Procédures sévères

Toutes tuées à l'issue, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour mesurer les échanges de lactate entre cellules du cerveau. Chacune subit environ une heure de chirurgie sous anesthésie, le temps d'implanter une fenêtre crânienne au-dessus du cerveau et de fixer une barre de contention sur sa tête. Suivent jusqu'à quinze séances d'imagerie de deux heures, des perfusions, des injections de colorants et d'insuline, un prélèvement de sang toutes les quinze minutes, et pour une partie des souris des observations éveillées après deux semaines d'habituation au poste. Le cerveau est prélevé sur 52 animaux, les 188 autres étant tués au motif qu'ils portent une fenêtre crânienne et ont reçu des injections, ce qui les rend impossibles à replacer.

Objectifs

L’objectif général du projet est d’approfondir notre connaissance du métabolisme cérébral et de sa régulation, pour mieux comprendre son altération dans les maladies neurodégénératives liées au vieillissement. L’activité électrique des neurones est la principale source de dépense énergétique du cerveau. Ainsi, le cerveau qui ne représente que deux pour cent de la masse corporelle, contribue à vingt pour cent des dépenses énergétiques du corps. Une série d’études ont montré que le glucose était le principal substrat énergétique du cerveau en condition physiologique. Cependant, d’autres travaux ont également démontré que le lactate, produit final de la fermentation du glucose et traditionnellement considéré comme un déchet métabolique, pouvait être substitué au glucose et permettre le maintien de l’activité neuronale de tranches de cerveaux maintenues en culture. En effet, bien qu’issue de la dégradation du glucose, la molécule de lactate reste relativement riche en énergie. Par ailleurs, il a été découvert que les astrocytes, un autre type de cellules cérébrales, pouvaient produire et libérer du lactate, conduisant ainsi à l’hypothèse d’un transfert de lactate des astrocytes vers les neurones. D’autre part, certaines études récentes suggèrent qu’une altération de la voie d’utilisation du glucose dans les astrocytes et donc de la libération de lactate par ces astrocytes, pourrait participer aux déficits cognitifs observés dans des modèles murins de la maladie d’Alzheimer. Comprendre quelle part de l’énergie utilisée par les neurones dérive de leur utilisation directe du glucose et-ou du lactate produit par les astrocytes est donc d’une importance fondamentale pour toute approche thérapeutique visant à restaurer le métabolisme cérébral dans différentes formes de démence. Notre projet vise donc à établir si la dynamique de production de lactate dans les astrocytes et de ses fluctuations dans l’espace extracellulaire et dans les neurones est compatible avec l’hypothèse d’un transfert de lactate des astrocytes vers les neurones. Par ailleurs, ce projet nous permettra également de déterminer si ce processus est impliqué dans le couplage neuro-vasculaire, c’est-à-dire l’ensemble de processus qui conduisent à une augmentation localisée du flux sanguin à la suite d’une activation neuronale, celui-ci étant dysfonctionnel dans différentes formes de démence.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension du métabolisme cérébral et notamment de l’utilisation du lactate astrocytaire par les neurones devrait contribuer à mieux comprendre les processus par lesquels ce métabolisme devient dysfonctionnel au cours de certaines maladies (comme les dégénérescences liées au vieillissement). Par ailleurs, savoir si les neurones utilisent de manière substantielle du lactate dans des conditions physiologiques devrait également permettre d’orienter certaines thérapies visant à compenser un métabolisme neuronal défectueux, mais aussi de mieux comprendre l’impact de certains facteurs environnementaux sur le métabolisme cérébrale (l’activité physique élève le taux plasmatique de lactate, certaines bactéries du microbiote intestinal produisent du lactate, certains aliments sont riches en lactate…).

