Procédures sévères

Pour tester des candidats médicaments contre les symptômes de la ménopause, 2 100 rates vont subir une ovariectomie bilatérale sous anesthésie, toutes tuées à l'issue, 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 500 un niveau modéré. Suivent, selon les protocoles, l'implantation d'un capteur de température, un traitement pouvant durer six mois, une cystométrie de quatre heures précédée de la pose d'un cathéter intravésical, une collecte d'urine en cage à métabolisme et jusqu'à cinq jours d'isolement pour la cicatrisation. Le porteur indique que les interventions seront limitées "selon les recommandations dans le cadre d'un partenariat avec une entreprise pharmaceutique". Les points limites doivent permettre aux zootechniciens de signaler l'apparition des critères déclenchant l'arrêt des souffrances, sans que ces critères soient nommés.

Objectifs

La ménopause est un événement physiologique qui survient entre 45 et 55 ans chez la femme, et qui correspond à l’arrêt du fonctionnement ovarien entraînant un arrêt de la production de progestérone puis des œstrogènes, marquant ainsi la fin des menstruations et donc de la fertilité. Cette carence en œstrogènes peut se manifester par des symptômes susceptibles d’altérer la qualité de vie des patientes, tels que des troubles vasomoteurs (bouffées de chaleur et sueurs nocturnes) et des symptômes génito-urinaires (atrophie et sécheresse vaginales, douleurs lors des rapports sexuels, augmentation de la fréquence des infections urinaires, etc.). Il s’agit également d’une période durant laquelle des pathologies potentiellement graves peuvent survenir en raison des changements hormonaux et du vieillissement, telles que les fractures ostéoporotiques, les maladies cardiovasculaires ou certains cancers. Le traitement hormonal de la ménopause (THM), destiné à compenser la carence en œstrogènes et en progestérone liée à l’arrêt de leur production par l’organisme, constitue l’approche thérapeutique la plus couramment prescrite aux femmes ménopausées. Toutefois, depuis 2002, plusieurs études ont mis en évidence des effets indésirables graves, notamment une augmentation du risque de cancers du sein et de l’utérus, ainsi que de maladies cardiovasculaires. En conséquence, depuis 2003, l’utilisation du THM n’est plus recommandée de manière systématique ni à titre préventif. Pour soulager leurs symptômes, certaines femmes se tournent également vers des alternatives, dont les risques potentiels restent encore mal connus. Dans ce contexte, il est nécessaire de mener une recherche préclinique intensive visant à identifier et/ou développer un traitement des symptômes de la ménopause à la fois efficace et présentant une sécurité d’emploi optimale. À cet égard, la rate ovariectomisée constitue un modèle préclinique de référence pour l’étude des mécanismes physiopathologiques associés à la ménopause et pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Des études antérieures ont d’ailleurs montré une diminution du taux d’œstrogènes circulants chez la rate ovariectomisée, reproduisant les modifications physiologiques observées chez la femme après la ménopause.

Bénéfices attendus

Depuis la parution de l’étude montrant les risques des traitements THM, moins de 6% des femmes ménopausées prennent actuellement ces traitements. Certaines femmes se tournent donc vers des solutions alternatives dont on ne connaît pas toujours les risques. Il est donc nécessaire d’identifier ou de développer des traitements efficaces qui offrent une sécurité d’emploi optimale. Cette étude vise à évaluer l’efficacité, et dans certains cas les effets indésirables, des nouveaux candidats médicaments dans la prise en charge des symptômes chez les femmes ménopausées, dans un modèle animal validé.

Procédures

Les animaux vont avoir une ovariectomie bilatérale sous anesthésie afin de modéliser la ménopause chez la femme. Cette opération est faite une seule fois au début de l'étude dure au maximum une demi-heure. Ensuite, les animaux seront traités par le composé à analyser ou ses contrôles, la fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (généralement moins de 6 mois). Tout type d’administration dure moins d’une minute sur un animal vigile, et moins de 30 min si l'administration nécessite une anesthésie. L’implantation d’un capteur télémétrique permet de suivre les variations de températures qui fait suite à l’ovariectomie. Une cystométrie peut être faite pour évaluer l'effet du composé administré, l’expérience dure 4 h au maximum, précédée de l’implantation d’un cathéter intravésical. Enfin, des prélèvements de sang, d’urines ou d'organes après euthanasie des animaux pourront être envisagés. Chaque prélèvement de sang durera moins de 3 minutes. Une collecte d’urine se fait en cage à métabolisme et en moins de 24h. A noter que tous les animaux n’auront pas forcément toutes ces interventions. En effet, les interventions seront limitées selon leur pertinence et selon les recommandations dans le cadre d’un partenariat avec une entreprise pharmaceutique.

