Procédures sévères

11 182 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune peut recevoir un traitement jusqu'à trois fois par jour pendant quatre semaines, porter une tumeur humaine greffée sur le flanc, entre les omoplates, dans la glande mammaire ou le côlon, et subir l'ablation chirurgicale de ses ovaires ou de ses testicules quand le traitement testé est une castration. Les tumeurs sont mesurées deux fois par semaine au pied à coulisse, et les métastases pulmonaires peuvent gêner la respiration. Le porteur écrit qu'en visant une efficacité antitumorale de 80 % plutôt que de 30 %, il ramène ses groupes de dix à cinq souris, ce qui déplace le seuil de résultat jugé intéressant en même temps que l'effectif.

Objectifs

Le cancer demeure l’une des principales causes de mortalité dans le monde. Malgré les avancées thérapeutiques, le développement de nouveaux traitements efficaces nécessite des modèles précliniques pertinents, capables de reproduire fidèlement les caractéristiques des tumeurs humaines. Parmi ces modèles, les xénogreffes—issues de l’implantation de tumeurs humaines sur des souris —constituent aujourd’hui l’une des approches les plus fiables, reflétant la diversité et l’hétérogénéité du cancer chez l’humain. Elles permettent de mener des études pharmacologiques à fort potentiel prédictif clinique, facilitant ainsi l’identification précoce des thérapies prometteuses. Ces modèles jouent un rôle clé dans l’évaluation de l’efficacité des nouvelles molécules, des combinaisons thérapeutiques innovantes ou encore de l’optimisation des schémas d’administration. Ces essais constituent une étape essentielle avant les phases cliniques, chez les patients. En identifiant les traitements les plus prometteurs, ils orientent le développement des nouvelles thérapies et permettent d’optimiser leur utilisation chez l’homme. L’objectif principal de ce projet est d’étudier les effets anticancéreux de nouveaux traitements. Ces recherches visent non seulement à développer de nouveaux traitements contre le cancer, mais aussi à identifier des biomarqueurs permettant de prédire la réponse aux thérapies. Elles permettront également d’explorer les mécanismes de résistance des tumeurs, afin d’optimiser l’efficacité des traitements et d’adapter les stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les études menées sur les xénogreffes issues de l’implantation de tumeurs humaines sur des souris jouent un rôle clé dans le développement des médicaments anticancéreux. En testant les thérapies dans des conditions proches de celles rencontrées par les patients, elles augmentent les chances d’obtenir des résultats transposables en clinique. Ce projet contribuera ainsi à l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le cancer, dont certaines pourront être testées ultérieurement chez l’homme lors d’essais cliniques. Il offrira également une meilleure compréhension des mécanismes d’action des traitements et des résistances tumorales, permettant d’optimiser la prise en charge des patients

Procédures

Dans un premier lot de souris , des traitements seront administrés aux animaux vigiles, chaque administration durant moins de 10 secondes. Cette phase durera 4 semaines, avec une fréquence variant d’une fois toutes les 3-4 semaines à 3 fois par jour selon les thérapies. Dans un deuxième lot de souris, des cellules tumorales seront implantées sous anesthésie générale lors d’une intervention chirurgicale d’environ 10 minutes. Puis, les souris recevront un traitement dont la fréquence et la durée seront identiques à celles du premier lot d’animaux. Dans certains cas, le traitement consistera en une castration sous anesthésie générale, cette chirurgie durant environ 20 minutes. Les effets du traitement sur la croissance tumorale pourront être suivis par imagerie non invasive une à deux fois par semaine sur animal anesthésie (15 minutes). Dans un troisième lot de souris, des cellules tumorales seront implantées sous anesthésie générale au cours d’une intervention de 10 minutes. En fonction des traitements testés, les souris recevront une administration unique ou répétée des molécules étudiées. Afin d’analyser la distribution et l’action du traitement dans l’organisme, des prélèvements sanguins (durée inférieure à 1 minute) seront réalisés à différents intervalles, allant de 30 minutes à 21 jours après la dernière administration. Des biopsies tumorales sous anesthésie générale (intervention d’environ 10 minutes) pourront également être réalisées 1 fois. Dans un quatrième lot de souris, des cellules tumorales seront injectées à l’aide d’une seringue chez des souris vigiles. Les souris recevront un traitement dont la fréquence et la durée seront identiques à celles du premier lot d’animaux. Dans certains cas, le traitement consistera en une castration sous anesthésie générale, cette chirurgie durant environ 20 minutes. Les effets du traitement sur la croissance des métastases seront suivis par imagerie non invasive 1 à 2 fois par semaine. Des prélèvements sanguins (3 fois– même conditions que les études de cinétique) permettront d’évaluer l’effet des traitements sur les cellules cancéreuses dans le sang.