Procédures

Les animaux sont tous soumis à une intervention chirurgicale d’environ une heure sous anesthésie et analgésie permettant d'implanter une fenêtre crânienne au-dessus du cerveau ainsi qu’une barre de contention sur la tête pour nos observations. Une partie des animaux recevront un agent sous anesthésie (intervention de 3 minutes maximum, une seule fois). Tous les animaux seront observés sous anesthésie durant des sessions d’imagerie n’excédant pas 2 heures et 15 fois maximum durant le projet (espacement de 3 jours minimum entre les observations). Durant les expériences d’imagerie, les animaux recevront une perfusion de solutions ainsi qu’une injection de colorants. Ils recevront également une injection d’insuline (maximum une fois par mois) et un prélèvement de sang sera effectué toutes les 15min pour suveiller leur glycémie durant le temps de l'imagerie. Les animaux seront également observés éveillé, après une habituation de deux semaines au poste d’imagerie.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront des injections pouvant provoquer un stress et une légère douleur. Les animaux sont exposés à un léger risque cardio-respiratoire, d’hypothermie ou d’hypoventilation durant les expérimentations sous anesthésie. La chirurgie peut provoquer une douleur transitoire et une perte de poids durant les 3 jours suivants l’opération. Certains animaux recevront une perfusion intraveineuse lente de solution durant les expériences sous anesthésie qui peut provoquer une légère douleur, un stress, ainsi qu’un très faible risque d’hémorragie au réveil à la fin de l’expérience. Certains animaux seront observés éveillés sous le microscope, après une période d’habituation qui peut être stressante au début de l’apprentissage.

Devenir

Les 240 animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire. Le cerveau sera prélevé post-mortem sur 52 animaux pour des analyses histochimiques complémentaires. Le reste des animaux (188), étant déjà injectés par des agents et porteurs d’une fenêtre crânienne sont euthanasiés car il n’est pas possible de les replacer.

Remplacement

Toutes les études métaboliques et celles s’intéressant à la régulation du flux sanguin nécessitent de travailler chez l’animal vivant. En effet, une grande partie des données obtenues in vitro se sont révélées non utilisables en recherche clinique. Nos recherches portent sur le métabolisme cérébral et plus particulièrement sur les fluctuations du lactate dans le cerveau or il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico satisfaisant, capable de reproduire la complexité des mécanismes cellulaires impliqués dans la régulation du lactate dans le cerveau.

Réduction

Ce projet nécessitera l’utilisation d’au maximum 240 souris. Nous avons réduit le nombre d'animaux au maximum tout en s’assurant de l’obtention de données statistiques robustes d'après nos expériences passées sur ces modèles. Ce nombre a été déterminé à partir d’une analyse de puissance à l’aide d’un logiciel adapté prenant en compte la valeur moyenne de nos réponses en condition basale pour chacune des 3 lignées transgéniques utilisées et des 13 molécules injectés.

Raffinement

Les animaux importés observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant le début des expérimentations ainsi que des temps de repos établis entre les différents actes expérimentaux. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec divers enrichissements (bâtons en bois et igloo et roue), et nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous éviterons tant que possible l’hébergement individuel des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Des points limites ont été définis et les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par la structure du bien-être animal pouvant mener à l’administration d’un traitement, à décaler dans le temps les actes prévus ou à euthanasier l’animal si cela est nécessaire. Durant les procédures, les animaux bénéficieront d’anesthésie générale et d’analgésie adaptée à chaque acte réalisé. Durant l’anesthésie, un apport d’air oxygéné et un suivi de température sera réalisé. Après la chirurgie et l’imagerie les animaux recevront un antidote à l’anesthésique pour leur permettre de retrouver rapidement leurs capacités physiologiques et seront placés dans une cage de réveil chauffée et oxygénée jusqu’à leur réveil complet. Après la chirurgie, ils recevront une gelée nutritive et un suivi postopératoire méticuleux de 3 jours, avec pesée quotidienne sera mis en place. Durant ce temps, les cages seront signalées grâce à une étiquette de soins postopératoires. Les animaux observés éveillés suivront avant toute expérience un protocole d’habituation au poste d’imagerie.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce de mammifère chez laquelle il est aisé de générer des animaux transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents, nous permettant ainsi de suivre l’activité de différents types cellulaires. Dans ce projet les souris seront utilisées entre 2 mois et 15 mois. Il est nécessaire d’utiliser des animaux chez lesquels les processus régulant le couplage neurovasculaire sont matures.

Une mini-pompe est implantée sous la peau du dos pour diffuser pendant vingt-huit jours une molécule qui provoque un anévrysme de l'aorte. 450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. S'y ajoutent des séances d'imagerie cardiaque et un transport à pied entre deux établissements, et l'un des gènes étudiés tue l'animal à la naissance lorsqu'il est totalement absent. Les effets déclarés se limitent à un léger stress et à une suture qui peut être irritée légèrement, alors que le même texte reconnaît qu'une dissection aortique et une mort subite peuvent survenir en fin de traitement.

