Procédures sévères

Quatre-vingt-quatre souris reçoivent un cathéter jugulaire reposé entre chaque séance, puis jusqu'à vingt perfusions d'une heure, éveillées, en quatre semaines. Sur 221 souris au total, toutes tuées à l'issue, 48 subissent en plus une implantation de cellules tumorales dans le cerveau, cinq injections de chimiothérapie par semaine pendant quatre semaines et trois séances d'irradiation, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur attend une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux développant un glioblastome. La rubrique consacrée aux objectifs ne décrit aucune question scientifique et se limite à indiquer que l'étude s'inscrit dans les thématiques de l'unité, qu'elle a été validée par son conseil scientifique et qu'elle fait l'objet d'une collaboration industrielle.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans les thématiques de recherche de l’unité. Il a été validé par le Conseil Scientifique de l’unité et fait l’objet d’une collaboration industrielle ayant elle-même validé l’importance scientifique de l’étude.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une amélioration de l’efficacité des stratégies thérapeutiques actuelles pour les tumeurs cérébrales (Glioblastome et Métastases cérébrales) (Radiothérapie+Chimiothérapie). En effet, dans les premiers temps (à court terme) nous évaluerons un débit d’administration optimal et nous nous assurerons que l’administration répétée de la molécule n’engendre pas de conséquences néfastes à l’animal. Puis à long terme nous évaluerons les effets de cette molécule en présence de radiochimiothérapie sur la croissance tumorale dans des modèles de glioblastome murins et métastases cérébrales.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : -Pose de cathéter jugulaire : 20 minutes par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 84 animaux sont concernés. -Injection lente (animal vigile): 60 minutes par animal, réalisées au maximum 20 fois sur un animal pendant une période de 4 semaines, 84 animaux sont concernés. -Prélèvements sanguins : 2 minutes par animal, réalisées au maximum 3 fois sur un animal , 12 animaux sont concernés. -Chirurgie (implantation cérébrale de cellules tumorales sous anesthésie générale) : 30 minutes maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, 48 animaux sont concernés. -Injection de la chimiothérapie (animal vigile) : 5 fois sur 5 jours consécutifs pendant maximum 4 semaines ; 5 minutes maximum par animal, 48 animaux sont concernés. -Irradiation (sous anesthésie générale) : 3 séances de 4 Gy sur 3 jours consécutifs : 10 minutes maximum par animal, 48 animaux sont concernés. -Injection pour les 60 animaux de la procédure métastase cérébrale. -Injection d'analgésique (animal vigile) : 1 fois avant la mise à mort pour tous les animaux ; 2 minutes maximum par animal, tous les animaux sont concernés. -Imagerie IRM pour suivi de croissance tumorale

Impact sur les animaux

Suivant l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à avoir une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les animaux qui auront un développement de glioblastomes ; ces effets indésirables surviennent en fin de protocole et grâce au respect des points limites, leur durée est de maximum 24h. La nuisance est considérée comme sévère. Les séances fractionnées de radiothérapie et les séances d’imagerie (IRM) n’induisent pas en elles-mêmes de douleurs, de perte de poids ou de comportement anormal, un autre point limite est ainsi défini par une diminution de la fréquence respiratoire en dessous de 30 respirations / min lors de l’irradiation. S’il est atteint, le pourcentage d’isoflurane sera légèrement diminué et si la fréquence n’augmente pas à nouveau, la procédure sera arrêtée. Cette fréquence est mesurée en continu par un ballonnet abdominal, ce qui nous permet d’être très réactif. Ces nuisances sont très courtes de moins d’une minute. La nuisance est considérée comme légère. Comme l’infusion de la molécule est prévue quotidiennement (5/7 j), le cathéter jugulaire sera replacé entre chaque session d’infusion. Cela occasionnera probablement une gêne pour l’animal sans toutefois lui induire une souffrance.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer différents organes pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs sont connues pour être multi-compartimentales, c'est-à-dire qu’au-delà du simple compartiment de la cellule tumorale existent la vascularisation, l’hypoxie et l’inflammation qui influent fortement sur la croissance tumorale. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux différents traitements. Ce projet intervient après plusieurs étapes de validation in vitro ayant permis de retenir la meilleure conformation de la molécule mais ne peut pas s’effectuer intégralement sur des modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’imagerie non invasive se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun des temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Concernant les troisième et quatrième procédures et afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques, nous estimons qu’au minimum, 12 animaux par groupe de traitement pour le Glioblastome et 15 animaux par groupe pour les métastases au départ sont nécessaires afin de réaliser des tests statistiques , et ainsi comparer les effets des différents traitements et ce, en fonction du temps. Ces 12 et 15 animaux sont calculés sur la base d’un test de puissance connaissant la variabilité intrinsèque des modèles tumoraux basés sur nos travaux antérieurs et en espérant une valeur statistique. Il est important de noter ici que le nombre d’animaux calculé est un nombre maximal. Grâce notamment aux études en imageries qui sont quantitatives, nous réaliserons des analyses séquentielles. Ainsi, les expériences seront réalisées par plusieurs lots et si les seuils statistiques sont atteints alors le protocole sera stoppé.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux (4 souris par cage) dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation (au minimum 7jours) avant toute expérimentation et bénéficieront également d’enrichissement (roue d’activité, stimulation sensorielle). Les animaux seront surveillés de leur arrivée à la fin du protocole par un personnel compétent afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant les phases critiques (implantation, irradiation) et 3 fois par semaine par la suite. Pour remédier à la perte de poids, les souris disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de la cage ainsi que du complément alimentaire. Le poids de chaque animal sera mesuré avant, pendant et après les procédures d’implantation tumorale et d’injection du traitement. Si une perte de poids supérieure à 15% est observée, la procédure sera arrêtée. La procédure chirurgicale pour l’établissement du modèle de tumeur cérébrale et/ou l’injection du traitement peuvent induire des douleurs. Pour limiter ces douleurs, les souris reçoivent une injection d'analgésique 20min avant la chirurgie et les anesthésies locales sont réalisées par application d'un gel Les souris sont ensuite anesthésiées pendant la chirurgie. Les animaux sont surveillés jusqu’à leur réveil et ensuite replacés dans leur cage et rentrés à l’animalerie tous les soirs. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement et grâce à l’échelle d’évaluation « Grimace scale », nous pouvons évaluer efficacement les éventuelles douleurs de l’animal. Dès qu’une observation de l’expression faciale de l’animal atteint un seuil critique sans que pour autant les points limites entrainant la mise à mort ne soient atteints, une couverture analgésique sera mise en place par une injection quotidienne d'analgésique. Les infusions de la molécule ayant lieu quotidiennement (5/7j), cela minimise fortement le risque de bouchage du cathéter jugulaire. Si cela arrive, un flux d’héparine sera réalisé pour le déboucher.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur les cellules tumorales tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral qui peuvent modifier l’effet thérapeutique du traitement. Nous utiliserons donc des souris immunocompétentes C57Bl/6 car ces souris présentent la composante inflammatoire et notamment macrophagique. Le modèle de tumeur cérébrale utilisé repose sur l’implantation de cellules de gliome GL261, cellules issues de souris C57Bl/6 qui permet alors d’éviter toute inflammation aberrante due au rejet de « greffe » par la souris souche utilisée. Ce projet consiste en une évaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle animal de glioblastome. Le choix de la souris est alors idéal pour obtenir des résultats fiables et reproductibles, permettant de réduire à un minimum le nombre d’animaux utilisés. De plus, ces modèles sont déjà maîtrisés dans notre laboratoire. Concernant le modèle de métastases cérébrales, ce dernier est réalisé sur souris Nude (immunodéficiente) car ce sont des cellules humaines qui sont injectées. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes, âgés de 8 à 12 semaines en début de protocole. Cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. De plus, à ce stade, le cerveau est mature et il est possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps longs. Cet âge leur confère également une résistance aux protocoles expérimentaux utilisés.

