Procédures sévères

Les souris qui montrent des "signes de douleur insupportable" sont tuées avant la fin du protocole. 12 000 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles développent un lupus, avec atteinte des reins, inflammation généralisée, douleurs articulaires et lésions cutanées, et reçoivent une puce sous la peau, des traitements jusqu'à deux fois par jour pendant plusieurs semaines, des prises de sang à la mâchoire toutes les deux semaines et des tests de sensibilité à un stimulus mécanique. Le chiffre de 12 000 couvre 130 études dont le porteur écrit qu'il ne peut pas fixer le nombre à l'avance, celui-ci dépendant "de nos partenaires et de nos molécules en développement".

Objectifs

Le lupus est une maladie auto-immune chronique et complexe caractérisée par la production d’auto-anticorps affectant plusieurs organes (reins, peau, articulations, sang…). Il s’agit d’une maladie du tissu conjonctif dont le symptôme caractéristique est une inflammation associée au système immunitaire. Il touche principalement les femmes (9 femmes pour 1 homme) en âge de procréer. C’est une maladie difficile à prendre en charge, car son évolution est imprévisible, les symptômes varient d’un patient à l’autre, et les traitements actuels, souvent lourds, ne permettent pas de guérir. Ils visent surtout à réduire les poussées inflammatoires et à prévenir les complications. Découvrir de nouvelles solutions thérapeutiques est crucial afin d’offrir des traitements plus efficaces, mieux tolérées et personnalisées améliorant la qualité de vie et réduisant la morbidité et la mortalité. Après une phase de sélection de molécules prometteuses, leur mode d’action sera étudié, et les plus pertinentes seront testées dans des modèles expérimentaux de lupus, qui reproduisent les grandes caractéristiques de la maladie humaine. Les molécules testées auront un potentiel anti-inflammatoire, immunomodulateur ou viseront des cibles biologiques impliquées dans le développement du lupus. Ces recherches, menées dans le cadre d’un programme de maturation préclinique, permettront d’évaluer la sécurité, la tolérance et l’efficacité de ces traitements potentiels avant toute phase clinique. L’objectif final est de proposer des solutions thérapeutiques innovantes qui amélioreront la qualité de vie des patients, tout en respectant les principes éthiques de la recherche.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet au sein du lupus érythémateux systémique. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver et de développer potentiellement de nouvelles thérapeutiques permettant de réduire la mortalité liée au lupus, de soulager les patients atteints de cette maladie, afin qu’ils aient une meilleure qualité de vie.

Procédures

Les animaux ne subiront pas de procédures chirurgicales. Tous les animaux recevront une injection en sous-cutanée pour l'implantation des puces d'identification RFID. Également, les animaux recevront des administrations de traitements. Plusieurs voies d'administrations sont envisagées en fonction du mode d'administration du composé testé. Le traitement sera administré une à sept fois par semaine, jusqu’à deux fois par jour, en fonction de la molécule étudiée et de la voie d’administration, pendant plusieurs semaines. Toutes les deux semaines maximum, les animaux pourront subir un prélèvement de sang au niveau mandibulaire. Ces prélèvements se feront sur animal anesthésié. Des tests de comportement pourront être effectués, jusqu'à 2 fois par semaine pendant la durée de l'étude, en mesurant la sensibilité à un stimulus mécanique (stimulation pendant 5 secondes, latence de 2 minutes entre chaque stimulation, soit un test durant 15 minutes en tout). Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour évaluer leur état général.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, les souris utilisées vont développer des caractéristiques similaires à celles observées chez les personnes atteintes de lupus, une maladie causée par un déséquilibre du système immunitaire. Ces signes peuvent avoir un impact sur leur état général et leur espérance de vie. Par exemple, les souris peuvent développer des dysfonctionnements aux reins, une inflammation généralisée, des douleurs articulaires, des problèmes de peau et de multiples atteintes notamment aux organes sièges de l'immunité tels que la rate et les ganglions lymphatiques. Ces dommages peuvent entraîner une perte de poids et une diminution de l'activité. Ces symptômes peuvent varier en intensité selon les modèles utilisés. Tout au long de l'étude, ces différents paramètres seront surveillés en observant l'état de chaque animal. Leur comportement, leur consommation de nourriture et de boisson, ainsi que leur poids seront régulièrement contrôlés, entre 2 et 5 fois par semaine. Les traitements administrés sont prévus à des doses non toxiques, basées sur des études préliminaires ou la littérature et ne devraient pas entraîner d'effets secondaires importants, hormis une légère gêne transitoire liée aux injections. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse afin de ne pas provoquer de douleur et en respectant les recommandations éthiques des volumes prélevés.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés. Certains organes seront récupérés et des prélèvements sanguins seront réalisés à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir évaluer l’effet de notre molécule sur la maladie.

