Procédures sévères
Traçage neuroanatomique rétrograde des motoneurones phréniques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Placées sur le dos et incapables de se retourner en moins de dix secondes, ou après avoir perdu 20 % de leur poids en 48 heures, les souris sont mises à mort. 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. 576 d'entre elles reçoivent une injection dans le cerveau à la naissance, puis une injection entre les plèvres vers 30 à 50 jours, avant une perfusion intracardiaque à 60, 90 ou 120 jours selon le stade de paralysie atteint. L'objectif est de compter les motoneurones du diaphragme après traitement par une protéine du virus Borna, pour savoir si la survie allongée déjà observée chez ces souris tient à ces neurones.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte sélective et progressive des neurones cortico-spinaux (neurones du cortex moteur) et des motoneurones bulbaires et spinaux (neurones innervant les muscles). L’atteinte de ces neurones aboutit à raideurs musculaires involontaires et des faiblesses musculaires évoluant vers une paralysie complète du patient. Une insuffisance respiratoire entraine la mort du patient 3 à 5 ans après le diagnostic. Aucun traitement curatif n’existe à ce jour, seul le riluzole augmente l’espérance de vie des patients d’environ 90 jours. Parmi les nouvelles pistes thérapeutiques investiguées, une stratégie consiste à détourner une protéine virale à des fins neuroprotectrices. Cette protéine appelée protéine X est une petite protéine du virus Borna. Nous avons récemment montré l’intérêt thérapeutique de cette protéine dans un modèle murin de SLA (une souche de souris génétiquement modifié). Dans ce modèle, la phase symptomatique débute vers l’âge de 90 jours par une faiblesse des membres postérieurs et évoluant vers une paralysie des membres postérieurs. L’étude in vivo menée sur ces animaux a mis en évidence un rôle de préservation des capacités motrices de ces souris, une diminution de la neurodégénérescence des motoneurones de la moelle epinière lombaire et une augmentation de l’espérance de vie des souris. Afin de déterminer si l'augmentation de l'espérance de vie est due à une augmentation de la survie des motoneurones respiratoires nous proposons ici de marquer spécifiquement les motoneurones du diaphragme afin de les identifier et de les quantifier après traitement avec la protéine X.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si l'augmentation de la survie des souris observée apres traitement avec la protéine X est lièe a une diminution de la dégénérescence des motoneurones innervant le diaphragme.Par consequent, ce projet permettra de montrer l’efficacité de la protéine X sur les capacités respiratoires des animaux et donnera des pistes thérapeutiques pour les patients qui meurent de déficience respiratoire. Par ailleurs l'effet du traitement sera egalement observé sur les capacites motrices des animaux .
Procédures
576 souris du projet seront soumises à 3 procédures chirurgicales : 1) Injection cérébrale (à la naissane) sous anesthésie générale , durée 10 minute par animal 2) Injection intrapleurale (entre 30 et 50 jours), sous anesthésie générale durée 30 min 3) Euthanasie pour prélevement d’échantillons à 3 stades symptomatiques (60 jours ; 90 jours ou 120 jours) durée de la perfusion 5 min . 24 souris du projet seront soumises à une injection intrapleurale à un âge compris entre 30 et 50 jours. Parmis ces 576 souris , 144 animaux effectueront des test moteurs au cours de la maladie afin d'évaluer les deficits moteurs.
Impact sur les animaux
1) Injection cérébrale : bien que cela soit très peu observé au cours de ces procédures, les nouveau-nés présentant une absence de poche de lait, une hypothermie ou peu de mobilité seront sacrifiés 2) Injection intra-diaphragmatique, si les souris développent une infection post-opératoire ou présentent un état létargique ou une perte de poids, les animaux seront traités en conséquence avec des traitements médicamenteux. La grille de score sera utilisée pour déterminer les points limites et determiner un sacrifice de l'animal si son état l'impose. 3) Perfusion intracardiaque : Concernant les animaux vivant jusqu'à des stades symptomatiques avancés (jusqu'à l’âge de 120 jours) : à partir des premiers signes de paralysie (membres posterieurs) les animaux seront observés quotidiennement et la douleur sera évaluée selon la grille d’évaluation), organisée selon 5 grands critères : apparence physique, comportement naturel, évolution de la maladie, comportement provoqué, et changement de poids corporel. L’accès à la nourriture et à la boisson seront facilités avec des doses de DietGel placées dans la cage. Le réflexe de retournement et le poids seront également determinés quotidiennement. Lorsque ces animaux placés sur le dos ne seront plus capables de se retourner en moins de 10s (score 4 - comportement provoqué) ou lorsque 20% de leur poids sera perdu en 48 heures, ils seront sacrifiés.
Devenir
Afin de préléver les tissus et de pouvoir identifier la survie des neurones respiratoires les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les méthodes alternatives telles que les cultures de lignées cellulaires ne permettent pas d’appréhender un système aussi complexe que le système moteur. Le recours à l’animal entier est déterminant dans les études précliniques, en effet, seule une approche intégrée peut rendre compte de l’efficacité de la molécule sur le retard de l’apparition et de la progression de la maladie ou encore sur la prolongation de la survie des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux a été determiné par une approche statistique. Ce nombre est par ailleurs à mettre en rapport avec le nombre de conditions et les différents stades de la maladie. La dégénérescence des motoneurones respiratoires sera d'abord confirmée pour chaque stade chez les animaux contrôles. Si la dégénérescence n'est pas révélée à des stades précoces par exemple (souris agées de 60 jours), l'effet du traitement sur ces stades ne sera pas étudié.
Raffinement
Une étude pilote sera réalisée sur une douzaine de souris anesthésiée afin de limiter la douleur en testant deux protocoles medicamendateux analgésiques pré et post-opératoire. Le protocole le plus adapté sera ensuite celui appliqué dans le projet. Les animaux seront placés dans des cages enrichies (carrés de cellulose lab’nest). Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle de lumière inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Une grille de score sera utilisée pour déterminer les points limites et déterminer une mise à mort de l'animal si son état l'impose.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisée est un modèle d’étude classique de la Sclérose Latérale Amyotrophique. Les injections des différentes constructions génétiques seront réalisées chez les souris à la naissance. Ces injections précoces augmenteront les chances de couvrir la fenêtre temporelle à laquelle la protéine du virus Borna aura potentiellement un effet. Les animaux recevront ensuite des injections dans le diaphragme entre 30 et 50 jours puis les expériences d’immunohistochimie seront réalisées chez des animaux adultes à 60, 90 ou 120 jours. Ces différentes périodes ont été choisi afin de suivre l’évolution de la maladie. 60 jours correspondent à un stade asymptomatique, 90 jours à un stade symptomatique débutant et 120 jours à un stade symptomatique avancé. Un groupe d'animaux servira egalement a suivre l'evolution des deficits moteurs au cours de la maladie et evaluer l'effet du traitrement sur ces symptomes moteurs .
Étudier le rôle des récepteurs immunitaires dans le développement des cellules souches sanguines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
2 580 poissons zèbres vont être utilisés pour fabriquer six lignées génétiquement modifiées, 430 individus par lignée dont 30 seulement seront gardés au terme de la sélection. Les autres sont tués. Le génotypage passe par la coupe d'un morceau de nageoire, et le porteur envisage des conséquences allant de légères à graves : nage, alimentation ou respiration anormales, saignements, ulcères, inflammations. 840 poissons subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 1 740 un niveau léger. Les 180 poissons gardés en vie ne seront pas relâchés, ils resteront dans l'élevage pour entretenir les lignées.
Objectifs
Notre corps produit les cellules sanguines grâce à un processus appelé hématopoïèse. Tout commence avec des cellules très particulières : les cellules souches sanguines. Comprendre comment ces cellules se développent dès le début de la vie est essentiel pour progresser dans la recherche sur les maladies du sang. Des études ont montré que certains capteurs immunitaires jouent un rôle important dans ce développement. Ces capteurs fonctionnent de la même façon chez le poisson zèbre, la souris… et probablement aussi chez l’être humain. C’est pourquoi nous créons des poissons zèbres dont ces capteurs immunitaires sont modifiés. Cela nous aide à mieux comprendre leur rôle et à avancer dans la recherche médicale.
Bénéfices attendus
En effectuant deux étapes de sélection, ainsi que trois cycles de reproduction, nous serons en mesure de créer six lignées stables de poissons modifiés par des capteurs immunitaires d'ici la fin du projet. Une fois ces lignées de poissons prêtes, nous pourrons poursuivre les expériences pour étudier comment ces capteurs affectent le processus de fabrication des cellules sanguines, sans ajouter d'autres modifications génétiques aux animaux. Nous espérons que cela nous aidera à mieux comprendre comment les cellules sanguines sont fabriquées et comment cela pourrait aider à traiter les maladies du sang.
Procédures
La biopsie sera réalisée avec un temps opératoire de 5 minutes maximum, et le poisson sera placé dans un aquarium isolé pendant un maximum d’une journée afin d’obtenir les résultats du génotypage.
Impact sur les animaux
Lors de la création d'un nouvel animal transgénique ou lors d'une procédure invasive telle que la coupe des nageoires pour le génotypage, nous envisageons toutes les conséquences possibles, de légères à graves, y compris un comportement anormal en matière de natation, d'alimentation ou de respiration, une modification de la morphologie, des saignements, des ulcères ou des inflammations, qui sont des signes de stress.
Devenir
Pour chaque lignée, un total de 430 poissons sera utilisé pour les processus de sélection. Après 2 tours de sélection et 3 générations , seuls 30 poissons seront conservés pour maintenir la stabilité de la lignée, tandis que les autres seront mis à mort. Avec un total de 6 lignes de poissons, nous avons 30 x 6 = 180 poissons qui seront conservés à la fin du projet. Ils seront utilisés pour entretenir la ligne de pêche.
Remplacement
Nous voulons étudier le processus de formation des cellules souches hématopoïétiques au cours du développement embryonnaire. Il n’existe pas de système in vitro approprié pour cette étude intégrative. De plus, le poisson-zèbre s’avère être un très bon modèle vertébré pour étudier le processus d’hématopoïèse
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé sur la base du nombre minimum de poissons transgéniques réussis requis pour l'étude. Pour mener l'expérience avec 6 lignées de poissons transgéniques, au moins 30 poissons transgéniques par lignée doivent être utilisés pour poursuivre l'expérience avec leur progéniture.
