Procédures sévères
Caractérisation de nouveaux agonistes des glucocorticoïdes
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
Rendues malades d'une inflammation de l'intestin par un produit ajouté à leur eau de boisson pendant six jours, une partie des 550 souris du projet développe des saignements, une douleur intestinale, une déshydratation et une perte de poids. Les autres reçoivent des glucocorticoïdes par injection dans l'abdomen ou par gavage quotidien pendant un mois, et certaines subissent une incision de la veine de la queue au scalpel pour mesurer leur glycémie. Le niveau de souffrance déclaré est modéré pour 480 d'entre elles et sévère pour 70, et toutes sont tuées à l'issue pour des analyses moléculaires et histologiques. Le porteur écrit que l'injection de glucocorticoïdes "n'est en général pas problématique pour l'animal", dans le même texte où il décrit la colite provoquée et le risque de fausse route au gavage.
Objectifs
Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. A ce jour, il n'existe pas de molécule dont les effets anti-inflammatoires sont dissociés des effets secondaires. Ce projet vise donc à caractériser de nouveaux composés.
Bénéfices attendus
Ces études permettront d'identifier le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules et ainsi promouvoir des avancées dans le traitement des maladies inflammatoires.
Procédures
Les animaux du groupe 1 qui nous permettront de comprendre les effets des molécules sur le système inflammatoire et l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü. Les glucocorticoïdes seront injectés une seule fois par jour pendant 3 jours par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 nous permettra de comprendre les effets d'un traitement prolongé aux glucocorticoïdes. Les souris de ce groupe seront traitées aux glucocorticoïdes par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant au maximum 1 mois. Les animaux du groupe 3 vont développer une inflammation de l'intestin par administration de Dextran Sulfate Sodium (DSS) dans l'eau de boisson pendant 6 jours. Ils subiront 3 injections par voie intrapéritonéale de glucocorticoïdes (1 min/ souris) afin de réduire l'inflammation.
Impact sur les animaux
L’inflammation chronique peut conduire à des saignements du fait de l'inflammation associés à une douleur intestinale, une déshydratation et une perte de poids de l’animal. Ce traitement durera 6 jours. Les premiers effets sont observables en général au 3è jour. L’injection de glucocorticoïdes par voie intrapéritonéale prend moins d'une minute par animal. Ces injections répétées (3 par souris) peuvent exceptionnellement causer des infections au niveau du site d'injection. Le gavage peut rarement conduire à des fausses routes et à une irritation. Les différentes administrations de traitement pourront éventuellement générer un stress chez l'animal ainsi qu'une douleur au niveau du site d'administration. Dans le cadre de la mesure des niveaux de glucose, un prélèvement de sang par incision au niveau de la veine caudal à l’aide d’un scalpel sera effectué pouvant engendré une douleur au niveau de la zone d'incision.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques sur le système immunitaire et l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.
Raffinement
Le personnel qui effectuera les gestes techniques est formé et compétent. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection des glucocorticoïdes en vérifiant la présence d'un éventuel abcès. Cependant, l’injection de glucocorticoïdes n'est en général pas problématique pour l'animal. Le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue. La sévérité de la procédure impliquera une surveillance stricte des souris. Ainsi, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, l’abondance de diarrhées, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Cette évaluation sera faite en conditions normales d'hébergement avec enrichissement et en maintenant les liens sociaux entre les animaux.
Choix des espèces
Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Il en va de même pour les mécanismes d’inflammation. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Le projet s’intéresse au rôle des glucocorticoïdes dans l’organisme adulte. Les animaux seront donc traités entre 10 et 15 semaines d'âge.
Impact du fractionnement spatial de la dose d’irradiation sur la réponse vasculaire pulmonaire chez la souris C57BL/6J
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Irradiées au thorax sous anesthésie, puis gardées jusqu'à six mois avant d'être tuées pour prélever leurs poumons, 1 000 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 792 d'entre elles, léger pour 208. Le porteur indique que les doses employées provoquent une fibrose pulmonaire au-delà de trois mois et que les animaux peuvent finir en détresse respiratoire, voire mourir avant le terme. Parmi les bénéfices attendus, il place l'anticipation de l'arrivée de cette technique en clinique et l'acquisition de compétences par son institut. Il écrit aussi vouloir "saisir l'opportunité du positionnement de l'institut et de la France" sur la question.
Objectifs
La radiothérapie est l’une des pierres angulaires du traitement du cancer. Les avancées technologiques de ces dernières années ont permis une amélioration considérable de la balistique des traitements mais les complications liées aux tissus sains restent la principale limitation à cette technique. Il est donc essentiel de trouver de nouvelles modalités de traitement qui permettraient de mieux protéger les tissus sains tout en garantissant un bon contrôle tumoral. Les techniques de fractionnement spatiale de la dose (SFRT) comme les mini faisceaux de radiothérapie (MBRT) sont de nouvelles modalités innovantes et très prometteuses qui utilisent une méthode radicalement différente pour l’administration de la dose : le fractionnement spatial de la dose. De nombreuses études précliniques ont montrés que le fractionnement spatial de la dose active des mécanismes radiobiologiques spécifiques qui conduisent à une meilleure préservation des tissus sains tout en maintenant un contrôle tumoral équivalent voir supérieur. Ces études précliniques ainsi que le traitement récent des deux premiers patients mettent en évidence que la MBRT est une technique très prometteuse. Bien que le potentiel de la SFRT ait été mis en évidence, il est essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacent à cette technique et sa relation avec le fractionnement spatial de la dose. Afin de mieux comprendre comment la modulation de paramètres physiques et dosimétriques affectent la réponse biologique, il est nécessaire de conduire de nouvelles études précliniques. Ce projet se focalisera sur le compartiment vasculaire qui est très affecté par les rayonnements. En effet, d'un point de vue physiopathologique, le compartiment vasculaire, à l'interface entre le sang et les tissus, a été démontré comme jouant un rôle clé dans l'initiation la progression des lésions au tissu sain après radiothérapie. L'impact du fractionnement spatial de la dose sur le compartiment vasculaire au niveau du tissu sain est mal connu car très peu étudié et probablement que les paramètres physiques, comme le volume irradié, jouent un rôle déterminant dans les effets biologiques observés aigues et tardifs.
Bénéfices attendus
Les enjeux autour de ces nouvelles techniques de radiothérapie en particulier le fractionnement spatial de la dose ici (SFRT) sont nombreux : • Anticiper l'émergence susceptible d’être très rapide de ces techniques en clinique. • Questionner la justification de ce type de techniques en termes de radioprotection des patients, puisqu’elle repose sur un changement de paradigme important. • Saisir l’opportunité du positionnement de l’institut et de la France autour de cette question • Acquérir des connaissances et des compétences autour des concepts liés aux modifications du volume d'irradiation pour alimenter l’expertise concernant la radioprotection des patients.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés, irradiés localement sous anesthésie chimique (durée max de 20 min), maintenus 1 semaine, 1 mois, 3 mois ou 6 mois en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie, puis sédatés profondément afin d’être euthanasiés avant le prélèvement des poumons. Les seules manipulations réalisées sur animal vigile seront les pesées (2 fois par semaine les deux premiers mois puis une fois par semaine). Selon les groupes expérimentaux, certains animaux seront anesthésiés pour réaliser une imagerie scanner ou une échographie (durée maximale de 10 min, maximum 4 fois). Aucune autre manipulation ne sera réalisée.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables pourront être occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Le modèle d’irradiation du thorax entier à 18 Gy à a été bien caractérisé dans notre laboratoire lors de projets précédents et a montré que les doses délivrées sont fibrosantes au niveau pulmonaire au temps tardifs (plus de 3 mois après irradiation). Aux temps les plus tardifs de l’étude (, les animaux pourraient être en détresse respiratoire voire décéder. Les animaux devront donc être surveillés de près et euthanasiés en cas d’atteinte importante de leur bien-être. Compte-tenu de l’objectif qui est d’étudier la réponse vasculaire pulmonaire de ces nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire de fixer un temps d’étude long, ici de 6 mois, pour toutes les études envisagées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir collecter les tissus pour les analyses.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales dans leur environnement tissulaire, qui joue un rôle sur la réponse moléculaire des cellules. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude. Il est à noter que ce projet vise à contribuer à l’établissement d’un modèle de prédiction du risque de toxicité sur cellules in vitro. A terme, il pourra donc servir à remplacer l’expérimentation animale par un modèle in vitro pour évaluer la toxicité de l’irradiation.
Réduction
Les études sur les lésions pulmonaires causées par la radiothérapie dépendent beaucoup de la physiologie des animaux utilisés. Pour faire des tests statistiques sur les analyses histologiques, les microscans, les analyses moléculaires en cytométrie ou les analyses d'expression génique, il faut des groupes de 10 animaux. Pour les analyses génétiques, des groupes de 4 à 6 animaux suffisent, car ces tests utilisent des milliers de cellules par échantillon, augmentant la précision des résultats. Selon les données obtenues, différents tests statistiques peuvent être utilisés : un ou plusieurs tests, paramétriques ou non.