Remplacement

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules pouvant agir sur l’inflammation, sur l’auto-immunité et sur la douleur implique de disposer de modèles animaux mimant au mieux la pathologie humaine. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce souris à travers nos différents modèles reproduit plusieurs aspects du lupus humain. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Pour évaluer et déterminer l’effet d’un traitement sur l’inflammation, la production d’auto- anticorps, la prolifération de lymphocytes, la douleur et sur l’aspect histologique des organes, il est essentiel d’examiner l’animal vivant entier.

Réduction

Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux en accord avec la littérature existante ou nos expériences précédentes pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité de la molécule candidate). Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des molécules thérapeutiques qui auront montré une efficacité lors d’études précédentes afin de limiter l’utilisation des animaux. Pour ce projet nous prévoyons d’effectuer 130 études avec l’utilisation de 12000 animaux sur 5 ans. Toutefois, ce sont des estimations larges car le nombre d’études ne peut pas être déterminé à l’avance car il dépend de nos partenaires et de nos molécules en développement, de l’efficacité des molécules, du choix du modèle translationnel pour aller en clinique ainsi que les souches d’animaux choisies en fonction du modèle. En effet, dans le cadre de demande d’autorisation, il est nécessaire d'inclure toutes les souches animales potentielles qui pourraient être utilisées. Chaque souche citée doit être associée à un nombre précis d’animaux, même si, dans la pratique, certaines souches pourraient ne pas être sélectionnées en fonction des besoins des projets en cours et des pilotes. Par conséquent, il est prévu en total un nombre d'études plus élevé que le besoin exact anticipé pour éviter des interruptions administratives ou des retards en cas de changements dans les souches animales requises si nous ne prévoyons pas cette marge dès le début du projet.

Raffinement

Pour minimiser les impacts sur les animaux de laboratoire, des études pilotes seront menées sur un petit nombre d'animaux pour préparer une étude plus large. Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie gazeuse (implantation des puces d’identification, prélèvements sanguins) durant toute la procédure expérimentale afin de maîtriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. Les procédures d’implantation des puces d’identification et de prélèvements sanguins sont réalisées sous anesthésie gazeuse (un anesthésique volatile reconnu pour son induction et son réveil rapide, minimisant ainsi le stress et l’impact sur l’animal). L’implantation de la puce est une procédure rapide (quelques secondes) et bien que légèrement invasive, elle ne provoque qu’un inconfort transitoire. De même, les prélèvements sanguins sont effectués de manière à limiter le traumatisme local pour minimiser la douleur et l’inflammation post-procédure. Toutefois, les animaux seront surveillés attentivement après chaque intervention. Une grille de score pour évaluer la douleur sera mise en place incluant un arbre décisionnel avec critères d’arrêt de souffrance. Si des signes de douleur ou d’inconfort prolongés étaient observés (léthargie, prostration, diminution de l’alimentation), un analgésique sera administré toutes les toutes les 6 à 12 heures jusqu’à 48 heures. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l’étude pour détecter les signes de douleur insupportable et euthanasiés en fin d’expérimentation pour des analyses supplémentaires. Les souris seront regroupées par 5 à 6 par cage. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’habitation. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude, leur environnement sera enrichi avec du matériel de nidification et de divertissement afin que les animaux puissent se cacher et ronger. Un tunnel sera utilisé pour limiter la contention des souris par la queue. Afin d’optimiser l'expérience, les animaux seront randomisés selon le poids des animaux et/ou un marqueur sanguin ou urinaire. L’objectif est de préserver le bien-être des animaux. La satisfaction de leurs besoins physiologiques et comportementaux permettra d’éviter tout biais sur les résultats des expérimentations.

Choix des espèces

En accord avec les recommandations et la littérature, la souris représente un modèle très développé pour étudier le lupus. En effet, chez la souris le lupus ressemble beaucoup au lupus chez l’homme, notamment en ce qui concerne les problèmes rénaux et la production d’autoanticorps. Les modèles murins de lupus se répartissent en deux catégories principales : spontanés et induits. Afin de pouvoir étudier la progression de la maladie, les souris seront âgées de 6 semaines minimum et pourront être étudiées tout au long de leur vie. Ce stade nous permettra de réaliser des études présymptomatiques, symptomatiques et d’étudier l’effet de traitements jusqu’à la fin de la vie des souris.

Un cathéter posé sous la peau, colonisé par un biofilm bactérien, puis jusqu'à deux administrations par jour : 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit une posture courbée, un pelage hérissé, une respiration laborieuse, une prostration et une perte de réponse aux stimuli, la mise à mort étant déclenchée au-delà de 20 % de perte de poids après l'infection. Il écrit que le nombre d'études "varie en fonction de la demande client", chaque étude mobilisant de 20 à 100 souris sur cinq ans. Les survivantes ne sont pas gardées, leur système immunitaire ayant réagi à l'infection les rendant inutilisables pour un autre essai.

Objectifs

Nous avons pour objectif le développement de thérapies innovantes dans le domaine de l'infectiologie afin de répondre à un problème majeur qu’est la résistance aux antibiotiques.

