Procédures sévères
Caractérisation mécanique des anévrismes à l’aide d’un dispositif de déformation de la paroi artérielle dans un modèle préclinique lapin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Quatre-vingt-dix minutes d'anesthésie générale pour créer l'anévrisme, puis jusqu'à six semaines d'attente avant une seconde chirurgie sans réveil de soixante minutes et trente minutes d'imagerie. 28 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. L'anévrisme est induit à l'élastase sur la paroi artérielle, puis mis sous pression jusqu'à la rupture pour mesurer le seuil auquel il cède, les données alimentant à terme un modèle d'intelligence artificielle censé prédire le risque de rupture chez les patients. Le porteur écrit que les complications attendues, instabilité hémodynamique, hypotension, thromboses, points de suture qui lâchent et perte d'appétit, ne sont pas génératrices de souffrance, dans une procédure qu'il classe pourtant en gravité sévère.
Objectifs
Ce projet a pour principal objectif la caractérisation mécanique de la paroi anévrismale, la paroi artérielle localisée au niveau de l’anévrisme. Un anévrisme est une déformation structurelle de la paroi artérielle. La caractérisation mécanique permettrait alors de développer un outil d’aide au diagnostic. De fait, in fine, l’ensemble des données mécaniques obtenues numériquement et expérimentalement (in vitro et in vivo) permettrait de constituer une base de données alimentant un modèle d’intelligence artificielle, capable de prédire le risque de rupture d’un anévrisme à partir d’une imagerie médicale. Dans ce contexte, l’expérimentation in vivo doit répondre à plusieurs objectifs. Le projet doit permettre la création d’anévrisme sur un modèle lapin, qui sera imagé par un scanner spectral. Le scanner permet en effet de reconstruire la déformation engendrée en 3D afin d’obtenir l’état de contrainte associé. Cette procédure permettra notamment d’analyser l’influence du temps de maturation et de la quantité d’élastase. En parallèle, l’expérimentation in vivo devra permettre de déterminer une valeur de pression minimale à partir de laquelle il y aura rupture de l’anévrisme, ainsi que d’analyser l’état de dégradation des fibres.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément la pathologie visée. Sur du court terme, comme indiqué au préalable, la caractérisation de la rupture est visée (caractérisation post-mortem). De plus, l’intérêt est également d’appliquer ce protocole à plus grande échelle afin d’alimenter un modèle d’intelligence artificielle permettant de prédire la rupture d’anévrismes. Effectivement, sur du long terme, l’objectif principal de ce projet est de donner un outil de diagnostic aux praticiens quant à la distance à la rupture ou non d’un anévrisme à partir des propriétés biomécaniques de la paroi.
Procédures
Les lapins seront soumis à une procédure d’induction d’anévrisme classée sévère, cette procédure implique une première anesthésie générale de quatre-vingt-dix minutes des animaux. Selon les groupes, la procédure pourra s'étendre jusqu'à six semaines à compter de la création de l’anévrisme afin de comprendre l’effet du temps de maturation sur la fragilité des parois anévrismales. En fin de procédure, les lapins seront de nouveau anesthésiés pour la caractérisation et l'imagerie de l'anévrisme réalisé (durée soixante minutes + imagerie trente minutes).
Impact sur les animaux
Les lapins seront soumis à une procédure d’induction d’anévrisme avec un suivi au maximum de six semaines, procédure classée sévère. La première nuisance attendue est le stress et la douleur induits par la prémédication de l'anesthésie chez l’animal. Les lapins subiront une première chirurgie sous anesthésie générale pour l’induction de l’anévrisme. Les éventuelles complications attendues sont une instabilité hémodynamique et hypotension liées à l’anesthésie et la formation de thromboses dans les voies d’abords. Ces complications ne sont pas létales pour l’animal et ne sont pas génératrices de souffrance mais susceptibles d’être à l’origine d’un arrêt prématuré de la procédure pour l’animal considéré, tout comme le risque hémorragique pouvant survenir lors de cette chirurgie. Pour les effets indésirables post création d’anévrismes on notera : • réouverture de la plaie par les points de sutures qui sautent, une anesthésie est réalisée pour refaire les points, entrainant une cicatrisation en seconde intention. • une diminution de l’appétit : les lapins ont du mal à s'alimenter entraînant une perte de poids. Les lapins subiront une seconde chirurgie sous anesthésie générale sans réveil, à deux ou six semaines, où nous retrouverons les mêmes nuisances que la première chirurgie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure, une résection du tissu anévrismal est effectuée afin de réaliser des tests de caractérisations biomécaniques sur ces tissus
Remplacement
Cette nouvelle phase d’expérimentation animale fait suite à un premier projet pilote, ainsi que plusieurs phases d’expérimentation in vitro et numérique qui ont permis de tester le dispositif de sollicitation sur des artères fantômes (imprimées en 3D) avec différents paramètres afin d’établir une première gamme de pressions utile. Pour faire suite à cette première phase d’expérimentation in vitro, une nouvelle étude va être réalisée en parallèle de l’expérimentation animale. L’expérimentation in vitro va être améliorée par l’utilisation de pompe pulsatile et des études paramétriques vont être réalisées. De plus, une phase de dégradation chimique de l’artère fantôme va être réalisée pour imiter la dégradation des fibres de la paroi artérielle. En revanche, l’expérimentation in vitro et numérique ne suffisent pas en ce qui concerne les propriétés biomécaniques de la paroi (élasticité, dégradation des fibres, artères multicouches, …). L’expérimentation animale est donc important pour obtenir de nouvelles informations pertinentes, notamment sur l’histologie des tissus.
Réduction
Un test de puissance statistique a été réalisé, notamment afin de réduire le nombre de lapins nécessaires à l’étude. La taille d’effet a été calculée à partir des données issues de la littérature et des données issues du premier projet. L'utilisation de l'imagerie non invasive permet la réalisation de plusieurs acquisitions sur le même animal, permettant ainsi une réduction du nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront commandés chez un fournisseur agréé et auront minimum une semaine d’acclimatation à leur environnement dans la pièce d’hébergement. Ils seront hébergés en collectivité, au sol dans des boxes dédiés avec alimentation et eau ad libitum. Les animaux seront suivis de manière quotidienne, manipulés pour réduire toute forme de stress. Ils seront pesés pour un suivi de gain de poids qui permettra le bon calcul des doses à administrées le jour de l’expérimentation. Le raffinement est appliqué, par l’utilisation de boxes/cages enrichis : foin, abris, bâton et bloc de cellulose à ronger permettant aux lapins d’exprimer au mieux leur comportement naturel. La règle de raffinement est aussi mise en place au cours de la procédure via un protocole d'anesthésie, des traitements analgésiques, anti-inflammatoires et une grille de suivi et des points limites adaptés.
Choix des espèces
Le lapin est un modèle souvent choisi pour la création d’anévrismes cérébraux. Ce modèle a d’ailleurs déjà été utilisé dans le projet précédent. Dans la littérature, le modèle lapin a été validé par de nombreuses publications comme un bon modèle préclinique. De plus, la taille de l’animal est adaptée à l’utilisation du dispositif de déformation ainsi qu’à l’imagerie utilisée. Il est également possible d’imiter la pathologie humaine avec ce modèle, notamment en termes de dégradation des couches artérielles. Les lapins au stade de développement adulte (à partir de 3/4 mois) seront utilisés. A ce stade, les lapins ont un poids entre 3 et 3,5kg permettant d'avoir un accès fémoral aisé, nécessaire pour une bonne navigation lors de la procédure d'intervention angiographique.
Rôle de la reprogrammation métabolique des cellules myéloïdes dans le remodelage cardiaque post-ischémique chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Nourries huit semaines au régime gras, opérées pour provoquer un infarctus du myocarde, irradiées treize minutes avant une greffe de moelle osseuse, parfois privées de leur rate, 5 700 souris vont être utilisées et toutes tuées. 3 540 relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 2 160 d'un niveau sévère. L'infarctus provoqué détruit une partie du muscle du ventricule gauche, l'irradiation entraîne fatigue, perte de poids et troubles digestifs, et une des lignées employées porte un déficit immunitaire. Le porteur écrit avoir calculé l'effectif au plus juste par des tests de puissance, sans donner un seul chiffre à l'appui de ces 5 700 souris.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de décès mondiale et posent un défi croissant aux systèmes de santé. La gestion des facteurs de risque, comme l'hypercholestérolémie, réduit ce fardeau, mais le rôle du système immunitaire est peu connu. Ce projet a pour but de caractériser les effets cellulaires et moléculaires d'un régime riche en lipides, court et transitoire, sur le remodelage cardiaque post-ischémique et de tester une approche thérapeutique pour limiter les dommages cardiaques délétères induits par l'alimentation. Les objectifs sont: 1. Caractériser les effets de la pré-exposition au régime riche en lipides sur le remodelage cardiaques à différents temps (avant et après l'infarctus) chez des souris mâles et femelles. 2. Étudier l’impact de l’exposition au régime riche en lipides sur les réponses immunitaires innées. 3. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’insuffisance cardiaque ischémique. 4. Tester des agents pharmaceutiques pour inverser la reprogrammation pathogénique des progéniteurs de la moelle osseuse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'améliorer notre compréhension des mécanismes du risque résiduel à long terme causé par une alimentation riche en lipides, et pourrait permettre de développer des nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cellules myéloïdes.
Procédures
Exposition diète riche en matières grasses - durée 8 semaines // Infarctus du myocarde - durée 30 minutes // Traitement pour une déplétion de la microbiote avec un cocktail d’antibiotiques // Une echocardiographie - Durée 15 minutes // Injection d’anticorps - durée 1 minute, chaque 48h pendant 10 jours posterieures a la chirurgie ou Injection d’agents pharmaceutiques - durée 1 minute, 3 fois par semaine durant les 8 semaines postérieures au régime gras // Transplantation de la moelle osseuse - irradiation dure 13 minutes, transplantation dure 10 minutes. // Splénectomie (ablation de la rate)- durée 30 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours des procédures, les animaux subiront les nuisances suivantes : 1/ Inconfort lié à la contention des animaux. 2/ Stress lié à l'anesthésie et mobilité transitoirement réduite. 3/ Le prélèvement de sang au niveau de la veine mandibulaire peut induire une douleur légère de courte durée au point du prélèvement. 5/ La transplantation de moelle osseuse par voie rétro-orbitaire peut provoquer une potentielle douleur de courte durée au point d’injection. 6/ Les chirurgies peuvent causer des douleurs modérées post opératoires transitoires. Les infarctus du myocarde vont entraîner la mort d’une partie du tissu cardiaque ventriculaire gauche. 7/ Les souris de la lignée Rag2 -/- présentent un phénotype dommageable car elles ont un déficit immunitaire. 8/ L’irradiation peut entraîner des effets secondaires tels que fatigue, perte de poids et troubles digestifs transitoires.