Le sang injecté dans le cerveau vient d'autres rats, rendus diabétiques par une injection unique puis saignés au bout de quatorze jours. 130 rats au total vont être utilisés, tous tués à l'issue, 120 d'entre eux dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. La chirurgie cérébrale dure trente minutes et dépose ce sang dans le striatum pour reproduire une hémorragie, avec des troubles locomoteurs et une perte de poids attendus au réveil. Le bénéfice avancé reste à deux conditionnels de distance, comprendre pourquoi les séquelles sont plus lourdes chez les personnes diabétiques, ce qui "pourrait donc à termes permettre de proposer des cibles thérapeutiques".

Objectifs

Les objectifs du projet sont de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques qui pourraient expliquer pourquoi les personnes diabétiques ont des AVC hémorragiques plus sévères (atteintes neurologiques plus importantes et mortalité plus importante). Notre hypothèse est que le sang glyqué ("sucré/diabétique") et notamment les globules rouges "diabétiques" pourraient être responsables d'un œdème, d'une réaction inflammatoire et d'un stress oxydant exacerbés entrainant par conséquent des séquelles cérébrales plus importantes. Dans ce contexte, nous voulons injecter du sang "sain" et du sang "diabétique" dans le cerveau de rat afin d'étudier différents aspects physiopathologiques: œdème, inflammation, stress oxydant, réactivité et mort de différents types cellulaires

Bénéfices attendus

La meilleure compréhension de l'impact de l'épanchement de sang "diabétique" dans le cerveau (hémorragie) et de ses conséquences pourrait permettre d'identifier la raison de l'aggravation des séquelles neurologiques et de la mortalité chez les personnes diabétiques. Cela pourrait donc à termes permettre de proposer des cibles thérapeutiques pour améliorer le pronostic des personnes diabétiques à la suite d'un AVC hémorragique et ainsi limiter leurs séquelles et la surmortalité

Procédures

Pour la Procédure 1 (induction Diabète de type 1) : une injection unique d'une drogue ou de tampon salin en intra-péritonéal et mesure de la glycémie à J+2 puis J+7 pour vérification de la glycémie. Le sang sera récupéré à 14 jours post-induction du diabète. Pour la Procédure 2 (Mimer un AVC hémorragique) : Chirurgie cérébrale sous anesthésie chimique (30 min) pour mimer un AVC hémorragique.

Impact sur les animaux

Les nuisances prévues pour les animaux de la procédure 1 impliquant la mise en place d'un diabète sont une polyurie et polydypsie caractéristiques du diabète. On peut envisager une perte de poids mais qui devraient rester limitée vue la durée de maintien de la pathologie (14 jours). Pour les animaux subissant l'injection de sang au niveau du striatum cérébral (Procédure 2), des troubles locomoteurs initiaux ainsi qu'une perte de poids initial sont prévus (difficulté à s'alimenter). Les animaux récupèrent assez vite et donc cette perte de poids est temporaire. L'infection est un risque faible. Egalement, une faiblesse et/ou douleur liée aux différents prélèvements et actes chirurgicaux peuvents survenir. Des douleurs post-opératoires représentent également une nuisance.

Devenir

A l'issue de chaque procédure l'ensemble des animaux sera euthanasié pour analyse.