Raffinement
Le poisson zèbre aime vivre en groupe. C’est pourquoi nous les gardons par groupes de 10 poissons par litre d’eau, afin qu’ils se sentent en sécurité et moins stressés. Nous prenons soin de leur environnement pour qu’il ressemble à ce qu’ils vivraient dans la nature. Par exemple, la lumière s’allume et s’éteint lentement, comme un lever ou un coucher de soleil. Chaque jour, ils reçoivent une nourriture vivante et équilibrée, pour rester en bonne santé et se comporter naturellement. Des personnes formées contrôlent les poissons tous les jours. Leur état de santé est évalué grâce à un système de notation allant de 0 (poisson en pleine forme) à 3 (problème grave). On observe leur façon de nager, de manger, de respirer, ainsi que tout signe de stress. Ce même système est utilisé pour suivre leur rétablissement après certains soins, comme lorsqu’un petit morceau de nageoire est retiré pour une étude
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un animal très utile pour étudier comment se forment les cellules du sang. En effet, son corps fabrique ces cellules de la même manière que chez l’être humain. Les gènes et les mécanismes responsables de cette production sont presque identiques. Ce petit poisson peut aussi développer des maladies du sang similaires à celles de l’homme, comme l’anémie ou la leucémie. Cela permet aux scientifiques d’étudier ces maladies plus facilement et de tester de nouveaux traitements.
Analyse dans un modèle murin d’Épilepsie du Lobe Temporal des processus inflammatoires systémiques impliquant les neutrophiles et de leur influence sur la progression de la pathologie
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Tuées à des dates échelonnées pour que leur cerveau, leurs méninges et leur moelle osseuse soient prélevés à différents stades de la maladie, 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour la moitié d'entre elles et sévère pour l'autre. Une chirurgie de quarante minutes leur injecte un produit convulsant directement dans le cerveau, après quoi elles développent des crises d'épilepsie spontanées et récurrentes, avec fatigue, perte de poids et agressivité croissante pouvant les amener à se blesser entre elles. S'y ajoutent des injections abdominales hebdomadaires, jusqu'à quatre prélèvements sanguins et des séries de tests comportementaux répétées jusqu'à six fois, dont le porteur ne nomme aucun. Il annonce en retour de nouvelles approches pour les 30 % de patients épileptiques qui ne répondent pas aux traitements, alors que le projet se limite à caractériser l'inflammation sanguine au cours de la maladie.
Objectifs
L’épilepsie, une des affections neurologiques les plus fréquentes, se caractérise par la répétition de décharges électriques excessives et soudaines au sein des neurones. Ce projet de recherche se centre plus particulièrement sur l'Épilepsie du Lobe Temporal (ELT), qui provoque des crises localisées dans une zone précise du cerveau, l’hippocampe. Le traitement habituellement administré pour cette pathologie consiste en une prise de médicaments antiépileptiques, qui limite l’excitation des neurones. Cependant, un tiers des patients ne répond pas aux traitements pharmacologiques. Cette résistance aux traitements conduit à une récurrence des crises d’épilepsie, entraînant des difficultés sociales, des états dépressifs ainsi que des déficits cognitifs. Chez certains patients, une chirurgie peut être réalisée, afin de retirer la zone cérébrale à l’origine des crises. Cependant, cela n’est pas toujours envisageable (si la zone est trop large, ou pas suffisamment bien identifiée) ; et dans le cas où la chirurgie peut être effectuée, elle n’aboutit pas toujours à la suppression des crises. Comprendre en profondeur les mécanismes tissulaires et cellulaires participant à l’épilepsie est donc important pour permettre une meilleure prise en charge des patients et le développement de nouveaux traitements. Parmi les cibles potentielles, on retrouve les processus inflammatoires, reconnus aujourd’hui comme pouvant participer au développement de l’épilepsie, notamment via les remodelages vasculaires qu’ils provoquent, modifiant ainsi l’équilibre cérébral. Cependant, la mise en place de ces processus, notamment de l’inflammation dans le sang (inflammation périphérique), et leurs liens avec l’inflammation cérébrale (inflammation centrale) sont encore à ce jour mal décrits. L’objectif de ce projet est donc de comprendre et caractériser l’évolution de l’inflammation périphérique au cours du développement de la pathologie, et les comorbidités qui y sont associées, en s’axant plus particulièrement sur une population de cellules immunitaires, les neutrophiles, qui sont les premières cellules recrutées lors d’une inflammation ou d’une infection.
Bénéfices attendus
L’épilepsie touche environ 50 millions de personnes dans le monde, en faisant une des affections neurologiques les plus fréquentes. De plus, 30 pour cent des patients ne répondent pas correctement aux traitements médicamenteux génériques, impactant durablement leur santé et leur quotidien. Des études précliniques dans un modèle murin ont apporté la preuve qu’une modulation de l’inflammation dans le sang (inflammation périphérique) induit une diminution de la fréquence et de la sévérité des crises d’épilepsie. Cependant, ces processus inflammatoires et la manière dont ils sont régulés sont encore peu connus et décrits. Ce projet vise donc à analyser plus précisément l’inflammation périphérique qui a lieu au cours du développement de l’épilepsie, ainsi que son interaction avec l'inflammation cérébrale et les comorbidités qui y sont associées. Ceci permettra d'apporter de nouvelles approches pour le soin des patients, dans le but d’une prise en charge plus efficace, notamment pour ceux ne répondant pas aux traitements habituels.
Procédures
Pour l’induction du modèle épileptique, les souris recevront une injection intracérébrale d’un produit convulsant au cours d’une unique chirurgie (40 minutes, sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire). Une partie des animaux sera soumise à des injections répétées au niveau de l’abdomen à raison d’une injection par semaine pendant 1 mois maximum (environ 20 secondes par injection sur animal vigile). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile. Pour limiter la fréquence des prélèvements par animaux, les souris seront séparées en 3 sous-groupes. Ainsi au maximum 4 prélèvements espacés d’un minimum de 2 semaines seront réalisés par souris. Une partie des animaux seront soumis à une série de tests comportementaux. Ces tests durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont réalisés sur un seul jour, d’autres sont répétés tous les jours pendant 6 jours. Les souris seront habituées au lieu dédié à l’évaluation au préalable, et auront une période de repos de 4 à 24h entre chaque test. Les souris pourront passer la série de tests entre 1 et jusqu’à 6 fois pour les temps de maintien les plus long. Enfin, l’anesthésie précédant l’euthanasie des animaux implique une injection au niveau de l’abdomen (environ 20 secondes sur animal vigile).
Impact sur les animaux
Pour générer les souris épileptiques, les animaux recevront une injection d’un produit permettant une excitation neuronale au niveau du cerveau au cours d’une unique chirurgie. Cet acte implique les risques inhérents à la chirurgie (stress thermique ou arrêt cardio-respiratoire lors de l’anesthésie, inflammation locale au niveau des cicatrices, ou encore dans de très rares cas une infection), et peut également entraîner des douleurs post-opératoires. Par la suite les souris développeront progressivement des crises d’épilepsie spontanées et récurrentes. Cela pourrait entraîner une fatigue, une perte de poids, des troubles du comportement, avec notamment une agressivité accrue avec l’âge, potentielle source d’affrontement et donc de blessures/lésions potentielles (rares). Les traitements mis en œuvre impliquent des injections répétées au cours du temps au niveau de l’abdomen, ainsi que des prélèvements sanguins. Ces actes peuvent être source de stress et de douleur de courte durée. Les tests de comportement réalisés pourront générer du stress et ou de l’angoisse en raison de la néophobie du modèle rongeur. Enfin, l’anesthésie précédant l’euthanasie des animaux implique une injection pouvant induire un stress en raison de la contention et une douleur de courte durée liée à la piqûre.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever différents organes (cerveau, méninges, moelle osseuse) pour réaliser des analyses biologiques. Leur euthanasie à différents temps permettra de suivre l’évolution des processus inflammatoires au cours du développement de l’épilepsie.
Remplacement
Nous utilisons actuellement trois alternatives au modèle animal : i) Expériences sur le tissu cérébral humain, disponible après opération de patients atteints d'épilepsie résistante aux traitements médicamenteux (zone épileptique retirée lors de la chirurgie) ; ii) Analyses de prélèvements sanguins de patients épileptiques ; iii) Travail en culture cellulaire. Néanmoins, les processus impliqués dans la transformation d'un cerveau sain en cerveau épileptique ne peuvent être légitimement bien étudiés chez l'homme (accès restreint à certains prélèvements seulement) ou par un modèle informatique (structure complexe du vivant). La culture de cellules comme les neurones peut satisfaire certains des critères nécessaires (étude de la connectivité entre les cellules - synapses, de la balance excitation-inhibition, des relations neurones / autres cellules cérébrales), mais pas tous. Notamment, les échanges et communications entre le système nerveux et le système immunitaire ne peuvent être reconstitués par cette méthode, qui ne permet que des études simples de contact entre deux ou trois types de cellules. L’ensemble de ce projet vise à mieux comprendre la régulation des processus inflammatoires, et notamment du système immunitaire inné, le premier à réagir en cas d’agression ou d’inflammation, au cours du développement de l’épilepsie. Il nécessite donc l’utilisation d’un système intégré (où l’on retrouve à la fois système nerveux et système immunitaire), permettant de comprendre les modifications structurales et fonctionnelles du système nerveux central, et ses interactions encore peu décrites avec le système immunitaire. De plus, les interactions entre cerveau et immunité périphérique étant amenées à évoluer au cours du développement de la pathologie, une étude sur de longues périodes de temps est nécessaire. Un modèle animal est donc indispensable pour ce projet, nous permettant à la fois d’avoir un système physiologique intégré (corps entier, interactions entre les différents systèmes ou organes), un meilleur contrôle de l’environnement cérébral chimique et électrique, ainsi qu’une étude tout au long du développement de la pathologie, augmentant la qualité des données obtenues.
Réduction
Le projet implique un total de 1500 animaux. Compte tenu des données de la littérature (variabilité interindividuelle et intergroupe du modèle) et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour cette étude. Ainsi, ce nombre a été limité au maximum, tout en permettant l'obtention de résultats statistiquement fiables. Les procédures expérimentales ont également été affinées pour limiter le nombre de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses d’immunohistochimie, de biochimie, ou pour les tests fonctionnels in vitro seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux.
