enrichissement environnemental adapté. Une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début de l’expérimentation afin de réduire le stress des animaux et d'assurer leur adaptation à l'environnement de laboratoire. Une surveillance quotidienne permettra d’observer tout changement comportemental et, si nécessaire, de mettre en place des adaptations ou des traitements. Toutes les injections seront administrées sous anesthésie locale afin de minimiser la douleur. Les souris seront pesées régulièrement, au moins une fois par semaine. Les points limites précoces seront strictement respectés et des soins adaptés seront prodigués, en consultation avec le vétérinaire, pour garantir le bien-être des animaux tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique est proche de celle de l’Homme et bien connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines, ce qui correspond à leur maturité sexuelle et assure une stabilité hormonale. Cet âge est optimal pour garantir une réponse biologique cohérente et réduire les variations liées aux fluctuations hormonales. De plus, leur système immunitaire est pleinement développé, ce qui est essentiel pour l’étude de la progression tumorale et des réponses aux traitements, tout en permettant des interventions expérimentales sur une période prolongée.

Inoculées par voie orale avec Salmonella après mise à jeun, les souris de ce projet peuvent ressentir de la douleur dès le troisième ou le quatrième jour, avec prostration, yeux fermés et difficultés motrices. 855 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, l'un des deux modèles reproduisant une infection systémique létale, l'autre une gastroentérite après prétraitement à la streptomycine. Toutes sont tuées pour prélever des organes, mesurer la luminescence bactérienne et compter les bactéries, l'objet étant de localiser où et quand Salmonella exprime ses facteurs de résistance au cuivre et au stress oxydatif. Au chapitre du raffinement, le porteur indique que réduire la douleur liée à l'infection n'est pas possible sans modifier la cinétique des symptômes, que les cages ne contiennent que du papier absorbant et que les souris ne recevront pas de récompenses.

Objectifs

Salmonella enterica serovar Typhimurium est un microorganisme pathogène à large spectre qui est responsable de gastroentérites ou de fièvre typhoïde en fonction de l’hôte infecté. Le principal mode de contamination passe par l’ingestion d’aliments d’origine animale contaminés (viande, poisson, œufs, lait). Cette entérobactérie colonise l’intestin et elle est capable de franchir la barrière intestinale. Ensuite, elle va circuler dans le sang jusqu’aux organes systémiques, la rate et le foie. Tout au long de ce processus infectieux, Salmonella va pouvoir entrer dans les cellules du système de défense de l’organisme (système immunitaire). Ces acteurs de l’immunité vont mettre en place différents mécanismes pour éliminer cet agent infectieux. Parmi ces mécanismes, on retrouve (i) l’import de cuivre, (ii) la production de molécules oxydantes, (iii) l’acidification ou encore (iv) la production de peptides antimicrobiens (lysozyme). Le cuivre, bien qu’étant un métal de transition essentiel pour différents processus biochimiques, devient toxique à fortes concentrations. Les molécules oxydantes produites sont quant à elles capables d’endommager les composants cellulaires des bactéries comme l’ADN, les protéines ou les lipides, pouvant alors causer un dysfonctionnement cellulaire ou un ralentissement de la croissance, voire la mort cellulaire dans certains cas. Récemment, un mécanisme de régulation original dépendant de la présence concomitante de cuivre et d’une molécule oxydante a été identifié chez Salmonella. Ce mécanisme permet l'acheminement du cuivre vers des protéines cibles de la cellule. Cela laisse entrevoir la possibilité d'une action simultanée des deux stress durant l'interaction hôte-pathogène et une réponse concertée du pathogène. Le projet présenté ici vise à déchiffrer l'orchestration du double stress cuivre et stress oxydatif en modèles souris reproduisant la gastroentérite à Salmonella ou la fièvre typhoïde, ainsi que les mécanismes d'adaptation utilisés par Salmonella pour faire face à ces stress pendant le processus infectieux.

