Procédures sévères

Une brûlure superficielle de la peau au point de contact de la sonde, des troubles moteurs possibles, puis vingt jours d'hébergement individuel sans cachette: 450 poissons cichlidés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélever leur cerveau. Chacun passe cinq tests de comportement avant et après une lésion cérébrale infligée par ultrasons sous anesthésie, sur trois mois au maximum. Il s'agit de savoir à quoi sert le lobe inférieur, une structure propre à ces poissons, chez des espèces qui utilisent des outils, se reconnaissent dans un miroir et identifient leurs congénères. Trois espèces ont été retenues parce que leur cerveau est assez gros pour l'imagerie, celui du poisson zèbre et du médaka ne l'étant pas.

Objectifs

Certains poissons présentent des comportements comme l’utilisation des outils, l’utilisation du miroir (reconnaissance de soi), la reconnaissance individuelle, et une communication multimodale complexe. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau de ces poissons, qui présentent des origines géographiques, une taille et des comportements différents. Les cerveaux des poissons sont organisés de façon très différente par rapport aux cerveaux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. En particulier, une structure de la partie ventrale du cerveau, le lobe inférieur, n'existe que chez ces poissons, et n’est pas retrouvée chez les mammifères ou les oiseaux. Les fonctions de cette structure demeurent inconnues, et nos travaux précédents suggèrent qu’elle pourrait être impliquée dans les fonctions cognitives remarquables citées précédemment. Mieux connaître la fonction du lobe inférieur chez les poissons permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux aussi différents que ceux des poissons ont pu permettre l’émergence de comportements complexes. Cette étude permettra donc de mieux comprendre comment des cerveaux dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs différents (EU 1/2 et EU 2/2).

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires. Ainsi, les bénéfices principaux de cette étude sont d’apporter une meilleure compréhension aux mécanismes biologiques fondamentaux d’évolution du cerveau et des comportements dits « intelligents ». L’étude de poissons permet en outre d’élargir le champ de la connaissance à ce groupe, dont l’anatomie du cerveau demeure peu connue.

Procédures

Les poissons seront soumis à 5 tests de comportement avant et après une lésion cérébrale pendant une durée maximale totale de 3 mois (durée des tests après la lésion : 3 à 20 jours, avec une à deux sessions d’une heure par jour). Les tests de comportement seront évalués sur animal vigile au sein de l’EU1/2. Les poissons seront soumis à la procédure de lésion cérébrale par ultrasons durant environ une heure sous anesthésie dans l’EU2/2.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont liées à: - La lésion par ultrasons, qui pourrait créer des problèmes moteurs, et provoquer une brûlure superficielle de la peau au point de contact avec la sonde ultrasons. - L’hébergement individuel et les tests comportementaux, qui nécessitent cet hébergement individuel des individus, et peuvent provoquer un stress pour l’animal. - La manipulation des animaux pour l’anesthésie (stress potentiel).

Devenir

L’euthanasie des individus est nécessaire au prélèvement de leur cerveau pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet, permettant de visualiser précisément le site de chaque lésion.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées par des modèles in silico, puisque nous étudions des comportements complexes. Notre étude nécessite des espèces de poissons téléostéens, qui seuls possèdent la structure cérébrale d’intérêt, le lobe inférieur, et nous avons besoin d’espèces possédant un lobe inférieur développé, ce qui est le cas des cichlidés. Les tests comportementaux prévus ne peuvent être réalisés que sur ces animaux. Les trois espèces que nous souhaitons utiliser, A. nigrofasciata, N. brichardi, P.zebra, ont des comportements très différents et des cerveaux organisés de façon différentes. De ce fait, il est pertinent et nécessaire d'utiliser ces trois espèces de cichlidés. Pour comprendre le rôle du lobe inférieur dans ces comportements, l'étude des lésions permet d'évaluer les déficits qui en résultent et d'établir un lien entre structure et fonction..

Réduction

Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses. Des études IRM précédemment publiées chez les mammifères, oiseaux et amphibiens nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge et leur bien-être est évalué régulièrement par des zootechniciens compétents. La température de la pièce est surveillée. Après la lésion cérébrale, le bien-être des animaux est plus attentivement surveillé jusqu'à euthanasie des animaux (20 jours maximum après la lésion). Aussi, la communication entre le personnel de zootechnie et les expérimentateurs est optimisée pour permettre un suivi adéquat des animaux. Des points limites tels que la nage anormale (sur le dos, sur le côté) ou la rétractation des pigments sont utilisés pour évaluer le bien-être ; ils prennent en compte des comportements ou signes visibles. Dans le cas où des animaux montreraient des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Selon la gravité de ces signes, les animaux pourront être soignés via une analgésie diluée dans l’eau de leur bassin , ou si ce n'est pas possible de soigner, ils seront euthanasiés dans les délais les plus brefs. L’analgésie par bain en post opératoire a été choisie pour réduire le stress de l’animal, puisqu’une injection demanderait la manipulation du poisson, ce qui produirait un stress trop important. En cas de brûlure légère liée à la température de la sonde, un pansement antiseptique sera appliqué que la plaie jusqu’à cicatrisation. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement pour fournir de l'enrichissement, sauf dans les jours suivant la procédure de lésion (durée maximum : 20 jours). Un contact visuel entre les poissons sera possible avant et après l’intervention puisque les aquariums seront placés les uns à côté des autres. Lors du transport des animaux, la température de l’eau sera maintenue par l’utilisation de chaufferettes dans la boîte de transport.