Raffinement
L’ensemble des procédures de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, tout en respectant le bien-être animal, et en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi, etc.). La principale contrainte concerne la chirurgie mise en œuvre pour induire le modèle épileptique. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible du projet : anesthésie locale/générale, analgésie, asepsie, plateau chauffant, soins pré- et post-opératoires. Les animaux disposeront d’une litière douce en postopératoire, associée à de la nourriture molle pour faciliter la récupération et la réhydratation. Afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.), et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. Le modèle inductible d’épilepsie est couramment utilisé dans les études sur l'Épilepsie du Lobe Temporal, et permet un développement de la pathologie similaire à celui retrouvé chez l’Homme (événement initial, phase silencieuse et phase chronique) en faisant un bon modèle cette étude. Justification des stades de développement : Les animaux auront entre 8 et 10 semaines. Cet âge permet d'avoir une maturation cérébrale suffisante afin de modéliser correctement le développement de l’épilepsie qui a lieu chez l’Homme. De plus, cette gamme d’âge est similaire, en termes de développement cérébral, à l’âge d’une première lésion (convulsion fébrile, infection ou autre), souvent associée à l’émergence d'une Épilepsie du Lobe. Nous garderons les animaux jusqu’à 4 mois puisque certaines de nos problématiques concernant les mécanismes d’aggravation de l’épilepsie après les premières crises.
Efficacité d’un gel radiomarqué à l’Yttrium-90 pour la radiothérapie interne per-opératoire du glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
Greffés d'une tumeur cérébrale en quarante minutes de chirurgie, rouverts plus tard pour quarante-cinq minutes d'exérèse et le dépôt d'un gel radioactif à l'yttrium-90 dans la cavité, 101 rats passent ensuite quatre séances d'imagerie TEP d'une heure sous anesthésie. Les procédures sont classées à un niveau de souffrance sévère, le porteur reconnaissant que l'analgésie et l'anesthésie ne suffisent pas à en descendre le niveau. Tous les rats sont tués, la tumeur récidivante, l'enchaînement des opérations et la radioactivité rendant selon lui toute réutilisation impossible. Les points limites reposent sur la perte de poids et les troubles de la motricité, dans un modèle où la survie sans traitement est estimée à trente-huit jours après la greffe.
Objectifs
Les tumeurs cérébrales agressives récidivent très souvent, même après des traitements conventionnels associant chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie. La majorité des récidives apparaissent aux bords de la zone opérée, ce qui montre que des cellules cancéreuses restent souvent sur place après le traitement conventionnel. Notre projet cherche donc à tester une nouvelle approche : implanter un gel dans la cavité formée après avoir retirer la tumeur. Le gel a les propriétés de se dégrader naturellement et d'être associé à une source émettrice de rayonnements. Ce gel, placé pendant l’opération, permettrait de mieux détruire les cellules cancéreuses restantes et de limiter les risques de récidive tout en protégeant le cerveau sain.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de valider le concept de radiothérapie interne mise en place pendant de la chirurgie par injection d'un gel radioactif. Nous nous attendons à une survie des animaux prolongée sans effet néfaste sur les organes d'élimination tels que les reins. Si le gain de survie attendu est atteint, la mise en place d'un protocole clinique est envisagé dans les 5 ans à venir.
Procédures
Chirurgie de greffe tumorale : 40 minutes / animal + Chirurgie opératoire (exérèse) incluant le dépôt du gel : 45 minutes / animal. Imagerie TEP/TDM (4 sessions d'1h/animal). Tests d'éviction d'obstacle (5 min quotidienne). Pesée (< 1 min / jour).
Impact sur les animaux
Chirurgie de xenogreffe (implantation des cellules tumorales) , chirurgie opératoire (exérèse), anesthésies répétées pour les sessions d'imageries, effets indésirables liés au développement même de la tumeur (atteintes neurologiques essentiellement). Malgré l'adpplication des raffinements (analgésie/anesthésie), la procédure reste sévère.
Devenir
A la fin des 2 procédures, tous les animaux seront mis à mort. La présence de tumeur cérébrale récidivante, l'enchainement de gestes opératoires et l'utilisation de composés radioactifs rendent impossible la réutilisation pertinente et/ou éthique des animaux.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible car le développement et la réponse au traitement in vivo de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques liés à la complexité même d'un organisme entier. De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant des cellules de diférentes nature. L’ensemble de ces facteurs dynamiques ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. Cependant, la quantité de radioactivité à déposer dans la cavité a été déterminée au préalable par des modèles de simulation informatique de façon à obtenir des doses équivalentes au schéma classique d’irradiation (par irradiation au rayons X lors du traitement standard de référence chez l'Homme).
Réduction
Pour réduire le nombre total d’animaux, les mêmes rats seront utilisés pour les comptages de radioactivité dans les organes (=étude de dosimétrie) et l’histologie (=étude des tissus post mortem sur les animaux) et les données du bras sans injection de gel seront celles obtenues lors d'un projet précédent. De plus, 42 jours post impantation tumorale, nous supposons que les animaux recevant le gel non-radioactif auront été mis à mort du fait d’une survie équivalente au modèle de récidive sans traitement (38 jours post-greffe) et nous ne prévoyons pas de rats supplémentaires dédiés à des études post-mortem sur les tissus après cette date pour ce groupe.
Raffinement
Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de papier craft et de buchettes en bois à ronger et bénéficieront d'un cycle jour/nuit inversé dans leur salle d'hébergement. Ils seront hébergés par 2 ou 3 et les expérimentations ne débuteront qu'après une semaine d'acclimatation suite à la réception des animaux. Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l'implantation de la tumeur et après son retrait chirurgical (pesée quotidienne, observation quotidienne (week-ends compris) du comportement et la motricité, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Des points limites précoces sont définis (perte de poids et problèmes de motricité essentiellement) afin d’anticiper toute souffrance ou dégradation de l’état général liée à la tumeur. Le transport des animaux vigiles entre l’animalerie et le site d’imagerie IRM (imagerie à résonance magnétique), sans passage à l’extérieur, sera réalisé en maintenant une température optimale par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages. Les examens TEP (Tomographie par Emission de Positons : imagerie basée sur l'injection d'un produit radioactif) seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane, depuis l’injection des radiotraceurs jusqu’à la fin de la procédure, conformément à des protocoles aseptiques adaptés aux caractéristiques individuelles de chaque animal et à la durée spécifique de la procédure. Ils seront effectuées par du personnel qualifié et expérimenté. Pendant l’examen, le niveau d'anesthésie sera surveillé en temps réel à l'aide de paramètres physiologiques tels que la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire, garantissant ainsi un état stable et sécurisé pour les animaux. Après la procédure, les animaux seront surveillés pendant le processus de réveil dans un environnement calme et contrôlé.
Choix des espèces
Les modèles animaux majoritairement utilisés pour les études sur le cancer sont les modèles murins : souris et rats. Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la taille du cerveau plus importante pour une implantation de la tumeur dont le volume deviendra suffisamment important pour s'affranchir des limitations liées à l’imagerie et permettre une injection de gel. Les rats qui seront utilisés présentent l'avantage d'avoir un système immunitaire intégralement préservé et sont une souche de référence utilisée pour le développement d’un modèle murin de tumeur cérébrale. Des rats âgés de 7 semaines (6 semaines à la réception) seront utilisés à un stade où leur cerveau est mature selon les standards définis.
Exposition à la silice et induction d’autoimmunité systémique : modèle de sclérodermie systémique « Modification »
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Jusqu'à cinquante injections intradermiques d'acide hypochloreux à raison de cinq par semaine pendant dix semaines, ou vingt-six injections intrapéritonéales à raison de trois par semaine : 615 souris vont être utilisées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 120 d'entre elles, modéré pour 205 et sévère pour 290. Elles développent une fibrose de la peau au point d'injection et une fibrose pulmonaire, deux expositions respiratoires à de la silice cristalline ou à de la poussière de pierre artificielle leur étant imposées sous anesthésie, et 114 subissent une biopsie cutanée au poinçon de 5 mm. L'objet déclaré est d'obtenir un modèle murin de sclérodermie plus proche de la maladie humaine et de mesurer ce que fait la poussière des plans de travail aux personnes qui la respirent au travail. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, peau, rate, rein et cœur.
Objectifs
Ce projet a 2 grands objectifs qui sont les suivants: 1) optimiser le modèle de souris sclérodermique, qui à ce jour ne reflète pas entièrement la physiopathologie observée chez l’homme (inflammation, autoimmunité et fibrose cutanée et pulmonaire). Nous évaluerons ces paramètres physiopathologiques dans le nouveau modèle que nous proposons et qui sera induit dans des souris génétiquement susceptibles de développer une autoimmunité en présence de la protéine recombinante contre laquelle les auto-anticorps sont dirigés et de silice cristalline utilisée comme adjuvant pour stimuler la réponse immunitaire. En effet, les modèles murins actuels sont soit génétiques soit induits par injection de substances chimiques tels que l’acide hypochloreux (HOCl) ou la bléomycine (BLM); 2) évaluer si une exposition à la poussière de pierre artificielle contenant de la silice cristalline (poussière émise lors de la fabrication et la taille de plans de travail) favorise le développement d'une autoimmunité systémique (production d'anticorps auto-immuns) et si oui, évaluer si cette exposition favorise le développement de la sclérodermie systémique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet seront : 1) de disposer d’un nouveau modèle de souris sclérodermiques dans lequel seront retrouvés les grands paramètres qui définissent cette maladie : l'inflammation, l’autoimmunité et fibrose cutanée/pulmonaire ; cela permettra d’une part d’apporter de nouvelles connaissances sur la physiopathologie de cette maladie et d’autres part de disposer d’un modèle pertinent pour tester de nouvelles thérapies; 2) d'évaluer l'importance du fond génétique des souris sur l'induction de la maladie; 3) d’évaluer les risques sur la santé d’une exposition à la poussière de pierre reconstituée à laquelle les travailleurs peuvent être exposés dans leur cadre professionnel et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets (autoimmunité, inflammation et fibrose). Ces informations pourraient à terme permettre de mieux informer les utilisateurs des risques encourus, de contribuer à mieux protéger les personnes exposées et à limiter l’utilisation de cette pierre artificielle.
Procédures
Des souris vigiles (n=100) seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 10 semaines maximum. Des souris anesthésiées (n=467) seront soumises à 2 expositions par voie respiratoire de NaCl ou de particules minérales à 15 jours d'intervalle). Des souris vigiles (n=290) seront soumises à 4 injections sous-cutanées (tous les 15 jours). Des souris vigiles (n=16) seront soumises à 2 injections intra-veineuse d'anticorps (une par mois). Des souris vigiles (n=258) seront soumises à 26 injections intra-péritonéales soit 3 fois/semaine. Des souris anesthésiées (n=114) auront une biopsie cutanée (punch de 5 mm).
