Procédures sévères

Une insuffisance cardiaque grave, parfois mortelle dès le cinquième jour : voilà ce que provoque le traitement anticancéreux injecté à 420 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère et toutes tuées pour prélever leur cœur. Les injections sont répétées trois fois par semaine pendant trois semaines, suivies d'une pesée quotidienne, de la pose d'un cathéter sous anesthésie profonde et d'une séance d'IRM d'une heure avec produit de contraste. Le but est de vérifier qu'une technique d'imagerie repère les premiers signes d'inflammation du cœur chez les patients sous chimiothérapie, 9 % d'entre eux développant ce type d'atteinte. Le porteur retient la souris parce que son anatomie cardiovasculaire ressemble dans ses grands traits à celle de l'être humain et parce que les modèles de cardiotoxicité y sont déjà bien établis.

Objectifs

Environ 9 % des patients traités avec certains médicaments anticancéreux, appelés anthracyclines, développent des problèmes cardiaques, notamment une fragilisation du muscle du cœur. L’atteinte cardiaque liée aux anthracyclines est souvent irréversible d'où l’importance d’un diagnostic précoce, idéalement avant l’apparition des premiers signes. Ce projet de recherche vise à améliorer la détection précoce de ces atteintes cardiaques grâce à une technique d’imagerie appelée immuno-IRM. Cette méthode permettrait de repérer les toutes premières réactions inflammatoires dans le cœur, en utilisant des produits de contraste injectables ciblant des molécules spécifiques liées à l’inflammation. Cela pourrait aider à mieux surveiller les patients sous chimiothérapie, à adapter leur traitement en fonction du risque, et à tester de nouvelles approches pour protéger leur cœur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples, tant sur le plan scientifique que médical. En premier lieu, le développement d’un modèle expérimental fiable de toxicité cardiaque induite par les anthracyclines permettra une meilleure compréhension des mécanismes précoces de l’atteinte cardiaque, en particulier des processus inflammatoires qui précèdent les altérations fonctionnelles. En intégrant l’immuno-IRM à ce modèle, le projet vise à démontrer la capacité de cette technique d’imagerie à détecter de manière non invasive et ciblée des marqueurs précoces d’inflammation cardiaque et à identifier de nouvelles cibles biologiques. Par ailleurs, il apportera les premières preuves de concept en faveur d’une translation clinique de cette approche, grâce à l’utilisation de produits de contraste injectables compatibles avec une utilisation chez l'Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Mise en place d'un modèle de cardiotoxicité induit par injection d'un traitement anti-cancéreux (nombre : 1 seule fois ou 3 fois par semaine pendant 3 semaine suivant la procédure ; durée : inférieure à 5min) o Pesée quotidienne (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Une seule imagerie IRM avec injection de produit de contraste (durée : environ 1 heure).

Impact sur les animaux

Le modèle de cardiotoxicité peut induire des effets indésirables sur les animaux. Le traitement anti-cancéreux utilisé est connu pour induire des dommages cardiaques pouvant mener à une insuffisance cardiaque grave et dans certains cas au décès. Des effets comme des sensations de nausées ou des lésions de la muqueuse gastro-intestinale peuvent se produire. D’autres complications peuvent également apparaître comme un stress (repéré des mouvements anormaux dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson voire une perte de poids…), de la fatigue (repérée par une réduction de l’activité spontanée voire une léthargie, une altération du toilettage…) et une douleur (repérée par de la prostration, des poils hérissés…). L’injection des produits de contraste peut générer des irritations locales, des réactions inflammatoires et des problèmes de tolérance. Enfin, des réactions indésirables aux agents anesthésiques (problèmes respiratoires, hypothermie) peuvent avoir lieu et les animaux peuvent être affectés par une anesthésie prolongée, notamment en termes de récupération post-opératoire (fatigue, comportement altéré). Dans cette étude, nous étudierons 2 types de cardiotoxicité : une forme chronique et une forme aiguë. Dans la forme aigue, une mortalité est observée dès le 5ème jour suivant l’induction.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux (coeur), permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem (biodistribution, caractérisations immunohistologiques). De plus, les caractérisations histologiques sont très souvent demandées pour justifier les résultats obtenus lorsqu'une nouvelle technique d'imagerie pré-clinique est étudiée.

Remplacement

Des tests en laboratoire ont été réalisés, notamment à l’aide de systèmes appelés « fantômes », pour vérifier que les produits de contraste injectables sont bien détectables par imagerie. Ces essais ont permis de confirmer que ces produits génèrent un signal visible dans des conditions simples et contrôlées. Cependant, ces tests ne permettent pas de reproduire ce qui se passe réellement dans un organisme vivant, notamment l’apparition de certaines molécules liées à l’inflammation du cœur. C’est pourquoi un modèle animal de toxicité cardiaque, induite par un médicament comme la doxorubicine, est indispensable. Il permet d’étudier l’efficacité du produit de contraste injectable dans un contexte proche de celui d’un patient malade. Les expériences proposées dans ce projet sont donc nécessaires car aucune méthode alternative ne permettrait d’obtenir les mêmes informations sans utiliser d’animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été soigneusement évalué à partir des données issues de nos précédentes études ayant développé les applications de l’immuno-IRM. Conformément aux recommandations scientifiques pour le développement d’un nouvel agent de contraste dans une modalité d’imagerie donnée, il est essentiel de s’appuyer sur un nombre d’animaux compris entre 5 et 10 par groupe pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre est nécessaire pour évaluer la spécificité (par exemple, à travers des études comparatives avec des particules ciblant les molécules d’adhésion endothéliales ou des particules contrôles) et des animaux contrôles (recevant du sérum physiologique), indispensables pour garantir la validité des résultats. Nous avons conçu le protocole de manière à minimiser ce nombre, en nous assurant que chaque expérience soit la plus informative possible tout en respectant les principes de réduction et de raffinement dans l’utilisation des animaux.

Raffinement

Les animaux auront le temps d'acclimatation de deux semaines. Un enrichissement du milieu est aussi prévu pour les souris (papier kraft, morceau de bois). Les animaux seront hébergés en groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. A partir du début de la mise en place du modèle, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse (d'après la grille d’évaluation comportementale standardisée de Mouse Grimace Scale) ou de douleur extérieure ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Une attention particulière sera accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée tous les jours afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 10%. Après injection, une surveillance sera faite comme suit : 15 minutes après injection, puis 1 heure après puis de une à deux fois par jour. Des points limites adaptés ont été préalablement mis en place et des décisions spécifiques seront prises en conséquence.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans les domaines des cardiopathies ischémiques et inflammatoires et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connues. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le potentiel diagnostic de l’imagerie de l’inflammation dans le suivi de ces pathologies. Nous utiliserons des souris qui pèsent entre 35-40g, ce qui correspond à un stade de développement de 8 à 12 semaines. En effet, les protocoles de modèles de cardiotoxicité expérimentale chez la souris utilisent des modèles sur des jeunes adultes.