Bénéfices attendus

Les stress métallique et oxydatif font partie des principaux mécanismes antibactériens utilisés par les cellules immunitaires de l'hôte pour combattre les infections bactériennes. En général, chacune de ces contraintes est étudiée individuellement, soit du côté hôte pour identifier les systèmes impliqués dans leur production, soit du côté pathogène pour comprendre les systèmes moléculaires utilisés pour éviter, assimiler ou dégrader ces composés. Dans ce projet, nous proposons d'étudier deux stress dont la concomitance n’a jamais été décrite, ce qui est un projet ambitieux et original. Cette approche intégrée et unificatrice vise à équilibrer durablement et à optimiser la santé des personnes, des animaux et des écosystèmes. Elle tient compte du fait que la santé des humains, des animaux domestiques et sauvages, des plantes, et de l'environnement au sens large (y compris les écosystèmes) sont étroitement liés et interdépendants. La complémentarité des expertises des partenaires (microbiologie moléculaire et infection/biologie cellulaire) nous offre une occasion unique de caractériser et de déchiffrer la voie du double stress Cu/stress oxydatif in vitro et in vivo. A court terme, nos résultats permettront de mieux comprendre l'importance du cuivre et du stress oxydatif durant la réponse immunitaire innée de l'hôte et auront un impact sur une grande communauté de biologistes. Ce projet produira des résultats directs sous forme de nouvelles données scientifiques et de nouveaux outils. A plus long terme, notre projet fondamental ouvrira également la voie à l'élaboration de stratégies nouvelles pour cibler différentes grandes questions de santé publique [virulence bactérienne ; action biocide ; biocapteurs Cu et ROS (Reactive Oxygen Species) ; physiologie des neutrophiles et macrophages].

Procédures

- Mises à jeun : 2 x 4h à 24h d’intervalle pour le modèle gastroentérite et 1 x 2h pour le modèle d’infection systémique létale. - Traitement antibiotique : sur animal vigile – une partie des animaux – 1 fois – durée = 10 sec maxi - Inoculation de Salmonella : sur animal vigile – tous les animaux – 1 fois – durée = 10 sec maxi - Anesthésie : tous les animaux de la procédure 1 – plusieurs fois pour certains animaux – durée = 5 min maxi par anesthésie - Imagerie in vivo : sur animal anesthésié – tous les animaux de la procédure 1 – plusieurs fois pour certains animaux – durée = 5 min maxi - Euthanasie : tous les animaux

Impact sur les animaux

Les animaux sont susceptibles de ressentir de la douleur à partir du jour 4 p.i. dans le modèle d’infection systémique létale et au bout de 3 jours p.i. dans le modèle gastroentérite. Les nuisances possibles liées à l’infection sont : prostation, yeux fermés et difficultés motrices. Autres nuisances (stress) liées à l’expérimentation : contention, dépilation, mise à jeun de 2 ou 4h et gavage.

Devenir

Pour les 3 procédures, tous les animaux sont euthanasiés en fin d’expérimentation afin de pouvoir prélever différents organes, pour mesure de la luminescence, purification de cellules ou numération bactérienne.

Remplacement

Nous travaillons sur des interactions pathogènes/hôte visant à comprendre l’arsenal dont dispose Salmonella pour infecter ses hôtes. La caractérisation phénotypique d’un gène de virulence in vitro est essentielle mais elle ne permet pas de comprendre le rôle de ce gène dans la pathogénie. Par exemple, in vitro, le gène cueP est important pour la prolifération intracellulaire de Salmonella au moins dans le macrophage et la régulation de son expression suggère un rôle fort pour que Salmonella résiste à la réponse immunitaire mise en place par les cellules de l’hôte. Cependant, in vivo, nous n’avons aucune idée du/des organes dans lesquels il est exprimé, de sa cinétique d’expression chez les hôtes de Salmonella, des cellules qu’il cible. Il est donc important de connaître ces informations. Il n’y a pas de modèle de remplacement qui reproduise à la fois l’environnement rencontré par la bactérie dans chacun des organes et la réponse de l’hôte à l’infection qui sont des facteurs influençant l’expression des facteurs de virulence.

Réduction

Stratégie pour réduire le nombre d’animaux - Gènes étudiés : Tous les gènes d’intérêt ont fait l’objet d’une caractérisation in vitro avant de passer à l’expérimentation animale (études de prévalence des gènes chez des souches de Salmonella, caractérisation biochimique de la protéine, caractérisation phénotypique d’un mutant de ce gène). Le choix des gènes d’intérêt à tester in vivo est déterminé en fonction de cette caractérisation in vitro. - Choix de la voie d’inoculation : La voie orale est la seule qui est testée systématiquement car c’est la voie d’infection naturelle utilisée par Salmonella pour contaminer ses hôtes. De plus, nous regroupons chaque fois que cela est possible les gènes à tester dans une même expérience pour qu’un seul lot témoin négatif soit utilisé, et cela afin de réduire le nombre d’animaux. Etude statistique : pour la procédure 1, tout signal luminescent détecté chez un animal reflète l’expression du facteur de virulence testé chez cet animal à cet instant. Aucun test statistique n’est donc nécessaire ni pertinent. Pour la procédure 2, les données d’expression du gène d’intérêt par les bactéries dans les différents types cellulaires présents pour chaque organe étudié seront soustraites avec les données d’expression obtenues pour le lot témoin. Tout comme pour l’axe I, aucun test statistique ne sera effectué ici, le but étant d’identifier dans quel type cellulaire le gène d’intérêt est le plus exprimé. Pour la procédure 3, le nombre d’animaux a été calculé afin d’utiliser le minimum d’animaux permettant de mettre en évidence une différence significative entre les lots testés.