Impact sur les animaux

L’ovariectomie, l’implantation de cathéter et de capteur de température sont réalisées sur des animaux anesthésiés, sous antalgiques et avec une antibiothérapie prophylactique. Toutefois, une sensation d’inconfort peut apparaître chez l’animal après ces procédures, ainsi qu’un stress potentiellement induit par l’isolement durant la période de cicatrisation, d’une durée de 5 jours au maximum en l’absence de complications. L’administration des composés ou les prélèvements sanguins et ou d’urine peuvent aussi entraîner un stress et ou une sensation d’inconfort chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront ovariectomisés afin de mimer la ménopause et vont être traité avant ou après par les composés à évaluer. L’efficacité des nouveaux traitements vont être évalués par le suivi de température, la cystométrie, et ou par l’analyse des différents prélèvements de sang, d’organe ou d’urine. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude.

Remplacement

La rate ovariectomisée est le modèle préclinique de choix pour la compréhension des événements physiopathologiques associés à la ménopause et pour le développement de nouvelles thérapies efficaces. Une diminution du taux d'œstrogènes circulants est observée chez la rate ovariectomisée, imitant les modifications physiologiques post-ménopausiques humaines. A ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro pertinent rendant ainsi indispensable l’utilisation d’un modèle intégré faisant appel à des animaux vivants.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. De plus, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les rats sont hébergés par 2 animaux par cage quand cela est possible, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. - Un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - Des points limites sont fixés afin que les zootechniciens puissent signaler aux responsables des soins et du projet l’apparition des critères nécessitant les traitements nécessaires pour arrêter les souffrances. - Les différentes interventions chirurgicales (ovariectomie, implantation d’une pompe osmotique ou d’un cathéter intraveineux, pose de capteurs de température ou d’un cathéter intravésical) sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Un traitement antibiotique est également administré pour prévenir les infections. Lorsque le protocole le permet, plusieurs de ces interventions peuvent être combinées afin de réduire le nombre d’opérations au cours de l’étude.

Choix des espèces

L’expérimentation animale est nécessaire pour l’étude de modifications physiologiques multi-symptomatiques consécutives à la diminution des hormones féminines à la ménopause. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et limitent l’utilisation de gros animaux tels que le chien. De plus ces derniers présentent comme chez la femme une ovulation spontanée contrairement au lapin qui a une ovulation provoquée suite à un accouplement. Par ailleurs, les évaluations incluses dans le cadre de ce projet sont plus faciles à réaliser chez le rat, par rapport à la souris. Concernant l’analyse des données de miction spontanée, la vessie du rat a une capacité plus importante et permet de faciliter l’analyse de la mesure du volume uriné. Des rates adultes de plus de 6 semaines sont employées, âge auquel les organes sexuels sont à maturité. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.

Des points limites et une grille de scoring déclenchent la mise à mort anticipée des souris dont l'état se dégrade après la fracture. 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus osseux, dont 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent sous anesthésie une fracture ou un défaut cortical de trente à quarante-cinq minutes, parfois une greffe, une injection de vecteurs viraux de vingt minutes, et reçoivent du tamoxifène par gavage ou injection intrapéritonéale, pour étudier les cellules souches de la réparation osseuse. Le porteur décrit des animaux qui "boitent les premiers jours" mais gardent "une activité normale dans la cage", alors que 300 des 370 relèvent d'un niveau de souffrance sévère.

Objectifs

Cette étude préliminaire vise à valider l’utilisation de lignées de souris transgéniques et un nouveau protocole de ciblage génique pour élucider les mécanismes de la régénération osseuse. La régénération osseuse a lieu dans un environnement tissulaire complexe impliquant les os, les vaisseaux sanguins, les nerfs, les cellules inflammatoires et le muscle adjacent à l’os. Nous cherchons à comprendre le role des cellules souches qui sont essentielles à la réparation et dont la fonction dépend de cet environnement complexe. En utilisant des modèles de souris, nous explorons le rôle des cellules souches et des gènes impliqués dans la réparation osseuse. Ces modèles nous permettent également de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques et d’évaluer leur potentiel pour des applications humaines. En effet de nouveaux traitements sont nécessaires pour corriger les défauts de consolidation après fracture. Ces défauts peuvent etre liés aux maladies du système musculosquelettique ou à un traumatisme sévère. Actuellement, la chirurgie et les greffes osseuses sont les principaux traitements, mais la thérapie cellulaire ou des traitements pharmacologiques pourraient offrir des solutions innovantes. Dans ce projet nous nous concentrons sur le role de la vascularisation, sur une nouvelle population de cellules souches osseuses et sur une nouvelle mutation entrainant la pseudarthrose congénitale de jambe, une déficience sévère de réparation osseuse. Ce projet multisite est réalisé dans les 2 établissements utilisateurs concernés.

Bénéfices attendus

Les fractures sont les blessures les plus fréquentes du système musculosquelettique. Bien que la réparation osseuse soit un processus très efficace, environ 20% des fractures présentent un retard ou absence de réparation. Le traitement de ces défauts de réparation est complexe, nécessitant généralement une prise en charge chirurgicale. Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la régénération osseuse en condition physiologique et pathologique. D’un point de vue fondamental, il permettra une meilleure compréhension du rôle des différents acteurs cellulaires et de différentes voies de signalisation. Il s’agit également d’un projet permettant l’étude de nouveaux traitements sur les défauts de régénération osseuse. Les potentielles applications cliniques sont concrètes et ouvrivont la voie à l’utilisation de ces traitements chez les patients.