Impact sur les animaux

Des cellules tumorales seront implantées chez les souris. Selon le site d’implantation, les tumeurs pourront se développer sur le flanc, entre les omoplates, au niveau de la glande mammaire ou du côlon entrainant une gêne locale lors de la greffe (quelques jours) puis lorsqu’elle atteint une taille plus grande (quelques semaines). Pour les modèles métastatiques, une gêne respiratoire pourrait apparaître lors du développement de métastases pulmonaires (quelques jours). Les souris recevront ensuite des traitements. Les effets secondaires attendus dépendront du mode d’administration. Les injections pourront occasionner une gêne passagère au site de la piqure (quelques secondes), le gavage un inconfort en raison de la contention (1 min). Certains traitements pourraient provoquer une perte de poids ou des épisodes de diarrhée au fil des administrations. En cas de traitement par ablation des ovaires ou des testicules, les désagréments seront liés à l’intervention chirurgicale (incision de la peau ou du péritoine, baisse de température due à l’anesthésie, douleurs post-opératoires). Ces douleurs pourront persister jusqu’à 48 heures après l’intervention. Tout au long des tests d’efficacité, les volumes tumoraux seront mesurés deux fois par semaine. Ces mesures seront effectuées soit sur des souris vigiles à l’aide d’un pied à coulisse, après une légère contention, soit par imagerie (au moins une fois toutes les 2 semaines) sous anesthésie générale (10 min) pouvant entraîner une baisse transitoire de la température corporelle. Enfin, certaines expériences nécessiteront des prélèvements sanguins ou tumoraux. Les prises de sang ne provoqueront qu’un inconfort momentané lié à la piqûre. Quant aux biopsies tumorales, elles impliqueront une anesthésie suivie d’une incision cutanée, pouvant entraîner une baisse transitoire de la température corporelle. Toutefois, ces désagréments resteront de courte durée (quelques jours).

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post mortem.

Remplacement

Avant d’initier une étude d’efficacité sur l’animal, une première étude des molécules est réalisée in vitro sur des lignées cellulaires et/ou sur des organoïdes (cultures cellulaires en 3D). Ces organoïdes, dérivés de tumeurs humaines, représentent des modèles physiologiques avancés permettant une étude précise des mécanismes cellulaires. Cette première étape de validation peut être réalisée au préalable par les collaborateurs ou au laboratoire en utilisant notre banque d'organoïdes issus directement de prélèvements de patients ou de xénogreffes dérivées de tumeurs humaines. Cependant, il reste nécessaire de valider l’effet observé dans un système intégré, tenant compte de la complexité d’un organisme vivant, des multiples interactions biologiques, de la toxicité potentielle et des difficultés qu’une molécule peut rencontrer pour atteindre sa cible. Les xénogreffes de tumeurs dérivées de patients constituent aujourd'hui l’outil d’analyse pharmacologique le plus proche de l’utilisation clinique. Pour sélectionner les meilleurs composés antitumoraux, l’évaluation préclinique reste une étape cruciale dans le développement de tout médicament avant son application clinique. Cette évaluation, combinant les modèles comme les organoïdes et les xénogreffes, optimise les modalités thérapeutiques, prédit les effets des médicaments en association et identifie des marqueurs de réponse ou de résistance. De plus, les effets des thérapies sur la dissémination métastatique et les cellules initiatrices de tumeurs sont également étudiés, renforçant ainsi la robustesse des données obtenues

Réduction

Afin de limiter le nombre de souris utilisées, nous avons mis en place plusieurs stratégies visant à optimiser nos études tout en garantissant la fiabilité des résultats. Nombre minimal de souris par type d’étude 1. Études de tolérance : 3 souris par dose suffisent pour détecter les effets secondaires fréquents. 2. Études d’efficacité (sur tumeur primaire et métastases) : Le nombre de souris est calculé pour détecter une différence de réponse de 30 % entre groupes, en intégrant la variabilité et le développement tumoral. 3. Études de cinétique : 5 souris permettent de réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses, en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Ce nombre pourra être ajusté selon les besoins des projets. Stratégies pour limiter l’utilisation des animaux 1. Optimisation des doses : Dans les études de tolérance, nous nous appuyons sur la littérature et les données de toxicité de nos collaborateurs pour identifier la dose tolérée par les souris, représentative de celle administrée à l’homme et efficace contre les tumeurs. L’objectif est de tester un minimum de doses sur le plus petit nombre d’animaux possible. 2. Réutilisation des souris : Les souris n’ayant pas développé de tumeurs en étude d’efficacité peuvent être réaffectées aux études de tolérance. 3. Recherche d’effet francs dans les études d’efficacité : Pour certaines molécules, viser une efficacité antitumorale de 80 % (plutôt que 30 %) permet de réduire le nombre de souris à 5 par groupe au lieu de 10. 4. Prélèvements en fin d’étude : Des analyses sanguines et tumorales peuvent être effectuées en fin d’expérience d’efficacité pour éviter des études de cinétique séparées. 5. Lors des études de cinétique, plusieurs prélèvements sur un même animal permettent de suivre l’évolution du traitement tout en limitant le nombre total de souris.