Devenir
À la fin de nos procédures, les animaux seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur.
Remplacement
Ces modèles d’animaux sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. Ces événements sont des phénomènes complexes impliquant un grand nombre de types cellulaires, ce que des modèles in vitro ne pourraient pas permettre de recréer dans leur entièreté. Ces modèles sont également nécessaires pour la validation des stratégies thérapeutiques pour mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste par l'utilisation de calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. Lors des procédures expérimentales, la souffrance animale sera réduite au maximum par l’utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour l’étude des maladies cardiovasculaires. Les souris génétiquement modifies (gain ou perte de fonction) sont d’une aide précieuse pour étudier les mécanismes physiopathologiques cellulaires et moléculaires. En plus, la souris permet de garantir l'homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. Grâce à ces modèles de souris, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce ayant des temps de reproduction plus longs et avec des nombre de naissances moins importants. Ce modèle murin est bien prédictif de la pathologie humaine. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 semaines et chez lesquelles le système cardiovasculaire est arrivé à maturité. En dessous de cet âge, la puberté n’est pas systématiquement atteinte, ce qui peut induire un biais car les hormones sexuelles jouent un rôle dans le remodelage cardiaque. Dans le cadre de ce projet, afin d’induire une immunité entraînée, il est important de pré exposer les souris à un régime riche en matières grasses pendant 2 semaines a un jeune âge (6 semaines). Ensuite, l’infarctus sera induit quand les souris arrivent à un âge de 16 semaines. Faire un infarctus avant les 10 semaines peut réduire fortement la survie des souris.
Nouvelle stratégie pour la thérapie génique cérébrale dans un modèle murin de la dystrophie myotonique de type 1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injectés dès la naissance, biopsiés à vif pour génotypage, puis pour une partie d'entre eux soumis à cinq séries de tests de réaction à la nouveauté, d'exploration, d'anxiété et de mémoire avant une chirurgie sans réveil, 1 800 souris vont être utilisées et toutes tuées. 164 relèvent d'un niveau de souffrance léger, 1 227 d'un niveau modéré et 409 d'un niveau sévère. Une partie porte un phénotype dommageable qui provoque un retard de croissance, des anomalies musculaires et comportementales, une pousse dentaire anormale gênant l'alimentation et une espérance de vie réduite, dans un projet qui teste une thérapie génique cérébrale contre la dystrophie myotonique de type 1. Les reproducteurs sont tués lorsque leur fertilité décline, les autres en fin de procédure, et le porteur décrit ces souris génétiquement modifiées comme "indispensables" aux essais précliniques.
Objectifs
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie rare qui affecte plusieurs partie du corps à la fois, avec un large éventail de symptômes cliniques affectant des patients de tous âges et des deux sexes. La DM1 est l'une des formes les plus courantes de dystrophie musculaire. Bien qu'elle ait été initialement caractérisée par des symptômes musculaires tels que la faiblesse musculaire, la myotonie, les défauts de conduction cardiaque; elle est hautement multisystémique. Les manifestations neuropsychologiques sont très invalidantes et particulièrement prononcées dans les formes précoces de la DM1. Afin d'étudier cette maladie au cours du développement et dans différents tissus, un modèle de souris transgéniques porteuses du gène muté responsable de la DM1 a été développé. Ces souris transgéniques reproduisent certaines caractéristiques de la maladie. Actuellement, il n'existe pas de traitement pour cette maladie, mais de nombreuses approches thérapeutiques sont évaluées en laboratoire et dans des essais cliniques chez l'Homme, avec pour le moment aucun traitement efficace pour le système nerveux central. Notre programme de recherche teste une nouvelle méthode pour corriger les anomalies au niveau du cerveau.
Bénéfices attendus
La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est la forme la plus fréquente de dystrophie musculaire chez l'adulte. Sa prévalence mondiale est estimée à 1 personne sur 8000, avec des variations selon les régions. Une étude récente suggère une prévalence globale pouvant atteindre 1 cas sur 2400 individus. La DM1 est une maladie chronique, évolutive et multisystémique, ainsi la prise en charge mobilise de nombreuses ressources médicales, sociales et familiales. Les soins de santé actuels se concentrent sur la réduction des incapacités grâce à des approches médicales multidisciplinaires, entraînant des coûts substantiels atteignant en moyenne 50 000 euros par patient par an. Ces dépenses peuvent s’élever à 1,5 million d’euros au cours des deux premières années de vie dans les cas congénitaux les plus sévères. Par conséquent, la recherche de traitements efficaces n’est pas seulement une nécessité médicale, mais également un impératif socio-économique essentiel pour améliorer la qualité de vie des patients, favoriser leur intégration socio-économique et réduire les coûts des soins de santé. Les efforts de recherche et de thérapie sur la DM1 se sont principalement concentrés sur les symptômes musculaires, tandis que la recherche sur la physiopathologie cérébrale a commencé plus tard et reste non résolue. Les bénéfices du projet à court et moyen terme : nous démontrerons la faisabilité d’une nouvelle stratégie thérapeutique et ouvrirons pour la première fois de nouvelles voies pour la thérapie génique dans le contexte de la DM1, axées sur le système nerveux central. Ceci favorisera la recherche préclinique visant à atténuer les manifestations neuropsychologiques invalidantes de la DM1 chez les patients. A long terme : les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre d’autres affections humaines ayant des mécanismes similaires (la dystrophie myotonique de type 2, l’ataxie spinocérébelleuse de type 8, l’ataxie de Friedreich et d’autres formes) pour lesquelles les études sur la DM1 sont des références.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : une injection de l'agent à tester (animal anesthésié, 1 fois, 3 minutes) puis une biopsie pour génotypage (animal vigile, 1 fois, 1minute). Une partie des animaux aura un prélèvement sanguin (animal vigile, 1 fois, 1 minute). L'autre partie suivra des tests comportementaux simples permettant d'évaluer la réaction à la nouveauté, l'exploration, l'anxiété et la mémoire (animal vigile, 5 fois, 30 minutes à 2 jours) puis une chirurgie sans réveil (animal anesthésié et analgésié, 1 fois, 10 minutes).
Impact sur les animaux
Une partie des animaux utilisés lors de ce projet présentent un phénotype dommageable qui induira un retard de croissance, des anomalies musculaires et des anomalies du comportement. Le phénotype pourra induire également une réduction de l'espérance de vie des animaux. Le phénotype pourra aussi induire une pousse anormale des dents qui peut géner la prise alimentaire et qui peut nécessiter une taille des dents qui pourra engendrer un léger stress chez l'animal. Une injection précoce sera réalisée chez les nouveaux-nés, elle pourra induire une douleur légère de courte durée et le rejet du petit par la mère. Une biopsie pour génotypage sera également réalisée chez les nouveaux-nés, elle pourra induire une douleur légère de courte durée. Un prélèvement sanguin à l'âge adulte sera réalisé sur certains animaux, ce prélèvement pourra induire une douleur légère de courte durée ainsi qu'un hématome. A l'âge adulte les animaux réaliseront des tests comportementaux simples qui pourront induire un léger stress à cause de l'environnement nouveau. Enfin, une chirurgie sans réveil sera effectuée sur certains animaux, l'anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire : les reproducteurs lorsque leur fertilité sera en déclin, les autres animaux en fin de procédure afin de pouvoir réaliser des prélèvements et faire des analyses biologiques.
Remplacement
Le projet se concentre sur une maladie humaine rare : la dystrophie myotonique de type 1 (DM1). Des études prélimaires in vitro seront réalisées au préalable du projet afin de pré sélectionner des traitements. Mais bien que certains mécanismes cellulaires puissent être étudiés dans des modèles de culture cellulaire artificiels, l'utilisation d'un modèle animal permet d'étudier les mécanismes spécifiques aux tissus et aux cellules. L'évaluation de la thérapie ou de la correction génétique in vitro sur des cultures primaires (neurones et astrocytes), bien qu'importante, ne peut malheureusement pas être prédictive de l'effet in vivo. L'utilisation de souris génétiquement modifiées est nécessaire pour étudier les composants neurodéveloppementaux et neurodégénératifs de la maladie cérébrale de la DM1. Ces modèles sont indispensables aujourd'hui pour les tests précliniques avant de passer aux tests cliniques chez les patients.
Réduction
1800 animaux seront utilisés dans ce projet. Afin de REDUIRE et d’optimiser le nombre d’animaux, le protocole d’étude a été développé avec une réduction du nombre d’animaux utilisés dans la mesure où tous les animaux issus des croisements (sans distinction de sexe) seront utilisés. Les souris n’ayant pas le génotype d’intérêt seront utilisées comme contrôles négatifs dans les différentes expériences. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, biologie moléculaire, histologie et ce, sur plusieurs tissus. Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation des animaux prévus dans la seconde étape, et ainsi de suite.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum (nidification et mastication) et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Les animaux sont déjà acclimatés à l'environnement car l'élevage est dans l'établissement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. En effet, tout sera mis en place pour limiter l'expression du phénotype dommageable (vérification de la dentition, ajout d'aliment hydraté facilement accessible). Les souriceaux seront délicatement manipulés et ils seront séparés de leur mère sur une courte durée (quelques minutes) pour limiter leur stress. Pour les tests comportementaux les animaux seront manipulés dans une pièce dédiée au calme. Une anesthésie et une analgésie est mise en place dès que nécessaire (injections, chirurgie sans réveil). Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Notre projet a pour but de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Si certains mécanismes cellulaires peuvent être étudiés en culture, seule l'utilisation d'un modèle animal permet d'étudier les mécanismes tissu-spécifiques. Ces modèles sont indispensables aujourd'hui pour les tests précliniques avant de passer aux tests cliniques chez les patients. Nous utilisons un modèle murin car nous disposons d'un modèle, que nous avons développé, de la dystrophie myotonique de type 1. Ce modèle développe des phénotypes multisystémiques comme chez l'Homme et est donc un modèle de choix dans ce projet, en particulier pour étudier l'aspect cérébral de la pathologie. Dans ce projet, les animaux seront utilisés dès la naissance car c'est à ce moment là que les cellules ciblées par la thérapie peuvent être modifiées. Les analyses se dérouleront entre 30 jours et 60 jours de vie car les modifications seront optimales à partir de cet âge et que les effets sur les animaux seront visibles.