Impact sur les animaux
L'injection intra-dermique d'acide hypochloreux (HOCl) peut entrainer une gêne (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois une plaie cutanée (au niveau du bas du dos). Les souris exposées à l'acide hypochloreux (HOCl) développent une fibrose cutanée au point d'injections (bas du dos) et une fibrose pulmonaire légère à modérée qui se développe à partir de la 3ième semaine. La fibrose induite est localisée dans la région sous-pleurale et s'étend peu à l'ensemble du parenchyme pulmonaire. Les souris exposées par instillations oropharyngées de silice cristalline (SiO2) développent une fibrose pulmonaire modérée qui s'étend à l'ensemble du parenchyme pulmonaire. Il n'a pas été décrit dans la littérature et nous n'avons pas non plus observé dans nos études antérieures de signes de difficulté ou de souffrances respiratoires dans ces deux modèles. Même si nous ne nous attendons pas à avoir d’inconfort ou de souffrance animale avec une exposition à la poussière de pierre artificielle (PA) nécessitant le recourt à des antalgiques, nous serons attentifs sur ce point. D'après la littérature, des injections sous-cutanées répétées à 15 jours d'intervalles n'ont pas non plus montré d'effets indésirables chez les souris.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de trissus et d'organes (sang, poumons, peau, rate, rein et coeur).
Remplacement
La sclérodermie systémique est une maladie autoimmune (présence d’autoanticorps dans la circulation sanguine), complexe avec des manifestations dans plusieurs organes (peau et poumons majoritairement) qu’il est impossible de reproduire in vitro. Il est important d’avoir un modèle de souris sclérodermique qui se rapproche le plus possible de ce qui est observé chez l’homme (fibrose cutanée et pulmonaire, autoimmunité et inflammation) pour tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Réduction
Le choix des conditions expérimentales est fixé en lien avec les questions scientifiques du projet et les principes de réduction. Les procédures expérimentales sont rigoureusement planifiées afin de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire mais suffisant pour obtenir des résultats statistiquement exploitables et obtenir assez d'échantillons biologiques (tissus/organes) permettant de réaliser toutes les analyses biologiques et biochimiques nécessaire pour répondre à nos objectifs. Notre expertise et nos précédents projets sur ces modèles murins nous ont permis de dimensionner nos groupes d’animaux à 8-10 individus afin de garantir l’obtention de données exploitables et de réaliser toutes les analyses nécessaires sur les différents tissus qui permettront de caractériser l’effet thérapeutique obtenu et d’investiguer les mécanismes d’action du traitement testé. Pour atteindre les objectifs scientifiques du projet, un nombre de 615 souris sera utilisé. Les statistiques seront réalisées à l'aide de tests non paramétriques de Mann et Whitney pour comparer des échantillons deux à deux et de Kruskal-Wallis pour comparer un nombre quelconque d'échantillons.
Raffinement
La mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel permettront de limiter le stress et la souffrance des animaux. Ils bénéficieront également d'un enrichissement constitué de coton et/ou « maisons » en carton afin de les stimuler, diminuer le stress et de leur permettre de se construire un « nid ». Selon les procédures, un suivi comprenant une évaluation de leur posture et locomotion et de leur comportement (expression faciale) sera réalisée soit au minimum 3 fois/semaine (procédures N° 2, 3 et N°4) soit 5 fois/semaine (Procédures N°1 et N°5) et permettra de contrôler leur état de santé. Le suivi du poids sera également réalisé une fois par semaine. Ces informations sont consignées dans un tableau ou grille de score, et ce suivi hebdomadaire des signes cliniques permettra d’avoir recours à des anti-douleurs adaptés si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux et à l’euthanasie dès que nécessaire.
Choix des espèces
Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre les effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte des adultes.
Recherche des mécanismes protecteurs de l’unité motrice dans la sclérose latérale amyotrophique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
6 170 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à deux injections par jour pendant toute la durée du protocole et une séance quotidienne d'exercice de vingt minutes. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 2 374 d'entre elles, modéré pour 2 480 et sévère pour 1 316, et toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Porteuses d'une mutation reproduisant la maladie de Charcot, elles perdent leur force à partir de trois mois puis l'usage de leurs pattes arrière à partir de quatre mois, et reçoivent des injections dans le canal rachidien ou dans le crâne sous anesthésie. Le porteur écrit avoir soigneusement calculé le nombre d'animaux nécessaires sans donner ce calcul, et présente le partage des tissus prélevés entre équipes comme une mesure de réduction.
Objectifs
Notre projet vise à mieux comprendre et traiter la sclérose latérale amyotrophique (SLA), aussi appelée maladie de Charcot. Cette maladie grave entraîne la mort des neurones qui contrôlent les muscles, ce qui cause une perte progressive de force et finit par être fatale. Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement qui puisse guérir la SLA, c’est pourquoi la recherche continue. L'activité motrice pourrait aider les personnes atteintes de SLA, mais on ne comprend pas encore bien comment cela fonctionne au niveau des cellules et des molécules. Le but de notre projet est donc de : 1)Étudier les changements dans les cellules du muscle et des nerfs, avant et après l’apparition des symptômes. 2) Découvrir comment l'activité motrice protège les muscles pour 3) essayer de reproduire ces effets grâce à des médicaments et 4) Evaluer si ces traitements peuvent soigner la maladie.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui, il n’existe pas de traitement pour guérir la maladie de Charcot. Notre projet de recherche a deux grands objectifs pour mieux comprendre la maladie et trouver de nouvelles pistes pour la traiter. On étudiera d’une part les bénéfices de l'activité motrice et d’autre part on recherchera des molécules capables de soigner les symptômes de la maladie. Notre projet permettra ainsi de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques de cette pathologie mortelle qui touche 8000 personnes en France à l’heure actuelle.
Procédures
Dans le cadre du protocole expérimental, différentes manipulations sont réalisées sur les animaux. Pour l'identification génétique des individus malades, une incision à l’extrémité de la queue est pratiquée sur les souriceaux (moins de 1 minute, 1 seule fois). Le protocole comprend une phase d'activité motrice. Les séances durent 20 minutes et sont réalisées quotidiennement jusqu’à la fin de l'expérience. L’intensité et la durée de ces activités sont adaptées aux capacités de l’animal. Concernant les injections, plusieurs types sont effectués : 1) Injections sous la peau ou dans la cavité abdominale : elles sont rapides (moins d’une minute), réalisées sur l’animal vigile, et peuvent avoir lieu jusqu’à deux fois par jour tout au long du protocole. 2) Injections dans le système nerveux central : elles sont effectuées sous anesthésie. Selon le type d’injection, la durée de la procédure varie (environ 10 minutes pour l’injection dans le canal rachidien, environ 30 minutes pour l’injection intracrânienne). Ces dernières ne sont réalisées qu’une seule fois dans la vie de l’animal. Toutes ces manipulations – activités motrices et injections – sont planifiées avec précision dans le calendrier expérimental. Le recours à la contention est limité au strict nécessaire et uniquement pour la durée des procédures.
Impact sur les animaux
Dans notre étude sur la maladie de Charcot chez la souris, certains effets secondaires sont attendus, principalement à cause des symptômes de la maladie elle-même. Les souris malades présentent une faiblesse musculaire et ont des difficultés à bouger lorsque la maladie avance. Les premiers signes apparaissent vers 3 mois avec une perte de force, puis, à partir de 4 mois, les souris commencent à perdre progressivement l’usage de leurs pattes arrière. Pour certains gestes techniques nécessaires à l’étude, comme l’administration de traitements, les animaux sont manipulés brièvement. Cela peut provoquer un stress passager ou une petite douleur, comme au moment d’une piqûre. Dans certains cas, des effets plus durables peuvent apparaître, notamment si les injections sont répétées. Les tests moteurs, lorsqu’ils sont utilisés comme approche thérapeutique, peuvent également provoquer de la fatigue ou du stress, une perte de poids ou des perturbations du sommeil.
Devenir
Dans le cadre de notre travail, certains animaux doivent être retirés de l’étude. Les animaux sont mis à mort à la fin des procédures pour analyser les tissus et mieux approfondir la compréhension de la maladie. Dans tous les cas, ces étapes sont menées avec le plus grand respect pour l’animal et dans le souci constant de limiter toute forme de souffrance.
Remplacement
Cette maladie neuromusculaire est très complexe. Elle touche plusieurs organes et types de cellules en même temps. Les dommages subis par les nerfs et les muscles ont des conséquences directes sur le mouvement et la coordination, ce qui ne peut être observé qu’en étudiant des animaux vivants. Pour mieux comprendre cette maladie et tester les effets de nouveaux traitements, il est donc essentiel de mener des recherches sur des modèles vivants. Bien sûr, en parallèle, nous utilisons aussi des techniques sur des cellules cultivées en laboratoire. Ces approches permettent d’explorer plus en détail certains mécanismes biologiques et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Nous pourrons alors tester sur les souris de possibles thérapies avant de les tester sur l'être humain.
Réduction
Dans le cadre de nos recherches, nous avons fait en sorte d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Notre objectif est de mieux comprendre les effets de cette maladie neurodégénérative, et de mieux comprendre les effets bénéfiques de l'activité motrice afin d’identifier des traitements. Pour cela, nous avons soigneusement calculé le nombre d’animaux nécessaires afin d'obtenir des résultats solides, sans en utiliser plus que ce qui est strictement nécessaire. Nous analysons ensuite les données recueillies à l’aide de méthodes statistiques adaptées à chaque situation, afin de tirer des conclusions justes. Par ailleurs, pour éviter le non emploi, nous prélevons autant de tissus que possible sur chaque animal à la fin de l'expérience. Ces échantillons sont ensuite conservés et mis à disposition de l’ensemble des chercheurs de notre équipe. Une liste des tissus encore disponibles est également partagée afin qu’ils puissent être utilisés dans d’autres projets, réduisant ainsi encore le besoin d’utiliser de nouveaux animaux.
Raffinement
Dans notre projet de recherche sur la SLA chez la souris, nous mettons tout en œuvre pour respecter le bien-être des animaux utilisés et réduire au maximum leur stress et leur inconfort. Pour cela, nous avons mis en place plusieurs mesures spécifiques. Tout d’abord, nous avons créé des grilles d’évaluation de l'état de santé de l'animal, adaptées à cette maladie particulière. Ces grilles ont été conçues avec l’aide du personnel spécialisé en soins animaliers. Elles permettent de suivre l’évolution de la maladie et de repérer rapidement tout signe de détresse chez les souris. Avant de commencer les expériences, les animaux passent par une phase d’adaptation/habituation. Cela permet de réduire leur stress. Quand une manipulation peut être source de mal-être, comme certaines injections, elle est toujours réalisée sous anesthésie. Si un animal montre des signes de faiblesse, comme une perte de poids ou des difficultés à se déplacer, des aliments faciles à consommer et des gels d’hydratation sont placés à sa portée. Et surtout, si malgré tout l’état d’un animal se dégrade, nous appliquons des règles strictes pour arrêter l’expérience à temps. Cela permet d’éviter toute souffrance inutile. Ces points d’arrêt anticipés sont décidés à l’avance pour chaque situation.