Raffinement

Dès l'arrivée des animaux à l’animalerie, une semaine d’acclimatation est prévue pour permettre l'adaptation des animaux à leur nouvel environnement. Les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Les animaux sont hébergés selon les conditions de l’établissement utilisateur agréé, en tenant compte de l’état physiologique des animaux et enregistrement de la température ambiante. Pour éviter les problèmes de luminescence parasite, uniquement du papier absorbant est utilisé dans les cages de souris comme raffinement au cours de l’expérimentation. Pour la même raison, les souris ne recevront pas de récompenses. L’utilisation de méthode pour réduire la douleur liée à l’infection par Salmonella n’est pas possible car elle modifierait la cinétique d’apparition des symptômes et ne reproduirait donc plus la maladie. En revanche, après imagerie sous anesthésie gazeuse, chaque souris est placée individuellement sous une lampe infra-rouge pour optimiser son bien-être lors du réveil et surveillée jusqu’à sa remise en cage avec ses congénères uniquement lorsqu’elle a retrouvé son activité normale.

Choix des espèces

Salmonella est responsable chez l’homme et les animaux de la fièvre typhoïde qui est une infection systémique létale en l’absence de traitement et de gastroentérites. Nous disposons de modèles murins reproduisant ces deux syndromes. Le modèle en souris sensibles à l’infection par Salmonella est un modèle d’infection systémique létale naturel qui reproduit la fièvre typhoïde. Le modèle de gastro-entérite en souris prétraitées à la streptomycine reproduit la colite observée naturellement chez le veau et la réponse immunitaire associée. Les modèles murins utilisés sont donc particulièrement pertinents pour étudier les infections à Salmonella en choisissant la bonne lignée de souris et le prétraitement adapté en fonction de la pathologie ciblée. Les souris utilisées sont adultes, elles ont entre 6 et 8 semaines d’âge dans le modèle d’infection systémique létale et entre 8 et 10 semaines dans le modèle de gastroentérite et ce, conformément aux modèles établis dans la littérature. Les souris sont réparties en cages dès leur réception, et au minimum 7 jours avant l’inoculation.

Suspendues par l'arrière-train pendant trois jours pour que leurs pattes ne portent plus leur poids, 640 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles passent quatre semaines et demie seules en cage, reçoivent un gavage trois fois par semaine pendant trois semaines, puis une injection trente minutes avant la mise à mort. Le porteur veut savoir si l'halofuginone protège les mitochondries du muscle pendant l'inactivité, et décrit comme modérés les bouchons urinaires du début de suspension et la perte de poids d'environ 15 %. Sur le remplacement, il conclut que l'animal vivant est "la seule option possible", l'expérimentation sur des humains en situation d'inactivité étant selon lui éthiquement difficile.

Objectifs

Le muscle squelettique joue un rôle central dans le mouvement, le maintien de la posture, la thermorégulation et les processus de défenses contre les agressions. Maintenir la masse et la fonction musculaire est essentiel pour préserver l'autonomie, prévenir les blessures et favoriser une bonne qualité de vie, notamment avec l'âge ou en cas de maladie. Les mécanismes impliqués dans le maintien de la masse musculaire ont été beaucoup étudié avec l’identification de nombreux processus intracellulaires, dont le maintien de l’intégrité mitochondriale. Pourtant, à l’heure actuelle, il n’existe toujours pas de traitement pour lutter efficacement contre la perte de masse musculaire (atrophie) qui s’installe dans diverses situations physiologiques ou pathologiques. La lutte contre l’atrophie musculaire reste donc un enjeu majeur de santé publique. L’halofuginone est un composé dérivé d’une plante chinoise qui inhibe la fibrose et l'inflammation dans différentes pathologies musculaires et qui peut retarder l’atrophie musculaire induite par l'inactivité physique chez des souris ayant été préalablement traitées par l’halofuginone pendant 3 semaines. Le projet a pour but d’étudier les effets de l’halofuginone sur le maintien de l’intégrité mitochondriale dans le muscle lors de l'inactivité physique, notamment sur les aspects structuraux et métaboliques d’une part et sur les conséquences sur la fonction musculaire d’autre part.