Modèle de rhabdomyosarcome chez la souris immunodéprimée : approche thérapeutique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris utilisées sont immunodéprimées par construction, choisies pour laisser se développer des tumeurs humaines sans réaction de rejet. 1 440 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Réceptionnées à quatre semaines, elles reçoivent une injection de cellules de rhabdomyosarcome dans un muscle ou dans la veine de la queue, puis trois injections de traitement par semaine pendant huit semaines au maximum, avec un développement tumoral qui peut atteindre 2 000 mm3, se nécroser en fin d'expérience et faire perdre du poids. Le porteur affirme que les traitements ne provoquent aucun effet indésirable et que le déficit immunitaire n'entraînera pas de nuisance, dans un projet qu'il classe lui-même en gravité sévère.
Objectifs
Le rhabdomyosarcome (RMS) est un cancer pédiatrique qui à pour origine les cellules musculaires. La tumeur primaire qui se développe localement peut se propager à d’autres organes, souvent les poumons. Malheureusement, les formes métastatiques se soignent difficilement et dans ce contexte, le taux de survie des patients est faible. L’objectif de ce projet est 1) d’étudier l’efficacité de nouveaux traitements identifiés suite aux projets de recherche fondamentale du laboratoire, et 2) d’étudier l’efficacité de ces nouveaux traitements sur la réponse aux traitements classiques de chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de déterminer la pertinence de ces nouveuax traitement et si ils optimisent les traitements de classiques de chimiothérapie. Cela permettra aussi de mieux comprendre les mécanismes immunitaires déterminants dans la réponse ou la non-réponse à ce type de traitements, et ouvrira de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Procédures
Une injection intramusculaire des cellules tumorales d'une durée de 30 secondes ou une injection intraveineuse au niveau de la queue d'une durée de 30 secondes. Traitement des souris par voie intrapéritonéale, intraveineuse et orale : trois injections par semaine pendant un maximum de 8 semaines (30 secondes pour chaque injection).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables observés sont ceux liés aux injections intramusculaires (et intraveineuses) des cellules tumorales et ceux liés au développement de tumeurs en site musculaire ou le développement des métastases pulmonaire, tels qu'une perte de mobilité lié à la masse tumorale qui ne dépassera jamais 2000 mm3. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Une perte de poids peut également être observée. Les différents traitements sont non toxiques aux doses utilisés et ne provoquent pas d'effets indésirables chez les souris. Leur administration entrainera un léger stress lié à la contention et une légère douleur de courte durée liée à l'injection intrapéritonéale et orale. Compte tenu des conditions d'hébergement en portoirs ventilés, le caractère immunodéficient (système immunitaire moins puissant) des animaux n’entrainera pas de nuisance.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Pour analyser les effets sur la réponse anti-tumorale de plusieurs traitements de chimiothérapie dans un modèle de rhabdomyosarcome, rien ne peut remplacer un modèle animal où les cellules sont confrontées à leur environnement physiologique. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet. Pour évaluer la migration dans un tissu et les effets sur la croissance tumorale, il est à ce stade du projet indispensable de réaliser des expériences in vivo chez la souris. Les expériences in vitro ne permettent pas de mimer un micro environnement tumoral complexe (muscle et tumeur). Néanmoins, les molécules connues et en développement sont systématiquement testées in-vitro pour étudier la cytotoxicité éventuelle.
Réduction
Compte-tenu d’études comparables déjà publiées, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique. Des tests statistiques seront utilisés pour comparer les volumes tumoraux entre deux groupes à un temps donné. Ainsi le nombre d’animaux sera réduit au minimum mais satisfaisant pour pouvoir conclure de façon statistiquement significative.
Raffinement
Afin de raffiner les procédures expérimentales, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter le plus précocement possible tout signe de douleur. Les animaux anesthésiés seront placés sur un tapis chauffant lors de la réalisation des gestes techniques, une analgésie sera appliquée dès que nécessaire et des points limites strictes et suffisament prédictifs seront établis. Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Les souris recevront une période d’acclimatation suffisante, avant l’entrée en projet. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de mal-être. En cas d'atteinte de mobilité, de la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage.
Choix des espèces
L’utilisation de souris immunodéprimées est choisie afin d’étudier le développement de nouvelles thérapies sur des tumeurs humaines dans un environnement in vivo complexe ( muscle et tumeur). Nous utilisons de jeunes souris afin de mimer au mieux les tumeurs qui se développent chez l’enfant, l’adolescent ou le jeune adulte chez les patients. Réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 semaines).
Mise en place, chez la souris, de deux modèles techniques pour imager des événements cinétiques dans des tumeurs intrapéritonéales dans le temps
- Recherche fondamentale
- Oncologie
L'expérience s'arrête si la fenêtre d'imagerie se détache de l'abdomen ou s'enflamme, sinon les souris sont tuées au plus tard seize jours après la pose. 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et l'autre moitié d'un niveau sévère. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales, pour certaines dans le foie après incision, puis une fenêtre souple fixée sur l'abdomen à la colle chirurgicale et des séances d'imagerie de quarante-cinq minutes sous anesthésie. Le porteur classe en stress sévère l'isolement de huit à seize jours qu'impose cette fenêtre, et situe l'objet du projet dans la comparaison de deux techniques d'observation, la fenêtre souple et la transparisation optique de la peau.
Objectifs
La microscopie intravitale permet d’observer en temps réel, à l’échelle des cellules, des événements dans les tissus vivants d’animaux anesthésiés. Cette technique est particulièrement utile pour étudier comment les cellules tumorales interagissent avec leur environnement ou pour mieux comprendre la réponse du système immunitaire, en suivant les interactions entre cellules directement dans l’animal. La microscopie intravitale est la seule méthode qui permet de suivre ces interactions en temps réel et de les observer sur plusieurs heures dans un même tissu. Cependant, pour réaliser ces observations, il est souvent nécessaire de faire une intervention chirurgicale lourde afin d'exposer le tissu, ce qui limite l’imagerie à quelques heures et ne permet pas d’observer le même animal sur plusieurs jours. Une alternative consiste à implanter une fenêtre d’imagerie permanente, permettant de suivre les changements dans le même animal sur plusieurs jours ou semaines, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires. Pour les cancers abdominaux, il existe deux types de fenêtres pour la souris : une fenêtre rigide avec un anneau métallique fixé à la peau par des sutures, et une fenêtre souple fabriquée en un matériau flexible, maintenue par de la colle chirurgicale. Une autre solution récente consiste à utiliser une méthode de transparisation optique, qui permet de voir les tissus profonds sans chirurgie en appliquant des molécules spéciales sur la peau. Cette technique permet de visualiser la structure et les fonctions des tissus sans aucune chirurgie, mais elle reste limitée par la diffusion de la lumière dans les tissus, ce qui réduit la qualité de l’image et la profondeur de l’observation. De plus, elle ne fonctionne bien que dans une partie du spectre visible. Le but de ce projet est de mettre en place un modèle de fenêtre souple pour observer le développement des tumeurs chez la souris à l’échelle cellulaire (comme la croissance, la migration ou l'invasion de cellules) sur plusieurs jours, et de comparer cette méthode avec la transparisation optique sans chirurgie. L’objectif est de déterminer laquelle de ces techniques offre la meilleure qualité d’image, la meilleure sensibilité et la meilleure stabilité pour le suivi des tumeurs tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires pour la recherche.
Bénéfices attendus
Observer le comportement des cellules tumorales et immunitaires dans leur environnement réel est essentiel pour mieux comprendre comment les cancers et le système immunitaire fonctionnent et s'adaptent aux traitements. Cela permet de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur ces observations. Seule la microscopie intravitale permet cela à l'échelle de la cellule. Cependant,cela nécessite une chirurgie qui limite l'imagerie à une seule fois. Proposer un outil permettant de réaliser cette imagerie intravitale dans un même animal au cours du temps et avec le moins de chirurgie possible permettra de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés et d’alléger la sévérité des expériences.
Procédures
Les souris subiront une injection sous anesthésie (2-3 minutes). Ces mêmes animaux seront anesthésiés pour être soumis à une séance d’imagerie durant en moyenne 45 minutes. Préalablement,certains de ces animaux auront une chirurgie : soit pour permettre une injection (durée 15 minutes), soit pour poser une fenêtre abdominale (durée 30 minutes) permettant de réaliser l’imagerie.
Impact sur les animaux
L’injection des cellules tumorales peut induire du stress et une douleur au site d'injection. Pour les cellules injectées dans le foie, l’incision, l’injection et la fermeture de l’incision, peuvent induire du stress et une douleur modérée du fait de la chirurgie et de l’injection. Le développement tumoral dans le foie et le pancréas peut causer des douleurs et une dégradation de l’état des animaux. La pose de la fenêtre abdominale peut induire une douleur modérée du fait de la chirurgie et un stress sévère du fait de l'isolement prolongé. L’injection du marqueur fluorescent sous anesthésie peut générer un stress et une douleur au site d'injection chez l’animal.
Devenir
Les animaux seront mis à mort après la dernière séance d’imagerie pour des prélèvements de tumeurs et des comparaisons histologiques entre les deux modèles développés.
Remplacement
Les procédures réalisées sur l’animal ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. Il n’est pas possible à l’heure actuelle de mimer in vitro la dynamique des cancers et de la réponse immunitaire associée de façon satisfaisante.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque lignée de souris a été déterminé afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour chaque type d’imagerie et comparer les deux modèles (transparisation versus fenêtre souple) par des tests statistiques. Le développement des modèles de chambre abdominale et de transparisation in vivo permettra de réaliser l’imagerie intravitale dans un même animal au cours du temps, réduisant ainsi considérablement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
L’injection des cellules et du marqueur, l’application du gel, et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie. Avant l’injection du marqueur, un analgésique sera appliqué. La pose de la fenêtre ventrale et l’injection des cellules dans le foie seront réalisés sous anesthésie. Un analgésique sera administré avant et après la chirurgie. En complément, un anesthésique local sera appliqué sur la peau, au lieu d’incision et un anti-inflammatoire administré. Le suivi des animaux, après l’injection des cellules tumorales et la pose de la fenêtre ventrale, se fera tous les jours par surveillance accrue et mise en place de points limites précoces. L’expérience sera arrêtée si la fenêtre se détache, l’animal présente une inflammation de la fenêtre, ou s'il y a dégradation de l'état général des animaux, sinon, les souris seront mises à mort au plus tard 16 jours après la pose. Les animaux seront hébergés individuellement à partir de la pose de la fenêtre (de 8 à 16 jours) pour éviter qu’ils ne se blessent entre eux, mais avec les autres animaux visibles et à proximité dans les autres cages.
