Procédures sévères

966 rats et 924 souris vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant d'abord une contusion ou une laminectomie de la moelle épinière cervicale de moins de quarante minutes. La lésion paralyse d'un côté les pattes avant et arrière et coupe la conduction nerveuse vers l'hémidiaphragme correspondant, réduisant la capacité respiratoire de l'animal. Suivent, cinq fois par semaine pendant deux à trois semaines, des séances de stimulation musculaire de trente minutes sous anesthésie et de stimulation médullaire de dix minutes sur animal éveillé, plus des injections sous-cutanées et l'injection d'un matériau végétal dans la moelle. Tous sont tués pour analyses histologiques, le porteur situant son objectif au stade de la preuve de concept tout en écrivant que "trouver une solution est indispensable" pour les patients dépendants d'un respirateur.

Objectifs

Chaque année, près de 500 000 personnes dans le monde subissent des lésions de la moelle épinière, que ce soit à la suite d'un accident ou d'une autre cause. La plupart de ces blessures touchent la région cervicale, ce qui entraîne non seulement une paralysie des muscles, mais aussi une réduction importante de la capacité pulmonaire, ce qui peut entraîner des difficultés respiratoires graves. De nombreuses personnes tétraplégiques (paralysées des quatre membres) ont besoin d’une assistance respiratoire, parfois à vie, ce qui a un fort impact sur leur qualité de vie et sur la société en général. Nos recherches visent à trouver des solutions alternatives à l’utilisation permanente de la ventilation mécanique. Dans ce cadre, nous travaillons sur des stratégies de réparation des réseaux neuronaux et des fonctions musculaires, en combinant des approches de stimulation neuromusculaire et nerveuse et des agents pharmacologiques. Pour tester nos idées, nous utilisons des modèles animaux bien établis dans la recherche scientifique. L'objectif de notre projet est de combiner ces différentes techniques pour maximiser la réparation après une lésion de la moelle épinière. Nous utilisons principalement des souris et des rats pour nos expérimentations, car ce sont des modèles qui ont fait leurs preuves. Par exemple, nous provoquons une lésion de la moelle épinière au niveau du cou, ce qui entraîne une paralysie des muscles respiratoires et des membres d’un côté (atteinte unilatérale). Cependant, ces animaux gardent une certaine capacité à respirer et à bouger, car certains circuits nerveux restent intacts. Enfin, nous avons pour objectif de tester de nouvelles techniques de réparation en combinant la stimulation neuromusculaire et l’ingénierie tissulaire. Nous veillons à respecter les principes éthiques de la recherche, notamment la règle des 3R : Remplacer, Réduire et Raffiner l'utilisation des animaux dans les expériences

Bénéfices attendus

Notre objectif ultime est d’apporter des preuves de concept de la récupération de l’activité ventilatoire partielle ou totale après une lésion médullaire cervicale, et ce par la combinaison d’approches thérapeutiques. De plus, nous attendons un effet de ces thérapeutiques sur la récupération de l'utilisation de membres supérieurs par les memes phénomènes de neuroplasticité induit par nos approches. Par ailleurs, nous poursuivrons notre processus de valorisation et d’interaction avec des cliniciens vers une perspective clinique, pour aboutir à des solutions transposables, réalisables et convaincantes pour leur application en clinique. Notre projet de recherche préclinique visera à démontrer qu’il est possible de réactiver et de soutenir la plasticité du système nerveux central (ici la moelle épinière), même dans les conditions les plus toxiques et néfastes de la lésion traumatique de la moelle épinière. Notre motivation dans cette thématique et qu’aujourd’hui aucune solution thérapeutique curative n’est disponible en routine clinique pour favoriser significativement la récupération médullaire chez les patients paralysés. Certains patients restent dépendants à vie d’un respirateur, les coupant d’une vie sociale et des centres de rééducation, et diminuant par conséquent leur espérance de vie. Trouver une solution est indispensable.

Procédures

Tous les animaux subiront une chirurgie qui consiste en une contusion ou une laminectomie (durée inferieure à 40 min) réalisée sous anesthésie et analgésie. Il s’agit du modèle de référence pour simuler une lésion de la moelle épinière qui est l’objet du projet de recherche. Par la suite les animaux seront impliqués dans différents traitements seuls ou combinés tels que la stimulation des muscle (30 min, 5 fois par semaine pendant 2 à 3 semaines sous anesthésie), la stimulation de la moelle épinière (10 min, 5 fois par semaine pendant 2 à 3 semaines, animal vigile), l’agent pharmacologique par voie sous-cutanée (injection de quelques secondes, 5 fois par semaine pendant 2 semaines, animal vigile), ou encore de l’ingénierie tissulaire (une injection unique sous anesthésie et analgésie). Ce dernier consiste en une injection d’un matériau végétal visant la régénération de la moelle épinière. Tous les animaux seront également impliqués dans des tests fonctionnels (déplacements libres dans un cylindre ou un espace libre mais restreint, filmé pendant 5 à 10min, à raison d’une fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les nuisances principales attendues sur les animaux sont celles induites par la chirurgie de lésion médullaire. Lors de l’anesthésie, il y a un risque d’hypothermie et de douleur au réveil. La lésion entraine également un inconfort dû à la perte sensori-motrice des pattes postérieures et antérieures correspondant au côté lésé, ainsi qu’une réduction de la capacité respiratoire liée à l’atteinte de la conduction nerveuse vers l’hémi diaphragme correspondant au côté lésé de la moelle épinière. Ces atteintes sont cependant unilatérales, de fait qu’elle permette à l’animal de se mouvoir, de se nourrir et de respirer mais cela peut entrainer un inconfort du fait de ne pas se mouvoir complètement librement. Une hypoventilation (diminution du volume respiratoire) est possible les premiers jours mais compensée par une augmentation de la fréquence respiratoire. Il peut aussi exister un risque de soif et de malnutrition si les animaux n’arrivent pas à se nourrir et boire suffisamment les jours après la chirurgie. Les injections par voie sous-cutanée sont faites sans anesthésie donc cela peut entrainer un stress au moment de la préhension. Lors des tests fonctionnels, les animaux pourront ressentir du stress lié à la découverte d’un nouvel environnement et à la limitation de leur liberté d’expression physique pour les tests en enceinte de taille restreinte. Enfin, les traitements n’entrainent pas d’effets secondaires connus mais ils peuvent engendrer un stress lors de la préhension et du positionnement dans un environnement limité (notamment pour s’assurer que l’animal est bien dans le champ de la stimulation par exemple).