Remplacement

La complexité des processus physiologiques se déroulant lors d’une hémorragie cérébrale ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Ils impliquent un oedème, la migration et la prolifération des cellules cérébrales, ainsi que l'interaction entre plusieurs types cellulaire. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors d’un dommage cérébral comme un AVC hémorragique (hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux). A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation. C'est pourquoi le modèle in vivo est pertinent et ne peut être remplacé.

Réduction

Une partie des expérimentations sera réalisée de façon séquentielle sur 2 groupes (2 x 5 animaux par groupe). Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. D'après notre expérience et connaissance des analyses effectuées via des expérimentations similaires, le nombre de 10 animaux par groupe permet de pallier à l'hétérogénéité de réponses des animaux, et les tests statistiques réalisés seront suffisamment puissants.

Raffinement

Les animaux seront placés dans des conditions optimales selon les réglementations en vigueur. L’atmosphère sera contrôlée en température et humidité. Ils auront à disposition nourriture et boisson. Une anesthésie générale est prévue avant toute manipulation invasive. Dans un souci de réduction de la douleur, toutes les mesures seront prises pendant les expérimentations (anesthésie, analgésie). Un enrichissement adapté à ce type d'expérimentations sera mis en place. Des points limites adaptés et des critères d’arrêt sont prévus.

Choix des espèces

Les rats sont des mammifères dont la neuroanatomie est proche de celle de l'humain. Ce sont des animaux permettant de mimer la pathologie de l'AVC hémorragique et de mieux la comprendre. Des rats de 12 semaines seront utilisés car ils correspondent à des stades de développement bien caractérisés quant aux processus neurologiques mis en place lors de l'AVC hémorragique.

980 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, 70 d'entre eux étant gardés vivants pour être réutilisés dans d'autres expériences et tous les autres tués pour prélever leurs organes. Les expérimentateurs leur inoculent un pneumocoque, parfois associé à un virus grippal, pour déclencher un sepsis pulmonaire. S'ensuivent jusqu'à deux injections par jour pendant 72 heures et des prises de sang allant jusqu'à 7,5 % du volume sanguin, 64 animaux subissant en plus une chirurgie sous anesthésie générale. Les atteintes attendues tiennent en trois lignes, isolement, démarche affaiblie, écoulements, perte de poids et chute de température corporelle, quand le bénéfice espéré tient dans une phrase au conditionnel sur un traitement qui "pourrait avoir un impact significatif".

Objectifs

Le sepsis est une maladie grave, causée par une réponse incontrôlée du système immunitaire à une infection. Elle fait 11 millions de victimes par an dans le monde, en particulier chez les jeunes enfants et les personnes âgées, dont le système immunitaire est plus fragile. Aujourd’hui, les traitements actuels visent à réduire l’inflammation et combattre l’infection. En collaboration avec une autre équipe de recherche, nous avons testé une nouvelle molécule prometteuse. Cette molécule réduit l’activation des macrophages, un type de cellule immunitaire, et améliore la survie de souris atteintes de sepsis. Cependant, les modèles précliniques utilisés ont leurs limites, en manquant de représentativité avec le sepsis humain, ou en étant invasif et difficiles à reproduire. Bien que cette molécule semble efficace, nous avons encore beaucoup à apprendre sur son fonctionnement global. Nous pensons qu’elle influence plusieurs aspects du système immunitaire et qu’il est essentiel de confirmer son efficacité dans un modèle plus proche du sepsis humain. Objectifs de l’étude: 1. Développer un modèle de sepsis pulmonaire: Comme la majorité des cas de sepsis pulmonaires sont causés par une bactérie (Streptococcus pneumoniae), souvent associée à des infections virales comme la grippe, nous infecterons des rongeurs avec ces agents. Cela nous permettra de vérifier si ces modèles reproduisent les symptômes des patients humains atteints de sepsis. 2. Tester la molécule dans ces conditions : Nous administrerons différentes doses pour identifier la dose optimale et étudier comment elle se distribue dans le corps par des techniques d’imagerie. Nous analyserons aussi la réponse immunitaire, notamment l’activité des cellules et des molécules responsables de l’inflammation. 3. Explorer en combinaison avec des corticoïdes : Les corticoïdes, souvent utilisés pour réduire l’inflammation, peuvent avoir des effets secondaires importants. En combinant ces deux traitements, nous espérons réduire ces inconvénients tout en améliorant l’efficacité du traitement. Nous mesurerons les mêmes paramètres pour évaluer les bénéfices de cette combinaison. En conclusion, cette recherche nous permettra de mieux comprendre les effets de la nouvelle molécule dans un modèle plus proche du sepsis humain. Ces avancées ouvriront potentiellement la voie à des essais cliniques et, à terme, à une utilisation thérapeutique, seule ou associée à d’autres traitements comme les corticoïdes.

Bénéfices attendus

Le sepsis provoque la majorité des admissions dans les unités de soins intensifs. Il se manifeste par une réponse inflammatoire généralisée due à une infection incontrôlée. Malgré les avancées médicales et l’application des directives internationales, les traitements actuels restent principalement symptomatiques, sans solution curative véritable. Dans le cadre de notre projet, nous souhaitons évaluer l’efficacité d’un traitement curatif prometteur nouvellement synthétisé. Si nos résultats sont concluants, ce traitement pourrait avoir un impact significatif non seulement sur la santé humaine et vétérinaire.