Raffinement

Un protocole rigoureux est mis en œuvre afin de minimiser les contraintes et la douleur infligées aux animaux. Le personnel est spécifiquement formé aux gestes techniques requis. L'utilisation d'anesthésiques et d’analgésiques est systématique lors des interventions chirurgicales, et des mesures sont prises pour réduire l'hypothermie pendant la chirurgie. L'utilisation de tapis et de lampe chauffante est systématique du début de l'anesthésie jusqu'au réveil des animaux. L'analgésie est prolongée systématiquement 48h pour toutes les chirurgies abdominales. Des gels nutritifs sont proposés aux souris après l'opération, et une hydratation supplémentaire est fournie en cas de perte de poids ou de difficulté à se déplacer. Une surveillance étroite des animaux est mise en place le jour de l’intervention pour les greffes de cellules tumorales, et étendue à 48 heures pour les chirurgies abdominales. Par la suite, un suivi clinique hebdomadaire au minimum est assuré par du personnel qualifié afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de l’expérience, et rapproché si baisse de l’état général de l’animal. Une grille de score est utilisée pour évaluer objectivement l'état des animaux et déterminer les points-limite. En cas de signes de douleur, des analgésiants sont administrés. L'expérience est interrompue lorsque la tumeur atteint la limite éthique ou si d'autres points limites décrits dans cette grille sont atteints.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce souris a été fait pour plusieurs raisons : - En tant que mammifère, la souris possède une physiologie proche de celle de l’Homme, ce qui en fait un modèle pertinent pour étudier l’effet antitumoral de nouvelle molécule ; - Les souches immunodéprimées de souris permettent la création de xénogreffes de tumeurs humaines sans provoquer de rejet de ces tumeurs ; - La disponibilité de souches immunodéficientes chez la souris offre la possibilité de greffer des cellules humaines, une approche souvent plus complexe avec d’autres espèces (le poisson zèbre, par exemple, se révèle moins immunodéprimé) ; - Enfin, la réglementation exige que tout développement de médicament soit évalué sur deux espèces vertébrés différentes pertinentes avant une administration chez l’Homme. La souris constitue alors le modèle de choix en première instance. Jeune adulte : la greffe est réalisée entre 5 et 8 semaines, une période au cours de laquelle les souris ont terminé leur croissance. Ce choix est stratégique, car il permet d’augmenter les chances de prise de la tumeur greffée, l’immunodéficience des souris ayant tendance à diminuer avec l’âge. À cet âge, les souris supportent également mieux les interventions telles que l’anesthésie, la chirurgie et les traitements.

Isolées en cage individuelle jusqu'à douze semaines, des souris subissent jusqu'à 11 défaites sociales, chacune faite de 2 à 10 minutes d'interaction avec une souris dominante puis de 24 heures à sa vue et à son odeur. 4 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour induire un état que le porteur dit "proche de la dépression" et tester des candidats médicaments. Suivent 28 jours de traitement par un candidat ou par un antidépresseur de référence, encadrés par cinq tests de comportement (interaction sociale, labyrinthes en croix et en Y, labyrinthe de Barnes, mesure du plaisir), et un éventuel prélèvement de liquide céphalorachidien sous anesthésie. La description des effets annonce, elle, "jusqu'à 10 défaites sociales". Les souris classées en souffrance sévère sont tuées à la fin des expériences, et celles classées en souffrance modérée sont déclarées réutilisables "au maximum sur deux autres études", 1 800 au total.

Objectifs

Les troubles dépressifs sont des affections très répandues chez l’homme, touchant environ 5 % de la population adulte (4 % des hommes et 6 % des femmes), soit environ 280 millions de personnes dans le monde. Bien qu’il existe des traitements antidépresseurs, environ 30 % des patients y sont peu ou pas sensibles, ce qui souligne la nécessité de découvrir de nouveaux médicaments. De plus, les antidépresseurs traditionnels présentent de nombreux effets secondaires qui apparaissent parfois avant les effets bénéfiques, ce qui limite l'observance thérapeutique. L’objectif de ce projet est de modéliser un stress social chronique chez la souris afin d’évaluer les effets de candidats-médicaments destinés au traitement des troubles dépressifs chez l’homme. Ce modèle comportemental permet d’induire chez les animaux un état proche de la dépression, caractérisé notamment par une diminution des interactions sociales, une anhédonie (perte de la sensation de plaisir) et un état anxieux. Ces symptômes persistent dans le temps, plusieurs semaines après la fin du protocole. Tout comme chez l’homme, ces symptômes peuvent être améliorés par l’administration chronique (sur plusieurs semaines) d’antidépresseurs. Ce modèle constitue donc un outil pertinent pour l’étude des troubles dépressifs chez l’homme et permet d’évaluer le potentiel thérapeutique de nouveaux candidats-médicaments. La découverte d'antidépresseurs avec un effet rapide et sans effets secondaires constitue un enjeu majeur de santé publique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la mise au point de nouveaux médicaments pour traiter les troubles dépressifs et anxieux, qui touche plus de 280 millions de personnes dans le monde dont environ 30% qui ne répondent pas aux traitements actuels. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive en fonction de l’objectif scientifique attendu.