Devenir

Chaque animal sera euthanasié à l’issue de leur procédure, afin de réaliser des études histologiques et biochimiques sur les prélèvements post-mortem. Ces analyses constituent une part importante des projets sur lesquels nous travaillons, auxquelles les méthodes alternatives ne répondent pas.

Remplacement

À l'heure actuelle, il n'y a pas de modèle expérimental clinique autre que les sujets humains ou animaux pour étudier les réponses physiologiques intégrées. Ce projet a pour but de développer des preuves de concept de réparation d’une neuropathologie pour laquelle aucune thérapie n’est proposée aux patients. Nous ne serions pas en mesure d'effectuer les manipulations nécessaires chez l'homme (par exemple, une intervention pharmacologique dans les systèmes de neurotransmetteurs, des tests neurochimiques, des prélèvements de moëlle épinière), et nous devons donc recourir à l'expérimentation sur les espèces de mammifères non humains. Les connectivités neuronales de ces systèmes intégrés nécessaires pour mener "des études de modélisation" ne sont pas disponibles, ou encore, aucun comportement suite à un traitement innovant ne peut être prédit, et il n'existe actuellement aucun substitut à l'expérimentation animale. Les concepts qui ont guidé cette recherche sont nouveaux dans le domaine et, à ce titre, doivent être soigneusement étudiés dans des situations biologiquement significatives.

Réduction

Dans ce projet, le nombre total d’animaux impliqués sera de 1890. Les mêmes animaux sont utilisés pour diverses études (fonction, biochimie, anatomie). Nous analysons plusieurs paramètres sur un même animal, la localisation ou l'expression de certains antigènes en immunohistochimie. Les données sont comparées avec des tests statistiques adaptés et la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Il nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés avec un cycle jour/nuit adapté et avec la boisson et la nourriture ad libitum. Toutes les chirurgies sont effectuées sous anesthésie et analgésique. Les animaux auront bénéficié d’une acclimatation après réception pendant 1 à 2 semaines. Les animaux sont maintenus de 2 à 4 par cage après la chirurgie pour conserver les liens sociaux et hiérarchiques dans la cage. Ils sont regroupés au plus tard lendemain de la chirurgie pour limiter la période d’isolement. Ils sont réhydratés en post-opératoire avec une injection sous-cutanée de sérum physiologique et nous utilisation de plaques chauffantes au cours et après l’anesthésie, jusqu’à 2h après le réveil (période de surveillance post-chirurgicale). Un enrichissement adapté pour chaque espèce de rongeur (ajout de briques en bois pour les rats et nid végétal pour les souris) est placé dans la cage. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien par une personne formée et compétente. Nous réalisons un changement de la litière deux fois par semaine et une surveillance des animaux tous les jours (prise en compte du comportement et des expressions faciales des animaux), ainsi qu’un traitement si présence de plaies (pommade grasse si eczéma ou irritation...) Ces contrôles enregistrés et validés par la structure locale chargée du Bien Être des Animaux, permettent de repérer tout animal malade ou blessé et de prendre les mesures appropriées. Les points limites sont définis et les méthodes seront mises en place pour supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux comme l’injection d’antalgiques ou l’euthanasie. Par ailleurs, nous continuons à poursuivre des formations de mise à jour pour appliquer au mieux la réglementation et d’avoir l’opportunité d’introduire des améliorations pout le meilleur raffinement possible en le validant en amont par notre structure locale chargée du Bien Être des Animaux et en interagissant avec le vétérinaire référant.

Choix des espèces

Rats et souris sont les animaux d’expérimentation les plus utilisés dans la recherche préclinique sur le traumatisme du système nerveux, afin d’améliorer la connaissance de la physiopathologie et développer des stratégies thérapeutiques adaptées. Malgré des différences entre l’homme et les rongeurs, les changements pathologiques, la réponse inflammatoire et l’expression des gènes précoces post-traumatiques sont les mêmes. L’induction du trauma est très reproductible et standardisée chez la souris et le rat et de nombreux tests sensorimoteurs ont été très bien établis. Les outils disponibles sont multiples et permettent de caractériser l’évolution d’une lésion (notamment par immunomarquages). Malgré l’absence de formation de cavités chez la souris (présente chez l’homme et le rat), elle permet de démontrer la fonction d’un gène spécifique grâce à la transgénèse et les caractéristiques moléculaires, cellulaires et fonctionnelles post-traumatiques y sont comparables. Chez le mammifère, l’incapacité d’un neurone à régénérer son axone après une lésion mécanique est essentiellement notée à l’âge adulte. Ainsi nos expériences seront réalisées chez la souris et le rat adultes âgés de 6 à 7 semaines, soit en moyenne 20 à 30g et 250-300g, respectivement. A noter que les lésions arrivent en grande majorité sur des jeunes adultes.