Choix des espèces

Les poissons utilisés sont reconnus comme des animaux modèles pour les études anatomiques des structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez 3 espèces qui ont des comportements propres et des cerveaux anatomiquement différents, mais chaque espèce présente des comportements qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude fonctionnelle de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser l’imagerie nécessaire à ce projet avec une résolution suffisante. L’utilisation de cichlidés, et en particulier de ces trois espèces, dont la taille du cerveau permet l’imagerie, semble donc toute indiquée. Nous utilisons dans le cadre de ce projet des poissons adultes, puisqu’il est nécessaire que le cerveau soit mature.

1 250 souris dépourvues d'interleukine 10 vont être élevées et utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, sans aucune intervention ni prélèvement pendant l'élevage. Avec l'âge, une partie d'entre elles développe une inflammation chronique du côlon qui peut entraîner de fortes diarrhées, des saignements rectaux, une déshydratation et une perte de poids importante, et environ 85 % des femelles et 90 % des mâles atteignent l'âge de 14 semaines. Cet élevage doit fournir à l'équipe et à ses partenaires des souris pour leurs recherches sur les maladies inflammatoires de l'intestin : elles y entrent dès 4 semaines et sont tuées à l'issue des procédures, les autres étant gardées pour la reproduction ou tuées en cas de souffrance, après deux mois sans portée ou à 24 semaines. Le porteur se donne pour objectif de mieux élever ces souris "tout en minimisant leur possible souffrance", et qualifie leur utilisation d'"essentielle" pour cette recherche.

Objectifs

Ce projet vise à décrire la prise en charge des animaux d’une lignée de souris développant progressivement une inflammation chronique de l’intestin (colite). Ces souris sont un modèle des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI), qui incluent la maladie de Crohn et la colite hémorragique qui sont causées par un mélange de facteurs génétiques, environnementaux et liés aux microbes présents dans l’intestin. Normalement, le corps produit une molécule appelée interleukine 10 (IL-10) qui aide à limiter l’inflammation dans l’intestin. Mais chez ces souris, cette molécule est absente, ce qui entraîne une réaction excessive du système immunitaire et une inflammation chronique du côlon. De plus, des éléments comme certains additifs alimentaires ou les antibiotiques peuvent aggraver cette inflammation en modifiant les microbes intestinaux. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment élever et prendre en charge ces souris tout en minimisant leur possible souffrance, afin de mieux étudier les maladies inflammatoires de l’intestin et, à terme, aider à la recherche sur ces maladies chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre à notre équipe et à nos partenaires d’avoir les souris nécessaires pour mener nos recherches sur les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). À long terme, ces souris aideront les chercheurs à mieux comprendre les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Grâce à elles, on pourra trouver de nouvelles façons de traiter ces maladies et identifier des marqueurs pour mieux les diagnostiquer. Ces souris permettront aussi de tester de nouveaux médicaments anti-inflammatoires et d’évaluer leur efficacité par rapport aux traitements déjà disponibles pour les patients atteints de MICI.

Procédures

Ce projet vise à gérer la production d’une lignée de souris qui peuvent développer des problèmes de santé progressifs avec l’âge. En particulier, ces souris pourront développer des signes d’inflammation de l’intestin (diarrhées, perte de poids, comme les patients atteins de MICI). Ils ne subiront aucune intervention ni prélèvement pendant toute la durée de l’élevage.

Impact sur les animaux

Certaines de ces souris peuvent commencer à développer progressivement avec l’âge une inflammation de l’intestin. Cela peut entraîner de fortes diarrhées, des saignements rectaux, une déshydratation et une perte de poids importante. Dans ces cas-là, l’expérimentation est arrêtée pour éviter toute souffrance excessive. En général, environ 85 % des femelles et 90 % des mâles atteignent l’âge de 14 semaines.