Procédures

L’administration du Tamoxifène ou de molécules est réalisée par injection intraperitonéale ou gavage. La greffe et la blessure osseuse (fracture, défaut cortical) sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri- et post- opératoire (durée de la procédure entre 30 et 45 min). L’injection d’AAV est réalisée sous anesthésie générale à l’isoflurane (3 à 4% en induction ; durée de l’injection ou du scan est 20 minutes/souris). Une analgésie péri-opératoire est utilisée pour l’injection AAV. Il s’agit d’un projet multisite et chaque intervention est réalisée dans les 2 établissements utilisateurs.

Impact sur les animaux

Après injection de Tamoxifène ou EdU, les animaux sont observés quotidiennement jusqu’au prélèvement. Les animaux utilisés pour l’induction locale par le gel d’Endoxifène reçoivent une dose supplémentaire de buprénorphine dans les 24h après l’opération. De plus, la plaie sera examinée pendant le suivi des animaux. En cas de signes de souffrance (mauvaise apparence physique, diminution de l’activité) ou d’infection (rougeurs, animaux léchant leur plaie), les réponses appropriées seront mises en place (voir grille de scoring ci- dessus). Le processus de régénération osseuse est spontané. Le cal est formé en une semaine stabilisant la fracture et les animaux sont guéris après 3 semaines lorsque le cal est entièrement ossifié. Ils boitent les premiers jours mais ont une activité normale dans la cage (marchent, grimpent, boivent, se nourrissent etc...) et présentent une apparence physique externe normale. Les effets tels que la douleur et la mobilité réduite sont généralement limités aux premiers jours. Les animaux retrouvent leur pleine mobilité par la suite. Un traitement antalgique et un suivi quotidien seront effectués, et nous nous référons à une grille de scoring afin d'agir sur le bien-être des animaux lorsque nécessaire.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l’ensemble des procédures afin de permettre l’analyse tissulaire et cellulaire des tissus osseux.

Remplacement

Le processus de régénération osseuse est complexe et implique de multiples types cellulaires, dont l’activité coordonnée et les interactions sont indispensables. Ces évènements ont lieu dans un environnement tissulaire complexe impliquant des interactions entre l’os, les vaisseaux, le système immunitaire, le système nerveux et les muscles. Expérimentalement, il n'est pas possible de reproduire la complexité de cet environnement dans un système cellulaire in vitro, et il est nécessaire de recourir à l’utilisation de modèles murins. En utilisant des modèles de souris et des modèles de blessure osseuse, nous explorons le rôle des cellules souches et des gènes impliqués dans la réparation osseuse. Ces modèles nous permettent également de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques et d’évaluer leur potentiel pour des applications humaines.

Réduction

Notre expérience antérieure nous permet de définir un nombre réduit de temps clés à analyser au cours de la régénération osseuse pour rendre compte de l’ensemble du processus. Par ailleurs, nous avons établi qu’une taille d'échantillon de 10 animaux par groupe est suffisante pour fournir des résultats statistiques valables

Raffinement

Le processus de régénération osseuse est spontané et est complet en moins de 3 semaines. Les animaux sont suivis de façon régulière. Ils boitent les premiers jours mais ont une activité normale dans la cage (marchent, grimpent, boivent, se nourrissent etc...) et présentent une apparence physique externe normale. Nos expérimentations sont accompagnées d’une analgésie en péri- et post-opératoire. Des points limites ont été définis et permettent un suivi efficace des animaux et la mise en place de réponses adaptées le cas échéant grâce à une grille de scoring. Pour le bien-être animal, des enrichissements (coton, maisonnette et papier) sont placés dans les cages.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour étudier les mécanismes de la réparation osseuse, car les étapes de réparation ressemblent aux étapes observées chez l’homme. La souris permet d’analyser les bases génétiques de la réparation osseuse normale ou pathologique grâce aux nombreux outils cellulaires et moléculaires à notre disposition. Les procédures sont réalisées sur des animaux aux jours 5-14 postnatal et des animaux adultes entre 2 et 16 mois.

2 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 905 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection d'endotoxine bactérienne ou de bactéries vivantes pour déclencher un sepsis, précédée pour certaines de cinq injections quotidiennes sur une semaine ou de quatre injections hebdomadaires sur un mois, et suivie pour d'autres de dix injections en sept jours. Le porteur énumère les atteintes attendues : inflammation systémique sévère, défaillance du foie, des reins, du cœur et des poumons, troubles de la coagulation, hypotension, hypothermie ou fièvre. Il écrit qu'aucun modèle in vitro ne reproduit cette complexité et qu'il reste attentif aux avancées qui pourraient un jour limiter le recours aux animaux, tout en programmant l'induction d'un choc septique chez près de trois mille souris.