64 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie de trente minutes réduit leur fonction rénale, puis un régime enrichi en phosphate et en vitamine D calcifie leurs artères, les traitements étant incorporés à la nourriture cinq jours sur sept pendant quatre semaines. L'incision ventrale est décrite comme une nuisance sévère avec mobilité réduite pendant vingt-quatre heures, suivie d'une perte de poids d'environ 10 %. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" et que l'interaction entre rein, cœur, vaisseaux et cerveau est "nécessaire", tout en indiquant que des résultats prometteurs sur la molécule ont déjà été obtenus sur des artères de souris et de patients cultivées hors de l'organisme.

Objectifs

Environ 850 millions de personnes sont atteintes d'insuffisance rénale chronique dans le monde (≈ 11 % de la population). La mortalité due à cette maladie augmente et devrait devenir la 5ème cause mondiale de décès d'ici 2040. Cela est en partie dû à une augmentation de la calcification vasculaire chez les patients. La calcification vasculaire est définie par l’accumulation de cristaux de phosphate de calcium dans les vaisseaux sanguins, ce qui les rend rigides, augmente la pression artérielle et fatigue le cœur. On manque encore de thérapies pour lutter contre la calcification vasculaire. Une nouvelle classe de médicaments, les gliflozines, a été utilisée pour lutter contre le diabète de type 2 ces dernières années. Il a été montré qu’en plus de leur action anti-diabète, ces composés induisent une protection des vaisseaux sanguins. Des résultats préliminaires suggèrent qu’une des gliflozines en particulier pourrait permettre de lutter contre la calcification vasculaire. Le projet a pour but de valider le potentiel thérapeutique de ce composé d’intérêt dans un modèle mimant fidèlement la maladie humaine : le rat avec réduction de fonction rénale et calcification vasculaire induite par un régime riche en phosphate et vitamine D. Ce modèle présente une hypertension artérielle et des atteintes cardiaques qui permettront d’évaluer la protection cardiovasculaire procurée par le composé. Le mode d’action du composé sera étudié en détail. On vérifiera également que ce composé agit en présence du principal médicament déjà utilisé chez les patients atteints d’insuffisance rénale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice principal du projet est de démontrer à court terme que la molécule d’intérêt étudiée peut permettre le traitement des patients insuffisant rénaux présentant une calcification vasculaire. Les résultats doivent venir valider et approfondir ceux précédemment obtenus dans des modèles in vitro. Le mécanisme d’action du composé étudié est encore mal compris et il semble posséder des cibles non-identifiées. Explorer ces voies d’action alternatives dans un modèle proche de la maladie humaine permettra d’approfondir notre compréhension de l’action de ces composés. Le projet inclus un groupe traité avec un médicament déjà très couramment utilisé chez les patients pour être au plus proche des « conditions cliniques » et avoir de plus grandes chances que les résultats obtenus chez les rats puissent être reproduits chez l’humain. De plus, nous utiliserons une stratégie unique, basée sur l’analyse de certaines protéines urinaires similairement modifiées dans le modèle animal et chez les patients (dit marqueurs « humanisés »), pour mieux déterminer si le traitement peut fonctionner chez les patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse. La chirurgie dure environ 30 minutes et a pour but de réduire la fonction rénale pour mimer l'insuffisance rénale chronique humaine. Des analgésiques puissants seront utilisés pendant la chirurgie et la couverture analgésique sera maintenue pendant la période post-opératoire (48h minimum). Un prélèvement de sang aura lieu au cours du projet, 8 semaines après le début du protocole et avant les traitements. Ce prélèvement (0,5 ml) sera effectué à la veine de la queue suite à l’anesthésie gazeuse des animaux. La fonction rénale des animaux sera évaluée à la fin du projet à l’aide d’un dispositif miniature. Ce dernier permet de mesurer à travers la peau l’élimination par le rein d’une substance fluorescente injectée en intraveineux sous anesthésie gazeuse. Les mesures sont effectuées pendant 2h sur les rats éveillés, libres de leur mouvement. Les traitements seront administrés 5 jours sur 7 pendant 4 semaines dans la nourriture des animaux (boulettes contenant les produits à tester). L’induction de la calcification vasculaire sera aussi effectuée lors de cette étape par une supplémentation en vitamine D. Les rats sont placés dans des cages individuelles en présence de la boulette de nourriture (contenant la vitamine D et les traitements) et remis en groupe une fois qu’ils l’ont mangée (évite les gavages). A la fin du protocole, la pression artérielle des rats sera mesurée sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésie. Cette partie de la procédure est sans réveil et les rats anesthésiés seront ensuite euthanasiés chimiquement.

Impact sur les animaux

La chirurgie sur le rein peut induire de la douleur pour les animaux. L’incision ventrale lors de la chirurgie induit une nuisance sévère et une mobilité réduite des rats pendant 24h. Dans les jours suivants la chirurgie une perte de poids (environ 10 %) transitoire peut être observée (nuisance modérée). Un prélèvement de sang, effectué sur des rats anesthésiés, peut entrainer un léger stress. De même, lors de la mesure des fonctions rénales, l’injection intraveineuse d’un produit fluorescent sur les animaux anesthésiés représente une nuisance légère. L'utilisation de phosphate et de vitamine D peut arrêter la prise de poids chez les animaux ayant les plus faibles fonctions rénales (stress léger).