Choisis parce qu'ils boivent de l'alcool de façon stable et prévisible dans les protocoles d'auto-administration, 608 rats mâles et femelles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une injection dans la patte arrière entretient une inflammation pendant deux mois, à quoi s'ajoutent des chirurgies abdominales, sous-cutanées ou intracérébrales de trente minutes à deux heures, des prises de sang sublinguales et trois séances d'IRM fonctionnelle d'une heure sous anesthésie. Le porteur annonce des douleurs postopératoires de trois jours, un risque infectieux au site d'incision et une douleur à la patte enflammée. Tous les rats sont tués à la fin de leur procédure, pour prélever du tissu ou vérifier que les canules et les lentilles implantées se trouvaient au bon endroit.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment une inflammation périphérique chronique influence les comportements de consommation d’alcool chez le rat, en tenant compte des différences entre mâles et femelles. Nous combinerons des approches comportementales, physiologiques, d’imagerie cérébrale et de neurobiologie pour caractériser les mécanismes cérébraux impliqués dans cette comorbidité. Toutes les études se feront aussi bien chez les mâles que chez les femelles.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les interactions entre inflammation périphérique chronique et trouble de l’usage d’alcool (TUA), deux conditions fréquemment comorbides chez l’humain. En utilisant des approches précliniques chez le rat, ce travail permettra de caractériser les effets de l’inflammation sur les comportements de consommation d’alcool et sur les altérations fonctionnelles entre les structures responsables de la motivation à consommer et celles responsables du contrôle inhibiteur du comportement. L’étude intégrera des analyses différenciées selon le sexe, afin de mieux appréhender les éventuels mécanismes neurobiologiques spécifiques. Les mesures comportementales et d’IRM fonctionnelle réalisées sont directement transposables à l’humain, renforçant la valeur translationnelle de ce projet. L’exploration complémentaire de l’implication de la voie vagale permettra d’identifier de potentielles cibles périphériques pour moduler cette comorbidité. À terme, ce projet contribuera à l’identification de biomarqueurs et de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients souffrant de TUA associé à un état inflammatoire chronique.

Procédures

- Injection dans la patte arrière d'un produit pro-inflammatoire (1 fois, durée : 2 mois) - Chirurgies abdominale, sous-cutanée ou intra-cérébrale (1 fois chacune dans la majorité des cas, un seul groupe sera soumis à 2 chirurgies de 20 minutes chacune espacées de 1 à 2 semaines, durées de 30 minutes à 2h selon le type de chirurgie)- Anesthésie générale pour imagerie cérébrale - Prise de sang (sublingual) - IRM fonctionnelle (3 fois 1 heure espacées de 1 et 2 semaines).

Impact sur les animaux

Douleurs post-opératoire (3 jours), risque infectieux au site d'incision (5 jours), douleur à la patte inflammée (3-4 jours), perte de poids transitoire en post-opératoire (2 jours).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures pour soit permettre le prélèvement de tissu en post-mortem, soit pour vérifier les sites d'implantation des canules guide ou des lentilles.

Remplacement

Les modèles in vitro actuels (organoïdes, et organ-on-chips) ne permettent pas de rendre compte du lien complexe existant entre les organes périphériques et le cerveau, ainsi que de l’organisation complexe du cerveau nécessaires à l’étude des interactions entre le cerveau et les atteintes périphériques (inflammation chronique). L'animal dans son entièreté est le seul modèle disponible actuellement pour remplir les objectifs de ce projet.

Réduction

Nous avons mis en place une rationnalaisation de l'utilisation des animaux pour nous permettre d'obtenir des données comportementales, physiologiques et neurobiologiques sur les mêmes animaux nous permettant ainsi de réduire grandement le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Nous avons évalués le nombre d'animaux nécessaires dans chacun des groupes expérimentaux pour nous assurer d'une puissance statistique suffisante tout en utilisant le moins d'animaux, ceci basé sur les résultats déjà obtenus dans d'autres expériences réalisées soit au sein de notre laboratoire ou dans le laboratoire de nos collaborateurs.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans un environnement enrichi d'un tube en carton et d'une buchette en bois. De la musique sera diffusée en continu dans les pièces de stabulation. Les rats seront manu pilés tous les jours permettant un enrichissement inter-espèce. Les rats seront placés 5 jours par semaine dans une cage d'auto-administration permettant un enrichissement moteur (appui sur les leviers) et un enrichissement cognitif (apprentissage d'une tâche d'auto-administration nécessitant une planification de l'action). Au cours des différentes étapes, les soins appropriés seront apportés aussi bien pendant les phases de consommation que dans les périodes per-opératoires en respectant les points limites fixés et déterminés par une échelle de bien-être animal reconnue internationalement.

Choix des espèces

Le rat constitue le modèle le plus adapté pour ce projet, en raison de ses capacités d’apprentissage, de sa robustesse physiologique et de la richesse des données disponibles en neurosciences comportementales. Contrairement à la souris, le rat développe des comportements stables et fiables dans les protocoles d’auto-administration orale d’alcool, ce qui est essentiel pour modéliser le trouble de l’usage d’alcool (TUA) de manière pertinente. Par ailleurs, le rat présente une réponse plus homogène et plus facilement interprétable dans les modèles d’inflammation chronique et de douleur, avec une meilleure transposabilité aux phénomènes observés chez l’humain. Sa taille permet également l’implantation plus fiable de dispositifs de télémétrie permettant l'enregistrement d’un électrocardiogramme et d'un électro-encéphalogramme (EEG/ECG), la réalisation d’imagerie fonctionnelle cérébrale (IRM) de qualité, et l’utilisation de techniques comme l’imagerie calcique sur animal vigile. L’ensemble de ces éléments rend le rat indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Les rats arriveront au laboratoire à l'âge de 7 semaines et seront conservés pendant 5 à 6 mois. L'addiction à l'alcool ainsi que la douleur chronique apparait en général à l'âge adulte.