Choix des espèces
Les souris sont souvent utilisées dans la recherche car leur fonctionnement biologique est assez proche de celui de l’être humain. Cela permet de mieux comprendre certains mécanismes naturels qui protègent le corps, en particulier lorsqu’ils font intervenir plusieurs organes. Ce type d’étude ne peut se faire que sur un organisme entier, ce qui rend l’animal indispensable. Nous utilisons une lignée de souris bien connue et très utilisée, porteuse de la maladie de Charcot que nous étudions. Ce modèle est particulièrement utile car il permet de suivre précisément l’évolution de la maladie. Grâce à sa capacité de reproduction bien maîtrisée, cette lignée facilite l’organisation des expériences. Pour mieux comprendre comment cette maladie évolue, nous observons les animaux à différentes étapes de la maladie : avant l’apparition des symptômes (avant 3 mois), au cours de la maladie (entre 3 et 4 mois) et à un stade avancé de la maladie (après 4 mois). Cela nous permet de suivre les changements dans leur organisme et de mieux comprendre cette maladie. La maladie étant très comparable à celle chez l’humain, nous pourrons alors essayer sur ces animaux des traitements et vérifier s'ils sont bénéfiques.
Mise au point d’un nouvel agent de contraste biocompatible pour l’imagerie photoacoustique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Pose d'un cathéter, épilation à la crème dépilatoire, injection d'un produit inflammatoire ou chirurgie du cerveau de trente minutes, séance d'imagerie, puis perfusion mortelle. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes. Le projet met au point un agent de contraste à base de microparticules de polydopamine, destiné à repérer l'inflammation en imagerie photoacoustique. Le porteur qualifie cette imagerie de non invasive et annonce dans le même texte que l'injection du produit inflammatoire peut provoquer une insuffisance cardiaque, des lésions de plusieurs organes et la mort des animaux.
Objectifs
L'inflammation joue un rôle central dans de nombreuses maladies, qu'elles soient neurologiques (AVC, traumatismes crâniens), digestives (maladie de Crohn), rénales (néphropathie diabétique) et cardiaques (ischémie du myocarde, myocardite). Ce projet vise à développer l’imagerie photoacoustique, une méthode innovante et non invasive pour visualiser l’inflammation de manière précoce et précise. Il repose sur l’utilisation de microparticules de polydopamine, un matériau biocompatible qui absorbe la lumière infrarouge et devient détectable en imagerie. En associant les microparticules de polydopamine à un anticorps ciblant une molécule inflammatoire, ces particules permettent de localiser les zones touchées dès les premiers stades de la maladie. Déjà prometteuse en IRM avec de l’oxyde de fer, cette approche pourrait offrir une alternative plus accessible pour détecter l’inflammation. L’objectif est d’évaluer sa précision et sa compatibilité biologique en vue d’une future application médicale.
Bénéfices attendus
Il est attendu de la technique d'imagerie photoacoustique utilisant ce nouvel agent de contraste qu'elle puisse permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation dans les différents modèles de maladies inflammatoires proposés. Cette étude pourra apporter les premiers éléments permettant d’envisager une application clinique future. A terme, cette nouvelle méthode d’imagerie pourrait améliorer le diagnostic et la prise en charge de nombreuses pathologies inflammatoires.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o 1 pose d’un cathéter sous anesthésie (durée : environ 15min) o 1 épilation d'une zone de la peau avec une crème dépilatoire sous anesthésie (durée : inférieure à 5 min) o 1 séance d'imagerie photoacoustique (non invasive) avec injection de produit de contraste sous anesthésie (durée : environ 20min) o Induction d'un modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) OU Induction d'un modèle de neuroinflammation par une unique chirurgie stéréotaxique sous anesthésie (durée : environ 30min) o Pesées lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o 1 perfusion après anesthésie et analgésie profonde (durée : environ 5min).
Impact sur les animaux
Les deux modèles d'inflammation utilisés peuvent produire des effets indésirables chez les animaux. Dans le premier modèle, une inflammation cérébrale créée pourra induire des changements dans le fonctionnement cérébral (symptômes dépressifs, de l'anxiété, altérations des fonctions mentales) et la chirurgie cérébrale réalisée pour induire le modèle peut provoquer des micro-saignements et des douleurs au niveau des points de suture de la peau. Dans le deuxième modèle, l'injection du produit inflammatoire peut induire une inflammation généralisée, une insuffisance cardiaque et des lésions touchant plusieurs organes ce qui peut mener à la mort des animaux. L’injection des microparticules pourrait provoquer une légère irritation ou une réaction inflammatoire. Enfin, l’anesthésie, bien que couramment utilisée, peut parfois causer des effets secondaires comme des troubles respiratoires, une baisse de température ou une récupération plus lente après le réveil (fatigue, comportement modifié).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisés en imagerie photoacoustique sur les microparticules de polydopamine (en utilisant des "fantômes") et ont montré que la polydopamine présente une absorption et une fluorescence significatives dans la région du proche infrarouge, adaptée à l'imagerie photoacoustique. Cependant, les expériences in vitro ne peuvent pas totalement remplacer les études in vivo, car il est crucial d’évaluer la sensibilité et la spécificité de détection des microparticules de polydopamine après injection dans un organisme vivant, en tenant compte des facteurs spécifiques à l'environnement biologique, tels que le flux sanguin, le passage du signal à travers la peau, les interactions avec les tissus environnants, la distribution des particules dans les différents organes. De plus, des études in vivo sont nécessaires pour évaluer la biodistribution et la biodégradabilité des particules à long terme, ainsi que pour détecter d’éventuels effets indésirables qui ne peuvent se manifester qu'après une période prolongée dans un organisme vivant. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet sont essentielles et ne peuvent être remplacées par des méthodes ne nécessitant pas l’utilisation d’animaux vivants, car seule l’expérimentation in vivo peut fournir les données complètes nécessaires pour valider cette approche et garantir sa transposition en clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été soigneusement évalué à partir des données issues de nos précédentes études ayant utilisé les mêmes modèles animaux et les mêmes types de microparticules. Conformément aux recommandations scientifiques, pour le développement d’un nouvel agent de contraste dans une modalité d’imagerie donnée, il est essentiel de s’appuyer sur un nombre d’animaux compris entre 5 et 10 par groupe pour obtenir des résultats fiables. Ce nombre est nécessaire pour évaluer la spécificité (par exemple, à travers des études comparatives avec des particules ciblant les molécules d’adhésion endothéliales ou des particules contrôles) et la sensibilité (notamment via des études de dose-réponse). Le nombre d’animaux requis est important mais d'après nos précédentes expériences dans le développement d’agents de contraste, nous avons établi que ces contrôles sont indispensables pour garantir la validité des résultats. Nous avons conçu le protocole de manière à minimiser ce nombre, en nous assurant que chaque expérience soit la plus informative possible tout en respectant les principes de réduction et de raffinement dans l’utilisation des animaux.
Raffinement
Les animaux auront le temps d’acclimatation d’une semaine. Un enrichissement du milieu d'hébergement des animaux de type boite à oeuf, tunnel PVC et/ou igloo PVC est prévu. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. A partir du début de la mise en place des modèles, une attention particulière sera accordée à l'état général des animaux, notamment pour vérifier l'absence d'apparition de signes de détresse ou de douleur extérieure ainsi que la bonne prise alimentaire et de boisson. Un gel "diet énergie" sera placé dans la cage pour faciliter la prise alimentaire et l'hydratation. Une attention particulière sera aussi accordée à l'évolution de la masse corporelle avec une pesée quotidienne afin de vérifier que la perte de poids n'est pas supérieure à 15%. Après induction des deux modèles, une surveillance sera faite dans les 3 heures après les injections, puis tous les jours jusqu’à la mise à mort des animaux. De plus, pendant la durée des modèles et avant la perfusion réalisée pour le prélèvement des organes d'intérêt, la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies de type inflammatoire. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les pathologies inflammatoires. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines, car c’est à partir de cet âge qu’ils sont considérés comme adultes.
Tests réglementaires d’activité pour la production de vaccins ou de médicaments immunogènes à destination de l’homme
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Cochons d'Inde : 44111
Le contrôle réglementaire de lots de vaccins avant leur mise sur le marché repose ici sur l'injection d'agents pathogènes à des animaux vivants. 136 195 souris et 44 111 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, 4 181 souris et 300 cobayes étant réutilisés et 99 cobayes placés à l'adoption, le reste tué. Les souris reçoivent une à trois injections de virus rabique ou de toxine tétanique, les cobayes jusqu'à sept injections de toxine diphtérique ou de tuberculine, les fortes doses pouvant provoquer des symptômes rabiques du cinquième au quatorzième jour, des symptômes tétaniques sur quatre jours ou une nécrose localisée. Le porteur annonce le remplacement progressif de ces tests par des contrôles 100 % in vitro et l'arrêt du test tuberculine dans les cinq ans, ce qui situe ces 180 306 animaux dans l'intervalle avant une bascule qu'il tient lui-même pour possible.
Objectifs
Ce projet consiste à évaluer l’activité protectrice soit : • De vaccins (valences rage, diphtérie et tétanos), à différents stades de production • D’un composé immunogène (tuberculine), tous destinés à l’homme. Les vaccins contre la rage, la diphtérie et le tétanos jouent un rôle fondamental dans la protection de la santé humaine à l’échelle mondiale. La rage est une maladie virale presque toujours mortelle une fois les symptômes apparus, mais entièrement évitable grâce à la vaccination, notamment en post-exposition. La diphtérie et le tétanos, quant à eux, sont des infections bactériennes graves : la diphtérie peut entraîner des complications respiratoires et cardiaques sévères, tandis que le tétanos provoque des spasmes musculaires douloureux pouvant être mortels. Ces maladies sont aujourd’hui rares dans les pays à forte couverture
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont la mise sur le marché (ou éventuellement l’utilisation en essai clinique) de lots de vaccins ou de composés immunogènes conformes aux spécifications et aux textes de référence, et ainsi améliorer la qualité de vie des patients. Bien que le nombre de dose associé au nombre de lot soit difficilement estimable, on peut considérer que ce projet représente la libération d’environ un million de dose de vaccins contre la diphtérie et le tétanos (soit 1000 lots), 100 000 doses de vaccins contre la rage (soit 100 lots) et 10 000 doses de détection de l’infection tuberculeuse lente même en l’absence de symptôme (soit 10 lots). Il joue donc un rôle fondamental dans la protection de la santé humaine à l’échelle mondiale.