Devenir

Les souris générées dans ce projet seront soit intégrés dans un protocole expérimental dès 4 semaines de vie, soit gardés en vie pour la gestion des accouplements, soit euthanasiés lorsqu'elles présenteront des signes de souffrance ou lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois ou âgées de 24 semaines (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement ou incluses dans un protocole de recherche). Les souris incluses dans un projet de recherche seront euthanasiées à l'issue des procédures expérimentales

Remplacement

L’utilisation de souris de laboratoire est essentielle pour cette recherche, car les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont très complexes. Elles impliquent plusieurs facteurs comme le système immunitaire, les microbes intestinaux, la génétique et l’environnement. Ces maladies affectent non seulement l’intestin mais aussi d’autres organes et provoquent une inflammation persistante dans tout le corps. Pour comprendre comment l’environnement et les microbes interagissent avec l’organisme, les souris sont le modèle le plus adapté. À ce jour, il est impossible de recréer ces interactions complexes en laboratoire uniquement avec des cellules, d’où la nécessité d’étudier ces maladies sur des animaux vivants.

Réduction

Nous ajusterons l’élevage des souris en fonction des besoins de recherche de l’équipe de recherche. Ayant une connaissance approfondie de cette lignée (son mode de reproduction, le nombre et la taille des portées), nous sommes en mesure de gérer l’élevage de manière efficace et raisonnée. Concrètement, nous maintenons en permanence deux couples reproducteurs pour assurer la continuité de la lignée. Si une expérience spécifique est prévue et approuvée, nous augmentons temporairement le nombre de souris pour répondre aux besoins de l’étude.

Raffinement

Les souris seront surveillées de façon journalière par du personnel technique dans le cadre de la surveillance obligatoire. En outre, une surveillance sera effectuée 1 à 3 fois par semaines par du personnel qualifié pour évaluer la santé des animaux. Si certains développent une inflammation de l’intestin, des soins adaptés seront mis en place en fonction de leur état, comme l’ajout d’un gel de réhydratation. S’il n’y a pas d’amélioration de leur état, elles seront euthanasiées afin d’éviter toute souffrance. L’évolution de la maladie sera suivie grâce à un système de notation qui prend en compte la perte de poids, l’apparence, la présence de diarrhée et le comportement des souris. Selon leur score, des mesures progressives seront appliquées (un suivi plus fréquent, l’ajout de gel de réhydratation, voire l’arrêt du protocole si nécessaire. Enfin, leur environnement sera aménagé avec des éléments comme du coton, des petites maisons et un éclairage respectant le cycle jour/nuit pour leur permettre d’adopter un comportement naturel.

Choix des espèces

Les souris sont souvent utilisées pour étudier les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), car elles permettent de mieux comprendre les liens entre l’alimentation, l’environnement, les microbes intestinaux et l’intestin lui-même. Dans ce projet, nous utilisons une lignée de souris qui ne produit pas une protéine clé entrainant ainsi une inflammation intestinale ressemblant à une colite hémorragique chez l’humain. Ce modèle génétique de la maladie n’existe que chez la souris. Les souris pourront commencer à se reproduire dès l’âge de 5 semaines, qui correspond à leur maturité sexuelle.

2 000 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir une prothèse crânienne, subir un accès chirurgical à l'artère cérébrale moyenne, un AVC provoqué, puis six séances d'imagerie fonctionnelle d'une heure étalées jusqu'au quatre-vingt-dixième jour. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance sévère et toutes les souris sont tuées à J+90, le porteur estimant que les maintenir en vie plus longtemps entraînerait une souffrance chronique. Les déficits fonctionnels et cognitifs consécutifs à l'ischémie cérébrale sont eux-mêmes classés sévères, et la mise à mort intervient dès une perte de poids supérieure à 20 % ou un score de grimace supérieur à 7. Le même document affirme pourtant que les acquis du laboratoire montrent des animaux qui se déplacent et s'alimentent normalement, prennent soin de leur pelage et n'émettent aucun son audible.

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, caractérisé par l'obstruction d'un vaisseau sanguin cérébral, induit des lésions cérébrales séquentielles : les premières atteintes touchent le compartiment vasculaire, suivies d'une altération de la barrière hémato-encéphalique et de lésions du parenchyme cérébral. Bien que l'injection intraveineuse de l'activateur tissulaire du plasminogène recombinant (rtPA) soit le traitement de référence pour les AVC aigus, les séquelles neurologiques, notamment au niveau du cortex somatosensoriel, restent importantes. De nombreux travaux ont mis en évidence que l'ischémie cérébrale induit des lésions neurologiques sévères, notamment au niveau du cortex somatosensoriel de la souris. Ces lésions, consécutives à l'occlusion vasculaire, altèrent significativement la plasticité cérébrale et entraînent des déficits sensoriels persistants. Ces résultats soulignent l'importance du cortex somatosensoriel dans la perception tactile et la localisation spatiale, ainsi que sa vulnérabilité face à l'ischémie. Si les conséquences d'un AVC sur le cortex somatosensoriel ont été largement étudiées, celles sur le cortex visuel demeurent méconnues. Cette lacune souligne l'importance d'une caractérisation approfondie des atteintes visuelles post-AVC. De plus, l'utilisation d'anesthésiques chez les modèles animaux, bien que nécessaire, peut influencer les résultats expérimentaux. Ainsi, notre étude vise à combler ces lacunes en caractérisant les atteintes visuelles structurelles et fonctionnelles consécutives à un AVC, ainsi qu'à évaluer la récupération fonctionnelle du cortex visuel et du cortex barrel. Nous porterons une attention particulière à l'intégrité du système vasculaire, notamment sous traitement thrombolytique associé ou non à un neuroprotecteur, en évaluant leur potentiel prédictif des altérations cérébrales à long terme. Cette approche originale permettra d'améliorer notre compréhension des mécanismes sous-jacents aux atteintes visuelles post-AVC et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. À notre connaissance, une telle caractérisation approfondie n'a pas encore été réalisée, soulignant ainsi l'originalité et l'importance de ce projet.