Bénéfices attendus

L’halofuginone est une molécule utilisée dans des études cliniques (notamment dans le cadre du traitement de dystrophies musculaires, ou de la malaria…) et possède diverses propriétés. Son rôle potentiel sur la préservation de l’intégrité mitochondriale dans le muscle en situation d’atrophie n’est pas cependant pas documenté. Ce projet apportera donc des connaissances sur des mécanismes additionnels par lesquels l’halofuginone exerce ses effets bénéfiques sur la préservation de la masse musculaire, et pourrait donc permettre à terme d’élargir son utilisation en clinique humaine.

Procédures

4 types d'intervention: (1) Hebergement individuel : durée = 4,5 semaines. (2) Suspension anti-orthostatique : durée = 3 jours. (3) Gavages : 3 fois par semaine ; durée = 3 semaines. (4) injection : 1 seule fois. 30 min. avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

(1) Protocole de suspension anti-orthostatique (3 jours) : les animaux peuvent présenter des bouchons urinaires surtout au début de la suspension. Les animaux sont donc observés deux fois par jour pendant les 3 jours de suspension. Si un bouchon est observé, l’expérimentateur l’élimine à l’aide d’une compresse humide. La suspension des animaux entraine de fait un stress lié à la restriction de leur mobilité. Cependant, les effets sur la prise alimentaire et sur le poids corporel restent modérés avec une baisse de l’ordre de 15% les 2-3 premiers jours sont normalisés ensuite. (2) Administration par gavage (3 fois par semaine pendant 3 semaines) : Ce mode d'administration peut entrainer dans certains cas du stress lié à la contention avec une irritation et/ou un incorfort. Les animaux seront observés quotidiennement pour évaluer tout comportement pouvant témoigner de douleur et la prise alimentaire mesurée tous les jours pour s'assurer qu'elle reste stable. (3) Injection (1 fois) : Ce mode d'administration peut entrainer dans certains cas du stress lié à la contention.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque protocole expérimental, les prélèvements nécessitant une procédure terminale sans réveil.

Remplacement

Les fontes musculaires lors de pathologies sont caractérisées par une atteinte simultanée de plusieurs tissus et/ou fonctions. Cette complexité des interactions entre tissus et organes n’existe que chez les animaux vivants. L’inactivité physique est impossible à reproduire sur des modèles expérimentaux plus simples (culture de tissus ou de cellules, organoïdes). Enfin, les situations d’inactivité physique chez l’Homme sont retrouvées lors de maladies ou de grande fatigue rendant éthiquement difficile ce type d’expérimentation chez l’Homme. L’utilisation d’animaux vivants placés en situation d’inactivité physique est la seule option possible.

Réduction

Nous avons planifié le nombre d'animaux nécessaires afin de garantir une puissance statistique adéquate tout en anticipant les éventuelles exclusions de certaines souris. Les procédures seront chacune réalisées en 2 étapes. Un premier protocole expérimental sera réalisé avec un effectif de 10 animaux par groupe, puis répété pour valider les observations dans 2 expériences indépendantes. Ces protocoles ne seront répétés que si les données initiales le justifient, dans le but de limiter autant que possible le nombre de souris utilisées dans chaque procédure.

Raffinement

Les contraintes que les animaux subissent au cours des procédures seront prises en compte par la mise en place de différentes mesures : (i) aménagement du milieu est prévu notamment par des ouates de cellulose pour augmenter le bien-être des souris pendant l’expérimentation. (ii) suivi quotidien des souris pour identifier des signes de stress ou de souffrance, caractrisés par l'état du pelage, le comportement de la souris (agressivité/apathie), mobilité, alimentation... Le poids corporel et la prise alimentaire seront donc mesurés tous les jours. (iii) soins spécifiques pendant la période de suspension (elimination des bouchons urinaires) (iv) mise en place de points limites. En cas d'atteinte d'un point limite l'animal sera exclu des procédures expérimentales.

Choix des espèces

Choix de l'espèce : Nous avons choisi d'utiliser des souris . La souris nous permet d'étudier les mécanismes par lesquels l'halofugionone permet de retarder l'atrophie musculaire lors de l'inactivité physique car cette espèce montre une bonne concordance avec l'atrophie musculaire observée chez l'homme en situation d'inactivité physique (bed rest, immobilisation), rendant les données obtenues particulièrement pertinentes pour une transposition potentielle des résultats. De plus, nous étudions ces phénomènes à un stade dé développement adulte pour s'affranchir des facteurs confondants liés à la croissance des animaux. Choix du stade de développement : Les souris seront matures âgées de 8-12 semaines, afin qu'elles soient matures d’un point de vue sexuel, ce qui permet d’éviter les modifications hormonales observées durant la croissance. De plus, la croissance musculaire est stabilisée ce qui permet d’observer les pertes de masse musculaire per se en réponse à la suspension, indépendamment d’un effet éventuel lié à un retard de croissance.