Choix des espèces
La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. De plus, les lignées de cellules tumorales et de souris transgéniques utilisées dans ce projet le sont pour servir d’autres projets déjà menés chez la souris avec ces mêmes lignées. Des souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature. De plus, il s’agit des stades de développement communément utilisés dans notre laboratoire pour les projets amenés à utiliser ces méthodes, donc pour développer ces modèles, nous souhaitons utiliser des animaux dans la même tranche d’âge.
Potentiel thérapeutique de l’aérosolisation des nanoparticules d’apolipoprotéine A1 enrichies en alpha-1- antitrypsine chez la souris (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Anesthésiées, suspendues par leurs incisives sur un panneau de plexiglas incliné à 45 degrés le temps d'une aérosolisation d'une minute : 246 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. L'installation de l'emphysème pulmonaire et la mesure des fonctions respiratoires sont classées en nuisance sévère, avec une évaluation du seuil de douleur au filament de von Frey et un arrêt de la procédure si une allodynie mécanique sous 0,3 g apparaît. Les nanoparticules lipidiques enrichies en alpha-1-antitrypsine sont inhalées pour établir une preuve de concept avant un éventuel essai clinique, une partie des souris étant transportée sur 80 kilomètres entre deux établissements. Le choix de l'espèce repose sur des souris privées du gène de l'alpha-1-antitrypsine, chez qui le porteur attend une destruction des alvéoles et une perte d'élasticité pulmonaire proches de l'emphysème humain.
Objectifs
Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs : EU1 et EU2. Le déficit en alpha-1-antitrypsine (AAT) est une maladie génétique rare causée par une mutation du gène SERPINA1, responsable de la production de la protéine AAT. L'AAT est principalement synthétisée dans le foie et sécrétée dans la circulation, où son rôle principal est de protéger le tissu pulmonaire contre l'action de différentes enzymes. Ce déficit en AAT est un facteur de risque au développement d'un emphysème pulmonaire, caractérisé par une dégradation progressive et irréversible du tissu alvéolaire, entraînant une diminution de la fonction respiratoire et un risque accru de mortalité. Chez les patients souffrant de cette maladie, l'administration intraveineuse d'AAT réduit la perte annuelle du tissu pulmonaire et ralentit le déclin de la fonction respiratoire. Cela étant, ce traitement n'a aucun effet sur des épisodes d'aggravations des symptôles et donc l'état de santé. Ce projet vise à évaluer un nouveau traitement reposant sur l'aérosolisation de l'AAT, vectorisée dans des nanoparticules lipidiques. Ces nanoparticules ont des propriétés protectrices (antiinflammatoire, anti-oxydante et anti-infectieuse). Ces effets protecteurs, combinés avec ceux de l'AAT, constituent une thérapie prometteuse pour laquelle l'inhalation permettra une action directe sur les poumons. Ainsi, ce projet qui se déroulera dans deux établissements utilisateurs, a le potentiel de fournir une preuve de concept pour le développement d'une thérapie innovante pour les patients déficients en AAT.
Bénéfices attendus
Recherche médicale : il existe un besoin d'améliorer les normes de soins pour les maladies pulmonaires liées à la déficience en alpha-1-antitrypsine (AATD). L'injection intraveineuse d'AAT a montré une efficacité limitée et les injections hebdomadaires constituent une contrainte sur la qualité de vie des patients. La voie inhalée est une stratégie thérapeutique prometteuse qui améliorera l'observance et l'autonomie des patients. Des études précliniques et cliniques de ces dernières années ont démontré la capacité des nanoparticules lipidiques inhalées à délivrer localement divers médicaments dans les poumons, pour le traitement de maladies pulmonaires telles que les cancers pulmonaires, les maladies pulmonaires obstructives et les infections respiratoires. Les nanoparticulesn lipidiques ont permis d’atteindre cet objectif tout en améliorant la stabilité des médicaments, en réduisant la toxicité systémique et en permettant une concentration locale plus élevée du médicament dans les poumons. Ici, nos particules ont aussi un intérêt thérapeutique, en potentialisant les effets bénéfiques des nanoparticules à celle de l’AAT. Coûts des soins de santé : des traitements efficaces contre l'emphysème pulmonaire lié à l'AATD et la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO ; 3ème cause de décès dans le monde) pourraient réduire les coûts des soins de santé associés aux hospitalisations et à la gestion à long terme de ces maladies chroniques. Les perspectives du projet sont de mener un essai clinique multicentrique avec des médecins du réseau RespiFIL (Filière Maladies Respiratoires Rares) pour évaluer si l'aérosolisation des nanoparticules enrichits en AAT peut améliorer la santé des patients.
Procédures
Dans l'EU1/2 : Les animaux auront une biopsie de queue à 6 jours et seront soumis à des aérosolisations à l'âge adulte. Parmi les animaux exposés, certains recevront des nanoparticules et ou du LPS et certains auront des mesures de leur fonction respiratoire. Les procédures d’aérosolisations et d’injections intraveineuses dure environ 1 minute et la procédure de mesure de fonction respiratoire dure environ 10 minutes. Ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale. Dans l'EU2/2 : Les animaux seront soumis à des aérosolisations de nanoparticules radiomarquées. La procédure d’aérosolisation dure environ 1 minute puis la mesure de la scintigraphie se déroule à 6h, 24h et 48h. Des prélèvements sanguins (caudales) sont aussi réalisés à ces temps. Ces procédures sont réalisées sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
- Nuisance modérée pour la biopsie de queue (douleur légère de courte durée). - Nuisance modérée pour l'instillation intratrachéale. Les souris anesthésiées sont retirées de la chambre d’induction et suspendus par leurs incisives sur un panneau en plexiglas en position couchée, avec une inclinaison d’environ 45 degrés. La durée totale de la procédure d’aérosolisation est d'environ 1 minute. - Nuisance sévère pour la mise en place de l'emphysème pulmonaire. Nous évaluerons le seuil à la douleur dans l’étude pilote en utilisant le test de Von Frey (stimuli mécaniques). Ce test mesure la réponse de retrait à des filaments appliquant une pression mécanique. Chez des souris avec emphysème, on pourrait s'attendre à une hypersensibilité mécanique (réduction du seuil). Une évaluation comportementale sera faite en complément. Si le seuil de douleur est très faible (allodynie mécanique
Devenir
Mise à mort pour prélèvements d’organes
Remplacement
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de l’emphysème pulmonaire ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de dégradation et de fibrose du tissu pulmonaire impliquent plusieurs types cellulaires : neutrophiles, macrophages, cellules endothéliales, fibroblastes, pneumocyte de type 1 et 2 entres autres. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de l’emphysème tel que l’inflammation et le stress oxydatif. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.
Réduction
Le nombre d’animaux de cette étude se base sur des publications scientifiques ayant décrit des résultats significatifs avec des approches similaires. Chaque expérimentation sera scindée en trois expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont significatifs avec les deux premières expériences (n=8 au lieu de 12 dans l’objectif 3.2 par exemple ; analyses statistiques : two-tailed unpaired t test ou two-way ANOVA). En effet, les résultats, s’ils sont homogènes, peuvent être significatifs avec 8 souris. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le groupe d'animaux suivant. Enfin, si l’objectif 1 n’est pas validé, alors le projet s’arrêtera.
Raffinement
Pour garantir un environnement optimal, les animaux seront logés dans des cages offrant un espace suffisant, avec un maximum de 5 animaux par cage. Cet aménagement limitera au maximum les contraintes subies et permettra un comportement normal. De plus, l’environnement sera enrichi avec des matériaux pour se nicher et jouer, contribuant ainsi à leur bien-être. Les animaux seront observés de façon continue pendant les 30 premières minutes après l’aérosolisation, puis 3 à 6 fois par jour afin de nous assurer de leur bien-être et de ne pas laisser un animal en souffrance. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté immédiatement au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée, conformément aux protocoles en vigueur pour minimiser la douleur et le stress des animaux. Nous observerons et analyserons divers points limites spécifiques pour évaluer leur bien-être, tels que : 1. Altération du comportement : signes d'apathie, d'agressivité, d'isolement, ou réduction drastique de l'activité normale. 2. Nutrition anormale : incapacité à se nourrir ou à boire normalement. 3. Perte de poids : surveillance régulière du poids pour détecter toute perte significative. 4. Aspect physique : poil ébouriffé, yeux fermés, respiration laborieuse, posture courbée. Si l'un de ces paramètres ou points limites est atteint, cela sera signalé immédiatement au vétérinaire référent. Celui-ci évaluera la situation et pourra décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal pour limiter ses souffrances, conformément aux règles éthiques en vigueur. Pour compléter le raffinement des procédures, une injection d’analgésique sera réalisée avant chaque intervention et chaque fois que la souris démontrera des signes de douleurs. La mise en place d’une étude pilote permettra aussi d’améliorer les manipulations de l’expérimentateur. Concernant le transport des souris de l’EU1/2 vers l’EU2/2, le transporteur agréé s'engage à réunir toutes les conditions pour assurer la sécurité des animaux et leur bien-être (véhicule climatisée avec des cages de transports agrées sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire, ajout de croquettes humidifiées et paille). Le choix d'un transport dédié uniquement à nos souris permet aussi d'assurer un trajet rapide d'environ 1 heure (80km).
Choix des espèces
La structure et la fonction du système respiratoire des souris présentent des similitudes avec celles des humains, bien que les différences existent en termes de taille et de complexité. Les souris possèdent des bronchioles, des alvéoles,et des cellules immunitaires pulmonaires similaires à celles des humains, ce qui permet d'étudier les effets des traitements inhalés. Les souris montrent des réponses inflammatoires et immunitaires comparables à celles des humains lorsqu'elles sont exposées à des agents pathogènes ou à des stimuli nocifs, permettant ainsi d'évaluer les réponses thérapeutiques des nanoparticules. Les modèles murins d'emphysème sont bien établis et peuvent être induits par diverses méthodes telles que l'exposition à la fumée de cigarette, l'administration d'élastase ou d'autres agents chimiques. Ici, les souris AAT KO reproduisent les caractéristiques clés de l'emphysème humain, telles que la destruction des alvéoles et la perte d'élasticité pulmonaire. Animaux adultes entre 8 et 10 semaines. À l'âge de 8 à 10 semaines, les souris ont atteint une maturité physiologique qui leur permet de mieux refléter les caractéristiques pulmonaires des adultes humains. Les structures alvéolaires et les voies respiratoires sont pleinement développées, ce qui est crucial pour étudier les changements pathologiques induits par l'emphysème. Les souris de cet âge possèdent un système immunitaire mature mais encore flexible, permettant une réponse inflammatoire et immunitaire comparable à celle observée chez les adultes humains. Cela est important pour étudier les mécanismes inflammatoires et immunopathologiques de l'emphysème. Enfin, à cet âge, les souris ont un niveau d'activité physique, de métabolisme et de croissance relativement stable, ce qui minimise les facteurs confondants qui pourraient influencer les résultats expérimentaux.