Objectifs

Le sepsis est une complication très grave des infections bactériennes et virales. Il peut apparaître de manière soudaine et imprévisible. Cette maladie survient lorsque le système immunitaire, censé protéger l’organisme contre les infections, s’emballe et déclenche une inflammation excessive, appelée choc cytokinique. Cette réaction incontrôlée peut entraîner un dysfonctionnement des organes et, dans les cas les plus graves, une défaillance généralisée (Source : Ministère des Solidarités et de la Santé). Des recherches récentes ont mis en évidence l’existence de certaines molécules jouant un rôle clé dans la régulation du métabolisme et du comportement alimentaire. Ces molécules sont naturellement produites par les cellules et les organes. Chez la souris, leur inhibition entraîne une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids. De plus, leur neutralisation active un mécanisme biologique appelé autophagie, qui permet aux cellules d’éliminer leurs composants endommagés et de mieux résister aux agressions, notamment dans certaines maladies du foie. Sur la base de ces découvertes, ce projet de recherche vise à déterminer si la modulation de l’autophagie pourrait aider à prévenir le choc septique. Pour cela, deux modèles expérimentaux seront étudiés sur des souris : Un modèle d’endotoxémie, où une toxine bactérienne est injectée pour déclencher une forte réaction inflammatoire. Un modèle de bactériémie, où des bactéries vivantes sont injectées afin de reproduire une infection généralisée plus proche des cas observés chez l’humain. L’objectif de cette recherche est d’explorer une nouvelle approche thérapeutique pour limiter l’inflammation excessive et améliorer la prise en charge du sepsis, une condition qui reste à ce jour un défi médical majeur.

Bénéfices attendus

Le sepsis représente un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Chaque année, il affecte près de 50 millions de personnes, avec une mortalité particulièrement élevée chez les enfants de moins de 5 ans, qui représentent plus de 40 pour cent des cas. Cette pathologie touche de manière disproportionnée les pays à faibles et moyens revenus, mais reste également l’une des principales causes de décès dans les pays développés. Globalement, le sepsis est responsable de plus de 11 millions de décès annuels, alors que beaucoup de ces décès pourraient être évités grâce à une prise en charge rapide et efficace. En Europe, le sepsis est à l’origine de près de 700 000 décès chaque année, dont environ 57 000 en France, soulignant l’urgence d’améliorer les stratégies de prévention et de traitement. Ce projet vise à valider une nouvelle approche thérapeutique contre la septicémie, en testant l’activation du flux autophagique dans un modèle préclinique approprié et représentatif de l’évolution clinique de la maladie. L’objectif est double : Évaluer l’efficacité et la pertinence de cette stratégie thérapeutique dans un cadre expérimental rigoureux, permettant d’identifier une nouvelle cible pour limiter l’hyper-inflammation et améliorer la survie des patients atteints de sepsis. Mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents au sepsis, qui restent encore insuffisamment caractérisés, notamment en ce qui concerne l’impact du métabolisme cellulaire et de l’autophagie dans la réponse inflammatoire systémique. En apportant de nouvelles connaissances sur ces mécanismes et en ouvrant des perspectives thérapeutiques innovantes, ce projet pourrait contribuer à la réduction de la mortalité associée au sepsis et à l’amélioration des stratégies de prise en charge clinique.

Procédures

La mise en place des modèles murins de sepsis implique plusieurs types d'interventions. Celles-ci comprennent des injections ainsi que des procédures de suivi et d'analyse. Avant de déclencher le sepsis, certaines souris recevront 5 injections quotidiennes sur une semaine (traitement par une molécule pour l’induction de la délétion génique). Certaines souris recevront 4 injections hebdomadaires sur 4 semaines. Chaque injection dure quelques secondes et est réalisée sur animal vigile. Enfin, certaines souris ne recevront aucune injection préalable. Pour la mise en place du sepsis, toutes les souris recevront une injection unique (quelques secondes) sur animal vigile. Après le déclenchement de la maladie, certains animaux recevront 10 injections sur 7 jours en fonction des groupes expérimentaux sur animal vigile. Chaque injection dure quelques secondes. Chaque pesée dure également quelques secondes. L'examen non invasif de la pression artérielle sera effectué sans anesthésie et durera environ 15 minutes. L'échocardiographie nécessite une anesthésie légère et dure environ 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus dans ce projet sont principalement liés à l’induction de l’endotoxémie et de la bactériémie. Les effets indésirables attendus sont ceux classiquement associés à l’induction du sepsis expérimental, sans effets additionnels imprévus. Les principales nuisances incluent : Inflammation systémique sévère, associée à une production excessive de cytokines pro-inflammatoires. Dysfonction d’organes (foie, reins, cœur, poumons), due à l’hypoperfusion tissulaire et au stress oxydatif. Altération de la coagulation, avec un risque accru de thromboses ou d’hémorragies. Hypotension, résultant d’une vasodilatation excessive et d’une augmentation de la perméabilité vasculaire. Altération de la barrière intestinale, favorisant la translocation bactérienne. Dysfonction immunitaire, avec une phase initiale d’hyperactivation suivie d’une immunosuppression secondaire. Altération de la thermorégulation, pouvant entraîner hypothermie ou fièvre. Les injections intrapéritonéales peuvent entraîner un stress temporaire, lié à la contention des animaux, une douleur locale transitoire au point d’injection, une inflammation locale (rougeur, œdème), un risque d’infection au site d’injection, notamment dans le modèle de bactériémie. Les effets liés aux interventions pharmacologiques pourraient induire des perturbations du métabolisme énergétique et modifications du poids corporel. Les mesures de pression artérielle non invasives peuvent induire un stress lié à la contention, malgré l’habituation préalable des animaux. L’échocardiographie nécessite une anesthésie, qui peut provoquer une hypothermie transitoire, et une récupération retardée.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur afin de prélever les différents organes pour des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques.