Procédures
3 injections sous anesthésie gazeuse sont réalisées sur les souris. 7 injections sont réalisées sur les cobayes. 1 injection est réalisée sur les cobayes. 5 à 7 injections sont réalisées sur les cobayes. 2 injections sont réalisées sur les souris. 1 injection est réalisée sur les souris. 5 injections sont réalisées sur les cobayes. Ces différents types d’injection durent moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont : • Injection de virus rabique chez la souris (10 secondes) : les plus faibles quantités injectées ne produisent pas d’effet chez l’animal. Les plus importantes quantités de virus peuvent provoquer des symptômes rabiques potentiels de J5 à J14. • Injection de toxine diphtérique chez le cobaye (30 secondes) : les plus faibles quantités injectées ne produisent pas d’effet chez l’animal. Les plus importantes quantités de toxine peuvent provoquer des symptômes diphtériques potentiels sur 24 h. • Injection de toxine tétanique chez la souris (10 secondes) : les plus faibles quantités injectées ne produisent pas d’effet chez l’animal. Les plus importantes quantités de toxine peuvent provoquer des symptômes tétaniques potentiels sur 4 jours • Injection de mycobactérium tuberculosis (10 secondes): la révélation avec la tuberculine peut engendrer des lésions érythémateuses potentiels sur 24h. Ces lésions peuvent dans certains cas exceptionnels aller jusqu’à une nécrose localisée
Devenir
Toutes procédures du présent projet ne permettent pas la réutilisation des animaux, qui ont tous subi des injections d’agents pathogènes ; Ils ne peuvent donc pas être inclus dans un autre test sans risque d’apporter un biais ou un risque sanitaire ; Ils ne peuvent pas non plus être adoptés sans risque pour l’adoptant. Comme ils n’ont pas été inclus dans la procédure, les animaux surnuméraires peuvent éventuellement être soumis à l’adoption ou être réaffectés à une autre procédure ou un autre projet, notamment au projet de formation.
Remplacement
Le remplacement des vaccins rabiques actuels par un vaccin nouvelle génération avec profil de contrôle 100% in vitro. La consommation d’animaux va diminuer progressivement durant la durée de validité du projet (test des stabilités). Concernant les vaccin diphtérique et tétanique : 1er objectif : pour les vaccins à destination Chine, remplacement du profil de contrôle d’activité par challenge par un test d’immunogénicité 2nd objectif : pour tous les vaccins, remplacement progressif par un test 100% in vitro
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est défini par la réglementation. Le prévisionnel du nombre de lots à tester sur les 5 années à venir et la mise en place des stratégies d’arrêt ou de remplacement de ces tests nous permettent de déterminer le nombre d’animaux nécessaires Un arrêt du test tuberculine dans les 5 ans à venir lié à l’arrêt du produit est envisagé.
Raffinement
Certaines injections sont faites sous anesthésie Les tests d’activité du vaccin rabique et tétanique comportent des points limites définis, permettant ainsi de limiter le niveau de souffrance atteint par les animaux. Des essais sont initiés en 2025 dans le but d’héberger les cobayes sur litière. Des récompenses alimentaires (graines et fruits secs) sont distribuées systématiquement après un acte technique. Cet ajout est également conseillé après tout acte jugé stressant (change, tonte, coloration…).
Choix des espèces
Les espèces choisies doivent être sensibles à l’agent infectieux correspondant au vaccin ou au composé immunogène contrôlé. Il s’agit de la souris pour les valences tétanique et rabique, et du cobaye pour la valence diphtérique et pour la tuberculine. Ces espèces sont décrites comme modèles dans les Pharmacopées en vigueur, ainsi que dans les rapports techniques de l’OMS. Les animaux utilisés dans ce projet sont tous a minima au stade sevré afin de garantir un certain niveau de maturité du système immunitaire.
Étude de l’impact d’un activateur de la kinase HRI dans la pathologie de l’Accident Vasculaire Cérébrale.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une ischémie cérébrale est provoquée par occlusion d'une artère, suivie d'une thrombolyse vingt minutes plus tard, puis d'un traitement à une heure et à vingt-quatre heures. 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées par exsanguination au quinzième jour pour prélever leurs tissus. Le projet teste un composé synthétique, le BTdCPU, sur un deuxième modèle d'accident vasculaire cérébral après des résultats obtenus sur un premier. Le porteur classe en sévères les douleurs postopératoires et les déficits fonctionnels ou cognitifs, et écrit par ailleurs que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et ne présentent aucun "syndrome du comportement malade".
Objectifs
L'Accident Vasculaire Cérébral (AVC) ischémique, résultant de l'occlusion d'un vaisseau cérébral, prive les neurones d'oxygène et de nutriments, induisant un stress majeur du réticulum endoplasmique (RE). Face à ce stress, les cellules neuronales activent des mécanismes de survie, notamment en ajustant la façon dont elles fabriquent les protéines. Une molécule essentielle à la fabrication des protéines est modifiée, ce qui ralentit la production générale de protéines. Ce ralentissement permet à la cellule d'économiser son énergie. Cette modification est un mécanisme clé de régulation de la production de protéines en cas de stress. Elle ralentit la fabrication globale de protéines, permettant à la cellule d'économiser de l'énergie pour survivre dans des conditions difficiles. Plusieurs enzymes peuvent provoquer cette modification en réponse à différents types de stress. L'une de ces enzymes, qui est habituellement liée à un manque de fer, montre une implication croissante dans la physiopathologie neuronale et potentiellement dans la réponse au stress ischémique cérébral. Elle représenterait donc un moyen supplémentaire de réguler la fabrication des protéines. Dans ce contexte, le BTdCPU est un composé synthétique, principalement utilisé en recherche pour son action activatrice sur cette enzyme particulière, notamment dans des études précliniques métaboliques et cancérologiques. Des expériences préliminaires sur neurones montrent que de petites quantités de BTdCPU améliorent la survie des cellules après un manque d'oxygène. Chez des souris ayant eu un AVC, l'administration de BTdCPU a réduit la taille des lésions et amélioré leurs fonctions motrices. Ces résultats prometteurs ouvrent la voie à une étude plus approfondie du rôle de cette enzyme dans d'autres modèles d'AVC chez les souris. L'objectif principal de ce projet est d'évaluer l'impact du BTdCPU, seul ou combiné à l'Altéplase, sur les lésions, l'inflammation et la récupération fonctionnelle dans un modèle murin d'AVC ischémique thromboembolique. Tester ce traitement sur un autre modèle animal d'AVC permettrait de confirmer son potentiel thérapeutique après un AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies (AVC, Sclérose en Plaques (SEP) et processus inflammatoires). En effet, une meilleure compréhension de l’efficacité et du mécanisme d’action de notre candidat nous permettra de développer des stratégies thérapeutiques adéquates, permettant d’envisager d’améliorer les performances de patients dans ces différentes pathologiques.
Procédures
J0 : Induction de l’ischémie cérébrale +/- Thrombolyse à 20 minutes +/- Traitement à 1 heure et 24 heures après l’occlusion artérielle (durée : 50 minutes). J0+6 heures : Evaluation par Imagerie par Résonance Magnétique moléculaire (durée : 30 minutes). J+1, J+5 : Evaluation par Imagerie par Résonance Magnétique structurelle (durée : 10 minutes/session). J+1, J+7, J+15 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 5 minutes/session). J+15 : Exsanguination par perfusion intracardiaque (n=80).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient, selon leurs degrés de gravité du stress pour l’ensemble des procédures : Leger. Une perte de poids pour l’ensemble des procédures, une hypothermie lors des phases d’anesthésies : Modéré. Des douleurs post-opératoires, des déficits fonctionnels et /ou cognitifs dans le cadre de l’ischémie cérébrale : Sévère.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de la procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification protéiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, les approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’IRM sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'aisance des expérimentateurs (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. L’ensemble des échantillons collectés permettra également un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de papier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons une litière plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « syndrome du comportement malade ». Les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra d’identifier les animaux les plus « à risque ».
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de Sclérose en Plaques (SEP) et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires. Cette tranche d'âge correspondant à un stade de développement de "jeunes adultes" chez la souris, est cruciale pour assurer la comparabilité de nos résultats avec les données existantes au sein de notre laboratoire. En effet, nos modèles d'AVC ischémique ont été largement caractérisés et étudiés sur cette tranche d'âge spécifique. De plus, cette fenêtre développementale est fréquemment utilisée dans la littérature scientifique étudiant l'AVC et ses mécanismes physiopathologiques. L'utilisation d'animaux adultes de 6 à 12 semaines est justifiée par le fait qu'ils ont atteint une maturité physiologique et neurologique stable.
Immunisation des souris par des vaccins à ARNm pour l’évaluation de la protection face à un challenge infectieux et le développement d’anticorps monoclonaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Soumises à six injections sur animal vigile et à quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, dont des ponctions rétro-orbitaires, 111 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Toutes sont tuées, en fin de procédure, au moment d'atteindre les points limites, ou pour prélever les organes servant à l'étude des anticorps. Le projet vise à vérifier que certaines protéines protègent contre une bactérie résistante aux antibiotiques et à produire des anticorps utilisables en diagnostic ou en traitement. La nourriture leur est retirée pendant seize heures avant l'infection, qui peut provoquer diarrhée, perte de poids et septicémie sévère jusqu'à la mort, les souris atteignant les points limites étant mises à mort avant ce terme.
Objectifs
Ce projet a deux objectifs : 1) Vérifier si certaines protéines peuvent protéger des souris contre une infection. 2) Créer des anticorps pour voir s’ils peuvent servir à diagnostiquer ou à prévenir l’infection, surtout en cas de bactérie résistante aux antibiotiques.
Bénéfices attendus
Les anticorps et vaccins identifiés peuvent être utilisés comme outils de diagnostic ou comme traitements thérapeutiques potentiels contre l'infection causée par la bactérie d’intérêt.
Procédures
Les animaux subiront un maximum de 6 injections d'une durée inférieure à 1 minute (contention + piqûre), réalisées sur animaux vigiles. Un maximum de 4 prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale. Pour les prélèvements sanguins (subjugal ou rétro-orbitaires), l'anesthésie sera de courte durée (anesthésie + prélèvement sanguin, temps inférieur à 5 minutes).