27 jours seules en cage, dont cinq jours à 14 °C après cinq jours à 30 °C : c'est le protocole imposé à des souris porteuses d'une mutation qui les rend résistantes à la prise de poids. 96 souris vont être utilisées dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, sévère. Le porteur qualifie pourtant ses mesures de non invasives et affirme qu'elles se font "sans impact négatif sur les animaux", ne retenant comme nuisances que l'isolement social et un stress physiologique transitoire au passage au froid. Toutes seront tuées pour les prélèvements.

Objectifs

L'obésité et le surpoids ont atteint des proportions épidémiques dans le monde, touchant 1,9 milliard d’adultes en surpoids et plus de 650 millions d’obèses en 2016. Des études montrent que l'immunité innée, activée par les bactéries du microbiote intestinal, joue un rôle clé dans ces troubles. Une nouvelle voie impliquant un récepteur a récemment été découverte. Des mutations du gène de ce récepteur ont été associées à l'obésité et au diabète de type 2. Pour mieux comprendre cette voie, une lignée de souris mutées a été développée. Ces souris prennent moins de poids sous régime riche en graisses et expriment davantage de gènes liés à la régulation de la température corporelle. Nous émettons donc l'hypothèse que ces souris ont une capacité adaptative accrue à un changement de température qui expliquerait leur phénotype de résistance à l'obésité. Cependant, l'effet de la température et du type de régime sur leur balance énergétique reste à étudier. Afin d'obtenir ces données, des mesures précises seront collectées de manière non invasive grâce à des cages de calorimétrie indirecte dans un environnement à température contrôlée.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment le corps régule son équilibre énergétique et sa température, des processus essentiels dans le développement de l'obésité, un problème de santé majeur avec des conséquences médicales et socio-économiques importantes. En étudiant un récepteur dont les mutations sont associées à l'obésité et au diabète de type 2 chez l'homme, cette recherche pourrait révéler de nouvelles cibles thérapeutiques. L’analyse de souris mutées pour ce récepteur, résistantes à la prise de poids sous régime riche en graisses et présentant une activation accrue des gènes liés à la production de chaleur, permettra d'explorer l'impact des régimes alimentaires et des variations de température sur le métabolisme. Des mesures non invasives, comme la calorimétrie indirecte et l'imagerie thermique, fourniront des informations précises sur l’équilibre énergétique et la composition corporelle. Les résultats obtenus pourraient ouvrir la voie à des stratégies innovantes pour prévenir et traiter l'obésité et les troubles métaboliques associés.

Procédures

La mesure de la balance énergétique sera effectuée durant 20 jours et donc les animaux seront individualisés pendant 27 jours. La température d'hébergement variera entre 30°C (5 jours) et 14°C (5 Jours) avec une transition à 22°C (5 jours).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels liés à ce protocole concernent principalement l’hébergement individuel, les manipulations ponctuelles lors de l’analyse corporelle, ainsi que l’exposition à des températures non standard, en particulier en raison de l’alternance des conditions environnementales. Les animaux seront placés en cage individuelle, ce qui peut générer un stress modéré, notamment lié à l’absence d’interactions sociales. Ce stress est susceptible de persister tout au long de la période d’isolement, qui n’excèdera pas 27 jours. Enfin, les animaux seront soumis à une alternance de conditions environnementales : une phase à 30 °C (température de thermoneutralité) suivie, après une période de transition de cinq jours à 22 °C, d’une phase à 14 °C (froid modéré). Ce changement de température, nécessaire pour étudier les capacités adaptatives des souris, nécessitera une adaptation de la souris à ce nouvel environnement, il peut entraîner un stress physiologique transitoire, notamment lors du passage au froid.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est justifié, car il est impossible de modéliser in vitro ou in silico les interactions complexes entre le régime alimentaire, l’immunité innée, la dépense énergétique, la composition corporelle et l’effet de la température ambiante. L’étude du métabolisme énergétique et des comportements associés nécessite un organisme entier, où les tissus métaboliquement actifs coopèrent de manière intégrée pour réguler ces processus.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, cette étude combine l’analyse du comportement alimentaire, de la dépense énergétique, de la composition corporelle et des paramètres d’exposition à différentes températures sur les mêmes individus pendant 5 jours par palier. Douze souris par groupe expérimental sont nécessaires pour garantir des résultats statistiquement significatifs en tenant compte de la variabilité connue des paramètres mesurés. Les relevés métaboliques réalisés sur plusieurs jours réduisent cette variabilité intrinsèque et interindividuelle. De plus, les méthodes, non invasives utilisées, permettent d’obtenir des données précises sans impact négatif sur les animaux. L’évaluation des capacités adaptatives sera également optimisée par le changement de régime sur les mêmes souris. Enfin, des analyses statistiques adaptées permettront de maximiser la robustesse des résultats tout en minimisant le nombre d’animaux requis.