Bénéfices attendus

Le nombre croissant d’antibiorésistances et d’infections nosocomiales sont clairement identifiés comme un besoin de santé public majeur. Il est indispensable de combattre la résistance aux antimicrobiens et de préserver la capacité de prévenir et traiter les maladies infectieuses à l’aide de nouveaux médicaments sûrs et efficaces. Ce nouveau modèle contribuera à la découverte de nouvelles thérapies anti-infectieuses.

Procédures

Voie d’administration : - Per os : 5 secondes, Sous cutané : 5 secondes , Intrapéritonéal : 5 secondes, Intramusculaire : 5 secondes, Intraveineuse : 5 secondes Pose du cathether en sous-cutané (procédure chirurgicale réalisée par une personne expérimentée détentrice d'une formation en chirurgie sur petits rongeurs) Le nombre d'interventions est spécifique de chaque étude et est dépendant du régime de traitement qui lui même est corrélé à la pharmacocinétique de chaque molécule en développement. Néanmoins les fréquences d'intervention (traitement uniquement) peuvent etre DIE : une fois par jour ou BID : deux fois par jour

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont une potentielle perte de poids (qui sera considérée comme un point limite si excédant 20% post infectiob). D'autres effets potentiels sont une apparition de signes cliniques : posture courbée, piloérection, respiration difficile, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus.

Devenir

Le sort prévu de tous les animaux à l'issue de chaque procédure est la mise à mort. Les animaux survivants ne peuvent resservir à d'autres expérimentations en raison du développement de défenses immunitaires au cours de l'établissement des pathologies infectieuses.

Remplacement

L’apparition de résistance aux traitements antibiotiques de référence rend urgente la découverte de nouvelles solutions thérapeutiques innovantes. Des tests in vitro et cellulaires sont mis en oeuvre dans un un premier temps afin de collecter des information cruciales sur l'inocuité, l'efficacité et le mécanisme d'action des nouvelles molécules en développement. Le recours à l’animal de laboratoire s’inscrit dans une seconde étape de recherche. En effet l’efficacité in vivo d’un composé sur une infection résulte non seulement de l’effet de ce dernier sur les micro-organismes mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur ces agents pathogènes. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Afin d’évaluer l’activité thérapeutique de nouvelles substances, des modèles pharmacologiques in vivo mimant les pathologies sont utilisés. De plus les mécanismes de réaction de l’hôte peuvent être mis en évidence en utilisant ces modèles sur animaux immunocompétents versus immunodéprimés. Une veille scientifique est mise en oeuvre pour étudier toute méthode scientifique alternative à l’expérimentation animale dans le domaine.

Réduction

Le nombre estimé est entre 200 et 400 animaux / an sur 5 ans. Le nombre d'étude varie en fonction de la demande client. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 100, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de souches bactériennes différentes à tester, nombre de molécules antibactériennes à tester, doses différentes de la molécule antibactérienne). Des études in vitro sont réalisées si possible en amont afin de ne pas avoir à tester des produits potentiellement dangereux ou non efficaces sur des animaux. Des analyses statistiques visant à déterminer le nombre d’animaux optimal pour produire des résultats robustes sont effectués. Des études pilotes sont conduites afin de s'assurer de la fiabilité du modèle.

Raffinement

Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées dans des cages à 22 ± 2 °C et 50 ± 10% d’hygrométrie, en portoirs ventilés ou isolateurs, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé chaque semaine. Les animaux ont une semaine d’acclimatation avant que les procédures ne débutent. Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un suivi attentif du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par la structure en charge du bien-être animal. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place. Les points limites utilisés sont: Le suivi du poids (le critère d'arret est une perte de plus de 20% post infection), L'accumulation de signes cliniques : posture courbée, pelage en piloérection, respiration laborieuse, prostration ou perte d’activité, perte de réponse à un stimulus. Pour le confort de l'animal la prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse au préalable de ceertains gestes (injection intraveineuse, injection intra-musculaire,...).

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus). Les modèles souris sont largement utilisés par les équipes de Recherche publique et privée dans le traitement des maladies infectieuses: Les souris se prêtent aux analyses immunologiques en raison d'un large panel d'outils d'analyses permettant de disséquer les mécanismes du développement de la physiopathologie Souris de 4 à 16 semaines selon le modèle expérimental