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies (AVC, Sclérose en plaques ; SEP et processus inflammatoires). En effet, une meilleure compréhension de cette interaction permettra de développer des stratégies thérapeutiques adéquates, permettant d’envisager d’améliorer les performances de patients dans ces différentes pathologiques.

Procédures

Procédure 1 (n=500) : Modèle d’AVC 1 & Procédure 2 (n=500) : Modèle d’AVC 2. - J0 : Induction de l‘AVC +/- Traitements à 20 minutes ou 4 heures (durée : 50 minutes). - J+1, J+5 : Evaluation du devenir cérébral (lésions, transformations hémorragiques, recanalisation) post-AVC par IRM (durée : 10 minutes). - J+1, J+3, J+7, J+15, J+30, J+90 : Evaluation par Imagerie par fUS (durée : 1 heure). - J+1, J+3, J+7, J+15, J+30, J+90 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 10 minutes/test). - J+90 : mis à mort par surdosage anesthésique/dislocation cervicale. Procédure 3 (n=500) : Modèle d’AVC vigile 1 & Procédure 4 (n=500) : Modèle d’AVC vigile 2. - J-11 : Pose d’une prothèse crânienne (durée : 45 minutes). - J-6/J-2 : Habituation (durée : 15-30 minutes). - J-1 : Accès à l'artère cérébrale moyenne (durée : 30 minutes). - J0 : Induction de l‘AVC +/- Traitements à 20 minutes ou 4 heures (durée : 50 minutes). - J+1, J+5 : Evaluation du devenir cérébral (lésions, transformations hémorragiques, recanalisation) post-AVC par IRM (durée : 10 minutes). - J+1, J+3, J+7, J+15, J+30, J+90 : Evaluation par Imagerie par fUS (durée : 1 heure). - J+1, J+3, J+7, J+15, J+30, J+90 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 10 minutes/test). - J+90 : mis à mort par surdosage anesthésique/dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient, selon leurs degrés de gravité du stress pour l’ensemble des procédures : Leger. Une perte de poids pour l’ensemble des procédures, une hypothermie lors des phases d’anesthésies : Modéré. Des douleurs post-opératoires, des déficits fonctionnels et /ou cognitifs dans le cadre de l’ischémie cérébrale : Sévère.

Devenir

Maintenir en vie des animaux ayant subi un AVC ischémique sur le long terme pourrait engendrer une souffrance chronique et une qualité de vie altérée, rendant la mise à mort éthiquement préférable pour minimiser leur douleur et préserver leur bien-être. Ainsi, l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, les approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. De plus, des méthodes d’études non invasives telle que l’IRM sont utilisées dans ce projet afin de faire un suivi longitudinal des animaux, permettant de recueillir de nombreuses données sans augmenter le nombre d’animaux. Dans ce projet aucune approche statistique n'a été réalisée, le nombre minimum d’animaux a été défini en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'aisance des expérimentateurs (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse. L’ensemble des échantillons collectés permettra également un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de papier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons une litière plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 20% est observée et/ou si un score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques). Durant la mise en place des modèles, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront également une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux des souris seront couverts afin de ne pas les éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et prévenir de la déshydratation. Après chirurgie, les souris disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra d’identifier les animaux les plus « à risque ».

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6-12 semaines seront nécessaires. Cette tranche d'âge correspondant à un stade de développement de "jeunes adultes" chez la souris, est cruciale pour assurer la comparabilité de nos résultats avec les données existantes au sein de notre laboratoire. En effet, nos modèles d'AVC ischémique ont été largement caractérisés et étudiés sur cette tranche d'âge spécifique. De plus, cette fenêtre développementale est fréquemment utilisée dans la littérature scientifique étudiant l'AVC et ses mécanismes physiopathologiques. L'utilisation d'animaux adultes de 6 à 12 semaines est justifiée par le fait qu'ils ont atteint une maturité physiologique et neurologique stable.