Raffinement

Pendant la phase d’individualisation, le poids et la consommation alimentaire seront enregistrés. La mesure de la balance énergétique et de la composition corporelle sont deux analyses non invasives. L’animal est hébergé dans une cage classique au sein des dispositifs de mesure de la dépense énergétique. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement, avec un abri en plastique rouge, deux carrés de coton, et une nacelle pour construire leur nid. Les capteurs, encastrés dans le couvercle de la cage, ne perturbent pas l'animal. Les mesures de la balance énergétique sont effectuées automatiquement, de jour comme de nuit, sans intervention de l’opérateur. Une attention particulière est portée afin que les animaux aient suffisament de matériel de nidification pour s'adapter à la baisse de la température ambiante. Les souris seront surveillées quotidiennement pendant toute la durée du protocole afin de détecter et signaler rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé. Des points limites stricts et spécifiques au projet ont été définis. En cas d'anomalie comportementale et/ou de détérioration de l'état de santé des souris, le protocole sera interrompu.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour l’étude de la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. C’est également un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements métaboliques, car de nombreuses voies de régulation métabolique sont conservées entre la souris et l’homme, ce qui permet d’extrapoler les résultats obtenus. Enfin, la souris est le modèle de choix et de référence pour l'étude des intéractions entre la réponse immunitaire et le métabolisme énergétique. Pour cette, les souris seront utilisées à l’âge adulte. Ce choix est justifié par plusieurs facteurs : (1) l’âge adulte garantit que toutes les structures cérébrales sont stabilisées, ce qui évite d'impacter leurs comportements alimentaires et locomoteurs au fil du temps; (2) le poids de l’animal est plus stable à cet âge, permettant une analyse fiable et robuste durant toute la durée de l’expérimentation.

Tester des candidats médicaments avant leur mise sur le marché suppose ici de provoquer des crises d'épilepsie chez des rongeurs par stimulation externe. 9 750 souris et 2 525 rats vont être utilisés, tous tués, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chaque animal est exposé à un stimulus de 3 à 60 secondes qui déclenche contractions toniques et secousses cloniques, la crise pouvant entraîner sa mort, et une partie subit en plus l'implantation d'un guide-canule sous anesthésie pendant une heure puis sept jours d'isolement. L'effectif de 12 275 rongeurs n'est adossé à aucun calcul détaillé, le porteur indiquant seulement qu'il ajuste le nombre selon la nature des données recueillies.

Objectifs

Le présent projet a pour objectif d’évaluer l’innocuité et/ou l’efficacité de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des épilepsies généralisées et partielles. Bien que plusieurs traitements médicamenteux soient actuellement disponibles, environ 30 % des patients présentent une résistance aux traitements, rendant la recherche de nouvelles thérapies indispensable pour améliorer leur qualité et espérance de vie. Les épilepsies généralisées sont caractérisées par des activités neuronales anormales affectant les deux hémisphères cérébraux, et peuvent notamment se manifester par des crises tonico-cloniques. Ces dernières se traduisent par des contractions musculaires soudaines (toniques), des secousses involontaires (cloniques) et, dans certains cas, un arrêt respiratoire temporaire ou définitif. Des signes avant-coureurs tels qu’une hypersalivation ou une respiration bruyante peuvent précéder ces épisodes. Les crises partielles, quant à elles, résultent d’une activité neuronale anormale localisée dans une région spécifique du cerveau. Les manifestations cliniques varient selon la zone atteinte et peuvent inclure des fourmillements, des mouvements involontaires d’un membre, des mouvements anormaux de la tête ou des yeux, ou encore des signes émotionnels comme la peur ou le rire. Afin d’évaluer les effets des substances pharmacologiques en développement, le projet repose sur l’utilisation de modèles expérimentaux dans lesquels des crises épileptiques sont induites par stimulations externes. Ces tests permettent de recueillir des données essentielles sur le potentiel thérapeutique des molécules étudiées.