Procédures

Pour la bonne induction du stress social et favoriser l'interaction des animaux, l'ensemble des animaux seront hébergées individuellement durant toute la durée du protocole. Au maximum l'hébergement individuel sera de 12 semaines : habituation, défaites sociales, traitement chronique avec candidats médicaments / antidépresseurs de référence et tests de comportement. Au maximum, les souris "test" subiront 11 défaites sociales (entre 2 et 10 minutes d'interaction avec une souris dominante suivi de 24h à vue et odeur de cette dernière), 28 jours de traitements par le candidat-médicament ou un antidépresseur de référence (1 à 2 administrations/jour maximum, 2 min par administration) et 5 tests de comportement visant à évaluer l'interaction sociale (15 min par animal), l'anxiété (10 minutes par animal), la sensation de plaisir (test effectué dans la cage d'hébergement pendant plusieurs jours), l'apprentissage et la mémoire spatiale (8 min le premier jour, 20 min le deuxième jour puis 38 min réparties sur une semaine entière) . Ces tests pourront être répétés deux fois maximum, une fois avant et une fois après traitement. Un à deux prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l'expérience (2 min maximum par prélèvement) ainsi qu'un prélèvement de liquide céphalo rachidien sous anesthésie et analgésie (maximum 1h). Les souris "témoins" subiront les mêmes contraintes mais sans défaites sociales. Les souris "dominantes" réaliseront 3 défaites sociales (maximum 10 minutes chacune) suivies de 3 séries de 11 défaites sociales au maximum (24h maximum chacune).

Impact sur les animaux

Les animaux seront hébergés individuellement durant l'ensemble du protocole (mais toujours en contact visuel et olfactif avec un animal). Les animaux « test » subiront jusqu’à 10 défaites sociales entrainant un stress chronique (base du modèle). L’administration des composés à l'essai ou de référence pourra entrainer un stress mineur de courte durée et une douleur équivalente à la piqure d’une aiguille. Les tests de comportements (interaction sociale, labyrinthe en croix et en Y, et labyrinthe de Barnes) induiront un stress léger de courte durée lié à la nouveauté de l’environnement et aux conditions de luminosité. Lors des prélèvements, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. Dans le cas d’une anesthésie pour un prélèvement, celle-ci peut induire un stress à l’endormissement. Les effets potentiellement indésirables des produits testés font l’objet d’échanges réguliers avec le responsable bien-être animal afin d’adapter les outils d’observation et d’anticiper au mieux d’éventuels signes cliniques. L’impact négatif sur les animaux sera minimisé en définissant avec précision la durée d’exposition et le nombre d’interactions nécessaires pour induire un stress social, tout en évitant de grandes blessures.

Devenir

Euthanasie des animaux à la fin des expériences pour les animaux avec degré de sévérité "sévère" et/ou euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal et/ou euthanasie des animaux suite aux effets indésirables éventuels provoqués par le(s) produit(s) à l'essai (candidats médicaments). Les animaux avec degré de sévérité "modéré" pourront être réutilisés au maximum sur deux autres études comme décrit dans la littérature scientifique sur ce modèle.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le comportement dépressif, ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 12 / par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux conditions expérimentales, • le ré-emploi d'animaux (souris mâles reproducteurs employés comme dominants), • Le recours à des procédures d'anesthésie et d'analgésie pour le prélèvement de LCR en ante-mortem.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales la plus pertinente et la plus couramment utilisée pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur la dépression car elle présente un comportement de territorialité vis-à vis d'un intrus qui entre sur son territoire. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Incision chirurgicale de la patte, injection d'une solution inflammatoire sous la voûte plantaire, implantation d'électrodes puis distension du côlon par un ballon gonflable, l'animal maintenu une heure dans un tube de contention : 4 032 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dont 1 824 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Il s'agit d'établir le rôle d'un récepteur dont la fonction reste inconnue dans la douleur et l'inflammation intestinales. Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids ou saignent abondamment dans leurs selles sont retirées et tuées. Le porteur qualifie de "peu invasifs" les protocoles de mesure du transit, qui comprennent l'introduction dans le côlon d'une bille de la taille d'une fèces.