Chez les souris SOD1-G93A, porteuses d'une mutation qui déclenche une forme murine de la maladie de Charcot, la perte de poids atteint 20 % pendant plus de 24 heures, puis vient la paralysie, et c'est alors qu'elles sont mises à mort. 48 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Pendant 98 jours, elles reçoivent chaque jour, éveillées, une administration nasale de placebo ou de CBT101, une molécule que le porteur présente comme un apport de créatine aux neurones, et passent 14 prises de sang sous anesthésie, un Neuroscore deux fois par semaine, trois tests de motricité et trois tests de tonus musculaire. Le porteur justifie leur mise à mort en une phrase : "Les animaux sont mis à mort car ils sont porteurs d'une maladie génétique qui va conduire à leur mort".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de rechercher si la molécule étudiée est efficace dans un modèle animal de Sclérose Latérale Amyotrophique, ou maladie de Charcot. La Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative des neurones qui permettent aux muscles de fonctionner et qui malheureusement conduit, à terme, au décès du patient. A ce jour, malgré plusieurs médicaments disponibles sur le marché, aucun n’est réellement efficace pour, ne serait-ce que, ralentir la progression de la maladie. Un modèle de souris transgénique est disponible pour étudier la pathologie et tester de nouveaux médicaments. La molécule étudiée est administrée par la voie nasale et va cibler spécifiquement les neurones pour y délivrer une molécule endogène permettant de restaurant l’équilibre énergétique des neurones. L'administration par le nez permet une mise en contact direct avec les neurones (dans un premier temps ceux liés à l'odorat et à la sensibilité de la face puis par diffusion de proches en proches aux autres neurones du cerveau). Cette distribution a déjà été démontré chez la souris et le primate non-humain. De plus, son efficacité a été objectivée dans d’autres modèles précliniques de maladies neurologiques comme une maladie rare appelée le Déficit en Transporteur de la Créatine et la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est donc de tester l’efficacité de cette nouvelle molécule donnée par la voie nasale pendant plusieurs semaines chez des souris transgéniques. L'efficacité sera mesurée par des tests de neuropharmacologie ainsi que par la mesure de biomarqueurs principalement dans le sang. Les atteintes neuronales des souris seront aussi étudiées. Cette étude permettra d'orienter les futures études de ce nouveau médicament chez les patients.

Bénéfices attendus

L’étude fait partie d’un projet plus large visant à développer une nouvelle molécule dans des maladies neurologiques. Cette molécule aide à réguler l'énergie des cellules en fournissant de la créatine aux neurones. Elle pourrait avoir de grands bénéfices pour les patients atteints de maladies neurologiques, notamment dégénératives, comme la maladie de Charcot ou SLA. A l’issue de la présente étude pré-clinique courant 2025, et en fonction des résultats, notamment de l'efficacité du produit à l’étude, une étude clinique pourrait être envisagée chez des patients atteints de SLA.

Procédures

Les interventions suivantes seront réalisées sur toutes les souris: - L’administration se fera par voie nasale quotidienne du médicament ou du placebo à toutes les souris de l’étude dans la cavité nasale. Ce geste sera réalisé sur animal vigile tous les jours pendant toute la durée de l’étude (soit 98 jours) et durera 1 minute. - La pesée quotidienne, réalisée sur animaux vigile, durera 2 minutes. - Le test neuromoteur Neuroscore sera réalisé 2 fois par semaine sur souris vigile et durera 4 minutes. - Le test motricité sera réalisé 3 fois au cours de l’étude sur animal vigile et durera 5 minutes. - Le test de tonus musculaire sera réalisé 3 fois au cours de l’étude sur animal vigile et durera 5 min. - Prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude (soit 14 fois), sous anesthésie générale et durera une minute.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées sont des souris qui par nature ont un fond génétique qui va les conduire à développer une Sclérose Latérale Amyotrophique murine (Maladie de Charcot chez l’homme). Ainsi, elles verront l’apparition de symptômes neuromusculaires conduisant à la baisse de leur poids qui atteindra 20% de leur poids initial pendant plus de 24 h puis à une paralysie. L’euthanasie de l'animal sera alors réalisée. Un prélèvement sanguin sera réalisé 1 fois par semaine, en sous-mandibulaire, ce qui pourraient engendrer des nuisances, telles que des hématomes et une légère douleur au point de piqure. L'anesthésie, la contention, les tests comportementaux peuvent provoquer un stress léger.

Devenir

Les animaux sont mis à mort car ils sont porteurs d’une maladie génétique qui va conduire à leur mort.

Remplacement

La maladie de Charcot ou Sclérose Latérale Amyotrophique est une maladie neurodégénérative extrêmement complexe des motoneurones (les neurones qui partent du cerveau pour régir les activités périphériques, comme la respiration, la déglutition ou la préhension). Les études in vitro ne sont pas représentatives de la complexité de la maladie. C’est d’ailleurs le cas des maladies neurodégénératives pour lesquelles seuls des modèles animaux sont capable d’apporter des informations utiles pour ensuite pouvoir se projeter chez le patient. Parmi les modèle animaux, les modèles de souris génétiquement modifiées sont les plus représentatives de la maladie. Il existe aussi des modèles de poisson zèbre, mais ils sont plus largement utilisés pour étudier la physiopathologie de la maladie. Ce modèle de poisson est moins représentatif pour étudier l’effet d’un médicament qui, comme le nôtre, agit sur la mitochondrie et l’énergie apportée dans les neurones. De plus l’administration nasale de la molécule étudiées est limitante pour utiliser ce modèle. Le choix des souris transgéniques est donc le plus rationnel et le plus efficace pour atteindre l’objectif de tester la molécule administrée par la voie nasale dans un modèle de la Sclérose latérale Amyotrophique.