Objectifs

Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Les anévrysmes de l’aorte thoracique (AAT) sont un gonflement d'une region spécifique de l'aorte qui relie le coeur au reste du corps humain. Ce gonflement à pour conséquence une fragilsation importante du reste du réseau cardiaque. La rupture de l’aorte qui consiste en un dechirement de celle-ci est alors favorisée et mortelle. Aucun traitement n’est pour le moment disponible pour ralentir la progression de la pathologie en raison de connaissances insuffisantes sur les mécanismes impliqués. Le but de notre recherche est d’identifier les gènes impliqués dans les AAT (anévrysme aortique thoracique) car a ce jour, seuls 30 % des patients ont une cause génétique connue. Il a été identifié 4 gènes qui sont potentiellement impliqués dans les anévrysmes mais leur rôle exact reste à établir. Pour mieux comprendre leur implication dans les anévrysmes de l'aorte thoracique, des modèles murins ont été générés afin de pouvoir etudier leur mécanismes. Un modèle de souris par gène identifié sera mis en place pour lequel nous induirons par la suite un anévrysme de l'aorte à l'aide d'une molécule déjà connue de la littérature.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider des gènes impliquées dans les AAT et ainsi réduire le nombre de patient dont la cause génétique n'est à ce jour pas connue. L'identification du rôle de ces gènes nous amenera a mieux comprendre leur mécanisme et ainsi offrir un meilleur suivi de l'anévrysme aux patients. La connaissance approfondie des potentiels acteurs impliqués dans les anévrysmes nous permettra de prévenir les conséquences fatales de la progression de cette pathologie et potentiellement de développer des solutions thérapeutiques.

Procédures

Dans l'EU1, une incision sous la peau au niveau du dos sera réalisée sur animal anesthésié pour implanter une mini-pompe qui délivrera une molécule pendant 28 jours pour induire un anévrysme. La durée de l’acte est de 10 min. Au préalable, sur un groupe d’animaux, il sera administré pendant une semaine dans l’eau de boisson une molécule connue de la littérature pour augmenter l’apparition de l’anévrysme. Pour suivre l'évolution du développement des anévrysmes, une imagerie cardiaque sera effectuée dans l'EU2 soit 10 min par souris.

Impact sur les animaux

La mise en place des pompes à AngII (pompes avec Angiotensine II qui est un hypertenseur) peut induire un léger stress à la souris. La suture peut être irritée légèrement. En fin de traitement, une possible dissection aortique peut survenir et donc une mort subite. Les échographies sont rapides et bien supportées par les animaux. L'un des gènes étudiés entraine la mort de l'animal à la naissance lorsqu'il est totalement absent.

Devenir

tous les animaux sont euthanasiés et des prélèvements de tissus seront effectués post-mortem pour analyses.

Remplacement

Les prélèvements chez l'humain après opérations sont limités en nombre et en nature (seulement des petites parties de la paroi anévrysmale sont retirées par les chirurgiens). Cette pathologie est complexe et fait intervenir de nombreux compartiments du corps humain (vaisseaux, sang) mais aussi des paramètres mécaniques (pression, vitesse). Les animaux et les humains partagent une grande similarité aussi bein sur le plan anatomique, génétique que fonctionnel. De plus, le modèle murin nous permet d'être en mesure de travailler sur des modèles génétiquement modifiés et ainsi de pouvoir moduler et cibler un gène en particulier. Des expériences ont été menées sur des cellules humaines isolées afin de remplacer autant que possible l'utilisation de ces animaux. Cependant, la complexité des mécanismes à l'origine des anévrysmes requiert l'utilisation d'un organisme complet.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. Un lot expérimental nécessite 10 souris pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif est déduit de nos expériences précédentes. Toutefois, si nous constatons une différence statistiquement significative à un effectif plus faible, nous conclurons l'étude. La production d'animaux nécessaire sera réduite au minimum des besoins expérimentaux.