Raffinement
Tous les animaux du projet seront surveillés afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin Ils seront pesés 2 à 3 fois par semaine dans les 3 premières semaines après l’irradiation, puis 1 fois par semaine jusqu’aux temps 3 et 6 mois. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, prostration, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation de signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera l’euthanasie. Lors des irradiations, les souris seront anesthésiées sous anesthésie chimique. Afin d’assurer un meilleur réveil, elles seront placées en thermacage dès la fin de l’irradiation. Des poches d’eau gélifiées ainsi que des croquettes seront également placés dans les cages de transport. Les souris de cette souche pouvant montrer des signes d’agressivité, des enrichissements supplémentaires seront mis dans les cages (bâtonnet en bois, dôme en carton, coton, papier kraft si nécessaire).
Choix des espèces
La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. C’est un modèle très utilisé au sein du laboratoire dans des protocoles d’irradiation thoracique pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions pulmonaires radio-induites. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8 à 10 semaines, ce qui correspond au stade jeune adulte. On choisit des souris de même âge, et jeunes adultes, pour éviter l’éventuelle hétérogénéité de la réponse liée à l’âge. Il s’agit de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ce modèle d’irradiation localisée. Comme tenu du caractère agressif des souris mâles, ils seront hébergés par 3 à 4 avec un enrichissement augmenté par rapport aux standards de l’animalerie.
Ciblage de MYC et de ses voies de signalisation pour le traitement du corticosurrénalome chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Les souris dont la tumeur atteint un point limite sont mises à mort avant le terme du protocole, ce que le porteur nomme être "sorties de l'expérience". 672 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs surrénales. Chacune subit l'amputation d'une phalange pour le génotypage, des injections dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, des injections dans l'abdomen et un gavage quotidiens pendant deux semaines, et quatre échographies. Certaines lignées portent un carcinome jusqu'à dix-huit mois, quand le bénéfice annoncé se limite à proposer de nouvelles pistes de traitement.
Objectifs
Le carcinome corticosurrénalien est un cancer rare et agressif, caractérisé par un pronostic défavorable. À son diagnostic, près de 50 % des patients présentent des métastases, ce qui explique un faible taux de survie à 5 ans. Actuellement, l’unique option curative pour les patients non métastatiques repose sur une exérèse complète de la tumeur primaire. Cependant, le risque de récidive est élevé (30 à 70 %), constituant la principale cause de décès. Pour les patients métastatiques, la chirurgie est inenvisageable, et les traitements existants, bien que lourds, n’améliorent pas la survie globale médiane, qui demeure autour de 15 mois. Les essais d’immunothérapie dans le carcinome corticosurrénalien ont donné des résultats décevants. Il est donc essentiel de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nous avons récemment montré dans un modèle murin de carcinome corticosurrénalien, que la testostérone produite au moment de la puberté induit un recrutement de macrophages chez les souris mâles, ce qui conduit à une régression de la tumeur. De façon similaire, le traitement des souris femelles portant des carcinomes corticosurrénaliens avec de la testostérone conduit aussi à un recrutement de macrophages et à une diminution de la taille de la tumeur. Ces résultats suggèrent que la testostérone possède un fort potentiel en tant qu’agent antitumoral dans le contexte du carcinome corticosurrénalien. Cependant, les effets secondaires de la testostérone rendent son utilisation difficile chez les patients. C’est pourquoi nous avons cherché à identifier des cibles spécifiques de la réponse aux androgènes qui pourraient être exploitées pour traiter le cancer. Nos recherches ont montré que la testostérone agit en inhibant un gène d'intérêt, ce qui arrête la croissance des cellules tumorales, endommage leurs chromosomes et déclenche leur mort. Dans ce projet, nous proposons deux axes d’étude : - Évaluer l’impact de la suppression du gène d’intérêt dans les surrénales de nos modèles murins de carcinome corticosurrénalien afin de confirmer son rôle en tant que cible thérapeutique. - Tester des molécules capables d’inhiber MYC et ses voies de signalisation en aval. L’objectif global de ces expériences est de développer une nouvelle approche thérapeutique visant à améliorer le traitement et la survie des patients atteints de carcinome corticosurrénalien.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet nous permettra de démontrer le rôle de la protéine d'intérêt dans la progression tumoral du carcinome corticosurrénalien dans différents modèles murins, cliniquement pertinents. D’une part en délétant complétement la protéine d'intérêt dans la surrénale dans 2 modèles murins puis en utilisant des molécules capables d’inhiber la protéine d'intérêt et ses voies de signalisation en aval. Ceci devrait permettre de proposer de nouvelles pistes de traitement et d’améliorer le pronostic du carcinome corticosurrénalien qui reste aujourd’hui défavorable.
Procédures
Les souris seront soumises aux interventions suivantes : Phalangectomie : durée 2min, 1 fois, sur toutes les souris. Injection intra-veineuse dans le sinus rétro-orbitaire d'une molécule d'intérêt thérapeutique sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane, durée 5 min, 2x - Injection intra-péritonéale d'une molécule d'intérêt thérapeutique, durée 2 min, tous les jours pendant 2 semaines - Administration par gavage d'une molécule d'intérêt thérapeutique, durée 2 min, tous les jours pendant 2 semaines. - Anesthésie gazeuse à l'isoflurane au moment de l'imagerie par échographie, durée 5 min, 4 fois.
Impact sur les animaux
La phalangectomie nécessaire à l’identification et au génotypage des individus peut induire une douleur légère et de courte durée mais n’entraine aucune complication chez l’individu au cours de son développement et aucune altération du comportement entre les individus de la portée et leur mère. L’injection par voie retro-orbitaire, réalisée sous anesthésie à l’isoflurane, peut engendrer une douleur locale légère et de courte durée. Les injections intra-péritonéales et le gavage peut engendrer également une douleur locale, légère, de courte durée. L’échographie, réalisée sous anesthésie à l’isoflurane, n’engendre pas de douleur mais peut induire un stress léger. Les différents modèles murins de CCS utilisés présente un développement tumoral et éventuellement des métastases. Afin d’éviter les nuisances associées au développement tumoral, tous les animaux seront étroitement surveillés par du personnel qualifié et sortis de l’expérience lorsqu’un point limite sera atteint.
Devenir
Tous les animaux ayant subi la procédure seront euthanasiés à la fin de l’expérience, puis des tissus seront prélevés pour la réalisation de différentes analyses permettant d’évaluer le rôle de MYC et de ses voies de signalisation en aval dans le développement du CCS et ainsi pouvoir potentiellement identifier une nouvelle cible de thérapie ciblée pour le traitement des corticosurrénalomes.
Remplacement
Afin d’éviter la douleur et l’inconfort à l’animal, nous souhaitons remplacer autant que possible les manipulations in vivo par des expériences de culture in vitro sur des lignées de cellules existantes ou provenant des animaux sacrifiés sans manipulation préalable. Cette technique est un bon modèle alternatif pour tester dans un premier temps les molécules inhibant MYC ou ses voies de signalisations en aval. Cependant, le développement et la progression du cancer vers des stades avancés ainsi que les réponses aux traitements sont fortement dépendants de l’environnement cellulaire (vascularisation, facteurs de croissance, système immunitaire périphérique…), et ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ainsi, la nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie in fine par le fait que le développement tumoral est un processus complexe impliquant de nombreux types cellulaires dont les interactions sont cruciales pour favoriser la progression de la tumeur. Pour ces raisons, des méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants n’apportent pas le même niveau d’information.