Objectifs

Nous avons récemment identifié le récepteur MrgprE comme un récepteur orphelin exprimé à la fois par les neurones sensoriels, les neurones du système nerveux entérique, certaines cellules immunitaire et épithéliales intestinales chez la souris. La fonction de ce récepteur dans l'intestin et l’hypersensibilité somatique et viscérale reste inconnue que ce soit dans un contexte physiologique ou pathologique. L'objectif général de ce projet est donc d'étudier le rôle de MrgprE dans la physiologie, l'inflammation et la douleur somatique et intestinale (du fait de son expression dans le tractus digestif et les neurones sensitifs).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de découvrir la biologie d'un nouveau récepteur : MrgprE, et de décrypter son implication dans le processus de la douleur et de l'inflammation intestinale. La prise en charge de la douleur repose actuellement sur des médicaments qui ont des effets secondaires, notamment les dérivés des opioïdes qui induisent une habituation et une dépendance. Par conséquent, MrgprE pourrait constituer une cible pharmacologique intéressante pour remplacer les traitements actuels dela douleur mais aussi de l'inflammation intestinale.

Procédures

Les animaux seront smousi à: 1) Chrirurgie d'incision plantaire (5minutes par chirurgie) puis test d'hypersenibilité à 24h, 48 et 96h après opération 2) Injection intra plantaire sous cutanée de solution induisant l'inflammation sous anesthésie gazeuse (10 secondes par injection) puis test d'évaluation de l'hypersensibilité tous le jours pendant 4 jours. 3) Chirurgie d'implantation des électrodes (sous anesthésie et analgésie, délivré par voie intrapéritonéale, durée 2 secondes), durée de la chrirurgie d'envrion 20 minutes par souris. Hébergement en cage individuelle pendant trois jours après la chirurgie. Pour le test de comportement, les souris seront mises en contention dans des tubes et l'expérimentation durera 1 heure. 4) les souris seront gavées avec les différentes solutions de suivi du transit (temps de gavage de 5 secondes par souris), et l'insertion de la bille dans le colon se fera sous anethésie gazeuse et l'opération prendra 5 secondes. 5) L'injection des agonistes/antgonistes se fera en par voie intrapéritonéale et durera 2 secondes par injection.

Impact sur les animaux

- Les souris mutantes utilisées ne présentent à notre connaissance pas de défauts de comportement, ni de déficiences immunitaires ni de létalité à l’état basal. -Les protocoles utilisés pour évaluer les temps de transit sont peu invasifs (gavage ou introduction d'une bille de la taille d’une fèces dans le colon) et seront conduits par des personnes expérimentées. La manipulation pouvant cependant générer un stress pour les souris, elles seront dès que possible anesthésiées à l'isoflurane pour minimiser leur stress pendant les procédures. -Les modèles d’inflammation somatique (incision plantaire et solution d’activation de l’inflammation) causeront un stress et une douleur de la patte chez l’animal et peuvent occasionner une boiterie. De ce fait, pour chacun des modèles, l’état général (mobilité, toilettage, sociabilité avec les autres animaux de la cage) et le poids seront suivit quotidiennement. Si jamais un animal perd plus de 20% de son poids initial, présente un état général non satisfaisant (immobilité, absence de toilettage, absence d'interactions), il sera écarté de l'expérience et euthanasié pour minimiser ses souffrances. -L'induction de l'inflammation colique par la solution d’activation de l’inflammation et la chirurgie causeront un stress chez l'animal. Celui-ci sera cependant suivit quotidiennement pour évaluer son état général (mobilité, toilettage, sociabilité avec les autres animaux de la cage), son poids, ainsi que la consistance de ses féces et la présence de sang dans les selles. Si jamais un animal perd plus de 20% de son poids initial, présente un état général non satisfaisant (immobilité, absence de toilettage, absence d'interactions), ou qu'il présente des saignements abondant dans les selles (nettement visible à l'œil nu), il sera écarté de l'expérience et euthanasié pour minimiser ses souffrances. - Lors de la chirurgie nécessaire à l'implantation des électrodes pour la mesure de la sensibilité viscérale, les animaux pourront décéder suite à l'anesthésie ou à la chirurgie. Suite à la chirurgie, les animaux pourront avoir une perte de poids et de la douleur. Lors de la distension colorectale, les animaux pourront être sujet à un stress dû à la contention de l'animal dans un tube, à la mise en place de la sonde et au gonflement du ballon. L'animal pourra aussi ressentir de la douleur viscérale lors de l'expérimentation.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem.