Une prostration, une difficulté respiratoire majeure ou une perte de poids supérieure à 20 % déclenchent la mise à mort par dislocation cervicale. 240 souris mâles privées de la protéine MeCP2 dans le cerveau vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leur cortex à la naissance puis à deux, quatre, six et huit semaines. Le porteur indique que le déficit neurologique apparaît vers la cinquième semaine, avec ataxie, tremblements, nervosité et respiration difficile, et que la moitié de ces souris meurent d'elles-mêmes à six semaines, 90 % à huit semaines. Le projet vise à valider une hypothèse sur l'organisation de l'ADN dans les neurones, un traitement pour les filles atteintes du syndrome de Rett restant, lui, une perspective.

Objectifs

L'ADN, qui contient l’ensemble des informations nécessaires au fonctionnement de nos cellules, est organisé sous une forme compacte appelée chromatine. Cette structure doit être souple et adaptable pour permettre aux cellules de fonctionner correctement. Lorsque cet équilibre est perturbé, cela peut entraîner des maladies, notamment des maladies dites « épigénétiques », qui affectent l’expression des gènes sans modifier directement l’ADN. Le syndrome de Rett est un exemple de maladie épigénétique rare qui touche presque exclusivement les filles. Il se manifeste par des troubles du développement neurologique entraînant un polyhandicap sévère, incluant une déficience intellectuelle, des troubles du spectre autistique et des complications respiratoires et cardiovasculaires pouvant réduire l’espérance de vie. Cette maladie est liée, dans la majorité des cas, à une mutation du gène MeCP2, situé sur le chromosome X. Les recherches sur le syndrome de Rett reposent en grande partie sur des modèles de souris génétiquement modifiées, permettant d’étudier la fonction de MeCP2 dans le cerveau. Il a ainsi été démontré que cette protéine joue un rôle clé dans le développement du système nerveux. Nos travaux récents suggèrent que le syndrome de Rett pourrait être une maladie de la chromatine : la mutation de MeCP2 empêcherait son rôle essentiel dans l’organisation de la chromatine des neurones, en perturbant son interaction avec certaines séquences répétées d’ADN. Pour mieux comprendre cette hypothèse, nous étudierons la fonction de MeCP2 dans le développement du cortex chez un modèle murin du syndrome de Rett.

Bénéfices attendus

Ce projet associera différentes approches fonctionnelles à l'échelle du génome novatrices et complémentaires. Il permettra une meilleure compréhension de la fonction neuronale de MeCP2, et clarifia l'étiologie moléculaire du syndrome de Rett. Les données obtenues pourraient conduire au développement de nouvelles thérapies pour cette maladie neuro-développementale sévère et incurable. De plus, nos travaux contribuent à la compréhension du rôle des courtes séquences d'ADN répétées sur l'organisation tridimentionnelle du génome et l’expression des gènes au cours du développement du cerveau, et peuvent avoir un impact plus large, notamment sur l'identification des mécanismes moléculaires impliqués dans les troubles du spectre autistique et dans les maladies neurodégénératives.

Procédures

Nous envisageons d'effectuer nos expériences sur des cortex prélévés sur des souris agées de 0, 2, 4, 6 et 8 semaines. Mais le déficit neurologique des mâles dépourvus en MeCP2 débute entre 4 et 5 semaines, entrainant une létalité de 50% à 6 semaines et de 90% à 8 semaines. Les souris agées de 6 ou 8 semaines seront donc probablement difficile à obtenir. Pour éviter d’avoir comme point limite la mort de l’animal pour ces souris, nous avons choisi une application stricte de point limite dès les premiers signes de souffrance (diminution importante de l’activité motrice ou prostration, difficulté respiratoire majeure ou perte de poids supérieure à 20% au poids attendu). Les souris seront observées quotidiennement, l'une de ces observations suffira à mettre en œuvre le point limite et les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les troubles neurologiques décris chez les souris où MeCP2 a été inactivée spécifiquement dans le cerveau à un stade embryonnaire précoce sont bien décris. Ils apparaisent vers la 5ème semaine et associent de l'ataxie, une hypoactivité, des tremblements, de la nervosité, une respiration diffcile et une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement post-mortem du cortex.

Remplacement

En associant des données biochimiques, structurales obtenues in vitro à des données génomiques obtenues à partir de cellules en culture, nous avons accumulé beaucoup de résultats préliminaires qui suggèrent que MeCP2 puisse agir comme un facteur de transcription pionnier dans les neurones, capable d'envahir la chromatine en se liant aux répétitions CA. Le syndrome de Rett pourrait ainsi être considéré comme une "maladie de la chromatine" provenant de l'incapacité qu’a MeCP2, lorsqu’elle est mutée, à moduler l'organisation de la chromatine. Nous souhaitons dans ce projet valider définitivement notre hypothèse de travail par des expériences effectuées sur l'animal, étape indispensable pour le développement d’approches thérapeutiques.