Procédures

La plupart des animaux (plus de 90 %) seront soumis à des injections et des prélèvements de sang pratiqués sous anesthésie générale. Un animal subira un maximum de 2 injections par jours sur une durée de 72h, et les prélèvements ne dépasseront pas 7,5 % du volume sanguin de l’animal. Nous estimons à 64 le nombre d’animaux qui subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Celle-ci sera précédée d’une injection d’anti- douleur, et suivie par une ou plusieurs injections de traitement. Les animaux pourront subir également des prélèvements de sang dans les 72h qui suivent la chirurgie, dans la limite de 7,5 % du volume sanguin de l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés pour reproduire le sepsis présentent des changements de comportement. Ils ont tendance à s’isoler, montrent une faiblesse physique qui affecte leur démarche, et peuvent avoir des écoulements, comme un nez qui coule. On observe également une perte de poids et une baisse de leur température corporelle.

Devenir

La majorité des animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de collecter les échantillons et mesurer les changements aux niveaux tissulaires, cellulaires ou moléculaires. Certains animaux pourront être gardés en vie, s’ils ont subi une procédure modérée ou légère et ne démontrent pas de signes pathologiques. Ils seront alors réutilisés.

Remplacement

Dans cette étude, l’utilisation d’animaux est nécessaire en raison de la complexité du sepsis, qui affecte plusieurs organes en même temps. Pour bien comprendre cette maladie, il est indispensable d’étudier ses effets sur un organisme entier. Par ailleurs, les résultats obtenus chez les rongeurs, lorsqu’ils sont cohérents entre différents modèles, reflètent généralement bien ce qui se passe chez l’Homme. Dans le cas où notre projet révèle certains mécanismes qui peuvent être étudiés sur cellules, nous remplacerons l’utilisation de modèles animaux par les cultures cellulaires.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, nous nous sommes basés sur les travaux précédents menés dans notre laboratoire, ainsi que sur une analyse approfondie de la littérature scientifique sur cette maladie. Nous avons aussi optimisé les prélèvements sanguins et les échantillons de tissus (cœur, foie, reins, poumons, glandes surrénales, muscles, moelle épinière, et omentum) prélevés après l’euthanasie de chaque animal. De plus, nous avons effectué un test statistique appelé "test de supériorité" (avec une puissance de 90 % et un seuil d’erreur de 5 %) pour déterminer précisément le nombre d’animaux nécessaires par groupe. Enfin, les variations des données collectées seront analysées à l’aide d’une méthode statistique spécifique (analyse de variance à deux facteurs) pour évaluer les effets du modèle et du traitement.

Raffinement

Une attention particulière sera portée au bien-être des animaux tout au long de l’étude. Nous surveillerons régulièrement les rongeurs pour détecter toute douleur excessive, car cela pourrait fausser nos résultats. Pour évaluer leur bien-être, nous utiliserons cinq critères standardisés, chacun noté sur 4 points, permettant d’obtenir un score global sur 20 : • L’état physique, le comportement, et les sécrétions seront vérifiés visuellement. • Le poids sera suivi à l’aide d’une balance. • La température corporelle sera mesurée avec un thermomètre rectal adapté aux rongeurs. Les rongeurs seront placés dans des armoires ventilées, où la température et la pression seront contrôlées. Ils auront un accès permanent à l’eau, à la nourriture, ainsi qu’à du papier et du coton pour construire leur nid. Nous ajouterons également des éléments d’enrichissement pour encourager le jeu et l’activité. Étant des animaux sociaux, aucun rongeur ne sera isolé dans sa cage, sauf en cas d’agressivité ou si des soins particuliers sont nécessaires.

Choix des espèces

Depuis 40 ans, plus de 10 000 études ont été publiées sur le sepsis en utilisant des rongeurs comme modèle animal. Leur utilisation nous permet de mieux situer nos résultats dans un contexte scientifique global. Ces modèles de rongeurs ont été largement étudiés, et l’on connaît bien leur cycle de vie ainsi que leurs éventuels impacts sur les expérimentations. Les rongeurs sont compatibles avec un large éventail de techniques pour analyser différents paramètres et mécanismes, y compris ceux que nous utiliserons dans cette étude. Une étude future pourrait se concentrer sur les mécanismes physiopathologiques liés à l’administration de la supformine. L’utilisation de souris est donc recommandée, notamment pour faciliter de futures comparaisons avec des souris transgéniques. Enfin, le rat présente l’avantage de fournir un volume de sang suffisant pour réaliser plusieurs analyses, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires tout en limitant les différences entre individus Les souris seront âgées de quelques jours à 24 mois. Cette grande amplitude permettra de moduler le système immunitaire dès le plus jeune âge et d’évaluer les effets de nos traitements sur des souris âgées plus représentatives des patients touchés par le sepsis. Les rats mâles auront un poids compris entre 200 et 400 g et agés de 5 à 10 semaines lors de leur utilisation soit l’âge de leur maturité sexuelle pour cette espèce. La grande majorité des animaux (80-90%) seront des souris. Les rats (10-20%) ne seront employés que pour les études nécessitant un grand volume de sang, et ce afin de réduire le nombre d'animaux employés.

Opérées du cerveau dans un premier établissement puis descendues par monte-charge du quatrième au premier étage vers un second pour les enregistrements, 360 souris vont être utilisées dans ce volet initial, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la moitié et sévère pour l'autre. La chirurgie dure une heure quinze à une heure trente, suivie de quatre tests moteurs de huit minutes et de trois jours d'apprentissage à quarante-cinq minutes par jour, la moitié des animaux recevant en plus une injection abdominale d'une molécule pharmacologique. Saignement intracérébral, douleurs aiguës après la pose des implants, infection, contention crânienne : le porteur liste les atteintes prévisibles sans les chiffrer. Le bénéfice annoncé tient à une meilleure compréhension de la connexion entre le noyau sous-thalamique et le cortex moteur, face à un déficit moteur induit avec perte de poids et comportements de rotation, avant la mise à mort des 360 souris pour analyse histologique.