936 poissons zèbres adultes vont être utilisés, tous tués pour prélever leur cœur, leur nageoire ou d'autres tissus, dont 768 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 432 subissent l'amputation au scalpel d'une partie de la nageoire caudale, d'autres une cryolésion du cœur de deux minutes sous anesthésie, et 168 sont écartés après génotypage parce qu'ils ne portent pas la modification recherchée. Le porteur décrit ensuite de l'hyperventilation, une prise alimentaire réduite et des comportements qu'il qualifie d'anxiété ou de résignation, prostration au fond du bac ou nage exclusive en surface, et prévoit de tuer immédiatement les poissons dont la nage devient erratique. Le bénéfice annoncé se limite à l'identification de stratégies immunomodulatrices capables de stimuler la régénération des organes chez les mammifères, perspective lointaine face aux lésions cardiaques et aux amputations infligées maintenant.

Objectifs

Les mammifères, y compris les humains, sont généralement incapables de régénérer leurs organes, ce qui constitue un obstacle aux nouvelles stratégies thérapeutiques pour plusieurs événements traumatiques et maladies dégénératives (infarctus du myocarde, ostéoporose, fracture osseuse). Cette incapacité à se régénérer contribue à une diminution à long terme de la fonction des organes et à une augmentation de la morbidité, et devient particulièrement importante dans les populations âgées. En particulier, selon l'Organisation Mondiale de la Santé (World Health Organization), les cardiopathies ischémiques telles que l'infarctus du myocarde représentent la première cause de mortalité dans le monde (13% du nombre total de décès dans le monde) et la deuxième cause de morbidité, juste après le COVID-19, dans la dernière évaluation (2021). Après un infarctus du myocarde, par exemple, le tissu mort est remplacé en permanence par du tissu cicatriciel, ce qui diminue la fonction cardiaque. Avec l'allongement de la durée de vie des populations modernes, l'ostéoporose, qui est de plus en plus répandue dans les populations âgées et qui est associée à des conditions pro-inflammatoires, diminuent également la qualité de vie et constituent un fardeau important pour la santé - elle touche une femme sur trois et un homme sur cinq de plus de 50 ans dans le monde (Organisation Mondiale de la Santé). Contrairement aux mammifères, le poisson zèbre peut régénérer entièrement ses organes, y compris le cœur et la nageoire (c'est-à-dire un modèle de régénération osseuse), et retrouver leur fonction. Le moment, l'étendue et le type de réponse immunitaire après une lésion d'organe influencent fortement les résultats de la régénération. En particulier, une vague inflammatoire autolimitée est essentielle pour parvenir à une régénération correcte des organes. Les granulines sont molécules naturellement produites par l'organisme pour aider à contrôler l'inflammation et potentiellement soutenir la réparation des tissus, et jouent un rôle important dans la prolifération cellulaire. De plus, elles sont régulées à la hausse dans les tissus en régénération chez le poisson zèbre. Nous émettons l'hypothèse que les granulines jouent un rôle clé dans le processus de régénération. Ce projet vise à étudier le rôle des granulines pendant la régénération des organes du poisson zèbre (cœur et nageoire). Cette étude sera essentielle pour stimuler la régénération dans des scénarios non régénératifs.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d'étudier les aspects immunitaires particuliers qui stimulent la régénération des organes. Cela permettra d'identifier des stratégies immunomodulatrices pour stimuler la régénération des tissus tout en minimisant les dommages causés aux tissus après une blessure.

Procédures

Pour les études cardiaques, 336 animaux seront soumis au génotypage par prélèvement caudal sous anesthésie. Parmi eux, 50 % (168) n'auront pas le bon génotype et ne subiront donc pas d'autres procédures (ils sont donc classés comme modérés). 168 animaux seront génotypés sur la base de la seule fluorescence. Cela est réalisé en analysant rapidement la fluorescence au niveau des yeux sous un stéréomicroscope, sous anesthésie. Parmi ces derniers, 336 seront soumis à une cryoblessure cardiaque pour étudier le processus de régénération et la réponse immunitaire correspondante. L'intervention elle-même dure environ 2 minutes. Le processus de régénération sera suivi pendant les 7 premiers jours, avec un petit nombre d'animaux (48) suivis jusqu'aux stades de régénération tardive et complète. Pour les études de régénération de la nageoire caudale, certains poissons-zèbres (432) seront soumis à une amputation d'une partie de nageoire, une procédure considérée comme légère. Pour ce faire, les poissons anesthésiés sont placés sur le côté dans une boîte de Pétri et, à l'aide d'un scalpel, une coupe rapide est effectuée sur la nageoire caudale et une petite partie du tissu est enlevée, sans affecter les autres tissus environnants. La procédure prend quelques secondes et le processus de régénération sera suivi jusqu'à 14 jours (nous n'étudions ici que les 7 premiers jours, lorsque le processus de régénération est très actif). Les autres interventions légères comprennent l'imagerie en direct (jusqu'à 10 minutes) du tissu de la nageoire caudale en cours de régénération, et la coloration des os en direct (15 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent : - La cryoblessure (cryoinjury) pour étudier la régénération cardiaque. Les effets indésirables potentiels surviennent généralement dans les 12 premières heures suivant la blessure. Il s'agit notamment de l'hyperventilation et de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Occasionnellement, un petit nombre d'animaux peut présenter une nage erratique (c'est-à-dire des poussées de nage verticale) immédiatement après l'opération. Pour éviter que ces animaux meurent en quelques heures ils sont donc immédiatement euthanasiés lorsque ce comportement est observé. - Amputation de la nageoire caudale. Les effets indésirables potentiels se produisent généralement immédiatement après la blessure et comprennent l'hyperventilation et des changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Celles-ci ne durent généralement que quelques minutes. Aucun fardeau phénotypique n'a été identifié pour les mutants grn1/2, mais on s'attend à ce qu'ils présentent une immunosuppression à un moment donné de leur vie, car ils pourraient être plus sensibles aux infections/maladies. Ce phénomène sera donc surveillé. Les animaux surexprimant le gène grn1 ne devraient avoir des niveaux de grn1 affectés que lors d'un choc thermique, car il s'agit d'une lignée inductible. La surexpression de grn1 peut également conduire à des altérations immunitaires et sera donc également surveillée, en particulier après un choc thermique. Toutes les autres interventions n'entraînent généralement pas de nuisances ou d'effets indésirables en elles-mêmes, à l'exception de l'anesthésie qui leur est associée et qui entraîne généralement une hyperventilation pendant quelques minutes après la récupération.