Réduction

L’étude s’appuie sur la bibliographie déjà existante sur les effets de la créatine dans des modèles de cette maladie et de la distribution efficace de la molécule vers les neurones pour ne concevoir qu’une seule étude, là où il est souvent nécessaire d’en réaliser plusieurs ou alors de plus grande ampleur (avec plusieurs doses par exemple). Ainsi le nombre de bras a été réduit, puisque 1 seule dose sera testée. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum (16 par groupes avec 8 males et 8 femelles par groupe), considérant que les 2 sexes seront étudiés dans cette étude et que les tests neuromoteurs demandent statistiquement plus d’animaux que d’autres type de mesures (comme des études de pharmacocinétique, par exemple).

Raffinement

Les souris seront logées en groupes de quatre dans des cages respectant les normes réglementaires, avec un accès libre à l'eau et à la nourriture. Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être animal, les souris seront manipulées quotidiennement par les mêmes expérimentateurs. Ces mêmes expérimentateurs feront les administrations de la molécule et les tests comportementaux tout au long du projet. Les expérimentateurs s’assureront quotidiennement du bien-être animal au moment de l’administration de la molécule par une surveillance et une pesée. Des points limites seront mis en place. Les mises à mort seront effectuées sous anesthésie profonde. Enfin, pour limiter le stress des animaux lors des tests comportementaux, des phases d’acclimatations dans les différentes enceintes font partie intégrante du protocole.

Choix des espèces

Les souris transgéniques utilisées sont le modèle de référence de la maladie de Charcot ou Sclérose Latérale Amyotrophique. Les souris devront commencer le traitement avant l’arrivée des premiers symptômes autour de 12-14 semaines. Elles arriveront au laboratoire à 6 semaines, après 2 semaines d'acclimatation et d'entrainement elles recevront le traitement à 8 semaines. Il existe un modèle de poisson Zebra Fish (oui poisson zèbre) de la maladie, mais la voie d’administration (voie nasale), la fréquence (quotidienne) et la durée du traitement (plusieurs semaines voire mois) avec la molécule étudiée ne permettent d’utiliser ce modèle. De plus, la recherche de biomarqueurs sanguins et cérébraux ne serait pas possible, limitant une transposition ultérieure chez le patient.

Les souris dont la perte de poids atteint 20 % pourront recevoir une médication, et la mortalité figure parmi les effets attendus du protocole. 865 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Elles sont immunodéprimées par une injection dans l'abdomen, infectées quatre jours par une bactérie résistante aux antibiotiques placée dans leur eau de boisson, traitées par antibiotique, puis saignées par ponction dans le cœur sous anesthésie le jour de leur mise à mort. Le porteur annonce des diarrhées et du sang dans les selles, et met en avant des bénéfices sanitaires, économiques et environnementaux d'une technologie qui reste à ce stade un concept.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques est une menace sanitaire croissante considérée par les organismes internationaux comme l’une des principales priorités de santé mondiale. En 2019, elle a été attribuée à 1,27 million de décès dans le monde. Nous introduisons un nouveau concept pour lutter contre la résistance aux antibiotiques : la technologie des inducteurs de peptides antimicrobiens. Basée sur des molécules qui stimulent le système immunitaite, la technologie visera à booster sélectivement l’expression des gènes de défense de l’organisme produisant les peptides antimicrobiens (AMP). Cette technologie permettra d'introduire une nouvelle approche pour lutter efficacement contre la résistance aux antibiotiques et les maladies infectieuses : ainsi, plutôt que de cibler directement un pathogène avec des antimicrobiens exogènes avec le risque de développement de résistance, notre technologie favorisera une réponse naturelle du corps humain à travers ses propres défenses. Cela aura l'avantage de réduire la pression de sélection sur les bactéries et le risque de favoriser la résistance.

Bénéfices attendus

Les effets positifs de la technologie des inducteurs d’AMP pourraient être considérables pour notre économie, notre environnement et notre société, en ce qui concerne plusieurs aspects : Améliorer la santé publique, en aidant à contrôler la propagation de la résistance aux antibiotiques, ce qui pourrait réduire le nombre de maladies liées aux infections. Réduire la charge de morbidité due aux infections par des agents pathogènes résistants aux antibiotiques. Réduire les coûts de santé associés aux infections résistantes aux antibiotiques. Réduire la quantité d'antibiotiques utilisés, ce qui pourrait réduire la pollution, les impacts négatifs sur l'environnement,et aider à maintenir des écosystèmes sains