Objectifs

La maladie de Parkinson est une maladie qui touche le cerveau et provoque des troubles du mouvement, comme des tremblements ou une raideur musculaire mais provoque aussi des troubles non-moteurs. Cette pathologie est caractérisée par la perte progressive de certains neurones dans une zone spécifique du cerveau appelée « substance noire », qui produisent une substance essentielle au bon fonctionnement du cerveau : la dopamine. Dans ce projet, nous nous intéressons à une autre région du cerveau très importante dans cette maladie : le noyau sous-thalamique. Ce noyau joue un rôle central dans la coordination des mouvements et pourrait être impliqué dans l’apparition des symptômes de la maladie de Parkinson. Cependantt, certaines connexions de ce noyau, notamment avec le cortex moteur (la zone qui contrôle les mouvements volontaires), sont encore mal connues. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre comment cette voie de communication fonctionne dans le contexte de la maladie de Parkinson. Pour cela, nous avons entrepris d’étudier l’activité des neurones du cortex moteur de souris atteintes de Parkinson, grâce à des techniques sophistiquées comme l’imagerie cérébrale en temps réel. Nous pourrons ainsi tester l’impact de la stimulation ou de l’inhibition de cette voie sur le fonctionnement du cerveau. Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de ces circuits cérébraux dans la maladie, et à long terme, il pourrait aider à concevoir de nouveaux traitements plus précis et plus efficaces pour les patients atteints de Parkinson. Ce projet se déroule dans 2 établissements Utilisateurs: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir notre compréhension de la connectivité entre le noyau sous-thalamique et le cortex moteur, ce qui va contribuer significativement aux connaissances sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson.

Procédures

Chirurgie : (se déroulera dans l'établissement Utilisateur: EU1). sous - anésthésie générale, les 360 animaux du projet recevront une chirurgie au niveau du cerveau, durée moyenne : 1h15 à 1h30. Le reste des interventions se dérouleront dans l'établissement Utilisateur: EU2 (même bâtiment). Comportement: -Tous les animaux (n=360) recevront le test de comportement moteur , durée : 8 minutes (4 fois soit 2x avant la chirurgie et 2 x après la chirurgie). -Tous les animaux (n=360) recevront l’apprentissage de la tâche motrice pendant 3 jours soit 45 min par jour. Puis 180 souris réaliseront cette tâche pendant la séance d'imagerie (d’enregistrement de l’activité) (1 fois) et 180 la réaliseront 2 fois. - 180 animaux vont recevoir une injection abdominale d’une molécule pharmacologique et une injection du serum physiologique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels chez les animaux sont principalement liés à l’induction du modèle de la maladie de Parkinson, qui entraîne un déficit moteur caractérisé par une réduction de l’activité locomotrice, une perte de poids et des comportements de rotation. D'autres effets indésirables prévisibles peuvent inclure : • un risque de saignement intracérébral, • des douleurs aiguës post-chirurgicales, notamment liées à la pose d’implants, • un risque d’infection associé à l’intervention chirurgicale et à la présence de matériel implanté, • un stress à court terme induit par l’utilisation de la contention crânienne, le stress physiologique associé à l’anesthésie générale •la douleur liée aux injections abdominales.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de l'expérimentation, soit 360 souris pour une analyse précise histologique afin de valider l'ensemble des résultats.

Remplacement

Le but du projet est de caractériser l’activité électrique des neurones pyramidaux du cortex moteur en lien avec le noyau sous-thalamique. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d'injections dans le cerveau, afin de faire exprimer des protéines capables de moduler l’activité du de ce noyau, combinées aux enregistrements de l’activité électrique in vivo chez l’animal réalisant une tâche comportementale. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, le recours au modèle animal reste la seule alternative pour la réalisation de cette étude. Le recours au modèle transgénique pour répondre aux questions scientifiques très spécifiques nous conforte dans cette décision. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions nécessaires pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

La réalisation de ce projet dans son ensemble concernera des souris mâles et femelles. Au-delà de l’intérêt de comparer les effets obtenus chez les 2 sexes, ceci permet d’inclure tous les animaux transgéniques des portées produites pour ce projet afin d’éviter que des animaux de l’autre sexe soient euthanasiés inutilement. La qualité de nos procédures qui est basée sur des années d'expériences, ce qui nous permettra de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. La réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique qui tient compte de l’hétérogénéité inter-individuelle. Le nombre de souris utilisé dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par groupe.

Raffinement

Tous les protocoles sont réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés tout au long de l’expérimentation en cage collective avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). L’utilisation d’anesthésique et d’analgésique est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie (2 fois par jour y compris le WE) jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place de mesures conservatoires si besoin. Des points limites suffisamment précoces sont définis. Les animaux seront ainsi suivis régulièrement pour détecter d’éventuels signes cliniques. En plus, des points limites spécifiques sont déterminés suite à la chirurgie et ce pendant 3 jours après la chirurgie et 15 jours pour les souris lésées, modèle expérimental de la maladie de Parkinson. Le transport des animaux entre les 2 établissements utilisateurs dure 3 min environ (du 4° au 1er étage), il se fait par le monte-charge. Les souris sont transportées dans des cages opaques dédiées au transport interne avec litière et papier. Les groupes sociaux sont respectés pendant le transport.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central (cerveau et moelle épinièredes vertébrés). En effet, c'est un mammifère présentant un lien de parenté proche avec l'espèce humaine et certains de ces comportements, notamment la motricité volontaire, peuvent être rapprochés de l'espèce humaine. Cette espèce est aussi un bon modèle de pathologiques neurologiques telle que la maladie de Parkinson qui peut être induite chez la souris à l'aide de neurotoxines, permettant d'inclure le plus faible nombre d'animaux possible dans les protocoles. Enfin, les lignées transgéniques pour cibler des populations neuronales de cette étude n’existent que chez la souris, d’où le choix de travailler avec cette espèce. Les modèles utilisés doivent être réalisés à l’âge adulte lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le cerveau et la moelle épinière sont matures. D’où le choix de souris adultes à partir de 8 semaines.