Devenir

Tous les poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés après la dernière intervention, car nous devons prélever le cœur ou la nageoire caudale (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les cellules et les composants moléculaires (réponse immunitaire et marqueurs de régénération), ce qui nécessite de prélever du tissu pour un traitement ultérieur après l'euthanasie du poisson.

Remplacement

Dans le cadre de ce protocole, nous prévoyons d'étudier la réponse immunitaire et la capacité de régénération, en utilisant une combinaison de plusieurs outils géniques. Ces outils génétiques, ainsi que le pouvoir exploratoire du modèle du poisson zèbre, le rendent unique pour ces processus de manière intégrée chez les mêmes individus (principe de remplacement). En raison de la nature systémique et physiologique de la réponse régénérative, ainsi que de la réponse immunitaire, des modèles plus simples tels que les systèmes in vitro et organoïdes sont incapables de répondre aux questions scientifiques de ce projet.

Réduction

Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 6 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction).

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau : nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental (principe de raffinement). NB: L’évaluation du poids sera effectuée toutes les deux semaines. Les poissons ne seront pas anesthésiés pour évaluer leur poids. Ils seront placés vigiles dans un bac d’eau sur une balance préalablement tarée.

Choix des espèces

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est génétiquement modifiable, ce qui permet des études à grande échelle rapides et peu coûteuses. De nombreuses lignées transgéniques et mutantes sont disponibles pour répondre à des questions biomédicales clés. Le poisson-zèbre adulte est capable de régénérer ses organes, offrant des perspectives pour favoriser la régénération dans des contextes non régénératifs. Cette capacité diminue avec l’âge, reflétant la réduction de la capacité réparatrice et le dysfonctionnement des organes observés chez les mammifères. Le système immunitaire du poisson-zèbre est conservé chez les mammifères. Ces caractéristiques font du poisson-zèbre un modèle précieux pour l’étude de la régénération des organes et de la réponse immunitaire. Toutes les expériences seront réalisées sur des poissons adultes, car toute la pathophysiologie que nous étudions se développe à l'âge adulte, et le protocole se concentre sur la réponse immunitaire (et la réponse immunitaire adaptative n'est mature que chez les animaux adultes). En outre, l'objectif proposé se concentre sur l'étude de la régénération chez les individus adultes.

2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une injection intrapéritonéale de lipopolysaccharide d'Escherichia coli déclenche chez elles une réaction inflammatoire simulant une infection généralisée et une atteinte rénale aiguë, puis elles reçoivent une ou deux administrations du composé à tester avant un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse. L'étude s'arrête à vingt-quatre heures, une limite que le porteur présente comme une mesure de raffinement, et les souris sont ensuite tuées pour prélever sang et organes. Une société privée cherche par là à trier rapidement ses molécules avant des modèles chroniques puis d'éventuels essais chez l'humain, et affirme que les interactions entre cellules inflammatoires et rein ne peuvent pas encore être reproduites in vitro.

Objectifs

Notre société développe des inhibiteurs des molécules spécifiques afin de limiter le stress oxydatif impliqué dans des processus de douleur et d’inflammation. Nous souhaitons utiliser un modèle in vivo aigu pour avoir une évaluation rapide de l’efficacité de nos molécules dans un modèle de pathologie rénale aigüe. Ce modèle pathologique induit avec une molécule bactérienne, est déjà utilisé par de nombreux laboratoires dont le nôtre, et se rapproche fortement, de par les cytokines sécrétées, du phénomène inflammatoire observé chez l’Homme lors d’insuffisance rénale aigüe. Des groupes travaillant sur ce modèle ont fait un lien avec une production excessive d’espèces réactives de l’oxygène, provoquée et maintenue par une réponse inflammatoire aigüe due à nos molécules cibles. De plus, en interne, ce modèle nous donne des résultats intéressants pour l’évaluation de nos composés et nous souhaitons continuer à l’utiliser pour valider rapidement l’efficacité de nos molécules au niveau rénal.

Bénéfices attendus

L’incidence des maladies rénales au sein de la population augmente. Cela s’explique par le vieillissement de la population mais aussi par le développement de thérapeutiques et/ou méthodes de diagnostic avec un risque d’atteinte rénale. Malheureusement, la mortalité associée à ces pathologies reste très haute. En effet, le traitement des maladies rénales reste limité (dialyse, greffe..) et très contraignant pour les patients. Les résultats attendus dans ce modèle nous permettraient d’identifier rapidement les molécules avec le meilleur potentiel thérapeutique. Ces molécules pourront alors être testées dans des modèles de maladies rénales chroniques et pourraient par la suite être incluses dans le processus de développement pour la mise en place d’essais cliniques chez l’Homme.

Procédures

Après l'induction de la pathologie par une injection intrapéritonéale (20 secondes), les animaux seront traités (20 secondes à 1 minute maximum) avec nos composés ou le véhicule, 1 à 2 fois maximum dans l'étude. Les volumes administrés seront adaptés en fonction du poids de l’animal. Les études durant 24h, une seule pesée sera faite avant traitement et les animaux seront observés à la recherche de potentiels effets cliniques. A la fin de l’étude, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie gazeuse (2 minutes). Il est possible, mais pas systématique, qu'un premier prélèvement sanguin soit réalisé dans les mêmes conditions avant la fin de l'étude. Les animaux seront ensuite euthanasiés sans réveil après le prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

L’injection de la molécule bactérienne a pour effet la simulation d’une infection. Afin de s’assurer qu’ils ne présentent pas de modification du comportement lié à une infection généralisée, ces derniers seront surveillés à chaque manipulation, et plus étroitement dans les premières heures après l’induction. La douce contention des animaux nécessaire pour la pesée et le traitement, ainsi que l'anesthésie pour le prélèvement sanguin, pourront engendrer un stress et un inconfort. Malgré la très bonne formation du personnel technique, les administrations et prélèvements entrainent une douleur légère mais de courte durée. Ils pourraient dans de rares cas entrainer d’autres conséquences (par exemples : hématome, douleur modérée). Les molécules administrées pourraient avoir des effets indésirables non connus.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements de sang et d'organes afin de contrôler l’évolution de paramètres biochimiques et histologiques.

Remplacement

L’intérêt de ce projet est d’étudier l’effet d'un composé pharmaceutique sur le rein dans un contexte de maladie qui le détruit, l’insuffisance rénale aigüe. Les différentes cellules du système inflammatoire vont interagir avec plusieurs organes, notamment le rein. Malheureusement, l'ensemble de ces interactions ne peut pas encore être reproduite in vitro c’est pour cela que la recherche in vivo est nécessaire. Le ou les mécanismes systémiques qui sont impliqués dans le devenir de la molécule in vivo ne sont pas reproductibles in vitro mais nécessaires à l’évaluation des composés. Nous ne pouvons alors pas utiliser à ce stade de modèle in vitro pertinent.