Réduction
Dans l’optique de réduire de nombre d’individus par expérience, nous planifions systématiquement plusieurs analyses simultanées, de sorte que les deux glandes surrénales de chaque individu soient utilisées. De même, le sang des animaux sacrifiés sera systématiquement recueilli afin de réaliser les analyses hormonales. Les croisements pour générer les souris d'intérêt seront optimisés afin d’utiliser 100% des individus. Le nombre d’animaux par groupe correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés, sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques intrinsèques aux individus, nous constituerons des groupes expérimentaux de 12 souris. Pour les analyses statistiques nous utiliserons des tests non paramétriques.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Durant la procédure, nous veillerons au bien-être des animaux par l’ajout de plaques de papier à ronger et de maisons en carton ou polycarbonate, de tunnels en plastique ou de billes en inox. Le choix de l’enrichissement sera réalisé en fonction de l’état général de l’animal, par exemple en cas de développement d’une tumeur importante l’ajout de plaques de papier à ronger ou de bâtons en bois sera choisi à la place de tunnels qui pourraient blesser l’animal. De plus, du coton sera ajouté dans les cages pour faciliter le maintien de la température corporelle. Les animaux seront hébergés par groupes de 4 individus (sauf indication contraire) pour permettre le maintien d’un bien-être social. Les injections intra-veineuses (rétro-orbitaires) seront pratiquées sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane après application d’une pommade analgésique à la lidocaïne. Le suivi du volume tumoral par échographie sera réalisé sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis seront établis et les expériences seront arrêtées en conséquence.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de l’oncologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins tumoraux mimant les cancers humains, incluant les carcinomes corticosurrénaliens. La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris, ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Les lignées murines utilisées pour générer notre lignée déficiente pour la protéine d'intérêt ou bien pour utiliser les molécules inhibants celle-ci et ses voies de signalisation en aval sont des modèles précliniques murins de corticosurrénalome reposant sur l’invalidation de gènes suppresseurs de tumeurs mutés chez les patients. Nous réaliserons nos analyses aux 3 stades de développement tumoral identifiés dans le modèle de carcinome corticosurrénalien. Un stade d’hyperplasie à 6 semaines, un stade carcinome corticosurrénalien agressif à 16 mois et un stade de carcinome corticosurrénalien métastatique à 18 mois. Ensuite, nous réaliserons nos analyses aux 3 stades de développement tumoral identifiés dans le modèle de carcinome corticosurrénalien métastatique disponible dans l’équipe. Un stade d’hyperplasie à 2 mois, un stade carcinome corticosurrénalien agressif à 4 mois et un stade de carcinome corticosurrénalien métastatique à 6 mois. Puis nos analyses se focaliseront au stade hyperplasique des souris soit de 4 à 6 semaines et de la transition carcinome corticosurrénalien agressif vers métastatique soit de 16 à 18 mois. Pour les souris double mutantes, nos analyses se focaliseront au stade hyperplasique (4 mois).
Évaluation de la spécificité de radiopharmaceutiques pour le marquage du thrombus en imagerie TEP chez des souris mâles 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Opérées de la veine cave pendant une heure trente à une heure quarante-cinq pour provoquer un caillot, suivies par échographie, puis transportées cinq heures vers un second établissement, 216 souris mâles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur chiffre lui-même ce que traverse chaque animal : huit contentions, quatre injections, quatre anesthésies, une chirurgie et une séance d'imagerie. Il classe en intensité sévère aussi bien les vingt-quatre heures de douleur qui suivent l'opération que les cinq heures de transport. Toutes sont tuées à l'issue, sang et organes prélevés pour vérifier si trois radiopharmaceutiques marquent bien le caillot.
Objectifs
La maladie veineuse thromboembolique (MVTE) est la conséquence de la formation d'un caillot de sang (thrombus), obstruant partiellement ou totalement une veine. Les deux principales présentations cliniques de la MVTE sont l’embolie pulmonaire et la thrombose veineuse profonde ou phlébite. La fréquence et la gravité de la MVTE n'ont pas changé au cours des 20 dernières années, malgré les progrès majeurs au niveau thérapeutique. La MVTE est une pathologie grave et fréquente qui peut devenir chronique. Pour améliorer la prise en charge et le diagnostic, il est important de faire la différence entre un nouvel évènement de thrombose et une récidive qui se distinguent par une composition différente du thrombus. Cependant avec les modalités d’imagerie médicale actuellement disponibles, il est seulement possible de déterminer s’il y a un thrombus ou non sans aucune information sur sa composition. Notre projet propose de réaliser deux modèles de thrombose veineuse chez la souris mâle induit par la chirurgie qui permettront de tester de nouveaux radiopharmaceutiques pour l’analyse du thrombus veineux en utilisant la technologie de tomographie par émission de positons (TEP). Ce projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs (EU).
Bénéfices attendus
Le traitement de la maladie veineuse thromboembolique repose sur les anticoagulants qui présentent un risque hémorragique important et que les patients doivent le plus souvent prendre à vie. Dans le contexte de MVTE, l'imagerie moléculaire permet un ciblage direct et non invasif des différents constituants du thrombus veineux avec une sensibilité et une spécificité élevée, et un potentiel d'imagerie corps entier. Les modalités d’imagerie actuelles ne permettent pas de caractériser les composants du thrombus. Par conséquent, il est impossible de déterminer s’il s’agit d’un thrombus récent qui nécessitera un traitement anticoagulant ou d’un thrombus résiduel, voire d’une séquelle vasculaire pour laquelle un traitement n’est pas obligatoire. Cette distinction est cruciale pour mieux adapter les traitements et réduire le risque d’hémorragies associées aux traitements anticoagulants. L'objectif de ce projet est de développer de nouveaux radiopharmaceutiques pour le diagnostic de la MVTE à l’aide de la technologie en tomographie par émission de positons (TEP) ayant une sensibilité plus élevée et une meilleure résolution spatiale que la tomographie par émission monophotonique (TEMP). Nous avons choisi des dérivés de traceurs déjà évalués chez l'homme avec la technologie TEMP, et de les tester sur des modèles précliniques de thrombose. Une meilleure caractérisation du thrombus veineux par l’imagerie médicale permettant une meilleure adaptation des traitements et donc un bénéfice pour la prise en charge des patients.
Procédures
Interventions dans EU1 : Afin d’induire une thrombose veineuse, les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie (durée 1h30 à 1h45). Le suivi de la formation du thrombus sera assuré par une échographie sous anesthésie (durée 15 minutes). Interventions dans EU2 : Une seule injection du radiopharmaceutique se fera sur animal vigile (durée 5 min). La procédure d’imagerie TEP est réalisée sous anesthésie et lit chauffant (Durée 10 minutes). Le prélèvement sanguin terminal est fait sur souris endormies et analgésiées avant leur mise à mort.
Impact sur les animaux
Les actes que subissent les 216 animaux : 8 contentions, 4 injections, 1 chirurgie 4 anesthésies, 1 transport et une imagerie TEP. Les nuisances suivantes sont anticipées : - Le stress lié à la contention et à la douleur liée à l’injection de l’analgésique : La nuisance subie est légère et d’une durée de 1 minute maximum. - Le stress lié à l’entrée des animaux dans la boîte à induction de l’anesthésie gazeuse avant la chirurgie et l’échographie-doppler : durée 4 minutes maximum, d’intensité légère. - La douleur générée par la chirurgie : (1) Douleur, durcissement de la zone de chirurgie, sensation de chaleur au niveau de la veine cave inférieure, (2) Occlusion intestinale, (3) Douleur au niveau de la zone suturée. Durée 24 h en post-chirurgie d’intensité sévère. - Le stress et l’angoisse générés par le transport des animaux depuis l’EU1 jusqu’à l’EU2 : La nuisance subie est sévère et d’une durée de 5h maximum. - Le stress lié à la contention et à la douleur liée à l’injection du radiopharmaceutique : durée 5 minutes, intensité légère. - Le stress et l’angoisse générés l’imagerie TEP est léger et d’une durée de 10 minutes.
Devenir
A l'issue de la procédure, nous devrons prélèver du sang et des organes sur tous les animaux, pour cela ils seront tous mis à mort.
Remplacement
Concernant le remplacement, nous avons eu recours à des expériences in vitro (formation de caillot de sang ou de plasma) pour valider la spécificité des 3 radiopharmaceutiques que nous souhaitons tester. Toutefois ces études ont des limites. En effet la maladie veineuse thromboembolique est une maladie multifactorielle impliquant le système vasculaire, les cellules circulantes (plaquettes, globules rouges et globules blancs) et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions, rate). Les modèles in vitro ou ceux de modélisation informatique sont encore incomplets et ne permettent pas de prendre en compte la complexité de cette pathologie.
Réduction
Les animaux seront réceptionnés sur plusieurs commandes, nous ajusterons ces commandes en fonction de nos besoins. Nos précédents projets ont montré que des groupes de 10-12 animaux au minimum sont nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Pour information, le nombre d'animaux a été réduit au maximum pour assurer une robustesse statistique des résultats. Quand nous aurons inclus 8 animaux par groupe, nous ferons un point sur les données obtenues à l’aide de tests statistiques adaptés. L’utilisation de l’échographie doppler nous permettra d’identifier les animaux qui ont thrombosés et qui pourront être envoyés à notre collaborateur.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, nous avons mis en place des mesures de raffinement adaptées à notre modèle expérimental. Au cours de la chirurgie, nous préviendrons : - La survenue d’une infection (travail en condition aseptique) - La douleur (analgésie et anesthésie) - L’hypothermie (tapis chauffant) - La déshydratation (administration de sérum physiologique) - Le desséchement oculaire (gel ophtalmique). En post-opératoire, nous utiliserons de façon systématique un gel d’hydratation qui sera supplémenté en analgésique la nuit suivant la chirurgie. Le bien-être et la douleur seront évalués 4-6h après la chirurgie, à J1, à J2 et à J3 à l’aide d’une grille de score. Chaque animal ayant atteint les points limites sera pris en charge immédiatement par les responsables du projet. Au cours du transport, nous disposerons au fond de la cage , un gel nourrissant suplémenté en analgésique. Au cours de l’imagerie TEP, nous préviendrons : - L’hypothermie (tapis chauffant) - Le desséchement oculaire (gel ophtalmique).