Remplacement

Le sepsis résulte d’une réponse immunitaire incontrôlée à une infection, impliquant une activation excessive des cellules immunitaires, la libération massive de cytokines, l’activation des voies de coagulation et un dysfonctionnement vasculaire, conduisant à une défaillance multi-organes. À ce jour, aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité du sepsis, notamment les interactions dynamiques entre le système immunitaire, les organes vitaux et le microbiote. Bien que des alternatives comme les cultures cellulaires et les organoïdes permettent d’étudier certains mécanismes isolés, elles ne remplacent pas l’étude sur organisme entier. L’expérimentation animale reste donc nécessaire à ce stade, mais nous restons attentifs aux avancées scientifiques qui pourraient, à terme, proposer des alternatives fiables permettant de limiter davantage le recours aux animaux.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2880 souris, avec une optimisation des expérimentations pour réduire le nombre d’animaux témoins. Ce nombre a été rigoureusement déterminé à l’aide d’une analyse statistique préalable, incluant des calculs de puissance fondés sur les effets observés dans des études préliminaires et des données publiées dans des travaux similaires. L’étude sera interrompue si la première série d’expériences invalide l’hypothèse de travail, afin d’éviter toute utilisation inutile d’animaux. Afin de maximiser l’exploitation des données, plusieurs tissus seront prélevés (analyses immunologiques, histologiques, biologie cellulaire et moléculaire). Ces échantillons seront partagés avec nos collaborateurs, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés dans des études complémentaires.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes aux réglementations en vigueur et adaptées en collaboration avec le personnel de l’animalerie. Les animaux auront un accès libre à une alimentation équilibrée et à de l’eau ad libitum. Leur environnement sera enrichi avec du coton de nidification et des structures adaptées (tunnels en carton, morceaux de bois) afin de favoriser leurs comportements naturels et réduire le stress. En cas de difficulté alimentaire, un gel nutritif sera placé dans les cages pour faciliter l’accès à une nutrition adaptée et prévenir toute perte de poids excessive. Toutes les manipulations expérimentales seront réalisées en veillant à minimiser l’inconfort et la souffrance des animaux. Un suivi rigoureux sera mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter toute anomalie. Le personnel impliqué dans ce projet est hautement qualifié et bénéficie d’une formation continue aux bonnes pratiques d’expérimentation animale. Toutes les procédures seront réalisées avec du matériel approprié pour réduire la douleur et le stress, notamment : L’utilisation d’aiguilles de petit calibre pour minimiser la douleur des injections. Le recours à des anesthésiques adaptés lorsque nécessaire. Les sites d’injection feront l’objet d’une surveillance rigoureuse afin de détecter toute inflammation ou infection. En cas de complication, des interventions appropriées seront réalisées, notamment l’application d’antiseptiques. Si des comportements agressifs ou des blessures sont observés chez les mâles, ils seront placés en hébergement individuel, avec un enrichissement adapté (coton de nidification, morceaux de bois) pour maintenir leur bien-être. Toute blessure sera immédiatement prise en charge.

Choix des espèces

Le choix des souris comme modèle animal se justifie par plusieurs raisons scientifiques. Elles représentent le modèle de laboratoire le plus couramment utilisé, ce qui permet de s'appuyer sur une vaste expertise en élevage, manipulation expérimentale et suivi vétérinaire. Les lignées de souris offrent l’avantage de disposer de modèles génétiquement modifiés spécifiques de nos protéines d’intérêt. Les lignées choisies sont immunocompétentes et ne présentent pas de phénotypes préjudiciables. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines, afin de disposer d’un organisme dont le développement est achevé.

Quatorze injections et deux chirurgies pour un même animal en deux à trois mois : 4 210 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Les expérimentateurs leur injectent des cellules cancéreuses sous la peau, dans le cœur, dans une veine, dans le tibia ou dans le pancréas, et certaines développent des tumeurs pendant sept mois. Le porteur décrit des douleurs abdominales, une lyse osseuse en cas de métastases et une hypersensibilité thermique et mécanique aux pattes et à la bouche provoquée par les chimiothérapies, hypersensibilité que le projet cherche précisément à reproduire pour en comprendre le mécanisme. Il emploie des souris nude de cinq semaines, immunodéficientes pour accepter les cellules humaines, et précise que les tumeurs prennent mal chez des animaux plus âgés.