Réduction

Ce modèle a déjà été utilisé au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. En amont des tests chez l’animal, les composés sélectionnés sont évalués sur des tests in vitro, permettant d’identifier les composés les plus prometteurs, de comprendre leurs mécanismes d’action et d’éliminer les molécules inactives ou pouvant entrainer des nuisances ou effets indésirables chez les animaux (via les tests de toxicologie cellulaire). Seules les molécules présentant une activité sur les tests cellulaires sans toxicité apparente et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront étudiées avec les animaux. Les données in vitro des différents composés ainsi que leur profil pharmacocinétique seront obtenus avant le début des procédures. Nous ne testerons donc que les composés les plus puissants en pharmacologie primaire et ceux présentant les caractéristiques d’un potentiel futur médicament. Les effectifs choisis nous permettront une optimisation de l’interprétation de tests statistiques.

Raffinement

Le modèle sera plafonné à 24h, pour limiter l’impact de l'inducteur et de ses conséquences inflammatoires sur les animaux et les organes cibles. Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. La Structure Chargée du Bien être Animal (SBEA) émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. Après réception, les animaux seront placés dans des cages par 4 à 5 souris. Un programme d’enrichissement permet de varier les éléments de la cage afin d’encourager leur comportement de rongeur : coton pour la construction de nid, dôme rouge ou tunnel en carton pour se cacher, bois à ronger… La formation du personnel, le matériel utilisé et l’adaptation des volumes administrés permettront de limiter le stress ressentit par l’animal lors du traitement. Les animaux seront monitorés à chaque traitement pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance.

Choix des espèces

Comme décrit dans la littérature, la souris est le modèle animal le plus utilisé pour étudier l’insuffisance rénale aigüe. Comme la mise en place de ce modèle nous a donné des résultats satisfaisant ces dernières années, nous continuerons a utiliser le modèle avec les souris, le plus approprié dans nos projets car elles peuvent développer plusieurs signes physiopathologiques caractéristiques de l’insuffisance rénale aigüe tels que la dysfonction endothéliale, la mort des cellules épithéliales ou encore l’infiltration des cellules immunitaires. De plus, les souris sont les espèces dont les manifestations inflammatoires sont les plus connues et se rapprochent le plus de celles de l’Homme. Il n’y a pas d’indication spécifique sur le choix de l’âge autre qu’une maturité immunitaire. Les animaux seront de jeunes adultes de 8 à 12 semaines.

Produire et entretenir des lignées de souris reproduisant l'amyotrophie spinale, dans ses formes sévère et modérée, 4 105 souris vont être utilisées pour cela, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, celles qui portent le génotype recherché partant ensuite vers des projets de test de traitements. Les nouveau-nés susceptibles de porter la forme sévère subissent dès la naissance une analyse génétique invasive. Ceux qui l'ont vivent une dizaine de jours, incapables de se déplacer, de s'alimenter ou de respirer normalement. Dans la forme modérée, le porteur décrit des nécroses sèches qui apparaissent au bout de la queue vers trois à quatre semaines, gagnent les oreilles puis quelques orteils, et qu'il note sur une échelle où le grade 2, nécrose sévère avec infection, déclenche la mise à mort.

Objectifs

L’amyotrophie spinale (SMA) est une maladie rare affectant les muscles suite à un problème génétique : un gène absent. Ce problème empêche la production d’une protéine importante pour les cellules nerveuses, ce qui entraîne une faiblesse musculaire. Un autre gène peut produire un peu de cette protéine en quantité plus ou moins importante : plus il y a cette protéine, plus la maladie est légère. Pour mieux comprendre la SMA et tester des traitements, des chercheurs utilisent des souris qui ont différentes versions de ce gène afin de reproduire la maladie et chercher des solutions, comme des traitements basés sur l'ADN ou l’ARN, pour améliorer la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet scientifique est important pour la recherche de traitements contre l’amyotrophie spinale (SMA). Il commence par créer des modèles de souris qui reproduisent bien la maladie, avec des formes légères à sévères, pour mieux comprendre comment elle fonctionne. Le projet assure aussi que ces modèles soient cohérents d'une étude à l'autre, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables pour comparer différentes solutions et valider les traitements plus facilement.

Procédures

Il s'agit d'une procédure de maintien et d’élevage de souris génétiquement altérées porteuses de la maladie SMA, afin de tester des traitements par la suite : seules les portées de nouveau-nés potentiellement porteurs de la forme sévère de la maladie subiront une analyse génétique invasive à la naissance pour déterminer s'ils sont malades (environ 25% des naissances) ou sains. Ce ne sera pas le cas pour ceux porteurs de la forme plus légère, issus d'un autre type d'accouplement, qui naissent tous avec la même version de la maladie.

Impact sur les animaux

Les souris SMA type 1 ont une espérance de vie très courte (environ 10 jours). Cela limite les études à long terme sur la maladie ou les traitements. Ces souris présentent des anomalies sévères dès la naissance (faiblesse musculaire extrême, incapacité à se déplacer, à s’alimenter ou à respirer normalement, poids moindre), donc les manipuler n'est pas un acte anodin car ils sont extrêmement fragiles. Le modèle SMA type 3 (forme modérée à légère) présente une progression plus lente. A partir de 3 à 4 semaines de vie environ, ces souris présentent des nécroses sèches au bout de la queue, puis les nécroses évoluent au niveau des oreilles, et beaucoup plus tard (1 an environ) à quelques orteils. Ces nécroses sèches sont attendues chez ces animaux, sans automutilation et qui n’entravent pas le comportement normal de l’animal (alimentation, déplacements, survie …). En outre, la fertilité de cette lignée décroit rapidement, il est donc nécessaire de renouveler les accouplements régulièrement.

Devenir

Les souris obtenues par cet élevage seront utilisées pour tester des traitements sur cette pathologie. En fonction des résultats de nos études expérimentales, les accouplements pourront être réduits ou arrêtés plus tôt que prévus.

Remplacement

Dans le cas de la SMA, les modèles animaux, notamment les souris, restent essentiels pour étudier les aspects physiologiques complexes de la maladie et tester les traitements dans un organisme entier, donc aucun remplacement n'est possible à ce stade.