Réduction

Nous ne travaillerons que sur des souris mâles pour lesquelles l'expression de MeCP2 aura été supprimée dans le cerveau, car les femelles équivalentes ne sont pas viables. L’objectif est ensuite de minimiser le nombre d'animaux utilisé tout en assurant une puissance statistique suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives des données issues des analyses par séquençage haut-débit et atteindre l'objectif scientifique du projet. Nous estimons que de 3 à 5 réplicats biologiques seront nécessaires par expérience et par âge, soit un total de 240 souris en tenant compte de leur mortalité précoce.

Raffinement

Les mâles KO pour MeCP2 présentent une régression neurologique importante conduisant à une mort prématurée typiquement entre 6 et 8 semaines. Pour éviter d’avoir comme point limite la mort de l’animal, nous avons choisi une application stricte de point limite. Les souris seront observées quotidiennement et notées selon une grille de scoring de la douleur appliquée à l’animalerie qui repose sur l'aspect général (poids corporel, apparence physique, signes cliniques mesurables) et le comportement (modifications du comportement non provoqué, et après stimulation) : -Un score de niveau zéro n’entrainera aucune intervention particulière. -Un score de niveau 1 entrainera des soins spécifiques comme l’utilisation d’aliments gélifiés à même la litière afin de faciliter l’accès à la nourriture des animaux présentant une hypoactivité ou de l’ataxie, l’utilisation de tunnels de transfert pour la manipulation des souris présentant un phénotype de nervosité, l’utilisation d’analgésiques complémentaires, un contrôle biquotidien, une pesée régulière, une consultation éventuelle avec la Structure du Bien-Etre Animal et le vétérinaire. -Un score de niveau 2 sera le point limite et nécessitera une décision de mise à mort par la méthode de dislocation cervicale.

Choix des espèces

La lignée de souris crée est le modèle murin idoine puisqu'il développe des symptômes cliniques similaires au syndrome de Rett, avec un déficit neurologique sévère qui apparait vers la 5ème semaine et une létalité de 50% à 6 semaines. Pour ces raisons, nos expériences seront limitées aux 8 premières semaines de vie mais à différentes étapes du développement du cortex : 0, 2, 4, 6 et 8 semaines. La multiplication des points de cinétique est essentielle à notre étude puisqu'elle permettra de vérifier si la fonction chromatinienne de MeCP2 lors du développement post-natal, est concommitante à l'apparition des troubles neurologiques dans les neurones en maturation dépourvus de MeCP2.

Le thorax ouvert et une artère cardiaque obstruée pour provoquer un infarctus, 191 souris subissent cette chirurgie avec réveil, puis un transport vers un autre établissement utilisateur situé à un autre étage du bâtiment. Les procédures impliquent un niveau de souffrance sévère et toutes les souris sont tuées pour des analyses post-mortem de la réponse inflammatoire. Le porteur annonce une mortalité liée à la chirurgie de 20 %, qu'il situe dans la fourchette basse de la littérature. Il indique que les injections d'agent d'imagerie suivies d'anesthésies interviennent à différents temps entre le deuxième et le vingt-et-unième jour, sans préciser combien chaque souris en subit.

Objectifs

Les maladies du cœur et des vaisseaux restent en France, une des premières causes de décès. Parmi elles, l’infarctus du myocarde, mieux connue sous le nom de crise cardiaque, est la destruction d'une zone plus ou moins étendue du muscle cardiaque, induisant une réponse inflammatoire qui est nécessaire à la cicatrisation. Cette inflammation peut cependant parfois avoir un effet néfaste. Des thérapies visant à moduler la réponse inflammatoire, soit en la stimulant soit en l’inhibant selon le contexte et la fenêtre temporelle, sont donc à l’étude. Un agent d’imagerie permettant de visualiser de manière non invasive la réponse inflammatoire permettrait de mieux appréhender sa cinétique, et d’évaluer des thérapies ciblant celle-ci. L’agent d’imagerie de l’inflammation qui va être évalué dans ce contexte est en cours d’évaluation clinique dans une autre indication. Les objectifs ici sont donc de déterminer s’il est suffisamment spécifique et sensible pour permettre la visualisation de l’inflammation du muscle cardiaque après la survenue de l’infarctus, ainsi que d’évaluer avec précision sa distribution et notamment les types cellulaires qui sont impliqués dans le signal observé par imagerie. S’il est validé comme étant pertinent pour monitorer l’inflammation, il pourra être utilisé dans le cadre de la recherche ou de la pratique clinique pour évaluer cette inflammation et pour tester de nouvelles thérapies. Cela ouvrira également la voie à l’exploration d’autres maladies caractérisées par de l’inflammation du muscle cardiaque telles que le rejet de greffe. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs distincts, néanmoins situés au sein du même bâtiment, à des étages différents.