Objectifs

Ce projet à pour objet l’amélioration des traitements des cancers pancréatique et prostatique. Trois objectifs distincts sont définis : (1) l’amélioration d’un traitement existant, (2) la compréhension des mécanismes de résistance aux chimiothérapies, et (3) l’identification des interactions potentielles entre effet secondaires des chimiothérapies et développement du cancer. (1) Nous avons précédemment montré le rôle in vivo de la protéine TRPV6 dans le développement tumoral et métastatique du cancer de la prostate. De plus, nous avons développé un anticorps capable de cibler spécifiquement cette protéine afin d'inhiber son activité et réduire ainsi significativement la croissance tumorale. Enfin, nous avons montré in vitro que l'inhibition simultanée de TRPV6 et d’un récepteur membranaire impliqué dans la métastase permettait de potentialiser la réduction de la croissance cellulaire de manière synergique. L’objectif de cet axe est de déterminer si l’inhibition conjointe de ces deux protéines augmente l’efficacité de notre anticorps à réduire la croissance tumorale. (2) Malgré l'efficacité des chimiothérapies actuelles, certaines cellules cancéreuses survivent et provoquent la récidive tumorale chez le patient. Un des objectifs du projet est de préciser le rôle de protéines clés dans la mise en place de cette résistance afin de pouvoir les cibler pour augmenter la réponse aux traitements. (3) Certains composés utilisés en chimiothérapie ont aussi comme effet secondaire le développement d’une neuropathie périphérique. La manière dont la chimiothérapie interagit avec le contexte cancéreux pour déclencher des douleurs neuropathiques est inconnu. L’objectif principal de cet axe est de préciser les mécanismes reliant certaines protéines connues pour être impliquées dans la thermoception et la nociception aux hypersensibilités thermiques déclenchées par la chimiothérapie dans le cadre du cancer du pancréas.

Bénéfices attendus

(1) Cet axe permettra potentiellement une amélioration significative de l'efficacité d'un traitement du cancer de la prostate par anticorps. Ces études sont cruciales pour potentialiser les effets de ce traitement sur le développement tumoral et métastatique. (2) Démontrer le rôle et l’implication de certaines protéines clés dans les mécanismes induisant la chimiorésistance dans le cancer du pancréas permettra de corréler la présence de ces protéines et de les proposer comme potentiel outil en clinique. (3) La neuropathie périphérique qui résulte des chimiothérapies d’intérêt mène chez certains patients à l’arrêt du traitement. A long terme, la prévention de ces symptômes pourrait donc permettre une meilleure prise en charge de la tumeur et une meilleure observance du traitement, menant à un taux d’échec moins important. Enfin, déterminer les mécanismes à l’origine des hypersensibilités douloureuses induites par la chimiothérapie dans un contexte de cancer permettra une meilleure sélection des molécules candidates à l’établissement de traitements visant à réduire ces douleurs chez le patient.

Procédures

Les animaux se verront injecter des cellules cancéreuses (voie souscutanée, intracardiaque, intraveineuse, intratibiale ou intrapancréatique) sous anesthésie gazeuse (environ 2-3 minutes d'anesthésie gazeuse avant l'injection des cellules qui prendra quelques secondes) afin de créer différents modèles permettant de visualiser le développement tumoral à tous les stades de la maladie. Les animaux seront par la suite traités (quelques secondes seront nécessaires pour les injections intrapéritonéales, 2 fois par semaine) avec divers composés ciblant des protéines clés afin de mesurer l'impact de ces composés sur le développement tumoral, et/ou avec des composés utilisés en chimiothérapie. Certains animaux seront injectés avec un traceur (quelques secondes nécessaires pour l'injection sous-cutanée) permettant de localiser les cellules d’intérêt. Enfin, une partie des animaux passeront des tests comportementaux d’hypersensibilité (qui peuvent durer jusque 2-3min maximum). Dans certains cas, ces 5 interventions auront lieu chez un même animal. La durée des expérimentations peut varier suivant la vitesse de développement tumoral allant jusque 3 mois maximum pour les animaux greffés directement avec des cellules cancéreuses et jusque 7 mois pour les animaux développant spontanément des tumeurs pour mimer au plus près ce qui se passe chez le patient. Au maximum, un même animal recevra 14 injections et 2 chirurgies en 2 à 3 mois.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront des tumeurs, ce qui peut engendrer des signes de stress tels qu’une prostration ou une perte de poids. De plus, les animaux modèles de cancer du pancréas peuvent présenter des douleurs abdominales liées à ce type de tumeurs. Dans certaines procédures, ces tumeurs seront prises en charge par des chimiothérapies induisant une hypersensibilité thermique et mécanique (retrouvée principalement au niveau des pattes et de la bouche), ce qui peut constituer une autre nuisance pour l’animal. Dans le cas où des métastases osseuses apparaissent, il peut également y avoir une lyse osseuse. L’anesthésie gazeuse ne constitue qu’une nuisance légère, les souris se réveillant en quelques dizaines de secondes.

Devenir

Afin de mettre fin à la souffrance des animaux qui présenteront des tumeurs, à la fin de chaque protocole, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et immunologiques de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. L’utilisation d’animaux d‘expérimentation est particulièrement pertinente dans le cadre de recherche en cancérologie reflétant ce qui se produit dans la pathologie humaine. De plus, le guidage et l’installation des cellules cancéreuses vers un organe cible comme l'os au niveau d’un organisme entier n’est pas reproductible in vitro. Enfin, il est obligatoire pour une partie du projet de regarder l'effet d'une hypersensibilité induite par des chimiothérapies dont aucun modèle n'existe in vitro.