Réduction

Dans le cadre de l'élevage de souris utilisées pour l'étude de la SMA, la stratégie de réduction vise à limiter au maximum le nombre d'animaux tout en garantissant la validité scientifique des travaux. Cette réduction est mise en œuvre par l'optimisation des protocoles d'élevage et des plans expérimentaux. Cela inclut une gestion rigoureuse des colonies, avec un suivi précis des lignées génétiques pour éviter les reproductions excessives ou inutiles. Des techniques précoces et fiables sont utilisées afin d’identifier rapidement les animaux malades, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Enfin, les animaux de sain en surplus seront utilisés autant que possible sur d'autres projets. Ces mesures garantissent une utilisation éthique et raisonnée des souris tout en répondant aux objectifs scientifiques.

Raffinement

De la nourriture en gelée pourra être ajoutée dans la cage pour les animaux jeunes ou faibles, afin de faciliter leur accès à la nourriture. Si un animal ne prend plus de poids dans sa phase de croissance, ou en perd 15% il sera séparé (si possible avec d'autres animaux de même gamme de poids de sa fratrie pour éviter la solitude). Les manipulations des animaux sont réalisées par un personnel formé, avec des techniques atraumatiques (nouveau-nés placés sur plaque chauffante pour le génotypage, avec un échantillon de nid et de litière pour l'odeur afin d'éviter le rejet ; les adultes ne sont jamais attrapés par la queue) et adaptées à leur bien-être. De plus, une surveillance rigoureuse de l'état de santé des souris est mise en place avec une mesure de l'évolution des nécroses chaque semaine, permettant une détection précoce des signes de détérioration liés à la maladie, afin de leur prodiguer des soins appropriés (désinfectant en cas de saignement, ou mise à disposition de gelées alimentaires) ou d’envisager une euthanasie si nécessaire. S’il y a des nécroses avec saignement, celles-ci seront désinfectées quotidiennement et évaluées selon les critères suivants : grade de 0 : légère, 1 : modérée désinfection quotidienne, 2 : sévère avec infection, euthanasie. La litière sera également changée s’il y a du sang dans la cage

Choix des espèces

Nous utilisons deux modèles de souris SMA pour nos études : SMA de type 1 (forme sévère de la maladie) ou de type 3 (forme modérée de maladie). Ces modèles animaux sont les plus appropriés pour évaluer l’efficacité thérapeutique de nos molécules sur cette pathologie ainsi que leur éventuelle toxicité. Les modèles de souris que nous employons sont de tous âges puisqu'il s'agit d'une DAP d'élevage. Ils sont bien décrits et documentés depuis de nombreuses années et reproduisent les différentes sévérités de la maladie humaine.

Constituer le dossier d'une demande d'essai clinique de phase I/II, voilà à quoi vont servir 1 732 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles portent trois lignées transgéniques de sclérose latérale amyotrophique, dont l'une où la souffrance s'installe à l'âge adulte et s'aggrave pendant trois à quatre mois. Chacune reçoit une injection dans le canal rachidien sous anesthésie, puis passe dix à quinze fois quatre tests moteurs, préhension, endurance musculaire, extension des membres et coordination. Le porteur indique que les organismes de réglementation demandent spécifiquement un modèle in vivo, et renvoie au conditionnel le bénéfice pour des patients dont l'espérance de vie reste inférieure à cinq ans après le diagnostic.

Objectifs

Les motoneurones (MNs) de la moelle épinière contrôlent les mouvements volontaires ainsi que la respiration. Dans la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), ces cellules dégénèrent ce qui entraîne des troubles moteurs. Nous avons identifié une protéine exprimée et sécrétée par les interneurones qui est importante pour la survie des MN. Une injection intrathécale de cette protéine synthétisée au laboratoire permet de bloquer la neurodégénérescence pendant 3 mois, et son injection répétée permet de maintenir l’effet neuroprotecteur sur une durée plus longue. En utilisant trois lignées transgéniques murines validées de la SLA présentant des impacts progressifs sur la survie des motoneurones nous testerons l’effet neuroprotecteur de la protéine recombinante à court, moyen ou plus long terme, en analysant en parallèle le comportement ainsi que les données physiologiques et histologiques des animaux transgéniques et des groupes contrôles appropriés, soit un total de 1732 souris.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies neurodégénératives est en constante augmentation à l’échelle planétaire. En France, la SLA affecte actuellement 5000 à 7000 patients, avec une incidence annuelle proche de 2,5 pour 100 000 habitants. Chez les patients atteints de SLA, les motoneurones (MN) de la moelle épinière contrôlant les mouvements volontaires ainsi que la respiration dégénèrent, ce qui entraîne des troubles moteurs. Cette maladie est progressive et fatale. L’espérance de vie des patients est en général inférieure à 5 ans après établissement du diagnostic. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour cette pathologie. En plus de la lourde souffrance pour les patients et leurs proches, le coût de prise en charge pour la santé publique est important. Une protéine recombinante humaine promeut la survie des MN. Ce projet évaluera l'activité de cette protéine dans plusieurs modèles animaux de la SLA. Il permettra notamment d'étudier les biomarqueurs putatifs et d'évaluer l'activité de la protéine par l'analyse d'échantillons de plasma. L’ensemble de ces expériences est d’une importance critique pour permettre la soumission d’une demande d’essai clinique de Phase I/II.

Procédures

Une injection intrathécale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 15 minutes et sera effectuée une seule fois. Des évaluations de la capacité motrice par 4 tests moteurs seront réalisées 10-15 fois sur animaux vigiles. Les animaux seront soumis à un test de préhension qui durent 2 minutes, un test d’endurance musculaire qui durent 3 minutes, un test d’extension des membres qui durent

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite, une posture voûtée, des problèmes digestifs, une hyperactivité, et des difficultés respiratoires. Les modèles de souris SLA utilisés dans ces expériences perdent progressivement leur capacité motrice à des moments bien définis et prévisibles. Pour le premier modèle, les phénotypes durent plusieurs mois, sont modérés et se déclenchent uniquement après induction. Pour le deuxième modèle, la souffrance est légère et s’installe dans la durée à l’âge adulte. Pour le troisième modèle, la souffrance se déclenche à l’âge adulte et devient de plus en plus sévère pendant 3 à 4 mois.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau, moelle épinière et muscles seront collectés afin de permettre des analyses histochimiques.