Choix des espèces
Le modèle de thrombose veineuse chez la souris que nous souhaitons utiliser est un modèle de référence pour l’étude de la maladie veineuse thromboembolique. Il est très bien caractérisé dans la littérature, fiable, reproductible et reconnu par nos pairs. La maladie thromboembolique veineuse touche les adultes, tous les animaux que nous utiliserons serons âgés de 7 à 12 semaines.
Étude de la dissémination métastatique dans le cancer gastrique : niches, cinétiques et partenaires
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Gavées trois jours de suite pour être infectées par une bactérie qui transforme leur estomac, puis injectées dans l'abdomen, 900 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le porteur décrit une perte de poids, des lésions gastriques et une souffrance visible sous forme de prostration, d'isolement et de mauvais toilettage. Le projet cherche à établir à quel moment les cellules d'un cancer gastrique se dispersent vers d'autres organes et vers la moelle osseuse. Sur la conduite à tenir face à cette souffrance, le porteur renvoie à une grille de score et à des "mesures conservatoires bien déterminées" qu'il ne décrit pas, et justifie l'usage des deux sexes par le fait de "réduire la production de moitié".
Objectifs
Le cancer gastrique présente un taux de rechute élevé même en cas de prise en charge précoce de la maladie. Ces rechutes seraient en partie liées à la capacité des cellules tumorales à coloniser rapidement d’autres organes et potentiellement la moelle osseuse. De plus, des cellules cancéreuses s’associent avec des cellules immunitaires encore non identifiées favorisant ce phénomène de dispersion. Nos principaux objectifs sont : - De déterminer à quel moment et où les cellules cancéreuses de l'estomac se dispersent dans le corps. - D’identifier les partenaires cellulaires associés aux cellules cancéreuses pendant ce processus.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra : - De valider un nouveau modèle pré-clinique de développement du cancer gastrique, plus proche des patients, pour tester des méthodes de détection précoce et des traitements ciblant les interactions avec les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses. - De déterminer à quel moment les cellules cancéreuses se propagent dans la moelle osseuse, ce qui pourrait expliquer les rechutes. En étudiant ce processus, nous espérons développer de nouveaux traitements pour cibler ces cellules et diminuer les rechutes chez les patients. - D’identifier les cellules immunitaires associées aux cellules cancéreuses pour cibler leurs interactions dans les différents organes et ouvrir de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Gavage sur animal vigile : 900 souris, 1 fois par jour pendant 3 jours, durée moins d’une minute. Injection dans le ventre sur animal vigile : 900 animaux, 1 fois, durée moins de 30 secondes. Prélèvement sanguin sous anesthésie générale : 900 souris, 1 fois en fin d’expérimentation, durée moins d’une minute.
Impact sur les animaux
Irritation liée au gavage, perte de poids liée à l’infection à H. felis et/ou au traitement menant au développement de lésions gastriques et à la transformation de l’estomac. Souffrance observée (prostration, isolement, mauvais toilettage).
Devenir
Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.
Remplacement
Nous souhaitons découvrir comment le cancer de l'estomac se propage à d'autres organes et à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour mimer ce processus ce qui rend le modèle animal indispensable.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser les 2 sexes dans cette étude afin de réduire la production de moitié. Sur les échantillons prélevés nous prévoyons de réaliser des études statistiques ; pour cela, d’après les publications précédentes de l’équipe et d’après la littérature scientifique sur ces modèles de souris qui présentent une certaine hétérogénéité de réponse entre animaux, des groupes de 10 animaux par condition expérimentale sont requis. Selon les résultats de la première expérience des conditions expérimentales et/ou des points de cinétique pourront être supprimés avant de réitérer l’expérience 2 fois de façon indépendante pour la reproductibilité et les statistiques.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids, maisonnettes). Les souris seront suivies en suivant les critères de poids, le comportement, l’apparence, la présence d'une blessure, la mobilité. Ce suivi est réalisé à l’aide d’une grille permettant de définir des critères d’arrêt des souffrances et de proposer des mesures conservatoires bien déterminées. Une analgésie sera également appliquée en cas de souffrance animale. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur.
Choix des espèces
Le modèle d’infection à H. felis a été mis au point chez la souris. De plus, plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées sont disponibles pour ce projet qui nous permettront de répondre aux objectifs fixés. Au début du projet, les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines car c’est l'âge optimal pour permettre une infection à H. felis. Après ce stade l’infection ne se met pas en place ce qui est assez représentatif de ce qu'il se passe chez l'homme.
Analyse par imagerie du rôle de l’Angiopoiétine-like 4 (ANGPTL4) dans la fuite capillaire dans un modèle de choc septique (2/2)
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de toxines bactériennes qui provoque un choc septique, avec chute de la pression artérielle, insuffisance circulatoire puis troubles de la conscience allant jusqu'au coma, avant un scanner sous anesthésie précédé d'une injection de produit de contraste derrière l'œil. Le bénéfice avancé, de nouveaux traitements contre la fuite capillaire chez des patients dont la mortalité atteint 60 %, reste au stade de l'hypothèse, l'objectif immédiat étant de tester une protéine repérée chez 19 patients. Le porteur indique avoir mené des études in vitro préliminaires, les juge incapables de reproduire les voies physiologiques en jeu et conclut au recours à un modèle animal.
Objectifs
Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de cette protéine dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de cette protéine permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Notre projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (l'un pour les injections et l'autre pour les imageries).
Bénéfices attendus
Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.
Procédures
Les animaux recevront chacun une injection de toxines bactériennes (d’une durée de moins d’une minute) puis de notre protéine d'intérêt (dans le premier établissement utilisateur). Une injection d’anti-douleur sera réalisée systématiquement en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute). Les animaux recevront du produit de contraste par voie rétro-orbitale après anesthésie générale pour limiter l'inconfort. Les animaux subiront un scanner d'une durée totale de 5 minutes sous anesthésie générale (dans le second établissement utilisateur).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à l'injection de toxines bactériennes sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma).
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et notre protéine d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques. De plus, les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition, etc... connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats.
Raffinement
Les doses de toxines bactériennes utilisées dans notre projet peuvent engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques chez l'animal. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, un antalgique sera administré. Néanmoins, si malgré cette administration et l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal pendant l'expérimentation (scorée par une grille d'évaluation adaptée aux points limites spécifiques du projet), une mise à mort immédiate sera réalisée sous anesthésie profonde. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Les examens d'imagerie médicale sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste utilisé en clinique. Les animaux seront surveillés tout au long du protocole afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance (scorée par une grille d'évaluation adaptée aux points limites spécifiques du projet), des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les procédures seront arrêtées et les animaux mis à mort.
Choix des espèces
Les souris âgées de 10 semaines ont été choisies car le protocole précis d'induction du choc septique avec des toxines bactériennes est bien établi et décrit dans la littérature chez ce modèle animal. De plus, de précédentes études menées au laboratoire sur des souris de cet âge ont déjà démontré que le modèle était pertinent. Ces expériences permettront de définir si la protéine peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du choc septique chez l'Homme.
Effet de trois procédés alimentaires sur la qualité nutritionnelle des protéines de chia chez le porc en croissance
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une canule posée dans l'iléon et un cathéter dans la veine jugulaire, gardés vingt-trois jours, un isolement en loge individuelle sur toute cette durée et trois séjours de vingt-quatre heures en cage à métabolisme : dix porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objet est de mesurer la digestibilité des protéines de graines de chia sous trois formes, farine brute, farine extrudée et cookie, environ 400 g de contenu intestinal étant recueillis en continu pendant neuf heures après chaque repas test. Le porteur écrit que la digestibilité des protéines ne peut aujourd'hui être déterminée de façon fiable que par des expérimentations animales "longues, coûteuses et soulevant des questions éthiques", et présente ce projet comme un moyen de fiabiliser les méthodes de digestion in vitro. Aucun des dix animaux ne pourra être placé ni réutilisé, précisément à cause de ces canules maintenues vingt-trois jours.
Objectifs
Ce projet a pour but de mesurer in vivo chez le porc en croissance la qualité nutritionnelle des protéines de chia, encore relativement peu caractérisées dans la littérature, mais dont la consommation humaine tend à se développer en Europe et particulièrement en France, où la consommation était estimée entre 1500 et 2000 tonnes en 2020. La richesse en protéines de cette graine contribue largement à cet engouement. Cependant, certaines données in vitro suggérent que les protéines de chia sont faiblement digestibles lorsque les graines sont consommées à l’état « brut ». C’est pourquoi le projet vise également à évaluer la possibilité d’améliorer leur qualité nutritionnelle via des procédés de transformation d’application courante dans l’industrie alimentaire. Les protéines de chia seront ainsi étudiées sous trois formes différentes : farine brute, farine extrudée, produit formulé type « cookie ». Il s’agira donc de mesurer (1) la digestibilité iléale réelle des trois formes de protéines de chia, (2) les cinétiques d’apparition dans le compartiment sanguin des acides aminés, du glucose et de l’insuline, (3) ainsi que les pertes urinaires azotées correspondantes. Ces mesures permettront de déterminer un indicateur de la qualité nutritionelle des protéines de chia, de mesurer l’impact des procédés testés sur cette qualité nutritionelle, ainsi que sur les réponses glycémiques et insulinémiques et d’établir un bilan azoté complet chez le porc en croissance. De plus, par comparaison avec les valeurs de digestibilité mesurées in vitro à partir de plusieurs protocoles rapportés dans la littérature, les mesures in vivo obtenues ici contribueront, en complément d’autres jeux de données dont nous disposons par ailleurs, à sélectionner de manière objective le(s) protocole(s) de digestion in vitro le(s) plus pertinent(s).