Devenir

les rats anesthésiés seront mis à mort pour prélèvement des organes

Remplacement

Le modèle animal est indispensable à cette étude pour induire une insuffisance rénale chronique et la calcification vasculaire qui est observée chez les patients. L'interaction entre différents organes (rein, cœur, vaisseaux sanguins, cerveau …) est nécessaire afin de représenter la maladie humaine. L’effet principal de la calcification vasculaire est l’augmentation de la pression artérielle qui va induire des atteintes cardiaques et rénales. Les artères sont soumises au flux sanguin les exposant à des composés toxiques lors de l’insuffisance rénale chronique et la calcification vasculaire s’accompagne d’un changement de la structure des artères. Cette situation ne peut être reproduite de façon réaliste que chez l’animal. Des résultats prometteurs concernant la molécule d’intérêt comme inhibiteur de la calcification vasculaire ont été obtenus dans plusieurs modèles in vitro et ex vivo (culture d'explants provenant d'artères de souris et de patients). Les expériences chez l’animal seront aussi complétées par des analyses sur culture cellulaire afin de mieux comprendre et décrire l’action de la molécule d’intérêt.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux par groupe a été déterminé en prenant en compte la variance que l’on s’attend à observer lors de la mesure de la calcification vasculaire dans le modèle. Ce nombre doit nous permettre de mettre en évidence une différence statistique si l’effet protecteur du composé testé se confirme. Si une faible mortalité est observée au cours du projet, le nombre total d’animaux utilisés sera revu à la baisse. Il a été choisi de focaliser l’étude uniquement sur les rats mâles car le modèle est beaucoup mieux décrit chez ce sexe, alors que la femelle présente une résistance à l’insuffisance rénale et à la calcification vasculaire, suite à l’action des hormones féminines. Inclure les deux sexes dès le départ du projet aurait nécessité d’utiliser un plus grand nombre d’animaux. Les possibilités de transposer les résultats obtenus à l’humain seront maximisés grâce à la présence d’un groupe traité avec la thérapie classique utilisée en clinique et l’études de protéines urinaires communes au rat et à l’humain. De nombreuses données seront obtenues comme la mesure des fonctions rénales et l’analyse de protéines sanguines et urinaires à plusieurs moments de l’expérience. Le test de 5 groupes en parallèle permet d’éviter de devoir répéter les groupes non traités plusieurs fois. De nombreux tissus seront prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe et avec des équipes partenaires (rein, cœur, sang, artères, urine et fèces, muscles du mollet, tibias, cerveau, foie et gras). Au total, le projet nécessitera 64 rats au maximum.

Raffinement

La chirurgie de réduction de masse rénale est réalisée sous anesthésie générale gazeuse en une seule étape, ce qui évite d’avoir à opérer 2 fois les animaux (autre technique souvent utilisée). L’utilisation d’analgésiques puissants lors de la chirurgie et pendant 48h suite à l’opération permet de limiter le plus possible la douleur induite par cette procédure. Lors de cette étape et durant tout le projet, les effets indésirables sur le bien-être des animaux seront surveillés par l’utilisation d’une grille de score et la mise en place de points limites adaptés. Les instruments sont stérilisés entre chaque opération pour éviter les infections. Un protecteur oculaire (gel) sera utilisé pour prévenir la sécheresse des yeux des rats pendant la chirurgie. Les rats sont placés en cage individuelle brièvementt suite à la chirurgie afin de mieux les surveiller et favoriser leur récupération. Les animaux seront surveillés quotidiennement (activité, cicatrisation) pendant la semaine post-opération et de la nourriture hydratée sera placée dans le fond des cages afin de favoriser leur prise alimentaire. Les traitements seront incorporés dans la nourriture (après entrainement d’une semaine) ce qui permet d’éviter le stress et les possibles lésions de la trachée induites par la réalisation quotidienne de gavage. Cela évite aussi l’utilisation de solvants nécessaires à la dissolution de certains composés testés et pouvant présenter une toxicité.

Choix des espèces

Le rat est un animal dont la fonction rénale et les pathologies associées sont très proches de celles de l’humain. Par rapport à la souris, le rat permet de mieux mimer l’insuffisance rénale humaine et d’étudier des modifications cardiovasculaires de par sa plus grande taille. Le modèle chez le rat est bien connu, de nombreuses données sont disponibles ainsi que de nombreux outils pour analyser les tissus chez cette espèce. Les rats sont réceptionnés à l'âge de 7 semaines (200-225g) et leur fonction rénale est réduite à l’âge de 8 semaines. A cet âge les animaux viennent d’atteindre leur maturité sexuelle (stade jeune adulte). La réduction de fonction rénale à ce stade « jeune » permet d’obtenir une insuffisance rénale qui mime bien la maladie humaine. Les rats suivront ensuite des traitements en même temps que l’induction de la calcification entre leur 16ème et 20ème semaine de vie (stade adulte). Agés de 16 semaines après la chirurgie de réduction de masse rénale réalisée à 8 semaines, les rats présentent une pathologie bien installée et qui devrait être reproductible entre les animaux.