Contrôle de la régression tumorale à long terme par les lymphocytes T antiviraux modifiés génétiquement
- Recherche appliquée
- Cancers
Injectées de cellules leucémiques dans la veine de la queue, puis d'un traitement cellulaire, prélevées de sang sept fois et passées sept fois sous imagerie sous anesthésie de quarante minutes, 36 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. La leucémie qui s'installe se traduit par des poils hérissés, une baisse d'activité, une perte de poids et, dans les cas extrêmes, un début de paralysie des pattes arrière, auxquels peuvent s'ajouter des signes de maladie du greffon contre l'hôte avec lésions cutanées et diarrhées. L'objectif déclaré est de comparer un nouveau type de lymphocyte anticancéreux issu de donneurs sains au traitement de référence, sur un suivi porté à 56 jours. Aucune souris n'est gardée au-delà de ces 56 jours, ni au-delà du point limite atteint.
Objectifs
La thérapie anti-cancéreuse à partir des cellules du patient modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses (appelées CAR-T cells) permet de traiter la leucémie. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité disparait à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de ces cellules à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. De plus, nous souhaitons utiliser une nouvelle source de cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST) : celles-ci sont capables de persister à long terme chez les patients. Aussi, nous souhaitons fabriquer des cellules anti-cancéreuses à partir de ces VST. Nous obtiendrons des CAR-VST qui permettraient d’apporter un bénéfice majeur par rapport au traitement de référence par CAR-T car persistant plus longtemps dans l’organisme. Nous devons donc d’abord vérifier qu’elles sont aussi efficaces que les cellules thérapeutiques CAR-T classiques. Pour cela, nous souhaitons étudier ce nouveau traitement en comparaison au traitement actuel par CAR-T cells. Après avoir montré que les cellules issues d’un seul donneur sont aussi efficaces que le traitement actuel, nous devons reproduire ces résultats sur des cellules provenant de deux autres donneurs, et assurer un suivi d’efficacité plus long, jusqu’à 56 jours
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de déterminer avec certitude si les CAR-VST possèdent un effet anti-leucémique reproductible et comparable au traitement de référence par CAR-T cells, et plus long, afin de permettre la mise au point de traitements efficaces à long terme.
Procédures
- Une injection de cellules leucémiques à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce (1min) - Une injection de cellules « traitement » à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce (1min) - 7 prélèvements d’une goutte de sang au niveau de la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce (1min) - 7 Imageries sous anesthésie (40min)
Impact sur les animaux
- L’injection intraveineuse est de courte durée et elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction. - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront une maladie type leucémie avec des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des pattes arrière. - Dans les semaines qui suivent l’injection des cellules d’intérêts (CAR T cells ou CAR VST), les souris peuvent présenter des signes de maladie de greffon contre l’hôte, caractérisés par une perte de poids, une altération de la fourrure avec lésions cutanées, un mal-être et des diarrhées. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie. - Le prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale sera réalisé avant l’imagerie, sous contention douce.
Devenir
Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 56 jours post injections ou en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences sur cellules pour valider lepotentiel anti-leucémique des cellules issues de donneur sains de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement développé dans un organisme. Cette saisine permet de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés de façon à obtenir des effets significatifs avec un nombre minimum d’animaux. Nos précédents travaux nous ont permis de déterminer ce nombre via l’utilisation d’un logiciel appliqué.
Raffinement
Les souris seront logées dans de grande cage avec des jouets et des matériaux, avec 3 ou 5 souris par cage, pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien ventilée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, une personne qualifiée vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, une grille de score permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper le mal être.
Choix des espèces
La souris NSG ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments de thérapie génique dans des modèles de neuropathies douloureuses chez les rongeurs
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 844
1 170 souris et 844 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour le prélèvement de nerfs et de cerveaux. Trois chirurgies sont prévues : l'injection d'un candidat médicament directement dans le nerf sciatique ou facial, la ligature de ce nerf, puis sa ligature ou sa section pour installer une neuropathie traumatique. S'y ajoutent une mesure de conduction nerveuse sous anesthésie et des tests comportementaux hebdomadaires, sur des animaux chez qui le porteur attend des douleurs neuropathiques, une mobilité réduite et, dans certains groupes, une obésité et une hyperglycémie sur six à dix semaines. Il annonce des essais chez l'être humain entre 2027 et 2029 et conclut que l'expérimentation animale reste "le seul véritable moyen" d'aborder ces maladies du nerf.
Objectifs
Le système nerveux périphérique des mammifères est composé des nerfs qui commandent les mouvements (motoneurones) et des nerfs qui renvoient au cerveau les sensations ressenties par le corps (neurones sensitifs). Le dysfonctionnement des motoneurones entraîne une faiblesse ou paralysie musculaire alors que celui des neurones sensitifs entraîne une sensibilité anormale ou une perte de sensibilité. La douleur neuropathique résulte d’une lésion ou d’un dysfonctionnement du système nerveux et peut également provenir d’une complication du diabète. Pour traiter la douleur, différents types d’analgésiques sont utilisés: les anti-inflammatoires et les opioïdes lors de douleurs intenses. Cependant les opioïdes peuvent créer une dépendance. L’objectif du projet est de valider des nouvelles approches thérapeutiques pour introduire dans les cellules des nerfs des candidats médicaments efficaces pendant plusieurs années pour prévenir ou réduire les troubles moteurs et sensoriels responsables de la douleur. Les traitements seront directement injectés dans les nerfs chez des modèles de rongeurs de neuropathies douloureuses. Ce projet validera nos candidats médicaments en vue de futurs essais cliniques.
Bénéfices attendus
Avantages court-terme: Ce projet doit nous permettre de valider notre stratégie thérapeutique pour réaliser par la suite des essais cliniques et créer une biobanque pour des analyses ultérieures. Les résultats seront publiés. Avantages à long terme: Cette approche thérapeutique permettrait d’administrer une fois tous les 10 ans, un traitement non toxique et stable aux patients. L’injection locale envisagée n’endommage pas le nerf et évite une dissémination des vecteurs dans tout l’organisme avec pour objectif la diminution des symptômes existants et l’arrêt de l’évolution et possible réversion de la maladie. Nous prévoyons les premiers essais chez l’Homme entre 2027 et 2029 et l’approbation pour la mise sur le marché entre 2029 et 2032.
Procédures
- Trois types de chirurgies o La première chirurgie sera réalisée une seule fois par animal sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent et consistera à administrer un candidat médicament directement dans les nerfs sciatiques ou le nerf facial. Elle durera 20-30 min, la finesse des aiguilles de verre permet de limiter les dommages du nerf. Après injection au niveau du nerf, la peau sera suturée. Aucun autre organe que la peau ne sera incisé. o La deuxième chirurgie de ligature unilatérale du nerf sciatique ou facial sera effectuée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent. Elle durera 15 à 30 minutes. o La troisième chirurgie d’induction de neuropathie périphérique traumatique (ligature ou transection du nerf sciatique) sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale par du personnel formé et compétent. Elle durera 15 à 20 minutes. - L’analyse de la conduction nerveuse du nerf sciatique sera réalisée une seule fois chez tous les animaux sous anesthésie générale. Aucune incision n’est nécessaire. Elle dure 20 minutes. - Les tests comportementaux seront réalisés chez tous les animaux une fois par semaine sur des animaux vigiles. Chaque session de chaque test dure 15 min maximum.
Impact sur les animaux
- Chirurgies selon les bonnes pratiques vétérinaires - Douleurs post-opératoires (4 jours) traitées par des analgésiques puissants - Maladie : douleurs neuropathiques légères à modérées, diminution légère à modérée de la mobilité - Tests comportementaux : léger stress (15 min par jour) - Nuisance associée au diabète : obésité, hyperglycémie (6 à 10 semaines et une évolution progressive). Dans les modèles de névralgie faciale, les animaux présenteront une gêne au niveau de la face en ipsilatéral à la ligature ou compression du nerf facial. Dans le modèle de neuropathie douloureuse, les animaux présenteront une gêne au niveau de la patte en ipsilatéral à la ligature ou transection du nerf sciatique.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car nous prélèverons des tissus (nerfs, cerveaux) pour étudier l’effet du traitement sur les pathologies étudiées.
Remplacement
La biologie de notre système d'étude, qui repose principalement sur une profonde collaboration entre la myéline et les axones qu'elles couvrent, rend difficile la modélisation et la reproduction complète du système in vitro. Il existe des méthodes pour étudier les nerfs mais leur structure obtenue par ces méthodes reste incomplète et immature. Etant donné l’immaturité de la myéline en culture, il a été montré que les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation, la dégénération, la régénération du nerf périphérique ne sont reproduits que partiellement in vitro. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques reste donc le seul véritable moyen d'aborder ces problèmes et de trouver des solutions aux maladies humaines du nerf.
Réduction
L’étude du nombre d’animaux utilisés dans les articles scientifiques ainsi qu’à partir de nos données internes sur lesquelles nous avons réalisé des tests de puissance statistique avec un logiciel spécialisé nous ont permis de déterminer le nombre d’animaux composant chaque groupe expérimental. Nous avons prévu de faire des calculs de puissance statistique sur les cohortes recevant la première dose avant de tester la deuxième dose afin de réduire si nécessaire le nombre d’animaux. Les procédures 2 à 4 sont des études longitudinales. Cette démarche permet de réduire le nombre d’animaux et d’augmenter la puissance statistique. Les deux sexes seront utilisés dans tous les modèles rongeurs de ce projet car il n’a pas été montré de différences significatives dans l’expression de la maladie entre les deux sexes pour les âges et les tests que nous allons étudier. Le nombre exact d’animaux nécessaire aux études sera commandé auprès de fournisseurs agréés pour limiter la production d’animaux inutiles. Dans la procédure 1, dans la mesure du possible nous réutiliserons les animaux n’ayant passés que des tests de comportement pour de la formation en chirurgie et en électrophysiologie s’il y a un nouvel employé à former sur ces tests.