Procédures

Les animaux seront traités aux antibiotiques par voie intrapéritonéale (1 fois par jour (1 min par souris) pendant 4 jours) ou dans l'eau de boisson pendant 4 jours. L'infection sera réalisée par inoculation de la bactérie dans l'eau de boisson (pendant 4 jours). Immunossupression par administration intrapéritonéale ( 1 injection, 1 minute). Prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie 1 fois ( 5 minutes le jour de la mise à mort)

Impact sur les animaux

Perte de poids, présence de diarrhée et de sang dans les féces, mortalité

Devenir

Mise à mort de tous animaux afin de prélever les organes post mortem pour analyses

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires et d'organoïdes humains, ceci afin de tester leur inocuité et leur mécanisme d'action. Le principe de remplacement n'est cependant pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduisent pas l'ecosystème complexe au cours de l'infection et par conséquent ne permettent pas l'obtention de tous les résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux. De plus, les molécules à tester auront d'abord été validées in vitro afin de ne tester que des molécules ayant un potentiel thérapeutique et les durées et fréquences d'administrations auront également été optimisées grâce à cela, permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les rongeurs utilisés sont consanguins et de même âge réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. De plus un maximum de prélèvements et de résultats seront réalisés sur chaque animaux afin de réduire le nombre d'expérimentations et donc d'animaux nécessaires.

Raffinement

Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des igloos et des carrés de coton purs ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé tout les jours en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechnicien afin de contrôler le poids, la présence de diarrhée, la température des animaux. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur: • altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de s’alimenter…), • vocalisation, tremblements …, • une perte de poids élevé (mais

Choix des espèces

La souris est une espèce pertinente dans notre modèle: infection gastrointestinale suivi de sepsis. Les souris utilisées sont adultes, elles ont entre 8 et 12 semaines et ce, conformément aux modèles établis dans la littérature.

60 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune subissant deux chirurgies de la moelle épinière, la pose d'électrodes dans le cerveau, neuf jours d'hébergement individuel, puis deux sessions de deux heures d'enregistrement, reliée à un câble. Le porteur décrit un risque d'infection, d'hémorragie, d'hypothermie et de défaillance cardiorespiratoire, et reconnaît que l'isolement stresse un animal grégaire. Toutes sont tuées pour prélever le cerveau et la moelle épinière, l'implant n'étant pas amovible. Les retombées annoncées pour les personnes atteintes de sclérose en plaques, limiter la progression du handicap, sont placées à plus long terme et présentées comme une possibilité.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire, dégénérative du système nerveux central (cerveau et moelle épinière) et la première cause d’handicap neurologique non traumatique chez les jeunes adultes. Dans cette maladie, on observe des phases de démyélinisation (il s’agit d’une perte de la myéline, substance permettant de favoriser les influx nerveux et la protection des neurones) dans lesquelles l’organisation des neurones est altérée, conduisant à des déficits fonctionnels chez les patients. Un mécanisme de réparation existe, mais il est incomplet et très variable selon les patients. Les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle épinière (microglie) sont activées précocement lors de la démyélinisation et participent à la réparation de la gaine de myéline. La microglie contacte par ailleurs les neurones et cette interaction peut influencer positivement la réparation post-démyélinisation. Nous avons mis en place une technique permettant de moduler l’activité neuronale lors de la phase de rémission dans un modèle murin de sclérose en plaques pour étudier l’impact de cette modulation sur les interactions entre les cellules immunitaires du cerveau et les neurones, afin de favoriser la réparation tissulaire et la récupération fonctionnelle. Le présent projet vise à mesurer par enregistrements électroencéphalographiques (EEG) les modulations d’activité nerveuse au niveau d’une zone d’intérêt du cerveau.

Bénéfices attendus

La sclérose en plaques touche plus de 100 000 personnes en France et se déclenche majoritairement chez le jeune adulte. La réparation de la myéline (remyélinisation) est essentielle dans cette pathologie, mais reste partielle, d’où une perte neuronale à long terme et des déficits irréversibles chez les patients. L’activité neuronale a été montrée comme favorisant la remyélinisation. Ce projet permettra de mieux comprendre comment nous modulons l’activité neuronale à l’aide de notre technique, et donc de mieux comprendre l’impact biologique obtenu avec cette méthode sur les interactions neurones-cellules immunitaires dans un modèle murin de sclérose en plaques. A plus long terme, la mise en évidence d’effets bénéfiques de l'activité neuronale sur la réparation via une modulation directe du dialogue neurones-cellules immunitaires pourrait permettre d'envisager des stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du handicap chez les patients.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée. La première permettra de réaliser une injection au niveau de la moelle épinière (durée 15 minutes). La deuxième permettra de réaliser une deuxième injection dans la moelle épinière pour la mise en place du modèle et la pose d’électrodes au niveau du cerveau (durée maximale 1h30) pour réaliser ensuite les enregistrements de l’activité du cerveau. Les animaux seront ensuite hébergés seuls pendant 9 jours. Tous les animaux recevront une injection intrapéritonéale (moins d’une minute) pour moduler ou non l’activité neuronale. L’activité électrique du cerveau de tous les animaux vigiles sera ensuite mesurée sur 2 sessions de 2 heures au cours de la même journée (1 session avant injection intrapéritonéale, et une après), pour cela ils seront connectés à un système d’enregistrement et pourront se déplacer librement pendant les mesures. Tous les animaux sont euthanasiés en fin d’étude par une méthode réglementaire pour réaliser différents prélèvements tissulaires.