512 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées par injection létale pour le prélèvement du sang, des tissus et des organes. Chacune est tondue, opérée sous anesthésie gazeuse pour l'implantation d'un dispositif, puis subit une douleur que le porteur qualifie lui-même de significative pendant les vingt-quatre premières heures, des réouvertures de cicatrice pour l'administration des molécules et jusqu'à quatre micro-incisions du bout de la queue par semaine pour les prises de sang. L'objet est de comparer, pour une société développant des vecteurs qui acheminent des médicaments vers le système nerveux central, une perfusion intrathécale de vingt-quatre heures à une injection unique. Le porteur écrit que le recours à l'animal est "indispensable" faute de modèle prédictif, et que ce même recours constitue "le principal désavantage" de sa demande.

Objectifs

Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et développer une stratégie de vectorisation innovante, afin de proposer de l’adressage spécifique de médicaments au niveau du système nerveux central après administration intraveineuse ou sous-cutanée. Ce transport est réalisé à l’aide de protéines ou peptides cargos (vecteurs) qui ciblent spécifiquement les récepteurs membranaires situés aux niveaux des barrières cellulaires de l’organisme, entre sang et tissus, dans notre cas, la barrière Hématoencéphalique du cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières collaborations internationales ont démontré tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements contre certaines neuropathies. Cet engouement a également permis de développer de nouveaux axes de recherches, notamment sur certaines maladies rares (Myopathies, lysosomales) ou encore chroniques liées à l’hygiène de vie (Cancers, Diabètes, obésités), devenues le fléau de ces 20 dernières années. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’adressage et l’effet de certains traitements. Par diverses optimisations galéniques, Il s’agira de contourner les problématiques de demi-vie sanguine (élimination, stabilité, immunité) et de démontrer l’apport de systèmes implantatoires à délivrances prolongées et maîtrisées. Nous pourrons ainsi proposer de meilleurs pharmacologies, optimisées pour le traitement de pathologies plus complexes ou sans traitements efficaces. Dans ce projet nous chercherons donc à démontrer au niveau intrathécale (c'est à dire dans le liquide méningé de la Moelle épinière et du cerveau) les effets bénéfiques d'une infusion sur 24 heures de nos molécules par rapport à une simple injection standard. A terme, une fois le schéma validé, nous chercherons à réduire les doses, tout en gardant la même efficacité pharmacologique.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons tester le potentiel d’action de nos vecteurs sur des administrations prolongées. Nous pourrons ainsi rechercher de meilleurs effets pharmacologiques pour de meilleures perspectives thérapeutiques. La modulation dans le temps et la réduction des concentrations médicamenteuses sont également des paramètres non négligeables lorsqu’il s’agit de molécules présentant certains effets secondaires, notamment lors de traitements à fortes doses efficaces. De plus, en proposant une administration en intrathécale, nous chercherons à mettre en place une voie d’administration directement transposable à l’homme, voie qui est de plus en plus utilisée pour le développement de traitements contre les neuropathies, notamment par l’administration de molécules complexes ou qui ne passent pas bien la Barrière Hématoencéphalique du cerveau.

Procédures

-Tonte des animaux : Sur animal anesthésié, une seule fois (durée 30 secondes). -Injection anti-douleur pré-opératoire : Sur animal vigile, une fois, durée quelques secondes sur animal éveillé (10 secondes). -Chirurgie implantatoire : Sous Anesthésie gazeuse, une seule fois (Induction anesthésie 3 minutes, stabilisation et maintien 15 minutes). - Réveil : Avant réveil, injection d’un antidouleur (Une fois, quelques secondes). -Suivi post-opératoire : Sur animal vigile, injection d’un antidouleur longue durée (minimum 3 fois), une toutes les 24h pendant 72h (ou plus si besoin), (Durée injection quelques secondes). - Administration des molécules : Sur animal anesthésié, en une seule fois (durée bolus ou pose pompe ALZET 30 secondes). - Prélèvements sanguins intermédiaires : Sur animaux vigiles (≤2min), une seule fois/24h et maximum 4 fois/semaine. - Mise à mort (Point final étude) : Sur animal vigile, administration rapide d’une dose létale anesthésique (quelques secondes).

Impact sur les animaux

Dans ce projet nous chercherons à limiter au maximum le stress induit aux animaux. Les possibles sources de stress, angoisse et/ou douleurs sont ici listées. -TRANSPORT ET ADAPTATION : Sources stress et angoisse non négligeable due au transport -TONTE : Stress et angoisse notables (quelques secondes) le temps de l’induction à l’anesthésie et lors du réveil, mais pas de douleur. - ANTALGIE PRE-OPERATOIRE : Stress et angoisse notables (30 secondes) lors de la contention manuelle et douleur transitoire (légère et rapide) lors de l’injection et pénétration cutanée de l’aiguille. - CHIRURGIE IMPLANTATOIRE : Rapide stress et présence d’angoisse (quelques secondes) le temps d’induction à l’anesthésie, douleur significative lors de la chirurgie, se poursuivant après le réveil. - SUIVI POST-OPERATOIRE : Douleur significative les 24 premières heures. Stress et angoisse non négligeables à l’administration de l’anti-douleur (30 secondes) lors de la contention manuelle, et douleur transitoire (légère et rapide) lors de l’injection et pénétration cutanée de l’aiguille. - ADMINISTRATIONS DES MOLECULES : Stress et angoisse notables (quelques secondes) le temps de l’induction à l’anesthésie et douleur non significative à la réouverture de la cicatrice au niveau cutanée. Douleur notable au réveil et lors de l’injection de l’anti-douleur (pénétration aiguille à travers la peau). - PRELEVEMENTS SANGUINS INTERMEDIAIRES : Stress et angoisse transitoire lors de la mise en contention (≤10 secondes), puis douleur notable lors de la micro-incision de l’extrémité de la queue pour réaliser le prélèvement sanguin (quelques secondes). - MISE A MORT (en fin d’incubation) : Léger stress (30 secondes) lors de la contention manuelle et douleur notable (légère et rapide) lors de l’injection par la pénétration cutanée de l’aiguille.