Raffinement

Nous raffinerons l'environnement des animaux par enrichissement de leur milieu de vie. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture ainsi que de la boisson. Nous veillerons à ce que les animaux ne soient pas laissé isoler dans les cages durant toutes les expériences afin de ne pas perturber les groupes souciaux. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés lors du projet pour couvrir les douleurs opératoires. De plus, les yeux seront couverts d'ocrygel pour eviter la déshydratation des yeux. Une surveillance quotidienne sera efféctué par l'expérimentateur ainsi que le personnel de l'animalerie, cette surveillance pourra être augmentée en cas de nécéssité. Le suivi sera quotidien. Nous établirons une grille d'évaluation des effets/nuisances susceptibles de toucher les animaux. Les critères observés seront l’apparence, le comportement, la mobilité et la perte poids. Les animaux recevront une injection d'un anti-douleur toutes les 8 heures pendant 2 jours en cas de besoin. En cas de déshydratation, les animaux recevront une injection de sérum physiologique au niveau de l’abdomen. Lors du transport des animaux de l'EU1 à l'EU2, nus ferons ce transport à pied (5min), à l'abri des regards, avec des hydrogels dans les cages et un peu de nourriture et des igloos en carton pour éviter le stress.

Choix des espèces

Les lignées murines impliquant les 4 gènes étudiés ont déjà été générées et nous y avons accès. De nombreux modèles murins ont déjà été décrits et développés pour les AAT nous permettant ainsi de comparer les modèles entre eux afin de mieux comprendre les mécanismes sous jacents. Les animaux seront utilisés au stade adulte (12 semaines), car les anévrismes de l’aorte thoracique se déclarent majoritairement chez l’Homme adulte et chez la souris à 12 semaines.

Les souris utilisées ont été génétiquement modifiées pour qu'une classe de leurs neurones sensoriels soit détruite, afin d'observer ce qu'il reste de la douleur quand ces fibres manquent. 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent cinq gavages successifs, puis six injections intrapéritonéales de deux molécules anticancéreuses réparties sur plusieurs semaines, avant des tests répétés de sensibilité de la patte arrière au toucher, au froid et à un gradient de température. Le porteur indique que ces injections provoquent une hypersensibilité mécanique, une hyperalgésie thermique et une allodynie au froid, et que tous les animaux sont tués pour prélever les tissus destinés aux analyses.

Objectifs

Plusieurs études dont certaines réalisées au sein de notre équipe, montrent qu’une classe particulière de fibres somato-sensorielles est impliquée dans la modulation de la douleur post-lésionnelle. Environ 30% des patients atteints de cancer et traités par des agents anti-cancéreux développent des douleurs chroniques notamment des douleurs neuropathiques périphériques. Chez les rongeurs, l’apparition de neuropathie périphérique induite par l’administration d’agents anti-cancéreux est réversible au bout de vingt jours. Afin de pouvoir démontrer directement la fonction de ces fibres somato-sensorielles in vivo, dans la modulation de la douleur neuropathique périphérique, nous avons créé des souris génétiquement modifiées dans lesquelles ces neurones sensoriels sont supprimés sélectivement. Ces souris seront exposées à 2 molécules anti-cancéreuses différentes afin d’évaluer l’impact de la suppression de ces neurones sensoriels dans la mise en place de la douleur neuropathique périphérique chimio-induite. Afin d’inclure le sexe en tant que variable biologique, comme requis depuis 2005 dans le domaine de la recherche sur la douleur, notre étude portera sur des souris mâles et des souris femelles.

Bénéfices attendus

La prise en charge de la douleur est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important. En particulier, les patients traités par des molécules anti-cancéreuses peuvent développer des douleurs chroniques plusieurs années après l’arrêt du traitement, détériorant grandement leur qualité de vie. Ainsi comprendre les mécanismes qui sous-tendent la mise en place de la neuropathie périphérique chimio-induite reste un enjeu majeur pour permettre le développement de nouveaux agents thérapeutiques. Dans ce projet, nous chercherons à caractériser le rôle d'une classe de neurones sensoriels dans la douleur neuropathique périphérique induite par chimiothérapie. Nous allons augmenter nos connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la mise en place et la durée de l'hypersensibilité sensorielle induite par l’administration de molécules anti-cancéreuses.

Procédures

Les animaux seront soumis à 5 gavages de 2 min toutes les 24h puis de 2 injections à 2 jours d'intervalle. 4 semaines après, 4 nouvelles injections seront administrées, espacées de 2 jours. 3 tests comportementaux alternativement seront réalisés sur ces animaux durant une semaine puis une à 2 fois par semaine pendant 5 semaines. Ces tests consistent à évaluer la sensibilité de la patte arrière de la souris à des stimulis mécaniques ou thermiques (au froid et à un gradient de température). Chaque stimulation varie de 3 à 20 sec en fonction des tests. La durée totale de ces tests est d'environ 1 min maximum par souris.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à subir des administrations de composés par gavage et par injection intrapéritonéale. La contention pour gavage et les injections intrapéritonéales sont susceptibles de générer du stress mais le personnel est formé à la réalisation de ces actes. Sur la base des données bibliographiques, nous savons que l’injection par voie intrapéritonéale des composés chimio-thérapeutiques va générer chez une souris sauvage une hypersensibilité mécanique, une hyperalgésie thermique et une allodynie au froid.