Bénéfices attendus

Les modèles expérimentaux de crises d’épilepsie généralisée et partielle induites par des stimulations externes sont actuellement recommandés pour l’évaluation préclinique de l’efficacité de nouveaux candidats médicaments avant leur mise sur le marché. La recherche de nouveaux traitements antiépileptiques constitue un enjeu de santé publique majeur. En effet, les traitements disponibles aujourd’hui sont uniquement symptomatiques et ne permettent pas de soigner la maladie. De plus, une proportion significative de patients (environ 10 à 30 %) doit interrompre leur traitement en raison d’effets secondaires indésirables ou d’une absence d’efficacité, liée à une résistance aux médicaments. Ce projet s’inscrit dans cette dynamique de développement de thérapies innovantes, à la fois pour améliorer le contrôle des crises chez les patients pharmaco-résistants, mais également pour réduire les effets indésirables des traitements actuels. Un autre objectif essentiel est de mettre au point des traitements qui pourraient empêcher la maladie de se développer chez les personnes identifiées comme à risque. À ce jour, aucun traitement de ce type n’est disponible. Ainsi, les résultats attendus de ce projet pourraient contribuer à l’identification de nouvelles approches thérapeutiques permettant d’améliorer la qualité et l’espérance de vie des patients atteints d’épilepsie.

Procédures

Pour chaque procédure décrite, les candidats médicaments seront administrés par un bolus rapide qui dure quelques secondes ou par perfusion de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées une fois par jour, pendant 7 jours au maximum, en fonction des spécificités du candidat traitement. Si applicable, l'implantation d'un guide canule est réalisée sous anesthésie générale sur environ 60 minutes. Dans chacune des procédures décrites, le rongeur sera exposé à un stimulus externe, d'un durée maximale de 3 à 60 secondes. Des prélèvements sanguins peuvent également être envisagés avant le test (à minima 24 heures avant la stimulation, durée de l'ordre de la minute) pour compléter les données in vivo par des données biochimiques ou histologiques. Pour les études nécessitant une chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement pendant 7 jours au maximum.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les tests modélisant des crises peuvent induire un certain inconfort ou un stress physique chez les rongeurs, se manifestant notamment par l'apparition de mouvements involontaires saccadés ou un raidissement des membres ou du corps. Ce stress est principalement lié à l’application de signaux externes de courte durée, qui entraînent l’apparition de manifestations convulsives. Dans certains cas, la survenue de crises tonico-cloniques peut entraîner le décès de l’animal. Lorsqu’ils sont implantés avec un guide canule, les animaux sont placés en cage de réveil et maintenus en hébergement individualisé pendant 7 jours maximum après la chirurgie, afin d’éviter toute dégradation du dispositif par les congénères. Enfin, le prélèvement de sang réalisé sur animal vigile au cours de certaines expérimentations peut également engendrer un stress transitoire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés immédiatement après la stimulation si une convulsion tonique est observée ou à la fin du test en l'absence de convulsion tonique car ces procédures ne permettent pas le maintien en vie des animaux dans de bonnes conditions.

Remplacement

Il existe des techniques alternatives in silico ou in vitro permettant d'évaluer les traitements sur des cultures primaires de neurones ou des tranches cérébrales afin de sélectionner les meilleurs candidats médicaments et donc de limiter le nombre d'animaux utilisés. Néanmoins, l'efficacité de nouveaux traitements doit également être démontrée sur des modèles plus complexes (modèles animaux) permettant ainsi l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux est ajusté afin de pouvoir évaluer l'effet d'un composé en réalisant une seule étude et en fonction des analyses statistiques réalisées dépendant de la nature des données : variables dichotomiques, données paramétriques ou non paramétriques. Il est possible de tester plusieurs composés et doses dans une même expérience. Ceci permet de limiter le nombre d'animaux contrôles et le nombre d'animaux testés avec une substance connue.

Raffinement

Les procédures décrites ont été optimisées pour limiter la douleur chez l'animal. Une solution anesthésiante sera appliquée avant chaque stimulation. Les animaux seront anesthésiés et/ou euthanasiés, immédiatement après l'apparition d'une convulsion tonique. Pour les études incluant une chirurgie pour administrer le candidat médicament, une analgésie est assurée par l’administration d'un analgésique systémique et l'utilisation d'un analgésique local. Enfin, un gel ophtalmique est appliqué pendant la chirurgie pour éviter le dessèchement de l'oeil. Un système de suivi des points limites a été mis en place afin de garantir le bien être animal.

Choix des espèces

Les modèles de convulsions induites par une stimulation externe sont largement décrits dans la littérature chez le rongeur (souris et rats). Les procédures décrites dans ce projet sont recommandées pour évaluer de nouveaux candidats médicaments (efficacité) et/ou l'innocuité d'un composé dans le cadre de l'épilepsie. Les rongeurs utilisés sont testés une fois sevrés, l’âge peut varier entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.