Devenir

Dans les deux procédures de cette demande, les animaux seront tous mis à mort en point final de l'étude afin de collecter en post-mortem le sang total, les tissus et organes d’intérêts.

Remplacement

Afin de mener à bien notre projet, nous n’utiliserons que nos vecteurs préalablement investigués et validés sur des études in vitro (sur cellules) et in vivo sur de récents suivis pharmacocinétiques et de biodistributions. Ces premières séries de tests amonts ont notamment permis de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cibles, mais restaient insuffisantes pour prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations). Afin de développer notre modèle pour de l’infusion médicamenteuse au niveau intrathécale, nous devrons absolument envisager de réaliser nos études sur le petit animal de laboratoire, ici le rongeur (souris). Le choix du modèle rongeur se justifie comme étant pour l’heure le 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’Homme pour l’étude des mécanismes physiologiques, sans trop de contraintes d’hébergement, ni de manipulations. Son utilisation sous forme de faibles cohortes permet d’exploiter au maximum les résultats par l’obtention de données statistiques significatives. Malheureusement, il n’existe pour le moment aucun modèle prédictif de bio-informatique associant l’ensemble des mécanismes physiologiques, capable d'apporter toutes ces réponses ou suffisamment complexe et informel, tel que les organoïdes ou sphéroïdes. Dans notre cas, le principal désavantage de cette demande reste donc le recours indispensable à l’utilisation d’animaux. Il s’agit maintenant de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus à utiliser.

Réduction

La totalité des animaux (n=512) sera implantée en début de chaque procédure, soit pour une administration par bolus ou par une infusion longue durée (autonome). Réalisation de groupes de n=4 individus par test (1 cage de 2 mâles/1 cage de 2 femelles), à raison de 4 tests par étude et 4 études par an, ce qui représente 64 individus/an et par procédure. Ce qui représente pour la voie bolus, 64 individus par an, soit 256 sur 4 ans et pour l’infusion, également 64 individus par an, soit 256 sur 4 ans. Par soucis de comparaisons à l’historique des différentes pharmacocinétiques, nous poursuivrons nos expérimentations sur la même lignée de souris. Ce modèle sera également utilisé par la suite, pour humaniser la cible, en vue d’une transposition de nos tests à l’Homme. Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). Pour une analyse statistique, le « n=4 » sera suffisant et nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. Nous pourrons réaliser un équivalent du test d’homogénéité entre groupes ou encore une analyse de variance. En fin de procédure, une liste ciblée des tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile d’animaux. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires, permet d'obtenir des données précieuses sur le passage systémique de nos candidats, en plus du prélèvement en point final, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 7 jours dès réception. 2 jours avant les administrations, les animaux seront sortis de l’hébergement conventionnel pour aller dans une autre pièce également cyclée (12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle à filtre), un maximum de 2 individus par cage (car groupes n=4 mixtes de 2 mâles + 2 femelles), litières (copeaux de bois) et double raffinement (maison en carton et bandelettes de carton). Les opérations chirurgicales, implantations et administrations bolus se feront sur animaux anesthésiés, tandis que l’administration (infusion), continue et autonome, se poursuivra une fois l’animal éveillé, au cours de sa stabulation post-implantation. Les prélèvements intermédiaires de sang seront précis et rapides (≤ 2min) sur animaux éveillés. Tout au long de la procédure, des points limites seront systématiquement établis afin de pouvoir répondre à une situation d’urgence. En point final, une injection létale d’anesthésiques permettra une mise à mort rapide des animaux sans stress ni douleur. Nous n’utiliserons ici que des animaux couramment utilisés en recherche pour des études de pharmacocinétiques.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études de pharmacocinétiques (groupes de 4 individus). A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur (ici souris), reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’Homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) avec une diminution des posologies. Les animaux seront utilisés pour réaliser des cinétiques pharmacologiques et des échantillonnages de sang et tissus. Pour notre procédure nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 10 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Chez la souris, cet âge correspond à un poids moyen de 27-30g environ. Cet âge s’avère particulièrement intéressant en termes pratique, économique et risques de toxicité par rapport à des animaux plus âgés (réduction des doses/risque immunogène).

Une souris dont l'état se dégrade est retirée du protocole et tuée avant le test. 216 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent un vecteur viral par voie intraveineuse ou rétro-orbitale, puis passent trente-deux heures d'enregistrement de leur activité, deux sessions de rotarod, un test de barre crantée, un test de reconnaissance d'objet, et une injection d'agent convulsivant dont la latence et la sévérité des crises sont mesurées. Le porteur cherche à montrer qu'une thérapie génique corrige les signes du syndrome de Rett chez la souris, preuve de concept qu'il présente comme l'étape "indispensable" avant tout essai chez l'humain.