Remplacement

L’identification des biomarqueurs affectés par la PER pour utilisation dans des essais cliniques nécessite des modèles animaux de la SLA. Les organismes de réglementation demandent spécifiquement un modèle in vivo de la SLA pour la validation de PER en tant que cible thérapeutique.

Réduction

Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser, grâce notamment à une réalisation séquentielle de nos expériences évitant l’initiation de travaux avant la caractérisation complète des outils et méthodes utilisés. Nous utiliserons mâles et femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à générer dans le cadre de l’élevage maintenu au sein de notre animalerie. Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à une injection intrathécale suivie de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses et/ou prélèvements sur chaque souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine, pour éviter le stress de l'isolement, et sont observés et pesés quotidiennement pendant 2 jours avec alimentation plus riche. Pour évaluer les points limites, les animaux seront inspectés quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciale), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront une alimentation enrichie. Les animaux à mobilité réduite auront de la nourriture et de l’eau au sol pour leur faciliter l’accès.

Choix des espèces

La souris est majoritairement utilisée dans le domaine des maladies neurodégénératives. Son utilisation permet une comparaison directe des résultats obtenus avec les données disponibles dans la littérature scientifique. De plus, un grand nombre de modèles de SLA ont été caractérisés chez la souris. La génétique de la souris est très documentée et proche de l’homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour nos travaux visant à préparer une demande d’essai clinique. La SLA est une maladie neurodégénérative mortelle qui affecte de nombreux systèmes chez l'homme. Il a été démontré que les modèles murins récapitulent un certain nombre de ces caractéristiques. Les souris présentent une atteinte multi-systémique, notamment du cerveau, de la moelle épinière, des jonctions neuromusculaires et des muscles, ce qui en fait un bon modèle pour l'évaluation d'agents thérapeutiques potentiels pour la SLA. Ce projet vise à caractériser le rôle neuroprotecteur de PER dans des modèles murins adulte de la maladie SLA étant donné que cette maladie neurodégénérative se déclare normalement chez l’adulte. La maladie sera déclenchée à 2 mois d’âge dans le modèle choisi. Nous prévoyons donc d’injecter la PER après ce stade afin d’évaluer sa capacité à bloquer le phénomène de dégénérescence progressive des motoneurones.

200 rats vont être utilisés, 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour analyser leur cœur et leurs poumons. Une chirurgie de 25 minutes installe une insuffisance cardiaque droite chronique, suivie d'une échocardiographie sous anesthésie chaque semaine pendant quatre ou huit semaines. Le porteur décrit des douleurs thoraciques, une forte fatigue, une mobilité réduite, de l'inconfort respiratoire et un essoufflement à l'effort, tout en affirmant que les conditions d'entretien sont contrôlées pour que les animaux ne subissent aucun stress. Il conclut qu'aucune simulation in vitro ou in silico ne reproduit la mise en place de cette insuffisance et que l'étude ne peut se faire sans ce modèle de cerclage chez le rat.

Objectifs

L'hypertension pulmonaire (HTP) est un groupe de maladies rares et sévères qui touchent environ 1% de la population mondiale et dont la survie à long terme est très limitée. En effet progressivement les patients atteints d'HTP développent une insuffisance ventirculaire droite (IVD). Cette insuffisance ventriculaire droite correspond à un mauvais fonctionnement du ventricule droit, qui va amener à un mauvais fonctionnement du ventricule gauche et donc de tout le cœur, qui à terme entraine le décès des patients. Actuellement l'IVD n'est ciblée par aucun médicament. L'objectif du projet est donc d'améliorer la compréhension de l’insuffisance ventriculaire droite et de déterminer si l’inhibition in vivo, d'un transporteur de glucose, serait bénéfique pour réduire le développement l'IVD, ce qui permettrait d'ouvrir le champ à des nouveaux candidats thérapeutiques pour cette maladie.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de confirmer l’implication d'un transporteur de glucose (SGLT2) dans le développement de l’insuffisance ventriculaire droite, et permettra de déterminer s’il est possible de repositionner les inhibiteurs de SGLT2 dpour réduire l'insuffisance ventriculaire droite. Au vu de l'absence de thérapeutique curative pour lutter contre le développement de l’insuffisance ventriculaire droite, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades.

Procédures

Le début de protocole commence par l'induction de l'insuffisance ventriculaire droite, qui sera réalisée par chirurgie sous anesthésie générale et analgésie (25 min par animal). Tous les animaux subiront des échocardiographies, une fois par semaine (pendant 4 ou 8 semaines selon le protocole) réalisées sous anesthésie générale (15 min par animal). A la fin des procédures, tous les animaux subiront un prélèvement sanguin à la veine caudale ainsi qu'un dernier bilan de ses fonctions cardiaques sous anesthésie générale (25 min par animal, J28 ou J56).

Impact sur les animaux

Comme décris précédemment, les procédures chirurgicales conduiront au développement d'une insuffisance cardiaque droite chez tous les animaux opérés. Celle-ci va dans un premier temps engendrer des douleurs au niveau thoracique pour l’animal. Puis à une forte fatigue conduisant à une mobilité réduite de l'animal, surtout dans les premiers jours post-chirurgies. Enfin, cela conduira également à des effets secondaires important tels que de l'inconfort respiratoire ou encore de l'essoufflement à l'effort. En effet, une maladie dite « chronique » va alors se mettre en place comme chez l’humain. Les réveils des anesthésies réalisées pour les échographies peuvent également être une source de stress pour l'animal. Tout comme le gavage ainsi que la contention pour réaliser les traitements. Les animaux auront également une prise de sang en fin de protocole sous anesthésie peuvent également être source de nuisance pour l’animal.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux pour analyses post-mortem sur le coeur et les poumons.

Remplacement

L’objectif de recherche est d’étudier et de comprendre le rôle du transporteur SGLT2 dans le développement de l'insuffisance ventriculaire droite et de déterminer si ce transporteur peut être une nouvelle cible thérapeutique dans l'hypertension pulmonaire en ciblant directement le ventricule droit. Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte dit normal ou sain (physiologique) et un contexte ou l'animal est malade (physiopathologique). Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo, que ce soit in vitro ou in silico, la mise en place de cette insuffisance ventriculaire droite qui est un processus complexe. L'obtention des nouvelles connaissances, nécessaires à une meilleure compréhension de la maladie et de futures thérapies, recherchées par cette étude ne peuvent donc pas avoir lieu sans l'utilisation de ce modèle de banding et donc de rats.