Bénéfices attendus

L’agent d’imagerie étudié a déjà fait ses preuves pour l’imagerie de lésions des artères et il fait actuellement l’objet d’un essai clinique pour cette application. La cible de cet agent d’imagerie est exprimée dans d’autres maladies caractérisées par des phénomènes inflammatoires. Evaluer le potentiel de cet agent d’imagerie après la survenue de l'infarctus du myocarde permettra donc potentiellement d’étendre son champ d’applications diagnostiques. Cela permettra également de disposer d’un outil de recherche pour tester de manière non invasive des traitements ciblant la réponse inflammatoire.

Procédures

Les animaux subiront une unique procédure incluant l’ouverture du thorax afin d’occlure une artère cardiaque (

Impact sur les animaux

Cette procédure a été classée en sévère car l’ouverture du thorax et l’induction d’une occlusion d’une artère cardiaque est une chirurgie avec réveil qui peut être une source de stress et de douleurs pour l’animal. Toutefois, le modèle est bien maitrisé par le laboratoire en charge de sa réalisation et la médication adaptée. Ainsi, la taille de l’infarctus est bien contrôlée, et le vide pleural correctement réalisé. De ce fait la mortalité associée à la procédure chirurgicale se trouve dans la fourchette basse de ce qui est classiquement reporté dans la littérature (20%).

Devenir

A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser la réponse inflammatoire et la distribution de l’agent d’imagerie à une échelle cellulaire et tissulaire.

Remplacement

La réponse inflammatoire suite à un infarctus ne peut être évaluée qu’in vivo. Toutefois, l’agent d’imagerie a été préalablement entièrement caractérisé et validé in vitro sur protéine produite par modification génétique et sur cellules. Sa spécificité et sa sensibilité pour lier sa cible ont ainsi été préalablement démontrées in vitro.

Réduction

Une étude pilote a été réalisée au préalable pour d’assurer de la faisabilité. Le design de l’étude a été conçu de sorte à réduire le nombre d’animaux, et la consolidation du modèle chirurgical sera, au maximum, réalisée à partir d’animaux de réforme ou d’élevage. Ainsi, dans un premier temps un suivi longitudinal sera réalisé sur un petit nombre d’animaux afin de restreindre l’étude aux seuls temps pertinents.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée par des personnes compétentes et expertes du domaine. La médication sera adaptée à la sévérité de la chirurgie, avec une analgésie en pré- et en post-opératoire. Des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie volatile. Lors du transport entre les deux établissements utilisateurs (

Choix des espèces

La souris constitue un modèle de référence, avec le rat, pour l’étude des événements se produisant suite à un infarctus chez le petit animal. L’agent d’imagerie évalué est un fragment d’anticorps reconnaissant la protéine de souris et la protéine humaine, mais pas la protéine de rat. De ce fait l’espèce retenue est la souris. Des souris adultes seront utilisées afin de se rapprocher du contexte clinique.

Les souris utilisées sont immunodéficientes, dépourvues de presque tout système immunitaire, ce qui permet de leur greffer des tumeurs humaines sans rejet. 2 184 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules de sarcome en intramusculaire ou en intraveineuse, subissent l'ablation de la tumeur primaire quand celle-ci atteint 1 000 mm3, puis des gavages ou injections de traitements et quatre semaines de radiothérapie à raison de cinq irradiations par semaine. Le porteur décrit des métastases pulmonaires provoquant des difficultés respiratoires, des œdèmes et des nécroses de la queue après injection intraveineuse, et prévoit de tuer chaque souris à la fin des traitements pour prélever ses organes métastasés.

Objectifs

Les sarcomes des tissus mous sont des tumeurs rares très complexes et hétérogènes (plus de 70 sous-types différents) qui touchent environ 4000 personnes par an en France. Malgré une chirurgie bien conduite suivie de traitements par chimiothérapies ou radiothérapies, plus de 40 pourcent des patients développent des métastases. A ce stade métastatique, peu de médicaments sont efficaces et les progrès depuis les 20 dernières années sont faibles avec une médiane de survie globale qui est passée de 12 à 18 mois seulement. Il existe donc dans cette pathologie un réel besoin de nouvelles thérapies permettant de cibler les processus metastatiques afin d’améliorer significativement les chances de survie des patients. Notre équipe est localisée dans un centre de référence dans le traitement de ce cancer rare, ce qui nous offre la possibilité d'obtenir des tumeurs de patients et ainsi de pouvoir développer des lignées cellulaires et des modèles de souris xénogreffées avec ces tumeurs. A partir de ces modèles, nous avons mis en place une plateforme préclinique qui nous permet d’étudier les effets biologiques et pharmacologiques de nouveaux médicaments en développement. Ces nouveaux composés sont dans un 1er temps testés in vitro sur des cellules en culture et dans la mesure où ils sont concluants, ils sont testés sur des souris de laboratoire préalablement implantées avec des tumeurs de patients quand cela est possible ou des cellules cancéreuses. Cependant, ces modèles sont limités par le fait qu’ils ne font pas de métastases dans la souris du fait de l’injection des cellules en sous-cutanée. Nous souhaiterions développer de nouveaux modèles afin d’optimiser l’apparition de métastases, soit en injectant les cellules directement dans la circulation sanguine, soit en les injectant dans leur organe d’origine pour bénéficier d’un microenvironnement propice. Une fois ces modèles établis, nous testerons l’efficacité de nouvelles molécules permettant d’inhiber ces processus métastatiques.