Objectifs

Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. La pathologie touche essentiellement les filles, rarement les garçons qui eux meurent d'une encéphalopathie néonatale sévère. Ce syndrome entraine un polyhandicap avec déficience intellectuelle sévère et infirmité motrice, ainsi que des troubles respiratoires et cardiovasculaires. Il se manifeste par une régression rapide des acquis après 6 à 24 mois de développement normal. Aujourd’hui, une prise en charge globale des symptômes permet à ces patients de vivre plusieurs dizaines d’années, mais il n'existe malheureusement pas de traitement curatif à ce jour. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par édition du génome pour corriger le gène muté responsable de la pathologie. Afin d'envisager cette approche thérapeutique, nous avons caractérisé au préalable trois modèles de souris portant des mutations dans ce gène, représentatives de la pathologie humaine, plus spécifiquement dans le domaine du comportement et de la cognition. Cette caractérisation et compréhension des modèles dans nos conditions nous a permis de sélectionner le modèle le plus pertinent pour évaluer une approche de thérapie génique. En parallèle, nous avons développé un vecteur viral AAV (Adeno-Associated Virus) pouvant être injecté par voie intraveineuse périphérique et capable de passer la barrière hémato-encéphalique de manière efficace afin de cibler les cellules portant la mutation dans le gène responsable de la pathologie, et ainsi aboutir à leur correction par édition du génome.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'obtenir une preuve de concept in vivo qu'une approche thérapeutique par thérapie génique permet de corriger les signes cliniques du syndrome de Rett dans un modèle murin, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de cette pathologie, contre laquelle il n'existe aucun traitement curatif à ce jour.

Procédures

Injection par voie intraveineuse caudale AMENDEMENT: par voie rétro-orbitale (durée 2-3 minutes) ; activité circadienne pour suivre l'activité locomotrice, ainsi que la consommation en eau et en nourriture durant un cycle complet jour-nuit (durée 32h); test de coordination (rotarod) (2 sessions de 15 minutes); barre crantée: test proprioceptif dépendant de la coordination motrice et de la fonction vestibulaire (10 minutes); test de reconnaissance d'un nouvel objet pour évaluer la cognition (30 minutes); test de susceptibilité aux crises épileptiques (durée du test: 20 minutes), après injection par voie intrapéritonéale d'un agent convulsivant( durée d'injection: 5 sec); le suivi du poids des animaux (1X/semaine, à partir de 3 semaines jusqu'en fin d'étude à 7 semaines d'âge).

Impact sur les animaux

La mutation dans le gène responsable de la pathologie induit une mortalité précoce des animaux, avec une médiane de survie de 9 semaines chez les males porteurs de la mutation. Ceux-ci peuvent notamment présenter les symptomes suivants à 6-8 semaines d'âge: hypoactivité, diminution du poids, diminution de la température corporelle, déficit dans la coordination motrice, démarche anormale, déficits cognitifs, et susceptibilité accrue aux crises épileptiques. Les femelles qui portent la mutation ne manifestent des défauts que vers l'âge de 9 mois (déficits moteurs, faible capacité à construire des nids) et peuvent survivre au-delà de l'âge de 1 an. Dans le cadre de notre projet, les femelles seront euthanasiées avant l'âge de 9 mois où commencent à apparaitre les symptomes. Au cours du test de sensibilité aux crises épileptiques par injection d'un agent pro-convulsivant, des crises convulsives peuvent survenir à différents degrés de sévérité; la durée, la latence et la sévérité sont enregistrées. Des effets indésirables sont également liés à l'injection de vecteurs AAV par voie intraveineuse, tel que des saignements au site d'injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences, avant l'apparition du phénotype dommageable.

Remplacement

L'objectif de cette étude est d'évaluer une approche thérapeutique dans un modèle de souris portant une mutation dans le gène responsable du syndrome de Rett, représentative de la clinique humaine. Il s'agit en particulier d'étudier la correction des phénotypes comportementaux, de déficit intellectuel et de susceptibilité aux crises épileptiques. Des études in vitro ont été réalisées au préalable afin d'évaluer cette approche dans des modèles de cellules neuronales en culture, ainsi que dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes de patients et dans des organoides cérébraux, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser la correction des symptômes de la maladie de Rett, et ainsi de valider l'effet thérapeutique par la correction du gène, étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 60 mâles portant une mutation dans le gène responsable du syndrome de Rett représentative de la clinique humaine: 30 seront traités par injection d'un vecteur viral permettant de corriger le gène muté pour évaluer l'approche thérapeutique, 30 ne seront pas traités. Ce nombre de souris tient compte d'une probabilité de perte des animaux au cours de l'étude en raison de la mortalité précoce associée à la mutation, tout en permettant d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes et fiables.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Afin d’améliorer leurs conditions de vie, elles seront ainsi stabulées dans des conditions optimales pour l’espèce : en groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de "nestlets" ou de maisonnettes en carton. Pour pallier au risque de diminution de la température corporelle, nous augmenterons le nombre de "nestlets"dans les cages. En cas de difficultés motrices, de la nourriture en gel sera ajoutée dans les cages. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Les manipulations et gestes brusques seront limités pour éviter de déclencher des crises d'épilpesie. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal. Le type de croisement choisi pour monter les cohortes expérimentales (femelles hétérozygotes X mâles qui ne portent pas la mutation) permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer les cohortes et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs, ceux-ci développant des symptômes pathologiques à 6-8 semaines, avec une survie limitée à environ 9-10 semaines. Les femelles hétérozygotes ne présentent, quant à elles, des symptômes qu'à partir de l'âge de 9 mois; elles seront euthanasiées avant cet âge afin de ne pas maintenir des animaux avec un potentiel phénotype dommageable.