Raffinement
Les rongeurs auront une période d'acclimatation de 5 jours lors de laquelle ils ne seront pas dérangés puis une habituation à la contention (gentle handling) sera effectuée à partir du 6ème jour pour diminuer leur stress. Ils seront observés quotidiennement par du personnel formé et compétent. Les conditions d'hébergement des rats et souris respecteront les bonnes pratiques en matière d'hébergement (matériel de nidification, copeaux, frisottis et maison en carton). La fréquence du change des cages et des biberons des souris diabétiques sera augmentée. Les chirurgies seront effectuées sous anesthésie et la prise en charge de la douleur pré et post opératoire sera traitée par l’utilisation d’analgésiques puissants. Les points limites précis et spécifiques du projet seront appliqués de manière stricte. La méthode d'injection locale des vecteurs viraux est un raffinement par rapport à l'injection systémique (diminution de la dissémination et des effets secondaires). Des fiches de suivi des animaux sont mises en place pour évaluer la sévérité de la neuropathie et l'état clinique des animaux en post-opératoire. Selon des critères précis pour une évaluation de la souffrance animale, il y aura une discussion avec le vétérinaire et/ou la Structure du Bien Etre Animal (SBEA) pour décider des soins à apporter. De manière générale nous mettrons en œuvre des actions adaptées, en cas de déshydratation un apport d'eau gélifiée ou une injection sous-cutanée d'une solution isotonique d'électrolytes pourra être effectuée et en cas de perte de poids ou d'état affaibli, de la nourriture humidifiée sera déposée sur le sol de la cage. Avant leur mise à mort, les souris et les rats seront sédatés.
Choix des espèces
Nous avons sélectionné des modèles animaux reconnus pour modéliser fidèlement les symptômes sensorimoteurs des neuropathies périphériques étudiés dans ce projet et dans lesquels nos produits, construits pour reconnaitre des cibles à la fois humaines et de rongeurs, seront actifs. D’autre part, les premières études de preuves de concept de nos candidats médicaments ont été apportées chez le rongeur justifiant de poursuivre nos recherches avec ces espèces. Différents modèles de douleurs neuropathiques existent à la fois chez le rat mais aussi chez la souris, nous avons choisis d’utiliser les modèles les plus pertinents et les plus étudiés en recherche fondamentale pour évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments afin de pouvoir anticiper les résultats que nous pourrons obtenir chez le gros animal avant d’évaluer leur efficacité chez l’homme. Notre objectif est de tester l’efficacité des traitements soit au début de l’apparition des symptômes pour prévenir la démyélinisation pathologique ou la dégénération axonale (stade précoce), soit une fois ceux-ci bien installés (stade tardif) afin de bloquer la progression de la maladie ou de favoriser la régénération. Rat/souris : mâle et femelle jeunes adultes (4 à 6 semaines d’âge) et adultes (8 semaines d’âge).
Etude de l’influence de l’inflammation intestinale sur la réponse immunitaire respiratoire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Immobilité, prostration, apathie, ou perte de plus de 20 % du poids : ces signes déclenchent la mise à mort immédiate de la souris. 1 340 souris vont être utilisées, 528 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 812 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever poumons, tissu nasal, rate, iléon, caecum et côlon. Une colite leur est provoquée par un agent chimique dans l'eau de boisson ou par gavage de la bactérie Citrobacter rodentium, avec diarrhée, sang dans les selles et perte de poids, avant une infection par un virus respiratoire ou trois vaccinations à trois semaines d'intervalle. Aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne leur sera donné, le porteur indiquant que ces traitements perturberaient les réponses immunitaires qu'il mesure.
Objectifs
L’objectif est d’évaluer l’influence de l’inflammation intestinale sur la réponse immunitaire respiratoire causée par l’infection de différentes souches de virus respiratoires ou la vaccination chez la souris. Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin sont caractérisées par une inflammation chronique de la muqueuse intestinale. Les patients qui ont une inflammation intestinale ont une réponse immunitaire déréglée et il a été démontré qu’ils sont plus suceptibles de developper des infections par des virus respiratoires et qu’ils ont aussi plus de risque de présenter des complications après infection. Il est désomais bien établi qu’il existe une communication entre le système digestif et le système respiratoire. Notre objectif est de mieux comprendre l’influence d’une inflammation intestinale sur le developpement des réponses immunitaires après une infection pulmonaire à des virus respiratoires mais aussi après vaccination contre ces virus notamment ceux qui induisent la grippe ou la bronchiolite. Afin d’étudier les effets de l’inflammation intestinale sur la réponse immunitaire respiratoire, nous induirons une inflammation intestinale chez les souris, grâce à un agent chimique ou infectieux, qui modélisera une maladie inflammatoire chronique intestinale. Différents modèles d’inflammation intestinale seront testés car ils induisent des réponses différentes. Une fois l’inflammation intestinale établie, les souris seront infectées ou vaccinées et la réponse immunitaire muqueuse (nasale, pulmonaire, intestinale) et dans le sang sera ensuite évaluée.
Bénéfices attendus
La réponse immunitaire des patients atteints de maladies inflammatoires chronique de l’intestin est modifiée et les sujets sont plus susceptibles à des inflections notamment respiratoires et leur réponse à des vaccins peut aussi varier. Notre projet vise à étudier par quels mécanismes l’inflammation intestinale peut moduler la réponse immunitaire respiratoire. Nous regarderons l'immunité au niveau des muqueuses et dans le sang. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances dans ces maladies complexes et pourra permettre d’améliorer la prise en charge des patients et d’optimiser les thérapeutiques. Ces résultats seront également potentiellemnt applicables à des sujets présentant une inflammation intestinale induite par des infections entériques ou dans le cadre du syndrome de l’intestin irritable. Suite aux résultats obtenus dans ces expériences animales, nous pourrons envisager de confirmer les résultats lors d’une étude chez l'homme.
Procédures
L'inflammation intestinale sera générée soit par un agent chimique dans l’eau que les souris boiront, soit par gavage avec la bactérie Citrobacter rodentium. Pour le suivi de l'inflammation, des prélèvements de sang et de fèces seront réalisés pour doser des anticorps et différents marqueurs inflammatoires. Le prélèvement de sang au niveau de la joue dure 30 secondes. Pour le prélèvement de fécès, les souris seront isolées dans des boîtes individuelles. Le mouvement des souris qui y seront enfermées n’est pas entravé et l’isolement n’excèdera pas 20 minutes. Ces prélèvements seront fait trois fois lors de colite et infection ou sept fois lorsque les souris auront une colite puis une vaccination puis un challenge, avant chaque étape. Les souris seront soit infectées une fois par des virus respiratoires, soit elles seront vaccinées 3 fois à trois semaines d’intervalle. Pour ces gestes, les souris seront ansthésiées pour leur confort et éviter de fausses routes, le geste dure 30 secondes maximum. Suite à l'infection, nous euthanasierons les souris à plusieurs interavalles de temps (J1, J3, J7, J14 et J21). Dans certaines expériences clés, les souris vaccinées seront ensuite infectées afin de déterminer la protection induite par le vaccin. Avant la première immunisation, un jour avant chacune des autres immunisations et un jour avant la mise à mort, des prélèvements de fèces, sang et lavages vaginaux seront aussi effectués afin de mesurer les réponses anticorps dans ces prélèvements. Les prélèvements vaginaux seront effectués sur les souris femelles avec une pipette pour liquide visqueux pour doser les anticorps sécrétés au niveau des muqueuses. Lorsque l’on veut analyser la permabilité intestinale, les souris seront gavées avec un agent qui permet de visualiser la perméabilité de l'intestin, 4 heures avant la mise à mort. Ce geste sera réalisé une seule fois. Lorsque l’on veut analyser certaines cellules spécifiques de la mémoire immunitaire dans les organes, une injection intraveineuse avec un anticorps fluorescent sera réalisée 3-5 minutes avant la mise à mort. Cette injection se fera à l’aide d’un tunnel fixé à la paillasse. La queue sera légèrement chauffée avec une lampe rouge durant 2 minutes. Ensuite, la queue sera rapidement désinfectée et un petit volume de solution saline contenant l’anticorps sera injecté. Cette injection sera réalisée sur souris vigile.
Impact sur les animaux
Les souris pouront, lors de la colite, avoir une perte de poids par rapport au poids initial, une diarrhée, du sang dans les selles. Les animaux peuvent diminuer leur toilettage et leur activité ainsi que s'isoler et changer leur posture. En plus de ces paramètres, suite à l’infection par les virus respiratoires ou la vaccination, la température corporelle peut être augmentée. Après l’infection voire aussi la vaccination, les animaux pourraient développer des signes de pathologies respiratoires, caractéristiques des infections à virus respiratoires : une perte de poids sur une durée de 1 à 10 jours après administration de virus ou vaccin, une accélération du rythme respiratoire, une perte d’activité légère entre 2 et 7 jours après administration de virus ou du vaccin. Les souris pourraient aussi subir des effets indésirables après la réalisation des gestes techniques de prélèvements sanguins ou d’injections éventuelles de vaccins. Ces effets indésirables seraient des douleurs locales et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever des organes (poumons, tissu nasal, rate, iléum, caecum, colon) et des fluides muqueux comme les lavages venant des poumons et nasaux. Ces prélévements permettront d’analyser les réponses immunitaires locales et systemiques.
Remplacement
L’étude du dialogue entre l’intestin, les poumons et le système immunitaire est complexe. Ces systèmes biologiques imposent le modèle animal pour valider les hypothèses; il n’existe pas aujourd’hui de modèle cellulaire récapitulant tous les paramètres du tube digestif, du système respiratoire et du système immunitaire.
Réduction
Le design des expériences sera optimisé afin de minimiser le nombre de souris utilisé dans les groupes contrôles. Lors de chaque expérience, nous inclurons donc le maximum de groupes expérimentaux pour un groupe contrôle, tout en se veillant que les expériences restent réalisables par les expérimentateurs. La répétition des expériences sera réalisée au maximum trois fois lorsque des réponses immunitaires significativement plus élevées seront observées dans le groupe experimental que dans le groupe contrôle. Nous aurons 5 animaux par groupe conformément à nos expériences précédentes au laboratoire; c'est le nombre minimal nécessaire pour avoir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement durant l’induction de l'inflammation intestinale, après infection ou vaccination. L’immobilité, la prostration, l’apathie, ainsi qu’une perte de poids de plus de 20% du poids seront considérées comme critères de points limites qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal. Etant donné que l’on analyse des réponses inflammatoires, nous ne pouvons pas donner d’anti-douleurs ou anti-inflammatoires qui pourraient perturber les réponses immunitaires des souris. Nous surveillerons l'apparition des points limites et appliquerons la procédure approprié. Lors de l'infection et de la vaccination par voie nasale, les souris seront anesthésiées par kétamine-Xylazine.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence pour les interactions poumon-intestin. Les souris auront entre 7 semaines et 16 semaines car avant 7 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire et intestinal complétement developpé et apres 16 semaines le système immunitaire est potentiellement modifié.