Bénéfices attendus
La transition vers des pratiques alimentaires plus saines et plus durables, ainsi que la demande croissante en protéines (+30% de demande globale d’ici 2100) implique une augmentation de la part des protéines végétales dans l’alimentation humaine, à condition toutefois que ces protéines soient de bonne qualité nutritionnelle. Or, la digestibilité, une composante majeure de leur qualité nutritionnelle, est souvent faible pour les protéines végétales. Un enjeu majeur réside donc dans l’amélioration de la digestibilité de ces protéines. L’impact des procédés technologiques sur l’amélioration de la digestibilité des protéines est généralement admis, même si nous disposons d’assez peu de données, en particulier in vivo. C’est donc pour enrichir le corpus de connaissances sur cette question que nous proposons d’étudier l’impact de trois procédés technologiques « classiques » sur la digestibilité des protéines de chia dont l’utilisation est croissante en alimentation humaine. De plus, à ce jour, la digestibilité des protéines et des acides aminés ne peut être déterminée avec fiabilité qu’à l’aide d’expérimentations animales, longues, coûteuses et soulevant des questions éthiques. Ce projet a pour objectif de renforcer la fiabilité des méthodes de digestion in vitro. En comparant les valeurs de digestibilité in vivo obtenues dans le cadre de ce projet aux valeurs obtenues par ailleurs selon différents protocoles de digestion in vitro, il sera possible de déterminer le(s) protocole(s) de digestion in vitro le(s) plus pertinent(s) et fiables.
Procédures
Les animaux (n=10) seront hébergés en loge individuelle (2 m²) pendant les 23 jours du dispositif expérimental car les tests et les mesures nécessitent de contrôler parfaitement les conditions d'alimentation et parce que les animaux arracheraient le cathéter du congénère s’ils étaient logés en collectif. Les repas seront formulés pour répondre à leurs besoins nutritionnels et ils auront un accès libre à l’eau de boisson. Les animaux subiront une intervention chirurgicale (environ 2 h) sous anesthesie générale afin de leur poser une canule au niveau de l’iléum et un cathéter veineux au niveau de la veine jugulaire. Ces deux dispositifs seront gardés tout au long de l’étude (23 jours). Des antibiotiques seront adminsitrés aux animaux suite à l’intervention chirurgicale pour limiter les risques d’infections. Les deux premiers jours après l’intervention chirurgicale, les douleurs seront prises en charge en utilisant des analgésiques. Ces traitements pourront être prolongés si l'animal présente des signes de douleur et de souffrance selon une grille de scores préétablie. Pendant les 3 jours d’expérimentation (1 jour par repas test pour chaque animal x 3 repas test), des prélèvements de digestas seront réalisés en continu au cours des 9 heures suivant l’ingestion du repas test, pour un volume total estimé à environ 400 g de digesta frais. Les digestas seront collectés dans des sacs plastiques fixés à la canule iléale. Des prélèvements sanguins seront également réalisés de manière répétée (10 prélèvements au cours des 9 h post-prandiales), à l’aide du cathéter veineux. Le volume maximal sanguin prélevé sera de 25 mL sur la journée (soit au maximum 2,5 mL de sang par prélèvement).
Impact sur les animaux
Pour chacun des 3 repas tests, les animaux seront logés ponctuellement dans des cages à métabolisme (nécessaires à la collecte des urines), pour une durée de 24 h maximum ; les animaux verront leur possibilité de mouvement limitée pendant cette durée. En dehors des jours d’expérimentation, les animaux seront logés dans des cages individuelles, limitant leurs interactions sociales même si des contacts visuels, auditifs et olfactifs seront maintenus. Les animaux seront également susceptibles de subir des effets indésirables suite à la pose de la canule et/ou du cathéter : infections, plaies, blessures, inflammation, fièvre, diarrhées ou encore sorties de cathéter et/ou de canule.
Devenir
Les animaux ne pourront pas être inclus dans d’autres protocoles expérimentaux, ni placés, du fait de la pose de canules maintenues sur une longue durée (23 jours).
Remplacement
Le projet s’intéressant à des réponses biologiques, l’utilisation d’un modèle animal vivant est indispensable. De fait, les modèles de digestion in vitro ne permettent pas à ce jour de reproduire à l’identique la complexité physiologique du vivant. Les mesures et indicateurs qui en sont extraits ne peuvent donc pas établir de manière certaine et indiscutable la qualité nutritionnelle des protéines alimentaires. Le porc en croissance a été choisi pour sa proximité physiologique avec l’Homme.
Réduction
La pose de la canule permet de réduire considérablement le nombre d’animaux prenant part à l’étude. De plus, le nombre d’animaux inclus dans l’étude (n=10) a été calculé de manière à avoir suffisamment de puissance statistique pour comparer la qualité nutritionnelle des 3 ingrédients protéiques testés.
Raffinement
Les compétences et expériences des expérimentateurs garantissent le respect du bien-être animal. Une attention particulière sera accordée à la gestion de la douleur pendant toute la durée de l’expérimentation ; des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Les porcs pourront avoir un contact olfactif, sonore et visuel avec leurs congénères. Des observations quotidiennes de l’état de santé général des animaux seront réalisées tout au long de l’expérimentation. Les cages seront régulièrement enrichies par des objets de nature variable et non consommable (jouets en plastique, tapis…)
Choix des espèces
Le modèle « porc en croissance » est celui actuellement validé par un groupe d’experts internationaux sur les sujets liés aux protéines et réunis sous l’égide de l’Organisation des Nations unies pour l'alimentation et l'agriculture, pour la mesure de la digestibilité iléale réelle des acides aminés. Nous proposons donc d’utiliser ce modèle afin d’estimer de manière aussi réaliste que possible la qualité nutritionnelle des trois ingrédients protéiques étudiés. Il convient de noter que la validité de ce modèle en substitution des études chez l’Homme est confirmée par un corpus d'études relativement nombreuses et concordantes.
Modèles pathologiques induits chez les rongeurs
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 11100
Cochons d'Inde : 900
Hamsters dorés : 2100
Arthrose, encéphalomyélite auto-immune, cancer, diabète, inflammations, infections bactériennes et morsures de tiques : ces pathologies sont induites chez 28 200 rongeurs pour tester, à la demande de clients de l'industrie pharmaceutique, l'efficacité ou la toxicité de substances et de dispositifs médicaux. 14 100 souris, 11 100 rats, 2 100 hamsters dorés et 900 cochons d'Inde vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, tous tués à l'issue pour analyses. Le porteur indique que l'encéphalomyélite induite peut provoquer une paralysie progressive de la queue puis des membres, accompagnée d'allodynie et de douleurs persistantes, et que le modèle d'arthrose peut conduire à de l'automutilation. La surveillance annoncée repose sur des scores de paralysie, sur l'observation des pattes et sur une pesée bihebdomadaire, sans qu'aucun seuil déclenchant la mise à mort ne soit chiffré.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de réaliser différents traitements chez le rongeur après induction de modèles expérimentaux tel que l’arthrose, l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), le cancer, le diabète, l’inflammation, l’infection parasitaire et bactérienne. Le but est d’évaluer l’efficacité ou la toxicité de substances ou dispositifs médicaux pour l’industrie pharmaceutique dans des modèles présentant les signes caractéristiques de ces pathologies.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’induire des pathologies afin de tester des substances sur des modèles expérimentaux correspondants. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme afin de proposer des traitements aux pathologies correspondantes. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.