Impact sur les animaux

Les chirurgies engendreront un inconfort temporaire lors du réveil après anesthésie (environ 30 min d’inconfort au réveil) et des douleurs post-opératoires. Il existe un risque rare de complications liées à la chirurgie : infections, hémorragie. L’anesthésie générale sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de défaillance cardiorespiratoire. Bien que la taille de l’implant soit réduite au maximum, son encombrement pourra provoquer une gêne chez l’animal. Les animaux sont hébergés seuls après la pose de l’implant EEG (pour une durée de 9 jours), s’agissant d’animaux grégaires cela pourra générer un stress. L’enregistrement de l’activité électrique du cerveau peut induire un stress car l’animal sera placé dans un nouvel environnement et relié à un câble au niveau des électrodes. La procédure d’injection par voie intrapéritonéale pour la mise en place du modèle peut générer un stress et une douleur localisée liée à la contention et l’injection. Le traitement peut occasionner un trouble locomoteur et une gêne dans les 3 heures maximum suivant l’injection.

Devenir

Des prélèvements tissulaires (cerveau et moelle épinière) sont réalisés post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Dans un objectif de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles in vitro et ex vivo qui nous permettent d’obtenir des données indispensables pour la poursuite de nos recherches. L’utilisation d’un modèle animal reste cependant nécessaire pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car il permet d'étudier la démyélinisation et la remyélinisation (destruction et réparation de la gaine de myéline) dans un organisme vivant entier, impliquant des interactions entre tissus nerveux, système immunitaire et circulation sanguine, qui sont des composantes importantes de cette pathologie

Réduction

Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés après l’utilisation des premiers lots d’animaux afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux nécessaires : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul statistique après utilisation initiale de 5 à 6 animaux par condition. Au maximum nous utiliserons 60 animaux pour ce projet. Des tests statistiques seront utilisés pour l’analyse des résultats obtenus, adaptées à chaque expérience et réalisées en partenariat avec des biostatisticiens.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe (sauf après la deuxième chirurgie). L’eau et la nourriture sont fournies à volonté. Les animaux sont observés quotidiennement. Un environnement enrichi est fourni aux animaux, comprenant nidification (carré de coton, kraft) et bâton à ronger. Les animaux sont manipulés uniquement par un personnel qualifié et sensibilisé au bien-être animal. Nous mettons en place des points-limites, ainsi qu’un suivi par l’équipe de recherche pour éviter la souffrance de l’animal. Les animaux soumis aux procédures chirurgicales sont placés sous anesthésie générale (durée maximale de 1h30), avec une prise en charge analgésique adaptée. Nous nous assurerons du maintien de la température des animaux durant toute la durée de l’anesthésie. Un gel de protection oculaire sera appliqué sur leurs yeux. En post-chirurgie immédiate, ils auront un accès facilité à la nourriture et à l’eau pour faciliter leur récupération. Nous mettrons ensuite en place une surveillance renforcée pendant 5 jours post-chirurgie. Après la chirurgie de mise en place des électrodes au niveau du cerveau, les animaux sont hébergés individuellement pendant 9 jours (les contacts visuels, olfactifs et auditifs avec les congénères étant maintenus). Pour limiter le stress lié à cet hébergement, ils seront placés dans un environnement à l’enrichissement augmenté. Avant les enregistrements de l’activité électrique du cerveau les souris bénéficieront d’un temps d’acclimatation dans la pièce pour réduire leur stress. Les animaux seront sédatés avant l’euthanasie médicamenteuse.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proches de l'Homme. L’âge adulte est requis pour pouvoir faire les actes chirurgicaux et les mesures d’activité neuronale envisagées dans ce projet.