Remplacement

Ce projet vise à étudier l'effet du récepteur MrgprE sur l’inflammation et la douleur somatique et intestinale chez la souris. Il n'existe pas à ce jour de modèle cellulaire satisfaisant qui puisse rendre compte de la diversité des interactions étudiées dans le contexte de ce projet. Devant la complexité de ces phénomènes, due notamment à l’implication de différents organes et types cellulaires, le recours aux modèles animaux est indispensable. De ce fait, les modèles de souris sont des éléments clés et incontournables pour étudier le rôle du récepteur MrgprE sur les phénomènes étudiés.

Réduction

Une veille bibliographique est/sera effectuée pour éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes. Les croisements des souris, notamment les croisements incluant des souris Cre, seront réalisés de telle façon que toute la descendance soit utilisée lors des manipulations (contrôle et animaux d’intérêt issu de la même portée). Le nombre d'animaux (12 souris par groupe) a été consciencieusement établit avec le minimum nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement significatifs (en prenant en compte la variabilité interindividuelle). Nous avons déterminé le nombre d'animaux par lot en utilisant une analyse de puissance statistique.. Cela nous a permis de déterminer qu'un minimum de 12 animaux par lot est nécessaire pour détecter des différences significatives entre les groupes expérimentaux, en raison de la variabilité inter-individuelle présente dans les différents modèles utilisés.

Raffinement

Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, le souris auront une phase d’acclimatation dans une pièce séparée sur portoirs ventilés d’au moins cinq jours. Les souris seront hébergées à maximum 5 par cages en portoir ventilé dans un environnement contrôlé . L’enrichissement sera constitué d’une maison en plastique et de frisure de papier kraft pour faire un nid. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour. Pour chaque procédure des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Lors de la procédure chirurgicale nécessaire pour mesurer la sensibilité viscérale des souris, un mélange de produits analgésiants et anesthésiants sera utilisé comme anesthésie et le souris seront mise sur tapis chauffant pendant la procédure chirurgicale. Un anti-inflammatoire sera utilisée comme analgésique en phase post-opératoire. Tout au long de la vie des animaux, si nous détectons une perte de poids équivalente à 20% du poids d’origine, ou bien un comportement apathique, des plaies trop importantes (due aux altercations courantes chez les mâles) ou la présence de dents longues ou de prolapsus, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les méthodes alternatives, permettant une évaluation de l’inflammation et de la douleur ne sont pas développées à l’heure actuelle, du fait que la douleur et l'inflammation sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à ce jour à reproduire in vitro dans leur intégralité. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques dans l’inflammation et la douleur qui représentent des problèmes de santé publique. Enfin, tous les animaux transgéniques nécessaires à la réalisation de ce projet sont disponibles chez la souris et sont déjà dans le laboratoire. Les animaux seront utilisés entre 8 et 16 semaines ce qui correspond à de jeunes adultes qui possèdent un système immunitaire bien développé et mature.

Irradiées trois fois au niveau du côlon sous anesthésie, à deux ou trois jours d'intervalle, puis traitées par jusqu'à vingt-cinq injections, 1 248 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 1 094 d'entre elles et sévère pour 154. Toutes sont tuées à l'issue pour le prélèvement des tissus coliques. Le projet porte sur les séquelles intestinales tardives des radiothérapies pelviennes et sur ce qu'y ajoute l'immunothérapie, en irradiant des tissus sains. Le porteur écrit qu'à cette dose les animaux ne perdent pas de poids, et indique quelques lignes plus loin qu'environ 20 % d'entre eux meurent avant la date prévue de mise à mort dans le protocole à douze semaines.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires au niveau du côlon qui sont responsables des séquelles tardives des irradiations de la zone pelvienne occasionnés par la radiothérapie et la combinaison de traitements d’immunothérapie et radiothérapie.

Bénéfices attendus

La radiothérapie externe est l’un des traitements incontournables dans la prise en charge des cancers (60% des patients en bénéficient). L’objectif est la recherche d’un compromis entre le contrôle du volume de la tumeur et les dommages aux tissus sains, situés autour de la tumeur. En effet, l’irradiation des tissus sains de la zone pelvienne entraîne de nombreux effets toxiques au niveau de certains organes tels que le côlon, le rectum ou l’intestin grêle dits « organes radiosensibles » du fait d’une forte capacité d’auto-renouvèlement des cellules et aussi d’une forte sensibilité aux rayonnements ionisants. La toxicité radio-induite du tissu intestinal peut entrainer chez certains patients des séquelles à long terme, altérer fortement la qualité de vie du patient voire même dans les cas les plus sévères engager son pronostic vital. L’ensemble et la complexité des séquelles induites suite à une radiothérapie pelvienne ont amené à la définition d’une nouvelle maladie, la « Pelvic Radiation Disease » ou PRD. Aujourd’hui, les traitements combinés, radiothérapie et immunothérapie, par l’utilisation d’inhibiteur de checkpoint, ont montré des bénéfices majeurs dans certains cas de cancers. Ce projet étudiera les conséquences de ces traitements sur le développement des lésions à court et long terme.