2 014 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 588 d'entre elles et sévère pour 1 426. Elles sont infectées par la bactérie de la tuberculose alors qu'elles sont éveillées, maintenues dans des tubes de contention pendant une nébulisation qui dure quarante à quarante-cinq minutes par groupe de vingt. Certaines reçoivent chaque jour pendant deux à trois semaines des molécules par gavage ou par voie intrapéritonéale, d'autres subissent une ouverture de la cage thoracique et restent jusqu'à cinq heures sous respiration artificielle, en hypothermie et déshydratation, sans être réveillées. Parmi les atteintes sévères, le porteur cite la perte de poids, la perte de pelage, l'isolement social et la difficulté à respirer, et conclut que le projet "nécessite" un "organisme entier" faute de culture cellulaire reproduisant ces interactions.

Objectifs

La tuberculose est l'une des maladies les plus meurtrières au monde, causant près de 1,5 millions de décès chaque année. Elle reste difficile à diagnostiquer et à suivre chez les patients, et il est encore compliqué de la prévenir par la vaccination ou de la traiter efficacement avec des médicaments. Même si l'on sait que le système immunitaire joue un rôle clé dans cette maladie, notre compréhension actuelle est encore limitée, ce qui complique les efforts pour améliorer le dépistage, le suivi et le traitement. Ce projet de recherche s'appuie sur des découvertes récentes qui montrent des différences dans les cellules immunitaires présentes dans les poumons de souris infectées par la tuberculose, selon qu'elles y sont plutôt sensibles ou plutôt résistantes. L'objectif est de tester de nouvelles approches, soit par des traitements qui renforcent le système immunitaire, soit par des vaccins, pour stimuler une réponse protectrice des cellules T (un type de cellules immunitaires) chez la souris. Plus précisément, le projet cherche à renforcer certaines cellules immunitaires, les cellules T « mémoires », qui pourraient jouer un rôle crucial dans la protection contre la tuberculose.

Bénéfices attendus

Il est attendu du projet un gain de connaissances fondamentales concernant le rôle de cellules T mémoires du système immunitaire dans le contrôle de l'infection. A partir de ces travaux, nous espérons des retombées indirectes comme par exemple le fait de pouvoir exploiter ces connaissances en proposant de possibles nouvelles approches préventives ou thérapeutiques, et ce, à partir de l'identification de stratégies vaccinales et/ou de l'utilisation de molécules pharmacologiques favorisant la résolution de l’infection en favorisant l’action des cellules T mémoires du système immunitaire. Ces démarches s'inscrivent dans la perspective de l'Organisation Mondiale de la Santé de mettre fin à la tuberculose.

Procédures

Dans ce projet, les souris seront infectées par la bactérie responsable de la tuberculose ; ceci se produit sur des animaux vigiles par l’utilisation d’aérosol et se déroule en une fois en quelques minutes. Certaines souris recevront l’administration d’un vaccin prophylactique (une seule injection dans une étape qui dure quelques minutes et qui est réalisée chez l’animal endormi) et d’autres recevront l’administration répétée de molécules thérapeutiques, réalisée sur des animaux vigiles de façon répétée (au maximum une fois par jour) pendant 2 à 3 semaines. Certaines souris seulement infectées subiront une chirurgie au niveau de la cage thoracique (une seule fois sous anesthésie générale et pour une durée de 5 heures au maximum).

Impact sur les animaux

Pour les souris recevant la vaccination (procédure 2), un stress faible lié à l’injection et à l’anesthésie est attendu, depuis l’endormissement jusqu’à la vaccination, qui ne durera pas plus de trois minutes au total. Pour les souris recevant les anticorps ou molécules thérapeutiques (procédure 3 et 4), un stress léger est attendu pour les administrations qui se feront par voie intrapéritonéale ou par gavage. Pour les souris infectées par M. tuberculosis (procédures 1, 2, 3 et 4), les nuisances attendues sur les animaux seront engendrées suite à la nébulisation et à l'induction de la pathologie pulmonaire. Les nuisances liées à la nébulisation sont : un stress modéré depuis leur installation et leur désinstallation dans les tubes de contention. L’ensemble de la nébulisation durera entre 40 et 45 minutes pour une infection de 20 souris (la mise en place de toutes les souris dans les tubes de contention, le cycle de l’infection et le démontage des tubes de contention). Les nuisances sévères observées durant la période d’infection sont : la perte de poids ou de pelage, l’isolement social ainsi que la tachypnée ou la dyspnée. Pour l’imagerie intravitale (procédure 1), les souris subiront un stress faible lors de injections IV par voie retro-orbitale qui ne dureront pas plus que 10 secondes. L’anesthésie provoquera une hypothermie et une déshydratation chez la souris durant la procédure chirurgicale qui ne durera pas plus de 20 minutes. Une fois sous respiration artificielle, la souris subira les mêmes nuisances (hypothermie et déshydratation) lesquelles dureront pendant la phase d’acquisition au microscope ne dépassera pas une durée de cinq heures.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expériences car celles-ci sont réalisées dans un environnement infectieux et que le poumon doit être analysé comme point final.