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à la fin pour prélèvement d'organes. Elles reçoivent quatre injections sous anesthésie, deux sur les flancs et deux par voie intraveineuse, qui déclenchent une inflammation du cerveau et une paralysie progressive partant de la queue et des pattes arrière. Des nodules et des lésions cutanées peuvent apparaître aux points d'injection. Le porteur prévoit six répétitions de l'expérience parce que, lors d'une étude antérieure, seules 60 % des souris avaient développé la maladie, ce qui porte à 240 le nombre d'animaux pour tester deux récepteurs.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie du jeune adulte, (la SEP est souvent diagnostiquée entre 25 et 35 ans). La SEP touche aujourd'hui 120 000 personnes en France, dont 700 enfants. Trois mille nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année. La sclérose en plaques est une maladie du système nerveux central, résultant d’une attaque incontrôlée du système immunitaire contre la gaine de myéline qui entoure les fibres nerveuses. Cette gaine, essentielle à la transmission des signaux nerveux est détruite, provoquant l'apparition de symptômes tels que des troubles moteurs, des perturbations visuelles, une faiblesse musculaire ou des engourdissements. Les traitements disponibles permettent de réduire la fréquence des poussées, mais restent incapables de ralentir l'évolution de la maladie. Les causes exactes de cette pathologie demeurent mal comprises, et ses mécanismes restent encore largement à élucider. Toutefois, un processus inflammatoire joue un rôle central, caractérisé par l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires qui contribuent activement à la démyélinisation. Notre projet se concentre sur l’étude de deux récepteurs impliqués dans le processus inflammatoire de la maladie. Nous prévoyons de développer un modèle de sclérose en plaques chez des souris dépourvues de l’un de ces deux récepteurs. L’objectif est d’évaluer un éventuel effet bénéfique de leur blocage dans le traitement de la sclérose en plaque, en ouvrant la voie à des approches thérapeutiques innovantes ciblant ces mécanismes inflammatoires.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d'évaluer le rôle de deux récepteurs en tant que cibles thérapeutiques potentielles pour moduler l’inflammation liée à l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires dans la sclérose en plaque. Ce projet pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter cette maladie.

Procédures

Les animaux subiront 4 injections au total : 1administration sur chacun des flancs de l’animal et 2 injections intraveineuses. Toutes les injections ne dépassent pas une minute par animal et sont effectuées sous anesthésie générale gazeuse.

Impact sur les animaux

L’induction de la sclérose en plaque provoque une inflammation cérébrale caractéristique des maladies inflammatoires démyélinisantes du système nerveux central. Les nuisances attendues incluent une paralysie progressive, débutant par la queue et les pattes arrière, entrainant une diminution des déplacements. Les animaux peuvent développer des nodules visibles au niveau des sites de l’injection sur les flancs. Ces zones peuvent également présenter des lésions cutanées, conséquence possible des injections. L’injection intra-veineuse peut entrainer un léger saignement et éventuellement un hématome. L'anesthésie générale gazeuse peut entrainer une hypothermie ainsi qu’un arrêt cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale. Différents organes seront prélevés après l’euthanasie pour des études biologiques et histologiques complémentaires.

Remplacement

Les études in vitro ne permettent ni d’observer les signes cliniques de la sclérose en plaque, ni de reproduire les mécanismes immunitaires et neurologiques impliqués dans cette pathologie. Par ailleurs, les cultures cellulaires, en raison de leur connectivité limitée, ne peuvent restituer toutes les propriétés complexes du système nerveux central. Il est aussi impossible à l’heure actuelle de suivre les conséquences physiques de la sclérose en plaques sur des modèles in vitro.

Réduction

Nous utiliserons dans ce projet le nombre minimum d’animaux permettant de garantir utilisés tout en garantissant des résultats scientifiquement et des données statistiquement fiables. Le nombre d’animaux nécessaire a été estimé sur la base de nos précédentes expériences. Ainsi, un effectif de 10 animaux par groupe expérimental est requis pour atteindre les objectifs scientifiques définis dans ce projet. En raison de la variabilité importante dans le développement de la pathologie (avec des niveaux d’inflammation différents au sein d’un même lot), les expériences devront etre conduites 6 fois. Lors d’une étude antérieure portant sur la sclérose en plaque, seuls 60 pourcents des animaux ont développé la maladie, ce qui nous a conduits à planifier six répétitions. Cependant, si un nombre de répétitions inférieur permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, nous n’effectuerons pas l’ensemble des six répétitions prévues. Au total 240 souris seront utilisées dans cette étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées avec enrichissement. Le nombre de souris par cage est limité à 5 individus adultes. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-etre. La gravité des symptômes observés sera évaluée à l’aide d’une grille d’évaluation clinique adaptée. Dans le cadre de ce projet, une surveillance quotidienne stricte est mise en place afin de garantir le bien-etre des animaux. Les animaux bénéficieront d'une anesthésie générale gazeuse pour les injections intraveineuses et sous-cutanées. En cas de mobilité réduite des animaux suite au développement de la maladie induite, nous mettons à disposition un gel hydratant et nutritif dans les cages pour aider à l’alimentation.

Choix des espèces

Les études in vitro ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie. Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour la sclérose en plaque. De plus, il existe des souris génétiquement modifiées pour les récepteurs étudiés dans ce projet, qui sont impliqués dans le processus inflammatoire de la maladie. Nous utiliserons des souris âgées entre 2 et 4 mois. Cet âge correspond à une phase où le système immunitaire et vasculaire des souris est pleinement mature, ce qui les rend aptes à développer la pathologie.