Devenir

Tous les animaux impliqués dans chaque procédure sont euthanasiés afin de prélever les tissus nécessaires aux besoins de l'analyse.

Remplacement

La thématique principale de notre laboratoire étant de comprendre la physiologie de la douleur, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers le cortex somatosensoriel. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. De plus, l'utilisation de la souris en tant que modèle expérimental nous permet d'étudier le rôle de populations neuronales définies dans la physiologie de la douleur, grâce à la génération de modèles murins génétiquement modifiés.

Réduction

Sur la base d’études pilotes, nous avons réduit au minimum nos effectifs permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. L’optimisation de notre plan expérimental (enchaînement de différents tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, partage de tissus) permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. L’utilisation d’outils informatiques prenant en compte la variabilité liée au traitement, aux tests comportementaux ainsi que le nombre minimum de souris pour obtenir suffisamment de matériel analysable, nous permettent de déterminer au plus juste le nombre d’animaux dans nos tests de comportement, ainsi que dans les analyses moléculaires prévues dans ce projet. Le nombre indiqué tient compte de toutes ces variables.

Raffinement

Les stratégies d’optimisation suivantes seront mises en place au cours du projet afin de réduire au mieux voir supprimer la souffrance chez l’animal : a) planification des procédures expérimentales (disponibilité de locaux d'expérimentation, de matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) limitant le stress des animaux et favorisant la validité des expériences ; b) recours à l'anesthésie/analgésie ; c) établissement d’une grille de score et des points limites les plus précoces possibles. Les expérimentateurs ont été formés et maitrisent les méthodes notamment l’administration par « voie orale ». Une surveillance accrue des souris sera réalisée durant la première semaine d’administration des molécules anti-cancéreuses et précédant chaque test de comportement. Si une anomalie est constatée, les zootechniciens en charge de la surveillance quotidienne contacteront le porteur de projet et les membres du bien-être animal et des mesures seront prises, si nécessaire (y compris les points limites adaptés) afin de minimiser la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. De plus, differents tissus impliqués dans l'intégration nociceptive (peau, neurones sensoriels et moèlle epinière) sont parfaitement décrits chez la souris. Nos tests comportementaux et nos analyses cellulaires et moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines car à ce stade du développement, le système somato-sensoriel primaire arrive à maturation. Néanmoins, l'expérimentation sera débutée chez ces souris âgées de 3 et 3.5 semaines afin de supprimer de façon optimale la population de neurones sensoriels d’intérêt.

Une injection unique sous anesthésie, une échographie deux semaines plus tard, puis une imagerie chaque semaine pendant six semaines : 180 souris suivent ce protocole pendant que se développe dans leur foie une tumeur qui peut comprimer les organes, provoquer une jaunisse et des métastases, et gêner leurs déplacements. Les procédures sont classées en niveau de souffrance sévère. Le porteur présente pourtant ce projet comme une manière de rendre les expériences "plus éthiques" et d'améliorer le bien-être des animaux non-humains, en remplaçant une technique d'induction jugée trop complexe. Toutes les souris sont tuées à la fin pour prélever les tumeurs et les foies.

Objectifs

Nous allons mener une étude pilote dans le but de développer un modèle d'étude du cancer du foie. L'objectif est de créer une méthode plus accessible, facile à mettre en place, et moins invasive pour les animaux. Actuellement, les méthodes utilisées pour étudier le cancer du foie peuvent être complexes et nécessiter des procédures invasives qui peuvent nuire au bien-être des animaux. En testant cette nouvelle approche, nous cherchons à rendre les expériences scientifiques plus éthiques tout en obtenant des résultats fiables pour mieux comprendre cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous allons remplacer une technique actuellement utilisée, qui est complexe et difficile à mettre en œuvre, par une autre méthode qui sera non seulement plus simple à réaliser, mais aussi moins stressante pour les animaux. L'objectif est de réduire le stress que ces techniques peuvent entraîner pour les animaux, tout en continuant à obtenir des résultats fiables et pertinents pour la recherche. En adoptant cette nouvelle approche, nous espérons améliorer le bien-être des animaux tout en maintenant la rigueur scientifique nécessaire pour faire avancer nos connaissances.