Réduction

Les fonctions cardiovasculaires seront étudiées par des méthodes non invasives chaque semaine (échocardiographie) permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Un dernier bilan de leur fonction cardiaque est réallisé à la fin de l'expérimentation afin de collecter un maximum de données. Le nombre total de rats utilisés sera de 200 sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales sur le même animal. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront également effectuées. Le test statistique adéquat (test Wilcoxon-Mann-Whitney avec une valeur alpha de 0,05 et une valeur Beta de 0,1) permet de bien définir le nombre d’animaux nécessaires à cette étude.

Raffinement

Une semaine d’acclimatation sont prévues à l’arrivée des animaux. Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques par voie gazeuse (Isoflurane®) et des analgésiques (Buprecare®) afin de minimiser le stress des animaux. L'eau ainsi que la nourriture sera en illimité pour les animaux. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages des animaux. La procédure conduira à une insuffisance cardiaque droite, les animaux seront donc surveillés quotidiennement (évaluation de la présence de points limites précoces, notamment la perte de poids, qualité de la fourrure et posture des animaux en post-chirurgie) et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress.

Choix des espèces

Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celle de l’homme. De plus notre équipe travaille en routine avec des modèles expérimentaux utilisant les rats pour l’étude de maladies vasculaires pulmonaires et cardiaque. Jeune adulte (8 semaines, 200g à 250g). A ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’insuffisance ventriculaire droite est plus rapide. De plus, chez l'Homme l'hypertension pulmonaire et l'insuffisance ventriculaire droite se développe chez les jeunes adultes.

3 280 rats vont être utilisés, 2 980 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour autopsie. Ils reçoivent par sonde orale un produit de santé, sur des durées allant de trois jours à un an, avec des prélèvements sanguins en cours d'étude. Le porteur décrit une irritation liée au passage répété de la sonde, des vocalises lors de la manipulation, de l'agressivité, des douleurs abdominales et une possible détresse respiratoire. L'étude est conduite pour un client qui s'engage par contrat à ne pas dupliquer les essais, et le porteur indique que l'utilisation d'animaux est "requise" par la réglementation et donc "obligatoire".

Objectifs

Le projet vise à respecter les exigences des autorités réglementaires et des normes en vigueur avant l’utilisation d’un produit de santé chez l’Homme. Il évalue la toxicité (i.e. les éventuels effets néfastes sur le corps) du produit de santé ou de ses composants après administration orale (une seule ou plusieurs administration(s)) chez le rat, sur une durée de 3 jours à un an, tout en reproduisant au mieux l'utilisation clinique. Les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit doivent être acceptables et garantir une haute protection de la santé et de la sécurité des patients et des utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de s’assurer avant sa mise sur le marché que l’utilisation du produit de santé est sûr pour les patients afin de répondre aux exigences des autorités réglementaires et des normes en vigueur. Il permet d’évaluer les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit et de s’assurer que les éventuels risques sont acceptables par rapport aux bienfaits/bénéfices apportés aux patients. Les résultats des études aideront à décider si le produit peut être mis ou maintenu sur le marché pour utilisation chez l'Homme, conformément aux règles en vigueur.

Procédures

La fréquence et la dose d’administration orale sont définies en fonction des textes auxquels on se réfère. L’administration sera réalisée de sorte à minimiser autant que possible les nuisances à l’animal (maximum 4 minutes par administration par animal). Pendant l'étude (si besoin), selon une fréquence et un volume n'affectant pas l'animal, des prélèvements sanguins (environ 5 minutes par animal) pourront être réalisés. La durée des interventions en fin d'étude est d'environ 10 minutes chez le rat.

Impact sur les animaux

L’administration par voie orale peut engendrer chez les animaux un stress lié à la contention, un stress ou une gêne légère lié au passage de la sonde, une légère irritation liée au passage répété de la sonde avec gêne légère à la déglutition. Ceci pouvant entraîner de petites pertes de poids, une baisse d'appétit, des comportements atypiques pour l’espèce, vocalises lors de la manipulation et/ou agressivité. Les effets liés au produit (si une toxicité systémique est constatée) et/ou à une mauvaise administration sont des pertes de poids, une baisse d’activité, des douleurs abdominales, voire une détresse respiratoire.

Devenir

Pour les besoins de l'étude, une autopsie est nécessaire. Ceci permet d'évaluer les effets potentiels de toxicité systémique du produit de santé à tester. Ces analyses expliquent l'impossibilité en fin d'étude de maintenir en vie les animaux utilisés. De plus, l’analyse des paramètres sanguins ainsi qu'une évaluation des tissus au microscope (analyse histopathologique) pourra s’avérer nécessaire.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. Les méthodes alternatives existantes ne permettent pas d’évaluer les effets toxiques à court, moyen ou long terme des produits de santé en raison de la complexité des mécanismes de régulation d’un organisme vivant. Il n'existe pas de test in vitro validé ni de modèle simulé par ordinateur capable de reproduire la complexité d'une réaction tissulaire et/ou des effets systémiques. L’utilisation d’animaux est alors obligatoire pour y parvenir.

Réduction

A la constitution de l’étude, le nombre minimal d'animaux requis par les textes de références est considéré. Dans la mesure du possible, les animaux témoins sont mutualisés entre les différents essais (un même groupe d’animaux "témoin" pour plusieurs groupes d’animaux "test" recevant des produits à tester différents). Pour chaque étude, le client pour lequel l'étude est conduite s’engage à ne pas dupliquer les essais via la signature du protocole d’essai. Les études dites "de faisabilité", sur un nombre restreint d’animaux, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur. Le cas échéant, le nombre d'animaux doit être suffisant pour permettre une analyse statistique pertinente (i.e. nombre minimum d’animaux requis) et cela est défini dans la norme. Les analyses statistiques sont réalisées sur le poids des animaux, le poids des organes (absolus et relatifs) et les paramètres sanguins.

Raffinement

La stratégie de raffinement est établie afin de limiter le stress et la douleur des animaux. Elle repose sur la présence d’enrichissements du milieu en systématique, un suivi sanitaire et clinique renforcé pendant la/les phase(s) d’administration avec une visite vétérinaire en cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, pour permettre une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. Un suivi des points limites spécifiques au projet sera mis en place et tracé en temps réel au moment des observations.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. De plus, il est largement utilisé, rendant disponibles de nombreuses données dans la littérature (données sur différents modèles - raffinement, données basales de pathologie…). Le choix du stade de développement est décrit dans le(s) texte(s) de référence qui recommande(nt) l'utilisation d'animaux adultes, âgés d’environ 6 à 12 semaines.