Procédures
Pour le modèle de l’arthrose, les animaux vigiles reçoivent plusieurs administrations d’une substance, de 2 à 5 administrations. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour la mise en place du modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, les animaux vigiles subissent l’administration d’une première substance, pratiquée sur le haut et sur le bas du dos, puis l’administration d’une seconde substance qui est répétée 2 à 3 jours après. En fonction de l’étude, si l’administration sur animal vigile n’est pas possible, il peut être réalisée une anesthésie générale et la mise en place d’une analgésie adaptée. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle de cancer, les animaux vigiles ou anesthésiés reçoivent une administration d’une solution de cellules cancéreuses. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle d’infection bactérienne, les animaux reçoivent une solution bactérienne. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle d’inflammation aiguë, les animaux reçoivent une solution d’une substance au niveau de la patte. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle d’inflammation chronique, les animaux reçoivent une solution d’une substance. La durée de ces administrations est de 5 minutes maximum. Pour le modèle anti parasitaire des tiques sont déposées sur la peau des animaux. La durée du dépot des tiques sera de 5 minutes maximum. Une substance test sera inoculée en dose unique ou répétée avant et/ou après le développement de chaque modèle. Ces administrations peuvent être quotidiennes jusqu’à la mise à mort des animaux. Pour le modèle du diabète, les animaux reçoivent une administration d’une substance. Une chirurgie sous anesthésie générale et avec un protocole d’analgésie adapté pourra être réalisée si la substance test est administrée dans un organe cible, dans ce cas, la chirurgie sera de 1h30 maxium.
Impact sur les animaux
Le modèle d'arthrose peut générer de la douleur au niveau des articulations à plus ou moins long terme. Les effets liés au développement du modèle peuvent aboutir à une baisse d'activité ainsi qu'un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, ...). Ces effets peuvent apparaître à partir du 21ème jour. Le modèle d'encéphalomyélite auto-immune peut provoquer une paralysie partielle ou totale au niveau des membres à plus ou moins long terme. Cette paralysie peut s'accompagner d'une allodynie et/ou d'une douleur plus ou moins persistante au niveau des memebres paralysés. Les premiers signes cliniques peuvent apparaître le 10ème jour avec une paralysie progressive de la queue et du train arrière qui peut se propager au niveau du train avant. Le modèle de développement de cancer peut provoquer des douleurs liées à l'apparition des masses tumorales. Les premiers signes cliniques peuvent survenir dès l'apparition visible de ces masses. Les animaux peuvent avoir des difficultés pour se déplacer. Le modèle d'infection bactérienne peut générer différents signes cliniques liés à l'infection. Ces signes cliniques peuvent être une perte de poids, des poils hérissés, une prostration de l'animal. Le modèle de diabète peut générer différents signes cliniques tels qu'une augmentation de la consommation d'eau, une augmentation des mictions, une déshydratation, une perte de poids et une distension abdominale. Les modèles d'inflammations aiguës et chroniques peuvent engendrer de la douleur au niveau du site de l'inflammation, des rougeurs, de la fièvre ainsi qu'une perte des fonctions physiques normales. Le modèle d'infection parasitaire peut engendrer de la douleur liés aux morsures de tiques, ainsi qu'une inflammation cutanée de lazone mordue, une faiblesse générale, de la fièvre ainsi qu'un manque d'apetit. Les effets liés à ces modèles peuvent aboutir à des changements comportementaux (baisse d'activité, baisse de la prise alimentaire) et physique (perte de poids, abscence de réflexes, immobilité). Ces effets ne sont pas limités dans le temps et peuvent durer tout le long du projet. En l'abscence de traitement, ces nuisances sont irréversibles.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses vitro et ex-vivo.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre installation. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Les modèles induits décrit dans ce projet sont caractérisés par des signes cliniques physiques. Dans le cas de l’arthrose, il s’agit de douleurs et de raideurs tandis que dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale il s’agit de paralysie des membres. Dans le cas de développement de cancer, il s’agit de l’apparition de tumeurs solides visibles ou sanguines (leucémie). Dans le cas d’activité antibactériennes, il s’agit d’une infection qui peut engendrer de la fièvre, une prostration de l’animal et des poils hérissés. Dans le cas du diabète il s’agit d’une perte de poids, une augmentation de la prise d’eau et des mictions, et d’une augmentation de la glycémie. Dans le cas d’inflammations aiguës et chroniques, il s’agit de rougeur et/ou de fièvre ainsi qu’un affaiblissement de l’animal. Dans le cas d’infection parasitaire, il s’agit de morsures de tiques entraînant des rougeurs, de la fièvre ainsi qu’un affaiblissement de l’animal. Ces signes pathologiques et leurs résorptions ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Par exemple, un nombre minimum d’animaux est requis pour les essais réglementaires, chaque groupe est composé de 10 animaux minimum (5 mâles et 5 femelles minimum). Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel. Il y aura environ 55 études par année (toutes procédures confondues).
Raffinement
De l’enrichissement comme des batônnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration, il est possible de mettre en place une analgésie adaptée en fonction des observations quotidiennes des animaux. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement peut être réalisée. Pour le développement de modèle de l’arthrose, un scoring est réalisé pour chaque patte de l’animal (enflure et rougeur de la cheville ou poignet jusqu’aux phalanges) deux fois par semaines au minimum après traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Pour le développement de modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un scoring sera réalisé quotidiennement après traitement afin d’évaluer l’apparition d’une paralysie (queue, membres postérieures et antérieures) jusqu’à la fin de l’étude. Pour le modèle de cancer, les tumeurs sont mesurées afin de suivre leurs évolutions. Pour le modèle de diabète, la glycémie est analysée régulièrement afin de suivre l’évolution du diabète. Pour le modèle antiparasitaire, le nombre et le poids des tiques détachés des animaux sont comptés. Pour le modèle d’inflammation aiguë, l’inflammation au niveau de la patte est mesurée. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. Pour la procédure d'arthrose, le choix du modèle dépend du volume et du mode d'administration. Pour la procédure d’encéphalomyélite auto-immune, le choix du modèle est la souris car uniquement celui-ci fonctionne sur ce modèle. Pour le modèle de cancer, le choix dépend du modèle de tumeur et du mode et du volume d'administration. Pour le modèle d'infection bactérienne, le choix dépend de l'agent pathogène. Pour le modèle de diabète le choix du modèle dépend de l'historique de la substance à tester et du volume d'administration. Pour le modèle d'inflammation aigüe, chronique et d'infection parasitaire le choix du modèle est fait selon le volume d'administration de la substance à tester. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Test de toxicité et d’efficacité d’un composé X anti-obésité en développement
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Douze mesures de température par sonde rectale et dix injections intrapéritonéales dans une procédure, vingt-deux injections et vingt-deux pesées dans l'autre. 90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 40 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Rendues obèses par onze semaines d'un régime dont 60 % des calories viennent des graisses, elles sont hébergées seules et passent deux sessions de 48 heures en mesure de dépenses énergétiques. Le porteur relève que leur obésité réduit leur capacité de mouvement et que le jeûne de quatre heures imposé avant les prises de sang provoque une sensation de faim. L'étude teste la toxicité et l'efficacité d'un candidat médicament pour le compte d'un client, et se limite aux mâles pour ne pas doubler les effectifs.
Objectifs
L'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus de 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Le présent projet est relatif à une étude menée à un stade précoce du développement d'un candidat médicament de notre client et vise à tester sa potentielle toxicité et son efficacité anti-obésité chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisses. Le projet devra permettre de montrer l'innocuité et l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur l'appétit, les dépenses énergétiques et, en conséquence, sur le poids corporel du modèle d'obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Alors que plusieurs molécules anti-obésité ont été autorisées ces vingt dernières années, un grand nombre d'entre elles se sont vues retirées du marché en raison d'effets secondaires graves. Seules 3 spécialités sont actuellement approuvées en Europe pour des traitements de longue durée du surpoids et de l'obésité, mais leur efficacité s'avère néanmoins très limitée. L'obésité est donc une pathologie présentant un besoin médical important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule anti-obésité.
Procédures
Procédure 1 : Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (8 mesures au cours de la procédure 1; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de placébo, du composé X ou du composé de référence par voie intrapéritonéale (10 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (1 mesure; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Mesures de température corporelle par sonde rectale (12 mesures; durée de la mesure : 1 minute); 5) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement de sang et d'organes (durée: 10 minutes). Procédure 2 : Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (22 mesures au cours de la procédure 1; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de véhicule, du composé X ou du composé de référence par voie intrapéritonéale (22 administrations; durée de l'administration : 1 minute); 3) Analyse non invasive de composition corporelle (2 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 4) Mesures de dépenses énergétiques (2 sessions de mesures de 48h); 5) Anesthésie générale avant euthanasie (durée: 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs légères et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).
Réduction
Les nombres de 8 animaux par groupe pour la procédure 1 et de 10 animaux par groupe pour la procédure 2 ont été rationalisés à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Par ailleurs, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genres.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie orale seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages individuelles mais un contact visuel et olfactif entre congénères sera maintenu. Par ailleurs, une attention particulière sera maintenue sur l'enrichissement des cages qui sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur, avec une rotation de leur présence dans la cage (a minima 2 matériels d'enrichissement présents dans la cage) afin de conserver un effet de nouveauté. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée (2 visites par jour) et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.
Choix des espèces
Le modèle de souris nourries avec une alimentation enrichie en graisses (avec 60% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 17 semaines (20 à 22 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une période de 11 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur.