Procédures

Tous les animaux de ce projet seront soumis à une injection unique, réalisée sur animaux anesthésiés qui durera moins d’une minute. Le suivi commencera par une échographie deux semaines après l'injection, puis les animaux seront imagés à partir de la troisième semaine, et ce, chaque semaine pendant six semaines, avec une échographie hebdomadaire. Les échographies seront réalisées sur animal anesthésié et dureront 5 minutes.

Impact sur les animaux

L’injection entraine du stress de contention et une perte de conscience, puis un développement de tumeur qui peut entrainer une compression des organes, une jaunisse, des métastases et des difficultés à se déplacer.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

L'injection sera effectuée sous anesthésie et analgésie. Pendant les 14 jours d'acclimatation, les souris seront laissées sans manipulation pendant 2 à 3 jours, puis progressivement habituées à la contention afin de minimiser le stress. Les animaux seront logés en cages collectives (maximum 5 par cage) sur des portoirs ventilés, avec un environnement enrichi comprenant des tubes en coton pour la nidification et des briques de tremble pour leur permettre de ronger. Des points limites ont été définis pour prévenir toute souffrance animale. En cas de douleur, des traitements analgésiques seront mises en place pour soulager les symptômes.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 6 à 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature.

Une arthrose est provoquée par l'injection dans le genou d'un composé chimique qui dégrade le cartilage, suivie de traitements répétés pendant quatre semaines par la bouche, dans l'articulation, dans la veine, sous la peau ou dans le ventre. 300 rats vont être utilisés, tous tués et autopsiés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les prélèvements sanguins hebdomadaires se font sans anesthésie, et le porteur attend des cris et de l'agitation pendant les administrations, un œdème de l'articulation et une boiterie. Le dispositif permet d'évaluer de trente à cinquante conditions différentes de principes actifs, chaque animal atteignant un point limite étant pris en charge ou tué.

Objectifs

Alors que les affections ostéoarticulaires chroniques, comme l’arthrose, touchent tout particulièrement les adultes de plus de 50 ans. Si les traitements médicamenteux actuels soulagent en partie les douleurs intenses et l’inflammation causée par ces affections, aucun des traitements n’est capable de freiner la dégradation du cartilage ou de totalement guérir de la maladie. Aujourd’hui, seuls les traitements chirurgicaux très invasifs, comme la pose de prothèse permettent de retrouver la mobilité perdue due à l’arthrose. Ainsi, la découverte et le développement de nouveaux traitements agissant de façon globale sur l’inflammation, les atteintes de l’os et du cartilage ainsi que la douleur, caractéristiques de l’arthrose, est un enjeu majeur de santé publique alors que le vieillissement de la population ne fait qu’augmenter. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques dans un modèle d’arthrose chez le rat. Ce modèle est obtenu par injection de produit chimique directement dans le genou de l’animal, et permet le développement d’un modèle dont les signes cliniques sont proches de ceux observés chez l’humain. L’objectif du projet est d’évaluer la capacité de principes actifs à limiter la dégradation du cartilage et/ou régénérer le cartilage dégradé dans un modèle d’arthrose chez le rat, ou contrôler la réponse inflammatoire liée à la pathologie. Grâce à ce projet, différents principes actifs, à différentes concentrations, ou voies d’administration pourront être évaluées. En fonction du nombre d’animaux par groupe, de 30 à 50 conditions différentes pourront être évaluées avec le nombre d’animaux inclus dans ce projet.

Bénéfices attendus

Chaque étude réalisée au sein de cette procédure permettra de générer des informations sur l’efficacité de nouveaux principes actifs testés, tant sur l’inflammation que sur la reconstitution du cartilage ou le ralentissement de l’apparition des lésions dans un modèle d’arthrose induit par injection chimique. A plus long terme, ce projet permettra d’obtenir des données importantes dans le cadre du développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de l’arthrose chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection intra-articulaire pour l’induction du modèle réalisée sous anesthésie. Cette opération dure 10 min par animal, et la prise en charge anti-douleur s’étale les jours suivants l’opération. Les traitements seront réalisés et/ou après l’induction du modèle par voie orale ou par injection dans l’articulation, en intra-veineuse, sous la peau, ou dans le ventre de l’animal, et répétés tout au long de la procédure pendant 4 semaines maximum. Des prélèvements sanguins pourront également être réalisés. Ces prélèvements auront lieu sur animal sans anesthésie, et dureront moins de 5 min par animal. Ils pourront être répétés une fois par semaine tout au long du protocole.