Modulation du système sérotoninergique pour le traitement des douleurs neuropathiques traumatiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 984 rats vont être utilisés, 1 780 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun passant jusqu'à trois heures dans un compartiment de test avec une mesure du seuil de douleur toutes les trente minutes. Un nerf est lésé chirurgicalement pour reproduire une neuropathie traumatique, la douleur post-opératoire est déclarée sévère et traitée pendant vingt-quatre heures, puis la patte est stimulée au toucher ou plongée dans l'eau froide, gestes que le porteur classe eux aussi comme sévèrement douloureux. La veille du test de reconnaissance sociale, chaque rat passe moins de vingt-quatre heures isolé. Les rats qui ne deviennent pas douloureux après la chirurgie, environ un sur cinq, sont écartés de l'étude, et 96 rats juvéniles sans traitement partent vers d'autres expériences de l'animalerie, tous les autres étant tués pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Les douleurs neuropathiques touchent en France 5.6–7.3% de la population générale adulte. Ce sont des douleurs chroniques car persistantes ou récurrentes qui ne sont généralement pas améliorées par le traitement de la maladie sous-jacente ou même par sa guérison. Elles se caractérisent par une perception aberrante de douleur et sont souvent associées à des troubles cognitifs. Le traitement de ces douleurs est difficile, par manque d’efficacité des médicaments de référence et par leurs nombreux effets indésirables.. La sérotonine est un neurotransmetteur impliqué dans la modulation de la douleur et dans de nombreuses autres fonctions, comme le contrôle de l’appétit, du sommeil, de l’humeur…. L'objectif principal de ce projet, qui mettra en œuvre des approches comportementales chez le rat présentant une neuropathie traumatique similaire à celle causée par un accident de la voie publique ou par la lésion d’un nerf au cours d’une chirurgie, est d'étudier le rôle de la sérotonine dans ce contexte douloureux afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques améliorant les symptômes douloureux et les comorbidités cognitives.
Bénéfices attendus
Si les agents pharmacologiques testés permettent de soulager la douleur et les comorbidités associées, alors on peut espérer i) soit leur utilisation dans de nouvelles indications (la douleur neuropathique), ii) soit le développement de nouveaux agents. Au vu de la sévérité des douleurs neuropathiques, de leur impact sur la qualité de vie des patients et du manque d’efficacité des traitements existants, le développement de thérapeutiques médicamenteuses efficaces est fortement attendu.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à un test de détection de seuil de douleur (14 jours après la chirurgie) et à un test de cognition (21 jours après l'induction de la neuropathie). Les rats ne sont soumis qu'à un seul test de détection de seuil de douleur (stimulation tactile ou froide). Les tests détection de seuil de douleur sont réalisés chez l'animal vigile à raison d'une mesure avant la chirugie puis une mesure 2 semaines après, puis, après l'administration de l'agent pharmacologique ou du véhicule, 1 fois toutes les 30 min pendant 3 h maximum (au total entre 5 et 7 mesures). Le test de cognition est réalisé chez l'animal vigile, une seule fois, il dure 10 minutes. Entre leur arrivée et leur mise à mort, les animaux ont subi: 2 injections intrapéritonéales d'agent pharmacologique (rat vigile) OU: 1 injection intrapéritonéale d'agent pharmacologique (rat vigile) et 1 injection intrathécale (rat anesthésié).
Impact sur les animaux
Stress (modéré) lié à l’immobilisation du rat dans la main de l’opérateur pour l'injection. Douleur (légère) de l’injection intrapéritonéale . La durée totale de la nuisance (immobilisation + injection) est de 10 secondes. Stress (modéré) dû au changement de salle. Stress (modéré) lors de l’immersion de la patte dû à l’immobilisation du rat entre les mains de l’expérimentateur (durée: 20 sec). Stress (modéré) lors de la mise du rats dans un compartiment pour la stimulation tactile (durée: 180 min). Stress (modéré) dû à l’isolement de l’animal la veille (pendant moins de 24 h) du test de reconnaissance sociale. Douleur post-opératoire (sévère) traitée avec un anti-inflammatoire (pendant 24 h). Douleur (sévère) à la stimulation tactile (durée 6 sec) et à la stimulation thermique (durée 14 sec maxi). Difficultés à se mouvoir (modérées) et à atteindre la mangeoire pendant 24 h après la chirurgie.
Devenir
A l'exception des 96 rats juvéniles issus de la procédure 3, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvement d'organes ou fixation de tissus.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal vigile, sont nécessaires pour appréhender les mécanismes intégrés de la douleur et pour évaluer la pertinence de traitements antalgiques potentiels sur la douleur et les comorbidités associées. Le modèle de neuropathie traumatique fait référence dans la communauté scientifique. Sa répétition est nécessaire afin d’évaluer l’effet de nouveaux agents pharmacologiques sur les symptômes douloureux de la neuropathie et les comorbidités cognitives associées. Les mécanismes moléculaires sous-jacents aux processus douloureux et cognitifs ne peuvent être entièrement élucidés par des études cliniques.
Réduction
n= 8 rats/condition (traitement), taille de l’échantillon définie selon la variabilité (10%) des paramètres étudiés et par la puissance des tests statistiques; une analyse de variance à une ou deux voies est réalisée,suivie d'un test post-hoc. Une partie des rats neuropathiques ayant subi la stimulation tactile ou l'immersion de la patte seront réutilisés pour le test de cognition. Ainsi, 288 rats pourront être réutilisés pour le test de cognition. Les rats non douloureux après la chirurgie seront écartés de l'étude pharmacologique. Ceux-ci représentent environ 20% de la proportion des rats opérés. Pour écarter les biais méthodologiques les traitements sont randomisés, les expériences réalisées en « aveugle » et selon la méthode des blocs. 96 rats juvéniles n'ayant subi aucun traitement pourront être intégrés dans d'autres expérimentations autorisées se déroulant au sein de l'animalerie.
Raffinement
Les rats sont stabulés à raison de 4 par cage. Le protocole mettant en jeu un modèle de douleur chronique, une attention particulière est portée aux animaux, aux conditions de stabulation et aux soins pré et post-opératoires : enrichissemnt du milieu avec des tunnels en plastique, du coton, d'un bloc de bois; change avec soin, utilisation d’un tapis chauffant, protection de la cornée par du gel oculaire, traitement antalgique en fin de chirurgie et 24 h après. En raison de la réduction de leur mobilité pendant les 24 h suivant la chirurgie, les granulés d’aliments sont placés sur le sol de la cage pendant 24 h. Les rats sont observés tous les jours et évalués à l’aide de la grille de score spécifique au modèle.
Choix des espèces
Des rats jeunes adultes (âgés de 6-7 semaines) et juvéniles (âgés de 4-5 semaines), mâles et femelles sont utilisés. Le choix du rat est justifié par: i) sa pertinence physiologique (nombreuses similarités structurelles et fonctionnelles de son système nerveux avec l’humain) pour permettre des extrapolations pertinentes ; ii) la richesse de ses comportements facilement observables et mesurables, reproductibles, pour l’étude des fonctions cognitives et de la douleur ; iii) sa facilité de manipulation, iv) son cycle de vie court (permettant d’étudier en quelques semaines les effets d’une pathologie qui peut perdurer plusieurs mois chez l’homme) ; v) la possibilité dedévelopper des modèles de maladies humaines, permettant de tester de nouvelles thérapies potentielles avant de passer aux essais cliniques chez l’humain.
Essai de toxicité aux premiers stades de la vie sur le poisson zèbre Danio rerio
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Nage en tire-bouchon, convulsion, tétanie, exophtalmie, œdème, hémorragie : ces signes déclenchent la mise à mort du poisson concerné. 8 640 poissons zèbres vont être utilisés, 4 320 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 2 880 un niveau modéré et 1 440 un niveau léger, tous tués à l'issue. Des œufs fraîchement fécondés sont exposés à cinq concentrations d'un produit chimique pendant environ trente jours après l'éclosion, la gamme étant calée pour que la plus faible concentration produise environ 10 % d'effet et la plus forte environ 90 %. Le test répond à l'obligation réglementaire REACH pesant sur des monomères que l'entreprise produit et qu'elle ne pourrait plus vendre en Europe sans lui.
Objectifs
Le test OCDE 210 est destiné à déterminer les effets létaux et sub-léthaux des produits chimiques sur les stades de développement de l'espèce étudiée (ici le poisson zèbre) et consiste à exposer des poissons aux premiers stades de leur vie à une série de 5 concentrations du produit chimique dissout dans l’eau, les effets étant comparés à un lot témoin non exposé. Ce test fait partie d’un ensemble de tests d’écotoxicité imposé par certaines réglementations (REACh notamment), il n’est réalisé qu’à la demande des autorités compétentes.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de réaliser les tests selon la ligne directrice OCDE 210 et de répondre ainsi à une exigence réglementaire qui consiste à caractériser les dangers et risques associés à la production et l’utilisation de nos produits. En absence de réponse à cette exigence, ces substances ne pourront plus être produites et/ou utilisées en Europe (les substances concernées sont des monomères produits par notre société et relevant notamment du règlement REACh qui s’applique aux produits chimiques hors biocides et produits phytosanitaires).
Procédures
Le test consiste à exposer des oeufs fraichement fécondés à une série de 5 concentrations du produit chimique testé dissout dans l’eau, pendant environ 30 jours après l’éclosion. Les points d’observation suivants, spécifiés dans la ligne directrice, seront relevés : - Éclosion et survie : dénombrement quotidien des éclosions et des survivants. Les oeufs moisis, embryons et larves morts seront retirés dès qu’ils sont repérés. - Apparence anormale : dénombrement (à minima 3 fois par semaine) des larves et juvéniles présentant une anomalie corporelle. En cas de malformations et apparence anormale telles que l’organisme est en état de souffrance considérable et irréversible, celui-ci sera retiré de l’essai et euthanasié. - Comportement anormal : hyperventilation, nage mal coordonnée, immobilité ou comportement alimentaire atypiques seront notées à minima 3 fois par semaine. - Poids & longueur totale : après euthanasie des poissons ayant survécu jusqu'à la fin de la période d'essai.- Paramètres physico-chimiques pH, oxygène dissous et température : mesure quotidienne. Les effets léthaux et subléthaux sont évalués et comparés aux valeurs témoin pour déterminer la concentration la plus basse pour laquelle on observe un effet, et la concentration sans effet observé.