Rôle des peptides natriurétiques et leurs récepteurs dans le contrôle de la thermogenèse et du métabolisme énergétique EU 2/2.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
4 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 3 520 un niveau modéré et 440 un niveau léger. Elles sont gavées une fois par jour pendant une semaine, subissent jusqu'à trois séries de dix prélèvements sanguins en deux heures, des injections rétro-orbitaires, une chirurgie, des séjours à 4 °C ou à 30 °C et des isolements pouvant durer cinq jours. L'exposition aiguë au froid peut provoquer une hypothermie modérée à sévère, et le porteur reconnaît une mortalité chirurgicale inférieure à 10 %. Il indique disposer de lignées cellulaires capables de remplacer l'animal pour produire des adipocytes bruns modifiés, avant de conclure qu'"aucun autre modèle n'est susceptible d'apporter les réponses aux questions posées".
Objectifs
L’obésité est une maladie chronique, évolutive et multifactorielle, qui représente la cinquième cause de mortalité mondiale et se caractérise par un excès de poids causé par un excès de tissu adipeux. Ce dernier est composé de cellules adipeuses (adipocytes) dont il existe plusieurs types. On distingue ainsi le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun ; le premier ayant plutôt un rôle de réserve d’énergie et le deuxième ayant plutôt un rôle de production de chaleur. Ce rôle thermogénique du tissu adipeux brun est consommateur de calories et pourrait être une piste intéressante dans le traitement de l’obésité. L’objectif principal de ce projet est de comprendre et identifier de nouveaux mécanismes et systèmes de régulation de l’activité thermogénique des adipocytes bruns/beiges dans un organisme complexe tel que le modèle murin. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Une forte prévalence (ou activité) du tissu adipeux brun (TAB) diminue fortement l’incidence des maladies cardiométaboliques comme le diabète de type 2 (DT2). Un enjeu majeur vise à comprendre les mécanismes de régulation du TAB et son rôle dans la gestion des flux de nutriments comme le glucose. Ces recherches pourraient mener à des pistes thérapeutiques potentielles dans le traitement des complications de l’obésité comme le DT2. Ce projet devrait nous apporter des connaissances théoriques nouvelles sur la biologie du TAB et pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles et stratégies de prise en charge de l’obésité et du DT2.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur : les animaux seront soumis à des gavages pendant une semaine, une fois par jour ; des injections ne durant que quelques secondes chacunes, des prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutive. Selon les procédures les animaux subiront 3 séquences (espacées d’au moins 1 semaine) de 10 prélèvements au maximum sur une durée de 2 heures. Certains seront aussi soumis à une chirurgie une fois au cours de leur vie, des hébergements au froid (4°C) ou à thermoneutralité (30°C), des isolements temporaires (maximum 5 jours) et une alimentation enrichie (lipides ou adénine) durant maximum 4 semaines consécutives. Dans le second établissement utilisateur : les animaux seront soumis à des injections ou des gavages ne durant que quelques secondes et des prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutive.
Impact sur les animaux
Les manipulations génétiques envisagées ne devraient pas s’accompagner de souffrance animale particulières dans des conditions d’hébergement standard. Une hypothermie modérée à sévère pourrait être observée lors de la procédure d’exposition aigue au froid. Cette procédure n°6 étant classée en sévère, nous porterons une attention renforcée au bien-être animal et nous évaluerons l’état général des animaux par une grille de score évaluant le degré de sévérité réel. Les animaux subiront divers stress, notamment des chirurgies surveillées avec gestion de la douleur, des expositions à 4°C ou 6°C, et des isolements pour des mesures des échanges gazeux (avec dérogation à l'hébergement). Effets indésirables potentiels liés aux expérimentations : - Inconfort lié au gavage et à la contention (durée inférieure à 15s), 1 fois/jour sur 5 jours, pouvant causer des irritations oesophagiennes. Certains groupes subiront un gavage de glucose unique lors de tests in vivo (à 2 semaines d’intervalle). - Stress de jeûne limité à 2h avant les tests in vivo pour normaliser la glycémie. - Inconfort et douleur liés à l'injection d'insuline (une fois, durée max 15s). - Inconfort et douleur lors des prélèvements sanguins à l’extrémités de la queue (tests in vivo). - Isolement des souris pour la mesure d’échanges gazeux (5 jours) avec surveillance accrue lors du retour en cages d’origines pour détecter d'éventuelles bagarres. - Injections rétro-orbitaires sous anesthésie gazeuse, potentiellement douloureuses, effectuées une fois avec anesthésique local. - Les chirurgies, sous anesthésie gazeuse et analgésie locale et centrale, peuvent causer inconfort, douleur et rarement la mortalité (inférieure à 10%). Utilisation de tapis chauffants maintenant la température des animaux. - Les expositions au froid, jusqu'à 5 heures, peuvent causer inconfort et douleur, avec contrôle de la température pour prévenir l'atteinte des points limites. Prise en charge immédiate des animaux atteignant ces points limites pour rétablir leurs constantes physiologiques.
Devenir
Ceci est indiqué pour chaque procédure expérimentale. Les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus suite à une stimulation chronique thermique par exemple ou un traitement pharmacologique. Pour toute cohorte de ce projet, les animaux ne seront pas ré-utilisés. Ils seront mis à mort à l'issue de leur période d'analyse, la plupart du temps entre 2 et 6 mois d'âge (sauf pour les cohortes vieillissement entre 12 et 24 mois), ceci dans le but de prélever tous les tissus d'intérêt à ce projet, notamment les différents dépots adipeux de l'organisme, mais aussi le foie, les muscles, le pancréas, le cœur et les reins.
Remplacement
Une partie importante de ce projet réside dans l’étude approfondie des mécanismes permettant à certaines protéines et/ou substrats énergétiques de réguler la thermogénèse des animaux. Des études de biochimie et de biologie cellulaire peuvent être réalisées sur des lignées cellulaires établies récemment dans notre laboratoire. Ces cellules peuvent subir des modifications du génome, ce qui permettra de remplacer l’utilisation de modèles animaux pour générer des adipocytes bruns dont l’expression des protéines est modifiée. Par ailleurs, nous utilisons déjà des modèles cellulaires développés au laboratoire dans le but de réduire l’utilisation de modèles animaux. Cependant, les régulations physiologiques et communications endocrines entre le cœur et les organes métaboliques clés comme le tissu adipeux brun (TAB) ne peuvent pas être étudiées dans des cultures 2D ou 3D. Le tissu adipeux brun est composé de plusieurs autres types cellulaires différents des adipocytes bruns et en lien avec les autres organes pour le maintien de l’homéostasie métabolique de l’organisme considéré. C’est pourquoi l’utilisation de procédures d’expérimentation sur le modèle murin sont nécessaires. Aucun autre modèle n’est susceptible d’apporter les réponses aux questions posées. Les modèles murins décrits dans ce projet s’inscrivent dans un niveau préclinique préalable à un éventuel transfert à visée thérapeutique chez l’Homme. Nous utiliserons dans toute la mesure du possible les banques de données accessibles en ligne. Celles-ci permettront d’acquérir des informations sur la régulation de nos protéines d’intérêt sans avoir à reproduire certaines données déjà accessibles.
Réduction
En raison d’une hétérogénéité interindividuelle significative des paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront d’utiliser 20 animaux contrôles (mâles et femelles) et 20 animaux génétiquement modifiés (mâles et femelles) par cohorte expérimentale en moyenne. Ce nombre est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats robustes basés sur une puissance statistique suffisante et permettant de réduire le nombre de cohortes dans une même condition expérimentale , et ce en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ».
Raffinement
Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souriceaux mâles seront uniquement regroupés au moment du sevrage. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements (feuille d’essuie-mains, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception de leur utilisation aiguë dans certaines procédures de ce projet, ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les classes de gravité des procédures utilisées dans le projet sont modérées à sévères et ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d’animaux. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et des plaques chauffantes. Dans le cas des procédures sévères une surveillance accrue sera opérée par les manipulateurs ou les zootechniciens et des actions d'enrichissement, par exemple, seront réalisées. Lors des procédures où la température d'hébergment est modifiée (4°C ou 30°C), des contrôles tels que surveillance accrue ou prises de températures seront effectués afin de vérifier le bon état de santé des animaux. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte de par l’utilisation de divers régimes alimentaires et températures d’hébergement. Nous étudions l’importance des protéines impliquées dans la régulation de la thermogénèse par les adipocytes bruns. A travers l’utilisation du modèle souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une invalidation pour le/les gène(s) d’intérêts ou des modifications géniques similaires à celles retrouvées chez des patients. Les souris seront étudiées à partir de l’âge de 7 semaines. Des analyses de suivi seront également effectuées sur un groupe d’animaux de nos différentes lignées allant jusqu’à 24 mois, ceci dans le but de déterminer sur le plus long terme les effets sur le développement du tissu adipeux brun et la physiologie de l’organisme de « nos » protéines d’intérêt de la thermogénèse.