Remplacement

Nous nous intéressons à l’impact des cellules T mémoires dans la tuberculose. Etant donné que les populations de lymphocytes d’intérêt sont assez rares, qu’elles sont pour certaines accessibles seulement dans les poumons et qu’il n'existe aucun modèle cellulaire ni de possibilité de culture ex vivo, nous devons utiliser un système intégré dans lequel la circulation sanguine, la présence de ganglions lymphatiques et les poumons sont nécessaires (ce qui exclut les modèles multicellulaires du type "organoïde"). Une partie de l’étude porte sur le comportement des lymphocytes notamment leur dynamique de déplacement, leur localisation pulmonaire et leurs interactions avec les cellules infectées dans l’environnement pulmonaire. L’autre partie vise à mobiliser ces cellules sur le site infectieux dans un cadre de thérapies ciblant l’hôte ou de vaccinations. L’ensemble de ces événements sont étroitement liés à certains paramètres physiologiques tels que la circulation sanguine, la présence de ganglions lymphatiques et le microenvironnement des poumons. Il n’existe aucun modèle cellulaire de culture ex vivo à ce jour qui recapitule cette complexité d’interactions. De ce fait, afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire et un tissu pulmonaire suffisamment proche de l’homme. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation d’un organisme entier telles les souris vivantes.

Réduction

Dans ce projet, un nombre maximum de 2014 animaux sera utilisé. Afin de s’inscrire dans la logique de réduction, nous avons intégré trois étapes dans notre raisonnement. Tout d’abord, certaines étapes de nos projets pourront en effet être suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des promesses offertes par les résultats. Nous possédons une forte expertise dans le domaine de la microscopie intravitale des poumons ce qui nous a fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Pour les thérapies ciblant l’hôte et la vaccination, nous disposons là aussi d’une forte expertise qui nous a permis de développer des approches expérimentales permettant d’analyser sur un même lot d’animaux, des paramètres qui étaient avant mesurés sur des lots d’animaux séparés. Finalement, l’expérience des années précédentes nous a fourni des indications sur la taille minimale des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Des tests statistiques seront utilisés sur des lots de 6 animaux par test.

Raffinement

Dans ce projet, plusieurs étapes peuvent causer de la douleur, du stress ou de l’inconfort aux animaux, et nous les prenons en compte pour minimiser ces effets : • Vaccination : Elle se fait sous anesthésie pour éviter la douleur. • Administration de substances : Nous privilégions des méthodes non douloureuses, comme les aérosols ou la prise d’eau, ou faiblement douloureuses comme certaines injections. • Injections spéciales : Elles sont réalisées sous anesthésie et avec un analgésique pour éviter toute douleur. • Suivi des souris infectées : Les souris sont surveillées quotidiennement pour repérer tout signe de souffrance. Si leur état se dégrade, elles sont mises à mort pour éviter toute souffrance inutile. • Chirurgie pour l'observation au microscope : Les souris reçoivent des anesthésiques et des analgésiques pour éviter la douleur, et leur confort est surveillé pendant toute la procédure. Elles ne sont pas réveillées après l'intervention. Ainsi, chaque étape est encadrée pour assurer le bien-être des animaux autant que possible.

Choix des espèces

Il existe plusieurs modèles animaux pour étudier la tuberculose, comme les singes, les poissons ou les rongeurs. Nous avons choisi d’utiliser des souris, car elles réagissent de manière similaire aux humains en termes de réponse immunitaire et de développement de la maladie. En particulier, certaines souris développent des lésions pulmonaires ressemblant à celles observées chez l’homme, ce qui permet une étude plus représentative. Les souris offrent aussi l’avantage de pouvoir utiliser des outils précis pour suivre les cellules du système immunitaire. Dans ce projet, nous utiliserons des souris d’un groupe génétique commun, ce qui permet d’éviter des différences qui pourraient fausser les résultats. Pour ce projet, seules des souris adultes de 6 à 12 semaines seront utilisées, car leur système immunitaire est suffisamment développé à cet âge pour fournir des résultats pertinents.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la moitié d'entre elles et sévère pour l'autre. Toutes subissent une chirurgie du cerveau d'une heure quinze à une heure trente, puis quatre tests moteurs de huit minutes et trois jours d'apprentissage d'une tâche à raison de quarante-cinq minutes par jour, la tête maintenue par une contention crânienne pendant les enregistrements. Le porteur liste parmi les effets prévisibles un saignement intracérébral, des douleurs aiguës après la pose des implants, un risque d'infection et le déficit moteur induit par le modèle de Parkinson, avec perte de poids et comportements de rotation. Les bénéfices annoncés tiennent en une ligne : mieux comprendre la connexion entre le noyau sous-thalamique et le cortex moteur. Les 360 souris sont tuées pour que leur cerveau soit analysé en histologie.