Impact sur les animaux
L’injection des antigènes pourrait entraîner des effets indésirables tels qu’une inflammation locale au site d’injection lors de l’immunisation. Les animaux seront injectés et cela peut provoquer une douleur légère, et stress (moins d'une minute) pour les animaux. L'anesthésie sera de courte durée, elle peut provoquer un certain stress (moins de 5 minutes) et de l’hypothermie. Le jour -1 avant l'infection, le retrait complet de la nourriture des cages est effectué 16 heures avant l'infection (mais l'eau est conservée). Cela peut causer un certain stress aux animaux. En raison des injections, il est possible que les animaux ressentent une douleur due à l'inflammation causée par les immunisations. En raison de l'infection par la bactérie, les animaux peuvent développer une maladie caractérisée par une perte de poids corporel, des dysfonctionnements intestinaux (diarrhée) et une translocation bactérienne vers la circulation sanguine, pouvant conduire à une septicémie sévère pouvant possiblement entraîner la mort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort que ce soit à la fin de la procédure, ou ceux qui auront atteint les points limites lors des expériences de survie, ou ceux utilisés pour le prélèvement d'organes destinés à l’étude des anticorps.
Remplacement
Les protéines ciblées sont sélectionnées en amont par le biais d'outils bioinformatiques adaptés avant toute expérimentation chez l'animal. Cependant le recours à un modèle murin reste indispensable. L’utilisation de souris dans ce projet est essentielle car elles permettent de mieux comprendre comment le corps réagit à un vaccin avant de passer à des études chez l’humain. Les souris possèdent un système immunitaire suffisamment proche de celui de l’homme pour donner des indications fiables sur l’efficacité et la sécurité d’un vaccin. Elles sont également utilisées pour produire des anticorps, des molécules naturelles qui aident le corps à se défendre contre les infections, et qui peuvent ensuite être utilisées pour développer des traitements.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés grâce à des tests statistiques adaptés afin de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique des résultats. Pour cela, des méthodes statistiques rigoureuses ont été utilisées pour calculer le nombre minimal de souris nécessaire à l’obtention de données fiables. Cette approche permet de limiter l’utilisation d’animaux tout en maintenant la qualité scientifique et éthique de l’étude.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Le bien-être des animaux sera vérifié tout au long de la procédure expérimentale, avec une fréquence définie pour chaque étape de la procédure. Tous les prélèvements sanguins sont réalisés avec l'application d’un anesthésique local. La ponction sanguine est réalisée sous anesthésie générale et avec un analgésique. Une grille de points limites stricts et spécifiques au projet a été déterminée afin de pallier toute souffrance.
Choix des espèces
Afin de développer des thérapeutiques contre les maladies infectieuses chez l'Homme, les souris permettent d' évaluer la réponse immunitaire et le développement des anticorps. Les souris sont utilisées pour les valider et éventuellement ces anticorps peuvent être transposés à l'homme à des fins thérapeutiques et diagnostiques. Les souris auront au moins 7 semaines (âge adulte) afin que leur système immunitaire soit complètement fonctionnel. Cela assure l'homogénéité des sujets nécessaire a la reproductibilité intra et inter expérimentale des résultats attendus.
Rôle des incrétines dans la phase céphalique de libération de l’insuline au cours de l’obésité associée au diabète de type 2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. Une chirurgie de trente minutes leur implante une canule à demeure dans le bulbe olfactif, puis viennent les tests de tolérance au glucose et à l'insuline de deux heures, avec sept mesures de glycémie par ponction de la queue, un gavage et des injections intrapéritonéales. Une partie des souris est rendue obèse et diabétique par un régime hypercalorique, avec hyperglycémie chronique et résistance à l'insuline. Après la chirurgie, elles vivent seules pendant environ trois mois pour protéger les canules, un isolement dont le porteur reconnaît lui-même qu'il constitue "un stress en soi".
Objectifs
La phase céphalique précéde et prépare l'organisme à la régulation métabolique nécessaire pendant le repas: elle est donc très importante à étudier dans le cadre des pathologies métaboliques. Ce projet a pour objectif d'étudier les effets d'une molécule exprimée dans le bulbe olfactif, le Glucagon Like-Protein 1 (GLP-1), sur la phase céphalique de libération d'insuline chez des souris obèses comparées à des souris normopondérées.
Bénéfices attendus
Les statistiques mondiales et françaises sur la progression de l'obésité et du diabète de type 2 sont très alarmantes. La pandémie touche 1 milliard d'humains obèses en 2025. Dans ce contexte, des nouvelles voies de thérapie sont à explorer. L'Ozempic(R) et le Wegovy(R) sont des médicaments analogues du GLP-1 communément utilisés dans ces pathologies métaboliques mais leurs actions cérébrales sont méconnues. Notre étude permettra de mieux comprendre les effets centraux de ces molécules pharmacologiques et de mieux décrire l'axe de régulation métabolique entre le système olfactif et le pancréas pendant la phase céphalique de libération d'insuline précédant la prise alimentaire chez la souris, une phase qui existe également chez l'humain.
Procédures
>Chirurgie. Les souris auront une chirurgie d'environ 30 minutes pour installer une canule dans leur bulbe olfactif, permettant d’y injecter les protéines nécessaires à l'étude. >Suivi métabolique. Pour suivre l'utilisation de glucose, un test de tolérance au glucose sera effectué : la glycémie sera mesurée à plusieurs temps (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) en déposant une goutte de sang sur un glucomètre, un appareil similaire à ceux pour humains. De faibles volumes de sang seront également prélevés aux temps 0, 15 et 90 minutes pour mesurer l’insuline, l’hormone de régulation du glucose. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline durent chacun deux heures. >Hébergement individuel. Pour procéder aux injections intracérébrales, une canule sera installée à demeure dans le bulbe olfactif des souris. Après chirurgie, pour éviter toute lésion qui adiendrait dans les interactions en hébergement collectif, il sera procédé à un hébérgement individuel des souris. Cet hébérgement durera environ 3 mois, un temps nécessaire pour effectuer l'ensemble des tests métaboliques.
Impact sur les animaux
>Les souris qui seront sous régime hypercalorique connaitront une augmentation significative de leur poids avec l'installation d'une obésité mais également une hyperglycémie chronique et une résistance à l'insuline qui reproduisent le diabète de type 2. >Les animaux qui subiront une injection intranasale peuvent avoir une gêne respiratoire par l'irritation passagère due au liquide placé dans les fosses nasales. >Les animaux qui subiront une chirugie stérotaxique sous anesthésie pourraient ressentir une douleur modérée à leur réveil. >Après la chirurgie, les animaux seront hébérgés individuellement afin d'éviter que les canules de perfusion ne soient endommagées dans leurs interactions sociales et ne les blessent. Cet hébérgement individuel est un stress en soi. >Concernant les tests de tolérance au glucose (OGTT) et à l'insuline (ITT), des nuisances légères pourraient survenir pendant le gavage (OGTT), l'injection intrapéritonéale (ITT) et les prélèvements de sang par ponction à la queue de l'animal (légère douleur, OGTT). Un faible risque d'hypoglycémie suite à l'administration d'insuline est possible dans l'ITT.
Devenir
Toutes les souris de ce projet (512 au total) seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin d'effectuer un prélévement de leur cerveau.
Remplacement
Le but de ce projet pilote est de pouvoir injecter et faire pénétrer une molécule pharmacologique dans le cerveau par voie intranasale afin d'obtenir une voie d'accès non-invasive pour moduler positivement le métabolisme énergétique des souris obèses. Le projet nécessite donc un animal vivant et de procéder à des injections in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiables et robustes, évitant ainsi de réitérer les expériences et en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible. Nous prendrons soin d'utiliser les mêmes souris pour effectuer des injections croisées entre saline et molécule pharmacologique dans les procédures avec injection intracérébrale d'agents pharmacologiques. Ainsi les souris seront leur propre témoin, ce qui permettra de réduire le nombre de souris.
Raffinement
>Toutes les souris seront acclimatées à l'animalerie en cage collectif pendant au moins une semaine avant de procéder aux expériences. Elles seront hébergées dans des cages avec enrichissement sensoriel (nid, bois à ronger, tunnel). Les animaux seront regulièrement examinés (poids, apparence, comportement). Les souris seront habituées à la contention avant les procédures expérimentales. >Pour éviter tout problème respiratoire pendant l'injection intra-nasale chez la souris, il sera procédé à une injection par narine à la fois avec un temps de pause de 3 minutes entre chaque injection pour laisser le temps à la souris de récupérer de la première contention et également d'observer son comportement. >Pour les tests métaboliques, nous avons prévu les prélèvements de sang en calculant au plus près des volumes nécessaires aux mesures du glucose et de l'insuline, ce qui réduira l'impact sur le bien-être animal. > Les animaux seront hébérgés individuellemment après chirurgie dans des cages standards avec des milieux enrichis (nids végétaux, bois à grignoter) ce qui permettra d'éviter toute blessure qui pourrait intervenir en hébergement collectif. Ils seront également observés quotidiennement afin d'identifier les animaux en souffrance et éventuellement d'euthanasier les animaux dont les points-limites auraient été atteints. Une légère perte de poids peut-être observée après les premiers jours suivants la chirurgie, et un complément alimentaire de type gel enrichi en calorie pourra être proposé aux animaux pour leur permettre une meilleure récupération. >A tout moment, si un point limite est atteint l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance. >Enfin, pour procéder à la perfusion intracardiaque avec une respiration et des battements cardiaques à l'arrêt, une mise à mort sera réalisée par injection intrapéritonéale d'une dose d'anesthésiant à dose élevée, précédée 15 minutes avant d'une injection intrapéritonéale d'un sédatif.
Choix des espèces
Les souris sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre, et représente un modèle d'étude adéquat. De plus, nous avons l'expertise depuis plusieurs années du suivi du bien-être et du phénotypage métabolique des souris. Les expériences seront effectuées sur des souris agées de 8 semaines et au-delà, ce qui permet de travailler sur des animaux adultes, lorsque que toutes les structures cérébrales sont stabilisées dans leur développement.