Impact sur les animaux

L’induction du modèle peut s’accompagner d’une possible réaction inflammatoire transitoire au niveau de l’articulation. De la même manière, l’apparition progressive des lésions arthrosiques est susceptible d’entrainer gène ou douleur. Les effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être un traumatisme exprimé par des cris/agitation pendant l’administration du traitement, ou le prélèvement de sang, une inflammation au niveau du site d’injection, un œdème articulaire ou une boiterie. Pour prévenir ces différents cas de figure, les animaux seront suivis avec précaution et des grilles d’évaluation clinique associée aux conduites à tenir en cas d’observation de ces signes ont été prévues.

Devenir

A l’issue de chaque protocole tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les articulations, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour évaluer les modifications de différents marqueurs induits par les traitements. Les organes et articulations prélevés seront utilisés pour réaliser des analyses histologiques, histopathologiques et/ou d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les principes actifs que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, dans le cadre des pathologies comme l’arthrose, il est pour le moment impossible de reproduire in vitro les mécanismes de l’articulation à l’origine de l’apparition des lésions. De la même façon, les interactions entre les différentes cellules et tissus composants l’articulation ne peuvent être mimées par un modèle simple de culture cellulaire. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de cette procédure.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux produits, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. L’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données d’études similaires, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu dans le cas où le traitement évalué est connu (par exemple : traitement de référence utilisé comme comparateur), et après analyse des résultats d’études préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente). Lors des prélèvements sanguins et des traitements, nous utiliserons un anesthésique, et des antalgiques dès l’apparition des premiers signes cliniques. Lors des traitements expérimentaux et lors des prises de mesures, nous maintiendrons les animaux dans une situation d’inconfort et de douleur pendant un minimum de temps. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine minimum. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus tôt possible au moment des suivis et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera pris en charge ou euthanasié.

Choix des espèces

Il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer les lésions ostéoarticulaires. L’animal demeure indispensable à l’évaluation de produits. De plus le modèle d’arthrose chez le rat, utilisé depuis de nombreuses années, est maintenant reconnu pour être un modèle très prédictif pour la recherche médicale humaine et vétérinaire. En effet, le rat est l’espèce mammifère dont les caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires sont proches de celles observées chez l'homme. Le rat, est fréquemment utilisé à des fins de recherche, car les résultats de produits thérapeutiques sont facilement transposables à l'homme, par simple approche/méthode statistique. La taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques analysables. Enfin, le rat est préféré à la souris pour l’étude de lésions cartilagineuses car le cartilage est plus épais et les effets de la pathologie chez le rat s’approchent de la pathologie humaine. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté au schéma thérapeutique des traitements étudiés. Bien que les pathologies rhumatiques puissent toucher des patients à n’importe quel âge, chez les rongeurs, la modélisation de ces maladies donne des résultats plus homogènes avec des rats adultes âgés de 8 à 10 semaines au début du protocole.

Vingt-et-une prises de sang par animal, à la queue et à la mâchoire, s'ajoutent à une greffe chirurgicale d'îlots pancréatiques de vingt à trente minutes. 15 souris humanisées vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un diabète leur est provoqué par deux injections avant la greffe, et le porteur retient parmi les risques une mauvaise cicatrisation, un saignement ou une infection du site greffé. Cette étude pilote sur quinze animaux doit poser les bases d'une thérapie cellulaire "virtuellement sans limitation" pour le diabète de type 1, perspective renvoyée à des travaux ultérieurs.