Objectifs

La maladie de Parkinson est une maladie qui touche le cerveau et provoque des troubles du mouvement, comme des tremblements ou une raideur musculaire mais provoque aussi des troubles non-moteurs. Cette pathologie est caractérisée par la perte progressive de certains neurones dans une zone spécifique du cerveau appelée « substance noire », qui produisent une substance essentielle au bon fonctionnement du cerveau : la dopamine. Dans ce projet, nous nous intéressons à une autre région du cerveau très importante dans cette maladie : le noyau sous-thalamique. Ce noyau joue un rôle central dans la coordination des mouvements et pourrait être impliqué dans l’apparition des symptômes de la maladie de Parkinson. Cependantt, certaines connexions de ce noyau, notamment avec le cortex moteur (la zone qui contrôle les mouvements volontaires), sont encore mal connues. L’objectif de ce projet est donc de mieux comprendre comment cette voie de communication fonctionne dans le contexte de la maladie de Parkinson. Pour cela, nous avons entrepris d’étudier l’activité des neurones du cortex moteur de souris atteintes de Parkinson, grâce à des techniques sophistiquées comme l’imagerie cérébrale en temps réel. Nous pourrons ainsi tester l’impact de la stimulation ou de l’inhibition de cette voie sur le fonctionnement du cerveau. Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de ces circuits cérébraux dans la maladie, et à long terme, il pourrait aider à concevoir de nouveaux traitements plus précis et plus efficaces pour les patients atteints de Parkinson. Ce projet se déroule dans 2 établissements Utilisateurs: EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir notre compréhension de la connectivité entre le noyau sous-thalamique et le cortex moteur, ce qui va contribuer significativement aux connaissances sur la physiopathologie de la maladie de Parkinson.

Procédures

Chirurgie : (se déroulera dans l'établissement Utilisateur: EU1). sous - anésthésie générale, les 360 animaux du projet recevront une chirurgie au niveau du cerveau, durée moyenne : 1h15 à 1h30. Le reste des interventions se dérouleront dans l'établissement Utilisateur: EU2 (même bâtiment). Comportement: -Tous les animaux (n=360) recevront le test de comportement moteur , durée : 8 minutes (4 fois soit 2x avant la chirurgie et 2 x après la chirurgie). -Tous les animaux (n=360) recevront l’apprentissage de la tâche motrice pendant 3 jours soit 45 min par jour. Puis 180 souris réaliseront cette tâche pendant la séance d'imagerie (d’enregistrement de l’activité) (1 fois) et 180 la réaliseront 2 fois. - 180 animaux vont recevoir une injection abdominale d’une molécule pharmacologique et une injection du serum physiologique.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels chez les animaux sont principalement liés à l’induction du modèle de la maladie de Parkinson, qui entraîne un déficit moteur caractérisé par une réduction de l’activité locomotrice, une perte de poids et des comportements de rotation. D'autres effets indésirables prévisibles peuvent inclure : • un risque de saignement intracérébral, • des douleurs aiguës post-chirurgicales, notamment liées à la pose d’implants, • un risque d’infection associé à l’intervention chirurgicale et à la présence de matériel implanté, • un stress à court terme induit par l’utilisation de la contention crânienne, le stress physiologique associé à l’anesthésie générale •la douleur liée aux injections abdominales.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de l'expérimentation, soit 360 souris pour une analyse précise histologique afin de valider l'ensemble des résultats.

Remplacement

Le but du projet est de caractériser l’activité électrique des neurones pyramidaux du cortex moteur en lien avec le noyau sous-thalamique. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d'injections dans le cerveau, afin de faire exprimer des protéines capables de moduler l’activité du de ce noyau, combinées aux enregistrements de l’activité électrique in vivo chez l’animal réalisant une tâche comportementale. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, le recours au modèle animal reste la seule alternative pour la réalisation de cette étude. Le recours au modèle transgénique pour répondre aux questions scientifiques très spécifiques nous conforte dans cette décision. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions nécessaires pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

La réalisation de ce projet dans son ensemble concernera des souris mâles et femelles. Au-delà de l’intérêt de comparer les effets obtenus chez les 2 sexes, ceci permet d’inclure tous les animaux transgéniques des portées produites pour ce projet afin d’éviter que des animaux de l’autre sexe soient euthanasiés inutilement. La qualité de nos procédures qui est basée sur des années d'expériences, ce qui nous permettra de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. La réduction du nombre d’animaux est prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique qui tient compte de l’hétérogénéité inter-individuelle. Le nombre de souris utilisé dans chacun des groupes expérimentaux ne dépassera pas ainsi 15 animaux par groupe.

Raffinement

Tous les protocoles sont réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés tout au long de l’expérimentation en cage collective avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). L’utilisation d’anesthésique et d’analgésique est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie (2 fois par jour y compris le WE) jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place de mesures conservatoires si besoin. Des points limites suffisamment précoces sont définis. Les animaux seront ainsi suivis régulièrement pour détecter d’éventuels signes cliniques. En plus, des points limites spécifiques sont déterminés suite à la chirurgie et ce pendant 3 jours après la chirurgie et 15 jours pour les souris lésées, modèle expérimental de la maladie de Parkinson. Le transport des animaux entre les 2 établissements utilisateurs dure 3 min environ (du 4° au 1er étage), il se fait par le monte-charge. Les souris sont transportées dans des cages opaques dédiées au transport interne avec litière et papier. Les groupes sociaux sont respectés pendant le transport.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central (cerveau et moelle épinièredes vertébrés). En effet, c'est un mammifère présentant un lien de parenté proche avec l'espèce humaine et certains de ces comportements, notamment la motricité volontaire, peuvent être rapprochés de l'espèce humaine. Cette espèce est aussi un bon modèle de pathologiques neurologiques telle que la maladie de Parkinson qui peut être induite chez la souris à l'aide de neurotoxines, permettant d'inclure le plus faible nombre d'animaux possible dans les protocoles. Enfin, les lignées transgéniques pour cibler des populations neuronales de cette étude n’existent que chez la souris, d’où le choix de travailler avec cette espèce. Les modèles utilisés doivent être réalisés à l’âge adulte lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le cerveau et la moelle épinière sont matures. D’où le choix de souris adultes à partir de 8 semaines.