Influence de la stimulation vagale sur la Restauration Cognitivo-motrice et la Modulation Inflammatoire Post-Traumatisme Crânien.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
95 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un poids est lâché sur leur crâne pour reproduire un traumatisme crânien, avec des fractures et des apnées attendues dont certaines peuvent se compliquer d'un arrêt cardiaque, puis une électrode est posée autour du nerf vague dans le cou et retirée après une séance de stimulation vraie ou simulée. Vingt souris servent uniquement à ce que les expérimentateurs s'entraînent aux deux gestes, et l'effectif intègre une mortalité anticipée de 20 %. Le porteur espère que la stimulation réduira l'étendue de la lésion et conclut que ces informations sont "impossibles à générer autrement qu'avec l'utilisation d'animaux".
Objectifs
Chaque année, les traumatismes crâniens touchent environ 55 millions de personnes dans le monde. Ils sont principalement causés par les accidents de la route et les chutes. Un grand nombre de ces patients conservent des séquelles durables, affectant leurs fonctions motrices, cognitives, comportementales ou psychologiques. Ces troubles entraînent une altération significative de leur qualité de vie. À ce jour, les solutions thérapeutiques disponibles – qu’elles soient médicales, chirurgicales ou issues de la rééducation – ne permettent pas de prévenir efficacement la mort neuronale, à l’origine de ces déficits. Il est donc essentiel d’explorer de nouvelles approches. L’une des pistes actuellement étudiées par notre laboratoire repose sur la stimulation du nerf vague. Ce nerf, situé au niveau du cou, est capable de transmettre des signaux au cerveau. Lorsqu’il est stimulé par des impulsions électriques délivrées par une électrode, ces signaux peuvent modifier l’activité de certaines régions cérébrales, notamment celles impliquées dans le contrôle du mouvement. Cette technique est déjà utilisée en pratique clinique pour traiter des pathologies telles que l’épilepsie, la dépression ou les migraines, tant chez l’animal que chez l’humain. Elle pourrait également représenter une solution prometteuse pour les traumatismes crâniens puisqu’elle permettrait d’amplifier la récupération motrice des rongeurs et de l’Homme après un accident vasculaire cérébral. Certaines études de traumatismes crâniens chez les rongeurs vont également dans ce sens à la fois pour les capacités motrices et cognitives lorsque la stimulation est réalisée plus tardivement. De surcroît, plusieurs études rapportent que cette stimulation diminuerait l’inflammation du cerveau, qui est l’une des causes de l’aggravation des lésions tant sur les modèles d’accident vasculaire cérébral que de traumatisme crânien. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de la stimulation du nerf vague dans les suites précoces d’un traumatisme crânien chez la souris. L’étude portera à la fois sur la réponse inflammatoire du cerveau après le traumatisme, et la récupération des fonctions motrices, cognitives et psychiques. En favorisant une récupération plus complète via la stimulation du nerf vague, cette approche innovante contribuerait à améliorer leur qualité de vie et à réduire les séquelles à long terme.
Bénéfices attendus
D’après nos hypothèses, nous prévoyons qu’une séance de stimulation dans les heures qui suivent le traumatisme crânien, devrait réduire l’étendue et la sévérité de la lésion en modulant la réponse des acteurs de l’inflammation ce qui contribuerait à restaurer un environnement favorable au bon fonctionnement des neurones. Nous espérons que cette intervention se traduira, à terme, par une amélioration des capacités motrices, cognitives et comportementales. Le parallèle entre les mécanismes impliqués dans le traumatisme crânien et ceux observés lors d’un accident vasculaire cérébral renforce la crédibilité de cette approche. En effet, les bénéfices observés dans les modèles expérimentaux d’accident vasculaire cérébral sont encourageants et confortent notre démarche. Ce projet ouvre ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des patients touchés par un traumatisme crânien, offrant un espoir d'une récupération optimale.
Procédures
Dans cette étude, les souris subiront deux interventions chirurgicales : la première consiste à reproduire un traumatisme crânien, et la seconde à placer une électrode autour d’un nerf situé dans le cou, appelé nerf vague. Cette électrode permet d’envoyer, ou non, de légères stimulations électriques selon les groupes. Elle sera retirée à la fin de la chirurgie, après la séance de vraie ou de fausse stimulation. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale, et les animaux recevront des médicaments contre la douleur avant et après l’intervention. Un suivi attentif sera mis en place pour surveiller leur état de santé et repérer tout signe de souffrance. Certaines souris ne subiront pas de traumatisme crânien mais auront par les mêmes étapes de chirurgie à l’exception de la chute du poids. De même, certaines souris ne recevront pas de stimulation électrique malgré la pose de l’électrode mais suivront les mêmes étapes chirurgicales que celles stimulées. Au total, 95 souris seront impliquées dans le projet : – 10 seront utilisées pour s’entraîner à la procédure du traumatisme crânien – 10 pour s’entraîner à la pose de l’électrode – 25 auront uniquement une incision sans traumatisme crânien – 50 auront un traumatisme crânien – 25 recevront la stimulation du nerf vague après implantation – 50 auront l’implantation de l’électrode sans stimulation Pour mesurer les effets des interventions, des tests du comportement seront réalisés. Ces tests évaluent les mouvements, les réflexes et les capacités de mémoire des souris. Deux outils seront principalement utilisés : – un test neurologique permettant d’évaluer les séquelles motrices, cognitives et les réflexes sur 85 souris, réalisé entre 4 à 8 fois selon les groupes ; – un test de reconnaissance d’objets, permettant d’évaluer la mémoire spatiale sur 51 souris, réalisé deux fois avant le traumatisme, puis quatre fois après. À la fin du protocole, les animaux seront profondément anesthésiés en ayant préalablement reçus une dose d’anti-douleur, puis mis à mort pour permettre des prélèvements du cerveau destinés à l’analyse des tissus cérébraux.
Impact sur les animaux
Lors de la chirurgie du traumatisme crânien et dans les minutes suivant celui-ci, des fractures du crâne, des apnées inférieures à 5 secondes, dont certaines peuvent se compliquer d’un arrêt cardiaque, peuvent être attendus.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort afin d’étudier leur cerveau et de comparer entre elles les différences de taille de lésion, de réponse des acteurs de l’inflammation, et de la survie des neurones.
Remplacement
Cette étude ne peut être réalisée chez l'être humain car cela nécessiterait une analyse post-mortem immédiate du cerveau. Les mécanismes pathologiques consécutifs au traumatisme crânien et les séquelles motrices et cognitives post-traumatiques sont trop complexes pour être étudiés in vitro (système cellulaire ou tranche de cerveau) ou in silico (modélisation par un programme informatique). Les informations qui seront recueillies dans cette étude sont donc impossibles à générer autrement qu’avec l’utilisation d’animaux.
Réduction
Ce projet est conçu de manière à n’utiliser que le nombre strictement nécessaire d’animaux, tout en garantissant la fiabilité des résultats. En effet, il est bien établi dans la littérature scientifique que les comportements et les réactions inflammatoires du cerveau peuvent varier fortement d’un individu à l’autre après une lésion cérébrale, en particulier dans le cas du traumatisme crânien. Cette variabilité naturelle impose d’inclure un nombre minimal d’animaux pour pouvoir détecter des différences significatives entre les groupes étudiés. Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé par des test statistiques adaptés en tenant compte de la fiabilité des tests comportementaux utilisés, de notre expérience acquise dans des études précédentes, et des recommandations présentes dans la littérature scientifique actuelle. Ainsi, l’effectif théorique de 8 souris dans chacun des 3 groupes pour la partie 1 et l’effectif de 17 souris par groupe (3 groupes) dans la seconde partie permettra de mettre en évidence des différences en prenant en compte une mortalité maximale de 20%. Ce modèle de traumatisme crânien a été choisi en raison d’un taux de mortalité réduit en comparaison aux autres modèles avec des lésions cérébrales identiques permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés et la souffrance en permettant une récupération fonctionnelle rapide. De plus, nous anticipons les éventuelles complications post-opératoires afin de garantir les meilleures conditions de récupération pour les animaux, permettant ainsi de réduire les pertes animales, de favoriser une récupération rapide, et donc de limiter au maximum le nombre d’animaux nécessaires, tout en veillant à leur bien-être.
Raffinement
Avant l’entrée dans l’étude, afin de diminuer le stress de l'animal, nous réaliserons du "Handling", c’est-à-dire une habituation au contact de la main de l’expérimentateur, ainsi qu’une habituation préalable aux tests comportementaux. La nourriture sera placée dans une mangeoire au sein même de la cage. Pour l'aider à s'abreuver, on placera une tétine plus longue, permettant à l'animal de boire correctement sans avoir à lever sa tête ou à s'appuyer sur ses pattes arrière. Les cages sont enrichies d’un tunnel afin de limiter l’ennui de l’animal et de favoriser son enrichissement cognitif. Pour éviter tout stress inutile, les cages seront placées dans une pièce calme et isolée du bruit extérieur. Le suivi des animaux sera effectué trois fois par jour en semaine, et une fois par jour les week-ends et jours fériés, tout au long du projet. Cette surveillance commencera avant l’opération et se poursuivra jusqu’à la fin de leur participation à l’étude. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et des médicaments contre la douleur seront également administrés avant et après l’opération afin que les animaux ne ressentent aucune douleur pendant et après l’intervention. L’état de chaque animal sera contrôlé régulièrement, toutes les six heures après la chirurgie, grâce à une échelle spécifique appelée Mouse Grimace Scale, qui permet de détecter la douleur chez la souris de façon fiable. Seules des personnes spécialement formées et expérimentées seront autorisées à pratiquer les opérations et à surveiller le bien-être des animaux. Le bien-être des animaux est au cœur de nos préoccupations, et toute douleur ou signe de souffrance fera l’objet d’une prise en charge immédiate. Depuis leur arrivée jusqu’à la fin de leur prise en charge, tout sera mis en œuvre pour respecter les principes éthiques et garantir aux animaux des conditions de vie adaptées et aussi confortables que possible.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est un mammifère non primate proche génétiquement de l’Homme : son degré́ d’homologie avec l’Homme est donc très élevé́. De fait, la souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser des lésions cérébrales acquises et le niveau de compréhension du fonctionnement de leur organisme et de leur cerveau est très avancé. L’anatomie du système nerveux et son fonctionnement proche de celui de l’Homme en font un très bon modèle pour le traumatisme crânien. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammifère (autres groupes de vertébrés ou invertébrés) ne permettrait pas d’obtenir des résultats aussi pertinents. Les animaux seront âgés de 16 à 24 semaines en début du protocole, ce qui correspond à la maturité́ cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des souris adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité́ des données déjà̀ disponibles dans la littérature scientifique sur les modèles de traumatisme crânien. Cet âge nous semble cohérent souhaitant être au plus proche des traumatismes crâniens par accident de la route chez l’Homme survenant majoritairement chez l’adulte de plus de 15 ans.