Procédures

Les animaux seront irradiés localement sous anesthésie : 3 irradiations de 7-8 min à deux ou trois jours d’intervalle (soit 10 min d’anesthésie au maximum). Pour chaque irradiation, les animaux sont transférés sur la plateforme (5 min aller, 5 min retour). Les souris recevront un traitement par injection (produit aqueux) 3 fois par semaine pour le protocole aigu (soit 6 injections maximum) et 2 fois par semaine pour le protocole tardif (soit 25 injections maximum).

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation locale du côlon en dose fractionnée, certaines souris vont présenter une dépilation au niveau de la zone d’irradiation et d’autres uniquement une décoloration des poils. A cette dose, les animaux ne perdent pas de poids. Pour le temps d’étude tardif (12 semaines) certains animaux peuvent décéder juste avant la date d’euthanasie. Les expériences précédentes montrent un taux de décès d’environ 20% selon les lots d’animaux. Les injections nécessitent une piqure pouvant entrainer une douleur légère et de courte durée. Ces actes seront réalisés dans le respect des bonnes pratiques. Il n’est pas attendu d’effet secondaire des produits administrés.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour des analyses histologiques, cellulaires ou moléculaires indispensables aux analyses ultérieures.

Remplacement

Le développement des séquelles coliques nécessite l’interaction entre différents compartiments tissulaires (vasculaire, stromal, inflammatoire et épithélial), conditions retrouvées chez le modèle animal intégré. A ce jour, il n’existe pas d’alternative au modèle animal pour étudier les processus physiopathologiques des séquelles des radiothérapies pelviennes. Ce projet in vivo chez l’animal sera complété par des analyses chez l’homme dans le cadre d’une étude clinique cognitive de ce projet financé et par des analyses in vitro sur des organoïdes issus de colon de souris.

Réduction

Les modèles d’expérimentation pour l’étude tardive des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques, cellulaires et moléculaires des groupes de 10 à 20 animaux sont nécessaires en fonction du modèle et des mesures réalisées. Des tests statistiques seront réalisés afin de comparer tous les groupes entre eux.

Raffinement

Différentes mesures spécifiques sont prises pour réduire au maximum l’impact sur le bien-être des animaux - Hébergement en petit groupe (3 animaux par cage) avec enrichissement (coton et igloo en carton) - Observation quotidienne des animaux suivi du comportement et de leur aspect physique (aspect du poil, mobilité, prostration, pesée) - Pesée hebdomadaire (voire plus fréquente aux temps tardifs) - Mise à disposition des animaux, si besoin, de poches d’eau gélifiée (avec ou sans vitamines) et/ou croquettes humides selon l’état général de l’animal - Mise en place d’une ceinture pour limiter les risques d’irradiation de zone radiosensible.

Choix des espèces

Les modèles d’irradiation chez la souris permettent de reproduire des lésions colorectales et similaires à celles que l’on peut observer chez des patients ayant des séquelles graves des radiothérapies pelviennes. De nombreux outils pour les études moléculaires sont disponibles chez la souris. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte sont utilisés (12 semaines).

Environ 309 études de 50 souris, pour tester des candidats médicaments contre le cancer, sont prévues sur trois ans, un volume estimé d'après l'activité des années précédentes et la croissance prévue au plan commercial. 15 480 souris, immunodéficientes, immunocompétentes ou dotées d'un système immunitaire ou d'un foie humanisés, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tuées en fin d'étude ou aux points limites, 1 200 d'entre elles étant déclarées réutilisables dans un projet de formation interne. Les procédures prévues comprennent des greffes de tumeurs humaines ou murines, des injections répétées de traitements, des castrations, des prélèvements vaginaux quotidiens pendant au moins cinq jours et des injections intraveineuses hydrodynamiques de plasmides, qui peuvent provoquer des troubles cardio-respiratoires et "une altération marquée de l'état général". Parmi les risques de la chirurgie, le porteur cite le cas où "la souris se réveille en cours de procédure", et il précise pour l'effectif : "Aucune approche statistique n'a été réalisée".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines sur des souris immunodéficientes, immunocompétentes ou avec un système immunitaire et/ou un foie humanisé. Différentes stratégies d’implantation des tumeurs pourront être mises en œuvre en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser sa toxicité et l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la fonctionnalité de candidats médicaments dans des modèles se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'humain.