Impact sur les animaux
Selon les substances et les concentrations testées, les nuisances attendues tout au long de la période d’essai peuvent être les suivantes : stress, douleur, comportement anormal, ralentissement anormal de la croissance (en termes de taille et de prise de poids). Parmi ces atteintes, seules celles définies comme étant des points limites auront pour conséquence une euthanasie des organismes concernés. Le protocole d'essai est clairement établi et ne peut être dérogé sous peine d'invalidité du test réalisé. La gamme d’essai étant choisie de sorte que la plus faible concentration testée ait environ 10% d’effet et la plus forte concentration environ 90%, nous considérons que les animaux exposés aux 2 plus faibles concentrations subiront un degré de gravité modéré et les animaux exposés aux 3 concentrations les plus élevées un degré sévère. Les organismes témoins subiront un degré de gravité légère.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés ne peut pas être réutilisés et doit être euthanasiés.
Remplacement
Ce test est une exigence réglementaire imposé par les autorités compétentes. Aucun test in vitro n’ayant été validé par les autorités, il ne sera procédé à aucun test in vitro en amont. Le test de toxicité selon la ligne directrice OCDE 210 est le seul test validé par les autorités compétentes, il n’est réalisé que sur leur autorisation, obtenue pour chacune des substances testées. De même, il n'existe pas de modélisation validée pour remplacer l'utilisation d'animaux.
Réduction
Pour chaque test, le nombre d'animaux utilisé est défini par le protocole d'essai et ne peut être diminué. Cependant, la ligne directrice autorise la possibilité de réaliser un pé-test permettant de définir les conditions exactes du test définitif, notamment la gamme de concentrations. Ce prétest est réalisé sur un nombre de concentration et de réplicat plus faibles. Afin de limiter le recours à ce test préliminaire, , nous définissions nos gammes de concentrations à partir de données de toxicité aiguë déjà disponibles sur chacune de nos substances et obtenues sur d’autres organismes (algues et daphnies notamment) mais également sur des poissons adultes de la même espèce. Ce processus permet également de réduire le risque d’invalidation d’un test dans le cas où la gamme de concentrations choisie ne permettrait pas d’atteindre les objectifs (par exemple dans le cas de concentrations trop élevées qui entraineraient une mortalité excessive ne permettant pas d’analyses statistique fiable. Dans cette situation nous serions obligé de recommencer le test et donc d’augmenter le nombre d’animaux utilisés).
Raffinement
Les organismes géniteurs sont commandés auprès de fournisseurs disposant de l’agrément européen. Dès réception, les poissons sont transférés dans un local indépendant où se situe le système d’hébergement. Ils sont d’abord versés dans un aquarium « tampon », puis l’eau de transport est progressivement diluée avec l’eau provenant du système d’hébergement (on remplace 1L tous les 1/4h environ). Les poissons sont maintenus dans un milieu à 50% de dilution pendant au moins 30 minutes puis sont transférés à l’aide d’une épuisette dans le système d’hébergement final (environ 6 individus par bac de 3.5L). Une période d’observation de 2 semaines minimum est respectée afin de valider le lot reçu. Le système d’hébergement est une armoire spécifiquement dédiée à l’hébergement des poissons, composée de racks d’aquariums de 3.5L sous lesquels un visuel de gravier a été ajouté pour améliorer le bien-être des animaux. Le système régule la température à 26°C et le renouvellement du milieu (composé d’eau osmosé et de sels minéraux); des sondes associées à un système d’alarme contrôlent en permanence la température, le pH et la conductivité. Les techniciens contrôlent à minima une fois par semaine les paramètres oxygène dissous, nitrates, nitrites, ammoniaque et dureté. Ils assurent également quotidiennement l’apport en nourriture (aliment en poudre, daphnies et artémias). Une photopériode de 16h de jour/8h de nuit est appliquée automatiquement. Les organismes soumis au test OCDE 210 (organismes témoins et organismes exposés à la substance testée) seront placés dans des aquariums nus (sans visuel de gravier) et maintenus dans les mêmes conditions environnementales que les géniteurs, de sorte que seule la concentration de la substance testée peut avoir un impact. Les comportements et anomalies suivants ont été définis comme des points limites nécessitant une euthanasie des individus concernés (dans le cadre de l’hébergement et des tests de toxicité) : nage « en tire-bouchon », convulsion, tétanie, exophtalmie, œdème et hémorragie. Dans le cadre de raffinement, la nourriture vivante (rotifère et artémies) est privilégiée.
Choix des espèces
Cette espèce est l'une de celles recommandées par la ligne directrice. Elle est employée par le laboratoire depuis plus de 20 ans pour d'autres projets (dont le test de toxicité aiguë sur adultes). La ligne directrice impose d'exposer les organsimes au produit chimique depuis le stade oeuf fécondé jusqu'au stade juvénile (soit environ 30 jours après l'éclosion).
Etude de la fonction des structures cérébrales de poissons osseux doués de capacités cognitives élaborées pour mieux comprendre l’évolution du cerveau (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les poissons retenus pour ce projet le sont pour leurs capacités cognitives, utilisation d'outils, reconnaissance de soi dans un miroir, reconnaissance individuelle, et pour un cerveau assez volumineux pour supporter une chirurgie. 450 cichlidés de trois espèces vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour que leur cerveau soit prélevé et le site de la lésion localisé. Chacun subit une lésion du lobe inférieur par ultrasons, environ une heure sous anesthésie, avec un risque de troubles moteurs et de brûlure superficielle de la peau au point de contact de la sonde, puis vit seul dans son aquarium le temps des tests. Le porteur annonce cinq tests de comportement avant et après la lésion, jusqu'à deux séances d'une heure par jour pendant vingt jours, sans dire lesquels.
Objectifs
Certains poissons présentent des comportements comme l’utilisation des outils, l’utilisation du miroir (reconnaissance de soi), la reconnaissance individuelle, et une communication multimodale complexe. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau de ces poissons, qui présentent des origines géographiques, une taille et des comportements différents. Les cerveaux des poissons sont organisés de façon très différente par rapport aux cerveaux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. En particulier, une structure de la partie ventrale du cerveau, le lobe inférieur, n'existe que chez ces poissons, et n’est pas retrouvée chez les mammifères ou les oiseaux. Les fonctions de cette structure demeurent inconnues, et nos travaux précédents suggèrent qu’elle pourrait être impliquée dans les fonctions cognitives remarquables citées précédemment. Mieux connaître la fonction du lobe inférieur chez les poissons permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux aussi différents que ceux des poissons ont pu permettre l’émergence de comportements complexes. Cette étude permettra donc de mieux comprendre comment des cerveaux dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires. Notre étude implique deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2) dont la demande d’autorisation de projet est soumise au CEEA pour chacun.
Bénéfices attendus
Certains poissons présentent des comportements assez complexes incluant certaines capacités cognitives dites de « haut niveau ». Cependant, les structures cérébrales impliquées demeurent méconnues. Afin d’expliquer comment les cerveaux des poissons produisent ces comportements, des études lésionnelles sont nécessaires. Nos études précédentes montrent que l'organisation globale du cerveau des poissons téléostéens est très différente de celle des mammifères, et que le lobe inférieur, une structure unique à ces poissons, pourrait être impliquée dans ces comportements complexes. Cette étude permettra donc de mieux comprendre comment des cerveaux dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Procédures
Les poissons seront soumis à 5 tests de comportement avant et après une lésion cérébrale pendant une durée maximale totale de 3 mois (durée des tests après la lésion : 3 à 20 jours, avec une à deux sessions d’une heure par jour). Les tests de comportement seront évalués sur animal vigile au sein de l’EU1. Les poissons seront soumis à la procédure de lésion cérébrale par ultrasons durant environ une heure sous anesthésie dans l’EU2.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées à: - La lésion par ultrasons, qui pourrait créer des problèmes moteurs, et provoquer une brûlure superficielle de la peau au point de contact avec la sonde ultrasons. - L’hébergement individuel et les tests comportementaux, qui nécessitent cet hébergement individuel des individus, et peuvent provoquer un stress pour l’animal. - La manipulation des animaux pour l’anesthésie (stress potentiel).
Devenir
L'euthanasie des individus est nécessaire au prélèvement de leur cerveau pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet, permettant de visualiser précisément le site de chaque lésion.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées. Notre étude nécessite un échantillonnage d'espèces qui ont un grand cerveau avec des capacités cognitives de haut niveau, et qui possèdent un lobe inférieur développé, ce qui est le cas des cichlidés. Les tests comportementaux prévus ne peuvent être réalisé que sur ces animaux. Les trois espèces que nous souhaitons utiliser, A. nigrofasciata, N. brichardi, P.zebra, ont des comportements très différents et des cerveaux organisés de façon différentes. De ce fait, il est pertinent et nécessaire d'utiliser ces trois espèces de cichlidés.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses, et nous privilégierons des tests statistiques qui permettront de limiter le nombre d’individus nécessaires. Des études précédemment publiées chez les poissons nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être sera particulièrement observé par des zootechniciens compétents. La température de l’eau est surveillée. Après la lésion cérébrale, le bien-être des animaux est plus attentivement surveillé par des expérimentateurs compétents jusqu'à la fin de l’expérimentation (20 jours maximum après la lésion). Aussi, une communication entre le personnel de zootechnie et les expérimentateurs permettra un suivi adéquat des animaux. Pour surveiller la santé des animaux, des points limites seront utilisés, prenant en compte des comportements ou signes visibles. Dans le cas où des animaux montreraient des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Selon la gravité de ces signes, les animaux pourront être soignés via une analgésie dans l’eau de nage, ou si ce n'est pas possible de soigner, ils seront euthanasiés dans les délais les plus brefs. L’analgésie par bain en post opératoire a été choisie pour réduire le stress de l’animal, puisqu’une injection demanderait la manipulation du poisson (sortie de son aquarium, anesthésie avec le MS222, puis injection), ce qui produirait un stress trop important. En cas de brûlure légère liée à la température de la sonde, un pansement antiseptique sera appliqué que la plaie jusqu’à cicatrisation. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement pour fournir de l'enrichissement. Un contact visuel entre les poissons sera possible avant et après l’intervention puisque les aquariums seront placés les uns à côté des autres. Lors du transport des animaux, la température de l’eau sera maintenue par l’utilisation de chaufferettes dans la boîte de transport.
Choix des espèces
Les poissons ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses anatomiques étudiant les structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez certaines espèces, mais chaque espèce présente des comportements particuliers et qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude neuroanatomique de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de poissons traditionnellement utilisées en recherche ne permet pas de réaliser les chirurgies nécessaires à ce projet. L’utilisation de poissons de plus grande taille, dont la taille du cerveau permet une approche lésionnelle, semble donc toute indiquée. Nous travaillerons sur des jeunes adultes (taille du corps à partir de 3 cm) car il nous est nécessaire d’étudier un cerveau pleinement développé.