Objectifs

Le diabète de type 1 est une maladie où le système immunitaire attaque par erreur les cellules du pancréas qui produisent l’insuline, une hormone essentielle pour réguler le sucre dans le sang. Cela entraîne un manque d’insuline et une augmentation du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Pour traiter cette maladie, les patients reçoivent généralement des injections régulières d’insuline, mais cela peut causer des effets secondaires comme des hypoglycémies ou une prise de poids. Des thérapies plus avancées, comme la greffe de cellules pancréatiques provenant de donneurs décédés, ont montré des résultats prometteurs. Cependant, elles sont limitées par la rareté des donneurs et nécessitent des médicaments pour éviter le rejet par le système immunitaire, ce qui peut augmenter les risques d’infections. Une alternative en développement consiste à utiliser des cellules souches modifiées pour produire de l’insuline. Ces cellules peuvent être fabriquées en grande quantité, mais elles nécessitent encore des traitements pour empêcher leur rejet par le corps. L'objective de ce projet vise à poser les bases pour une nouvelle approche, testée sur des souris avec un système immunitaire humain, utilisant des celules ces cellules souches génétiquement modfiées pour qu’elles soient mieux tolérées par le système immunitaire. Cette méthode pourrait offrir une solution innovante pour traiter durablement le diabète de type 1.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet fourniront les bases pour un approche de thérapie cellulaire allogénique pour le diabète de type I virtuellement sans limitation d’îlots disponible à la greffe et avec une meilleure efficacité par rapport au protocoles actuels. En plus, cette nouvelle méthode pourrait être adaptée pour générer cellules thérapeutiques universelles dans de nombreux domaines comme la médecine régénérative ou l'oncologie en utilisant de différents types cellulaires comme les cellules souches, les lymphocytes, les fibroblastes. Grâce à cela, de nombreux patients pourrait recevoir des « cellules-médicaments » bien plus efficaces et plus faciles à produire à grande échelle. La thérapie cellulaire pour bien d’autres maladies pourrait donc également avoir bénéfice de nos résultats

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivantes: - 2 injections intrapéritonéales à 1 semaine d’intervalle. - 7 prises de sang (queue) pour valider l’induction du diabète. - 1 procédure chirurgicale sous anesthésie (20-30 minutes). - 7 prises de sang (queue) à 4 moments (Semaines 2, 4, 6 et 8), sur une durée de 4 heures (10-15 secondes par prise). - 7 prises de sang submandibulaires aux jours 0, 1, 3, puis aux Semaines 1, 3, 6 et 8 (10-15 secondes par prise). Les prises de sang des points 4 et 5 servent également au suivi hebdomadaire de la glycémie.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances possibles sont associé à la procédure chirurgicale, qui est classée comme sévère. Elles incluent des complications inattendues lors de la chirurgie, ainsi qu’une mauvaise cicatrisation post-operatioire, un saignement ou une infection au niveau du site de la greffe. Des nuisances légères pourraient engendrer du stress chez la souris lors des manipulations manuelles, des prélèvements ou des injections.

Devenir

À la fin des la procedure, les souris seront mises a mort pour prélever le foie effectuer les analyses histologiques pour évaluer la taille et la qualité des îlots greffés, ainsi que la récupération métabolique de l’animal (histologie, contenu en triglycérides et en glycogène).

Remplacement

Des études préliminaires sur îlots produits en vitro ont étés menés pour valider la capacité de notre protocole à générer des ilots humaines fonctionnels. Néanmoins, aucune méthode alternative au modèle in vivo n’est disponible pour aller plus loin dans notre étude et évaluer l’efficacité de notre protocole à inhiber le rejet allogénique.

Réduction

Les études d'optimisation in vitro nous ont permis de réduire le nombre de souris nécessaire pour les procédures chirurgicales. Ce projet pilote vise à évaluer sur un petit nombre de souris la faisabilité de la procédure, avant de s’engager dans un nombre plus important d’animaux qui pourrait se révéler non optimale.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, des mesures de raffinement seront mises en œuvre pour minimiser la douleur, la souffrance et le stress des animaux, notamment par l’utilisation systématique d’analgésiques et d’anesthésiques adaptés, la surveillance accrue des animaux avec des points limites spécifiques, ainsi que par l’enrichissement de leur environnement pour favoriser leur bien-être physique et social.

Choix des espèces

Aucune méthode en laboratoire ou modèle alternatif ne peut reproduire la complexité du système immunitaire humain. Pour avancer dans cette étude, un modèle de souris humanisées sont utilisées. Ces souris permettent d’étudier, en conditions réelles (in vivo), les interactions entre le système immunitaire humain et des îlots pancréatiques dérivés de cellules souches humaines. Ce modèle est bien maîtrisé, avec des protocoles établis et des outils d’analyse disponibles. Les souris seront immunisées directement par le fournisseur. Elles seront livrées à l’âge de 16 semaines (intervalle 13-18 semaines), après validation. Elles seront utilisées rapidement après leur arrivée en animalerie.