Une distension nocive de la paroi intestinale, quatre fois de suite, vingt secondes à chaque fois : 112 souris vont subir cette série dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Douze d'entre elles reçoivent en plus des électrodes implantées dans l'abdomen sous anesthésie, vingt minutes d'opération, pour comparer la méthode existante à celle que le porteur veut mettre au point. Cette nouvelle méthode consiste à filmer la posture des souris pendant la distension, et le porteur la présente comme une avancée de raffinement. La distension reste infligée, décrite comme une source d'inconfort voire de douleur aiguë, et toutes les souris sont tuées à la fin pour prélever des échantillons.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de développer une nouvelle technique d'évaluation de la sensibilité colique chez la souris de laboratoire. Les standards actuels font appel à des gestes chirurgicaux invasifs associés à des nuisances pour les animaux. Dans ce projet, nous souhaitons entrainer, valider et utiliser des algorithmes permettant d'évaluer la force des contractions abdominales en réponse à une stimulation de la paroi intestinale uniquement au moyen de l'enregistrement vidéo de la posture des animaux. Ce procédé, s'il est validé au cours de ce projet, s'intégrerait parfaitement dans une stratégie de raffinement pour l'étude de la sensibilité colique de l'animal de laboratoire.

Bénéfices attendus

Si cette nouvelle méthode de mesure apporte des résultats satisfaisants, les autres méthodes actuellement employées pourraient être remplacées par un protocole beaucoup moins invasif. Ce protocole d'étude pourrait par la suite permettre l'évaluation de candidats médicaments chez l'Homme pour le traitement de la douleur colique qui demeure, encore à l'heure actuelle, difficile à prendre en charge du fait de la faible efficacité des molécules actuellement disponibles et/ou des effets indésirables gastro-intestinaux associés aux antalgiques classiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une distension nocive de la paroi intestinale, procédé indispensable à l'étude de la sensibilité colique. Chaque lot d'animaux sera soumis à une série de 4 distensions coliques, chaque stimulation durant 20 secondes. De plus, afin de comparer cette nouvelle méthode d'étude aux standards actuellement employés, il sera nécessaire de réaliser des chirurgies d'implantation d'électrodes abdominales chez certains animaux. Douze animaux seront utilisés pour cette partie du projet et l'acte chirurgical dure une vingtaine de minutes pour chaque animal.

Impact sur les animaux

L'implantation d'électrodes au niveau abdominal réalisée sous anesthésie générale, peut induire un stress chez l'animal au moment de l'induction de l'anesthésie. La distension colorectale, source d'inconfort voire de douleur aiguë pour les animaux, est nécessaire afin d'évaluer efficacement la sensibilité des animaux. Le modèle d'hypersensibilité proposé induit une inflammation transitoire de la paroi intestinale dont la sévérité sera évaluée quotidiennement par les expérimentateurs.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures dans le but de collecter des échantillons biologiques afin de mettre en relation le niveau de sensibilité colique des animaux avec des marqueurs biochimiques et moléculaires de l'activation des voies nerveuses transmettant l'information douloureuse.

Remplacement

L’utilisation d’animaux pour les tests d'efficacité d’analgésiques/antalgiques est rendue nécessaire par le fait que les mécanismes d'action des candidats-médicaments sont des processus complexes impliquant la totalité du système nerveux (de manière imagée, des communications réciproques entre le cerveau, la moelle épinière, et les tissus périphériques). C’est seulement chez l’animal entier que l’impact de ces traitements peut être évalué. En régle général, la sensation douloureuse fait intervenir des processus complexes et des interactions multiples entre différents grands systèmes de l'organisme qui sont impossibles à appréhender uniquement in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit par le soin apporté à chaque expérience conjugué à plus de 15 ans de pratique dans le domaine d'étude de la sensibilité viscérale par le personnel du laboratoire limitant ainsi les pertes liées à l'acte chirurgical. Afin d'assurer la qualité scientifique du projet le nombre d'animaux sera calculé selon le test présentant la plus grande variabilité et qui est la mesure de la pression intracolique en réponse à la distension colorectale.

Raffinement

Afin de déceler l'apparition de souffrance ou de comportements anormaux, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si l'un des points limites mis en place est atteint pour un animal, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles). De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements structurels de type petite maisonnette ainsi que du coton pour la nidification. La manipulation des animaux sera réalisée selon les protocoles de contention "low stress" auxquels les personnels impliqués dans ce projet ont été récemment formés.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par sa pertinence pour l’étude des pathologies intestinales in vivo ainsi que par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse développés pour cette espèce. Des animaux adultes seront utilisés au cours de toutes les expérimentations. Il est impossible de réaliser des distensions colorectales sur des animaux plus jeunes au risque de léser la paroi intestinale.