Réduction

Un logiciel statistique a été utilisé afin de déterminer la taille des groupes nécessaires à la génération de données fiables. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, entre 10 et 20 souris par groupe expérimental seront nécessaires pour ce type d’étude. Des expériences préalables ont été effectuées dans le but de déterminer la dose optimale des anticorps, ne permettant pas de réduire le nombre d’animaux. Dans certains cas, certaines souris pourront être réutilisés (notamment les souris de groupes contrôles) pour limiter le nombre d'animaux utilisés et suivant les résultats obtenus (si négatifs notamment), certains groupes ne seront pas réalisés. Egalement, pour certains protocoles nécessitant des gestes techniques précis, des entrainements seront réalisés sur des souris ayant été euthanasiés dans d'autres protocoles pour limiter le taux d'échec au moment des injections.

Raffinement

Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi avec tunnel en papier, bâton à ronger, papier kraft et coton pour réduire le stress des animaux et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques. Afin de réduire le stress des animaux, seules les manipulations nécessaires aux différentes procédures seront réalisées par des expérimentateurs formés et expérimentés à la manipulation des animaux. La durée des manipulations ainsi que leurs fréquences seront réduites au strict minimum afin de limiter le stress associé. Des mesures spécifiques comme une surveillance accrue, des soins postopératoires ainsi que la gestion de la douleur seront prises en relation avec les procédures pour minimiser les effets indésirables sur le bien-être des animaux . Pour cela, dans les différentes procédures, une grille d’évaluation du bien-être, des points limites adaptés, un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance sont mis en place. Pendant toute la durée des procédures, des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés afin d’éviter la douleur pendant mais aussi après les procédures. En cas de signes graves de stress associé à un de nos points limites, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris nude sont couramment utilisées en oncologie. Elles sont immuno-déficientes, ce qui permet l’injection de cellules tumorales humaines et ainsi reproduire les tumeurs humaines in vivo. Elles ne possèdent pas de lymphocytes T (permettant d'éviter le rejet de greffe), mais les autres cellules du système immunitaire (lymphocytes B, macrophages, cellules dendritiques, cellules NK) sont présentes et ne sont pas affectées dans leurs fonctions. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 5 semaines, le développement des tumeurs humaines étant très faible chez les animaux plus âgés.

12 porcs de trois à six mois vont être utilisés, chacun portant huit à dix plaies chirurgicales créées sur son dos sous anesthésie générale, au cours d'une opération de trois heures. Dix sont exposés à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, deux à un niveau sévère. Suivent jusqu'à douze changements de pansement, chacun sous anesthésie et accompagné d'une prise de sang et d'une biopsie par plaie, le porteur indiquant que les plaies seront douloureuses surtout les premiers jours. Le nombre d'animaux est calculé à partir du nombre de plaies exploitables, deux porcs à dix plaies étant préférés à quatre porcs à cinq plaies, et tous sont tués à la fin pour des analyses histologiques.

Objectifs

On estime qu’en Europe, environ 1 à 2 % de la population souffre d’une plaie chronique, soit plusieurs millions de patients. Les principales catégories sont les ulcères veineux, artériels, mixtes, les plaies diabétiques et les escarres. Leur prévalence est en augmentation en raison du vieillissement de la population et de la hausse des maladies chroniques telles que le diabète ou l’insuffisance veineuse. Le traitement des plaies chroniques repose sur une prise en charge globale comprenant le nettoyage de la plaie, le contrôle de l’infection, la gestion du suintement des plaies, l'éliminiation des tissus mort et la promotion de la cicatrisation. Malgré les progrès, les traitements actuels présentent des limites importantes. Les pansements modernes sont utilisés pour maintenir un environnement humide favorable à la cicatrisation mais n’active pas directement cette cicatrisation. La cicatrisation est souvent lente et incomplète, entraînant des récidives fréquentes et une altération de la qualité de vie. De plus, il n'existe pas de solution unique adaptée à tous les types de plaies : chaque patient nécessite une prise en charge personnalisée, tenant compte de la cause de l'apparition des plaies et des troubles associés . La mise en place des soins est lourde car 1) la cicatrisation peut prendre du temps 2) il est nécessaire de changer les pansements de manière régulière 3) les soins peuvent être douloureux Les infections représentent également une complication fréquente et majeure. La formation d'un environnement bactérien rend les traitements locaux moins efficaces et complique la lutte contre les agents pathogènes. Par conséquent il est nécessaire de dévelloper de nouvelles alternatives ( destinées à être délivrées localement pour favoriser la cicatrisation de la peau et lutter contre les infections.