Bénéfices attendus

Les modèles de sarcomes des tissus mous métastatiques sont quasiment inexistants, or plus de 40% des patients développent des métastases. Il est donc primordial de trouver de nouveaux médicaments ciblant ces processus. Ce projet permettra d’avoir des modèles plus proches de la réalité du patient et de reproduire les processus métastatiques afin de trouver de nouvelles molécules les inhibant. Ces expérimentations s'inscrivent donc dans un projet de recherche translationnelle qui vise à élargir l'éventail thérapeutique dans le traitement des sarcomes des tissus mous.

Procédures

- greffes de cellules humaines en intramusculaire ou intraveineuse (une fois, durée 2min par souris) - Exerese de la tumeur primaire (une fois, durée 5min par souris) - Traitements medicamenteux par gavages / injections intrapéritonéales ou intraveineuses (durée et nombre de fois différents en fonction du traitement > une demande spécifique à chaque traitement sera soumise à la structure en charge du bien-etre animal) - Irradiations des metastases (radiothérapie) (durée 4 semaines à raison de 5 irradiations par semaine)

Impact sur les animaux

La procédure de xenogreffes en intramusculaire pourra provoquer un inconfort léger et diminuer la mobilité des souris. Lorsque que la tumeur primaire atteint une taille de 1000mm3, la souris sera opérée afin d’enlever la tumeur primaire et ainsi prolonger sa survie tout en permettant un suivi plus long de l’apparition des métastases. Cette chirurgie pourra provoquer une perte de poids ainsi qu'une perte de mobilité pendant 1 semaine environ. Dans le cas de métastases pulmonaires, des problèmes respiratoires peuvent survenir. En ce qui concerne l'administration des traitements, les gestes sont réalisés par du personnels expérimentés maitrisant ces injections. Ces gestes sont donc réalisés rapidement et n’entrainent que peu de stress chez l’animal. Cependant, pour les injections intraveineuses, des œdèmes éventuels et nécroses à la queue sont possible ; pour les gavages: cas de fausse route possible ; pour les injections intrapéritonéales: peu de stress

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des traitements, quand les tumeurs primaires atteignent 1000mm3 ou lorsqu’un point limite est atteint. Les souris sont euthanasiées puis leurs organes métastasés sont prélevés pour analyses.

Remplacement

Ces expérimentations s'inscrivent dans un projet de recherche translationnelle qui vise à élargir l'éventail thérapeutique dans le traitement des sarcomes des tissus mous. Nous avons étudié les effets biologiques et pharmacologiques de nombreuses nouvelles molécules en développement sur des lignées de sarcomes in vitro. Nous souhaitons dorénavant étendre ces études à un modèle plus complet qu’est le petit animal. En effet, l’oncogenèse et plus particulièrement l’apparition de métastases sont des modèles intégrés qui font intervenir un grand nombre de mécanismes physiologiques et de tissus avoisinants qui ne peuvent être modélisés in vitro. Nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel avant de pouvoir réaliser les essais chez l'homme.

Réduction

Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d'animaux. La croissance tumorale des cellules greffées sera suivie tout au long des expériences ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés, le but étant d'obtenir des données significatives d'efficacité du médicament. Nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Toutes les expérimentations sont réalisées par du personnel qualifié. Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l'enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire, utilisation de tapis chauffant et d'ocrygel, mesure hebdomadaire du poids des souris et du volume tumoral, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt).

Choix des espèces

Le but du projet étant de valider l’efficacité de nouvelles thérapies ciblées afin d'utiliser ces médicaments en clinique chez l'homme, il faut nécessairement un modèle de mammifères pour extrapoler les résultats. Nous avons donc choisi de réaliser nos expériences sur des souris immunodéficientes. Ce sont des modèles très immunodéprimés (ne possédant que très peu de système immunitaire) particulièrement adaptés à l'implantation de cellules tumorales. Animaux âgés de 8-12 semaines (jeunes adultes) pour qu’ils puissent supporter la greffe et le développement de la tumeur.