Mise en évidence du rôle des vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs (TA-HEV) dans le recrutement des lymphocytes B dans les tumeurs de souris (Mus musculus)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Prostration, absence de toilettage, difficultés respiratoires, ces signes marquent chez les souris porteuses de nodules pulmonaires l'approche du seuil où l'expérience s'arrête. 2 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 502 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 818 un niveau modéré. Elles reçoivent des cellules tumorales dans la veine de la queue ou en d'autres sites, des immunothérapies pouvant déclencher inflammation et auto-immunité, et pour certaines une chirurgie suivie de deux à trois heures de microscopie intravitale. Le porteur écrit que le projet "devrait permettre" de mieux comprendre comment les lymphocytes entrent dans les tumeurs, bénéfice renvoyé à des recherches futures quand les atteintes sévères infligées à 1 502 souris sont, elles, programmées d'emblée.
Objectifs
Les traitements par immunothérapie contre le cancer ont transformé le traitement de nombreux cancers. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces pour tous les patients. Les vaisseaux sanguins à paroi épaisse, associés aux tumeurs, sont des vaisseaux particuliers que l'on trouve dans les tumeurs murines et humaines. Ces vaisseaux jouent un rôle clé en permettant aux lymphocytes d'entrer dans les tumeurs pendant la réponse immunitaire contre le cancer et lors des traitements combinés d’immunothérapie. De plus, augmenter la fréquence et la maturité de ces vaisseaux grâce à un traitement améliore la réponse à l’immunothérapie dans des modèles précliniques murins. Enfin, dans les tumeurs fortement envahies par les cellules immunitaires, ou dites « chaudes », la présence de lymphocytes particuliers produisant des anticorps et de structures lymphoïdes riches en ce type de lymphocytes est souvent associée à une meilleure réponse à l’immunothérapie. Toutefois, les mécanismes qui régulent l’entrée de ces lymphocytes particuliers dans ces tumeurs demeurent inconnus. L’objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de ces vaisseaux dans l'infiltration des lymphocytes produisant des anticorps et la formation de ces structures lymphoïdes dans les tumeurs « chaudes » traitées par immunothérapie.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de mieux caractériser le rôle des vaisseaux à endothélium épais associés aux tumeurs dans l'établissement de structures lymphoïde tertiaires (TLS). Ces TLS sont des structures qui ressemblent en partie à nos ganglions lymphatiques et leur induction et leur développement pourrait favoriser la réponse immunitaire anti-cancéreuse.
Procédures
Des souris auront une injection en vigile sous analgésie locale (1-2 minutes). Pour certaines souris, quatre injections en vigile (environ 10 secondes par injection) seront réalisées. Des souris auront une injection sous anesthésie (2-3 minutes) ainsi que trois injections en vigile (environ 10 secondes par injection). Des souris auront en plus, 1h avant leur mise à mort, une injection en vigile sous analgésie locale (1-2 minutes). Des souris auront une injection sous anesthésie (2-3 minutes), trois injections en vigile (environ 10 secondes par injection) et seront anesthésiées avant la pose d’un cathéter, puis seront soumis à une chirurgie nécessaire à la microscopie intra vitale. Cette procédure dure moins d’1h, l’imagerie quant à elle dure en moyenne une heure pour la microscopie intravitale à champ large et de 2 à 3h pour la microscopie intravitale multiphoton.
Impact sur les animaux
L'injection de cellules tumorales dans la veine de la queue pour les modèles de développement de tumeurs pulmonaires peut provoquer une douleur modérée et entraîner du stress chez l'animal. Le cancer se manifeste par l'apparition de nodules dans les poumons, ce qui peut entraîner des douleurs, des difficultés respiratoires et une détérioration de l'état général de l'animal (absence de toilettage, prostration, lenteur dans les mouvements, etc.). L'injection des cellules tumorales dans d’autres sites peut également causer du stress. Le développement de la tumeur peut entraîner des douleurs et une dégradation de l'état général. Les traitements d'immunothérapie peuvent provoquer des effets secondaires similaires à ceux observés chez l'homme, comme une inflammation et une auto-immunité.
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort pour des prélèvements ou bien à l’issue d’une chirurgie prolongée ne permettant pas de réutilisation des animaux
Remplacement
Les procédures réalisées sur l’animal dans le contexte de ce projet ne peuvent pas être remplacées par des méthodes expérimentales alternatives. En effet, il n’est pas possible à l’heure actuelle de disposer de modèles in vitro permettant d'intégrer à la fois le système immunitaire, le développement d'une tumeur et le système vasculaire sanguin. De plus les vaisseaux auxquels nous nous intéressons dans ce projet ne conservent pas leur caractéristiques en dehors d'un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque expérience a été déterminé à partir de nos études antérieures et de la littérature scientifique. Il est de 15 animaux maximum pour chaque groupe afin d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour mettre en évidence des différences significatives statistiquement, en utilisant des tests appropriés. Le projet est conçu avec une hiérarchie des procédures où la réalisation d’une procédure ultérieure n’est possible que si les résultats des procédures précédentes le justifient.
Raffinement
La stratégie de raffinement se base premièrement sur une connaissance approfondie du développement tumoral des modèles : les résultats d’expériences précédemment établies et publiés nous permettent de connaître précisément le moment où la réponse immunitaire anti tumorale est maximale et nous ont permis d'établir le point final de chaque expérience qui se situe bien avant d'atteindre les points limites. Le suivi des animaux sera réalisé quotidiennement par les expérimentateurs et des soigneurs en suivant une grille des scoring conçue spécifiquement pour ce projet. Les méthodes d’expérimentation et d’hébergement sont optimisées pour réduire au maximum le stress et la douleur causée par les procédures. Les injections sont réalisées sous anesthésie locale et avec un matériel de contention dédié et optimisé pour ces injections. La chirurgie est réalisée sous anesthésie (générale + locale) et un analgésique est administré avant.
Choix des espèces
La souris est un organisme modèle génétiquement proche de l’être humain, ce qui en fait un modèle préclinique de choix très utilisé dans les domaines de la cancérologie et de l’immunologie. L'étude présentée ici nécessite aussi l'utilisation d'un modèle mammifère car les ganglions lymphatiques sont apparus tardivement au cours de l'évolution. Pour toutes les procédures, des souris âgées de 6 à 10 semaines seront utilisées car à ce stade, ces animaux ont un système immunitaire mature.
Etude la dose léthale 50 en intra-veineuse d’une formulation innovante de mitotane
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
48 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une injection intraveineuse unique de cinq secondes d'une formulation de mitotane, l'effectif variant de 12 à 48 selon la réponse toxicologique observée, pour établir la dose qui tue la moitié des animaux. Le porteur annonce des troubles gastro-intestinaux fréquents, une surveillance matin, midi et soir pendant cinq jours, et la mise à mort de l'animal si l'analgésique morphinique ne suffit pas. Il affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, les modèles cellulaires ne permettant pas d'établir une dose léthale 50, et présente cette étape comme le passage obligé avant les premiers essais chez l'humain.
Objectifs
L’adénocarcinome corticosurrénalien est une maladie rare (0,5 à 2/million/an) aboutissant dans la majorité des cas au décès du patient. Cette pathologie peut survenir à tout âge, principalement chez l’adulte de plus de 50 ans et chez l’enfant de moins de 15 ans. Le but de cette étude, est de trouver une nouvelle formulation de Mitotane éfficace.
Bénéfices attendus
Obtenir des données sur la toxicité d’une formulation innovante, afin de finaliser les études précliniques et pouvoir passer aux études cliniques de niveau 1 chez l’Homme.
Procédures
Une injection "unique"en intra-veineux sera réalisé sur chaque animal, le premier jour, durée de l'injection :5 secondes
Impact sur les animaux
Troubles Gastro-intestinal fréquemement obervés
Devenir
Tous les animaux utilisés dans ce protocole seront euthanasiés, suivant les procédures décrites dans cette DAP.
Remplacement
Il est indispensable pour notre étude d’avoir recours à l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne permettent pas la réalisation d’un profil de DL 50 in vivo. Il est donc primordial avant de passer sur un modèle Humain de définir la DL 50 chez l’animal.
Réduction
Un faible nombre d’animaux sera utilisé, c'est à dire 12 souris au minimun et 48 au maximun, en fonction de la réponse toxicologique de chaque animal; selon les recommandations OECD 423 (ligne directrice de l'OECD), pour les essais de produits chimiques.
Raffinement
Les vistes de surveillance seront effectués , afin de vérifier l'atteinte des points limiets et ceux-ci, tous les matins, midis et soir, pendant les 5 journées du déroulement du protocole et en cas d'observation de souffrance de l'animal, un traitement analgésique à base de morphinique (Buprecare 0.1mL/Kg) sera effectué en IP sur chaque animal. Si le traitment antalgique n'est pas suffisant, il sera décidé de la mise à mort de l'animal (voir pragraphe sur la mise de mort de l'animal).
Choix des espèces
La souris est l’animal de référence pour les études de DL 50. Les animaux utilisés sont au stade adulte, la taille à cet âge permet une réalisation facile de l’administration par voie IV