Procédures

Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris avec ou sans anesthésie en fonction de la voie choisie. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids et à l’âge de l’animal avec une limite fixée sur une période glissante de 14 jours. Une réhydratation avec du sérum physiologique sera réalisée si nécessaire. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole de l’étude et sera contrôlée par un vétérinaire. Chaque prélèvement durera quelques secondes. Pour les analyses nécessitant un volume plus important, un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse sera réalisé. Des prélèvements vaginaux pourront aussi être pratiqués quotidiennement pendant au moins cinq jours, voire plusieurs semaines pour caractériser le cycle œstral. Des prélèvements d’urines et de fèces pourront être pratiqués par contention et massage du ventre. Les animaux recevront des injections de solution saline isotonique contenant des plasmides, une ou deux fois selon la durée de l’étude. Ces injections, administrées uniquement aux souris de plus de 18 g, dureront entre 10 et 15 secondes. Les administrations de traitements ou de cellules seront réalisées par injections qui pourront être répétées selon le protocole et dureront quelques secondes. Certaines procédures nécessiteront des actes chirurgicaux pour la castration, l’implantation de fragments de tumeurs et/ou de dispositifs sous-cutanés, réalisés sous anesthésie gazeuse avec une analgésie préopératoire et un suivi post-opératoire rigoureux. L’implantation durera environ 8 minutes et pourra être répétée selon les besoins de l’étude. Concernant la castration, celle-ci durera moins de 10 minutes. Le suivi de la croissance tumorale pourra se à l’aide d’un pied à coulisse pour une durée de quelques secondes et/ou par imagerie pour une durée comprise entre 10 et 45 minutes. À l’issue des études, les animaux devant être euthanasiés le seront selon les méthodes réglementaires. Toutes les interventions seront réalisées sous un suivi clinique rigoureux afin de minimiser douleur et stress des animaux.

Impact sur les animaux

-Injection(s) hydrodynamique(s) intraveineuse(s) de plasmides : peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, pendant les minutes suivants l’injection. Peut engendrer un hématome. -Prélèvements vaginaux : peut engendrer une irritation locale, une inflammation ou un stress temporaire. -Chirurgie : douleur, hémorragie, un défaut du système d’anesthésie / analgésie (ex : la souris se réveille en cours de procédure), un état clinique détérioré au réveil (ex : hypothermie), mauvaise cicatrisation. -Administration de traitements ou de cellules cancéreuses : effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques, hématome, douleur, lésion au site d’administration (notamment si administrations répétées) - Prélèvements sanguins : hématome, douleur, lésion au site de prélèvement (notamment si prélèvement répétés). -Rasage et crème dépilatoire : microlésions, irritations cutanées, gêne (sensation de brûlure de la crème), inflammation transitoire. -Anesthésie : risque d’hypothermie et de sécheresse oculaire (ajout de gel ophtalmique en prévention). -Prélèvement d’urine et de fèces : stress, gêne voire potentiellement douleur si présence de tumeurs au niveau abdominal. -Prise de température corporelle à l’aide d’une sonde : irritation, inflammation, stress. Des nuisances peuvent également être induites par le stress dû à la contention, le développement des tumeurs et des éventuelles métastases. La douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Tous les animaux en fin d'étude, ayant atteints les points limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasiés. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général. Des souris issues de cette procédure pourront être réutilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris » sur décision vétérinaire. Ceci ne pourra être envisagé que dans les cas ou des animaux ont subi seulement une partie de la procédure (ex : animaux du groupe contrôle négatif) et ne présentant pas d’altérations résiduelles de leur état de santé.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques de médicaments en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 15480 souris seront utilisées, couvrant une période de 3 ans et permettant de réaliser environ 309 études précliniques de 50 souris. Aucune approche statistique n'a été réalisée, pour le nombre total d’études ou pour le nombre total d’animaux dans le projet. L’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum par des analyses rétrospectives systématiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction de la variabilité de croissance historique sur un modèle déterminé.

Raffinement

En début d'étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables de 5 individus. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant de creuser, se cacher et réaliser un nid. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles pour synchroniser le cycle œstral. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, elles bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse, une échelle de scores cliniques (pelage, mobilité, état général, activité, comportement, etc…) sera appliquée dès le premier geste invasif ou dès qu’un signe d’altération sera observé lors de la surveillance quotidienne. Des traitements antalgiques préventifs et curatifs seront mis en œuvre dès que nécessaire, sous avis vétérinaire, administrée avant intervention chirurgicale ou toute procédure potentiellement douloureuse. Un relais dans l’eau de boisson pourra ensuite être réalisé. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est défini pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement sous anesthésie sans réveil, suivi d’une euthanasie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie, une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites sont définis selon l’état général (score clinique), perte de poids ou volume tumoral.

Choix des espèces

90% des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain, ou de manière fonctionnelle par greffe de cellules humaines dans une lignée immunodéficiente, permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures d’un point de vue physiologique. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang. Les animaux humanisés avec des cellules modifiées seront inclus à partir de 5 semaines, âge auquel la greffe de cellules dans le sang est la plus efficace.