Bénéfices attendus

Un meilleur traitement des plaies chroniques peut transformer profondément la vie des patients et alléger considérablement la charge sur le système de santé. Voici les principaux bénéfices que l'on peut en attendre : I – Amélioration de la qualité de vie des patients : 1) accélérer le processus de cicatrisation 2) éviter l’aggravation ou la stagnation de la plaie 3) Diminuer la fréquence de changement de pansement. II -Une réduction des complications médicales : 1) Diminution des surinfections 2) Diminution des nécroses tissulaire pouvant aller jusqu’à l’amputation. III - Diminution des coûts de santé : 1) réduduction de la durée et du nombre des soins 2) prévention des rechutes.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés (fixe) pour la réalisation de la procédure chirurgicale (création de plaies sur la peau), la mise en place des traitements et les changements de pansement. Les injections d'anesthésiques se feront dans le muscle et seront très bref, quelques secondes. Les animaux seront ensuite maintenus anesthésiés grâce à une anesthésie gazeuse. Ils resteront anesthésiés (gazeuse) le temps de la réalisation des différents actes, soit 3h environ pour la réalisation de la chirurgie et la mise en place des traitements et 45min pour les changements de pansement . Au maximum il y aura un total de 12 changements de pansement pour toute la durée de l'étude. Une fois par semaine, pendant les changements de pansement et sous anesthésie, une prise de sang sera réalisée ainsi 1 biopsie par plaie. Les biopsies seront réalisés en alternant les plaies une semaine sur deux, de façon à ce que les plaies ne soient prélevées qu'une fois toutes les deux semaines.

Impact sur les animaux

Les contentions et injections pour les anesthésies provoqueront un stress et une douleur transitoire chez les animaux. Ces nuisances ne dureront pas plus de quelques minutes pour les animaux. Les mises à jeun avant les anesthésies provoqueront également un stress chez les animaux. Les plaies chirurgicales déclencheront une réaction inflammatoire pour amorcer la cicatrisation. Cette réaction provoquera rougeur, chaleur, gonflement et douleur. Les plaies seront douloureuses, surtout les premiers jours, cette douleur devrait s’estomper au fur et à mesure de la cicatrisation. L’hébergement individuel provoquera également un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'étude afin de preléver les sites et réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

La cicatrisation, et plus particulièrement l’épithélialisation des plaies se déroulent selon un enchaînement de séquences ordonnées au cours desquels les kératinocytes migrent, prolifèrent et se différencient. Les différentes phases, et leur enchainement, nécessitent l'intervention de multiples types cellulaires et médiateurs : ce processus complexe ne peut être reproduit à l'aide de techniques alternatives.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé en fonction du nombre de plaies que l’on peut créer. Afin de pouvoir mettre en avant une différence significative entre les traitements il nous faut 10 observations par modalités de traitement. Ainsi deux porcs avec 10 plaies/porcs sont nécessaires pour comparer un traitement de référence avec un traitement test. Cahque animal sera utilisé pour tester un maximum de conditions expérimentales (sans impacter la fiabilité des résultats) de façon à utiliser le moins d'animaux possible : ainsi on préfèrera 2 porcs avec 10 plaies plutôt que 4 porcs avec 5 plaies. La taille et le nombre des plaies seront adaptés, de façon à rester toujours inférieurs à 10% de surface corporelle en plaies profondes ou 25% en plaies superficielles. (Ces limites sont basées sur l'évaluation de gravité de plaies chez l'Homme) Dans tous les cas, au sein de ces limites, on veillera à réduire la taille et le nombre des plaies au strict minimum nécessaire pour répondre aux objectifs de chaque étude.

Raffinement

Les animaux feront l'objet d'un entrainement, basé sur des interactions positives avec les personnels en charge des soins, ceci afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Des changements de pansement seront réalisés régulièrement, minimum 2x/semaine les trois premières. Lors des changements de pansement les plaies seront observées et nettoyées. Un examen clinique avec pesée sera réalisé lors de chaque changement de pansement. Des mesures compensatrices sont mises en place lors de l’hébergement individuel des animaux. Les boxes sont ajourés, permettant au cochon de se voir, se toucher et se sentir. En outre, ils seront promonés tous les jours (fréquence qui pourra être augmenté si nécessaire) par un soigneur qu’il leur distibuera des récompenses. Si les animaux montrent de la douleur au-delà de 3 jours (fin du procotole d’analgésie), les traitements seront prolongés autant que nécessaire. Des points d'alerte adaptés, bien connus par notre laboratoire permettent d'anticiper et traiter la souffrance avant qu'elle apparaisse. Si toutefois la souffrance apparaît, des points limites basés sur des critères cliniques sont prévus, permettant d'interrompre les procédures et mettre fin aux souffrances.

Choix des espèces

Le Porc est utilisé dans les études de cicatrisation du fait de la similarité de sa peau avec la peau humaine (1). De plus, le choix d'animaux de taille adaptée permet la réalisation de plusieurs plaies sur un seul animal, ce qui permet d'obtenir des résultats statistiquement exploitables sur un plus faible nombre d'animaux L'utilisation de porcs d'environ 35 à 50kg permet de réaliser 8 à 10 plaies par animal et d’obtenir de résultats statistiquement exploitables pour un grand nombre de modalités, avec un nombre réduit d'animaux. Il s'agit d'animaux jeunes (3-6 mois), dont la peau se rapproche le plus possible de la peau humaine. Ce stade de développement est le meilleur rapport entre maniabilité des animaux / longueur du dos adaptée au nombre de plaies / similarité avec la peau humaine.