Choix des espèces

Le modèle souris portant la mutation dans le gène responsable de la pathologie permet de reproduire les symptômes de la maladie de Rett observés en clinique humaine. Il permettra ainsi d'évaluer un traitement par thérapie génique et de suivre la correction des phénotypes. Les études précédentes nous ont permis de définir un âge maximum de 8 semaines pour réaliser les tests comportementaux, avant que les animaux n'expriment un phénotype dommageable entrainant leur mort. Par ailleurs, nous savons qu'il faut un délai de 3-4 semaines entre l'injection des vecteurs AAV et une expression efficace des transgènes. Nous utiliserons ainsi des animaux âgés de 3 semaines pour réaliser les injections par voie intraveineuse du vecteur AAV, suivi de l'évaluation de la correction du phénotype à l'aide de tests comportementaux et de cognition à 6-7 semaines d'âge (stade symptomatique similaire au stade retenu en vue d'applications en clinique humaine, chez des sujets jeunes présentant des symptômes du syndrome de Rett).

Infectées par le SARS-CoV-2, 3 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont soit maintenues immobiles quarante minutes dans une chambre de contention, le nez dans le flux d'air, soit anesthésiées pour une instillation nasale, puis reçoivent chaque jour pendant dix jours un composé ou un vaccin avant le prélèvement des organes. Le projet est vendu comme prestation de service : doses, voie d'administration et fréquence sont fixées avec le client, académique ou privé, ce qui empêche le porteur d'annoncer le nombre et la durée des interventions. Le virus se multiplie dans les poumons et provoque inflammation, lésions et difficultés respiratoires, et le porteur revendique un "besoin urgent d'études in vivo" pour "pérenniser la plateforme technologique".

Objectifs

Le SARS-CoV2 est le virus responsable de la maladie appelée COVID-19. Le manque d'antiviraux a révélé un besoin urgent d'études in vivo pertinentes afin d'évaluer de nouveaux vaccins et de nouvelles molécules potentiellement anti-SARS-CoV2. Différents modèles de souris dont un modèle de souris génétiquement modifiées pour être sensibles au virus SARS-CoV2 est décrit dans la littérature. Ces souris sont un outil de choix pour étudier la pathogenèse du SARS-CoV2 et pour évaluer les vaccins et les produits thérapeutiques COVID-19. L’ambition de ce projet est de péréniser la plateforme technologique, à destination de futurs clients, académiques ou privés, où des souris sensibles au virus sont utilisées pour tester de nouveuax vaccins et de nouvelles molécules antivirales pour le traitement de la COVID-19. Pour comprendre les différents mécanismes biologiques et l’influence du système immunitaire de l’hôte sur le virus, il est en effet crucial à ce stade, d’utiliser un organisme vivant dans son ensemble. Différentes techniques in vitro ont déjà été utilisées en amont. Nous avons donc pour objectif de continuer à contribuer au développement de thérapies innovantes dans le domaine de l'infectiologie afin de répondre à un problème majeur qu’est l'épidémie de Covid-19.

Bénéfices attendus

L’utilisation d’un modèle souris pour étudier la pathogenèse du SARS-CoV2 contribue à comprendre les différents mécanismes biologiques et l’influence du système immunitaire de l’hôte sur le virus. Ce modèle préclinique in vivo permet d’évaluer des vaccins et des produits thérapeutiques Covid19.

Procédures

Les animaux seront infectés 1) soit par voie aérosol, les animaux vigiles sont maintenus immobiles dans des chambres de contention avec le nez pointant vers le flux d’air (durée d’environ 40 minutes) 2) soit par voie nasale, les souris seront anesthésiées/analgésiées une fois (durée d’environ 1 minute). Les nouveaux vaccins et les nouvelles molécules potentiellement antivirales seront testés selon la voie d’injection définie en accord avec le client fournisseur. Les doses et la fréquence d’administration dépendent des composés et de l'étude. Ce projet a été écrit afin de réaliser de la prestation de service. Il nous est donc difficile à ce jour de définir le nombre d’intervention et leur durée. Pour des procédures dites « classiques », les animaux reçoivent une infection, une administration de molécules ou vaccins tous les jours pendant maximum 10 jours avant prélèvement d’organes

Impact sur les animaux

L’infection des souris peut se faire soit : - Par instillation intranasale, des nuisances modérées, (durée 1 minute), sont présentes au moment de l’anesthésie (préhension, contention piqûre). - Par nébulisation, les animaux sont maintenus immobiles dans des chambres pendant 40 min et induit un stress modéré. La préhension et la contention afin de procéder aux diverses injections ou gavage engendre un stress modéré (durée 1 minute). La pesée des animaux (durée 1 minute) entraine un stress léger. Suite à l’infection des souris, le virus se multiplient dans les poumons de l’animal générant une inflammation et des lésions tissulaires. Les effets attendus sont : altération de l’état général et difficultés respiratoires. L’effet cumulatif de ces actes sur un même animal (infection, injections et développement de l’infection, pesée) entraine des nuisances sévères

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort. Il n’y a pas de possibilité de replacement, vu le contexte hautement pathogène

Remplacement

L’amplitude de l'épidémie de Covid-19 ainsi que l'absence de traitement de référence rend urgente la découverte de nouveaux vaccins ou de nouvelles solutions thérapeutiques innovantes. Le recours à l’animal de laboratoire s’inscrit dans le cadre de l'étude de l’efficacité in vivo d’un composé sou d'un vaccin sur une infection, qui résulte non seulement de l’effet de ce composé sur le virus mais également de la réponse du système immunitaire de l’hôte sur cet agent pathogène. Il n’existe aucun modèle in vitro mimant de façon précise ces interactions complexes. Afin d’évaluer l’activité thérapeutique de nouvelles substances et de vaccins, des modèles pharmacologiques in vivo mimant les pathologies sont incontournables. Les souris sont largement utilisées par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses pour les études d'immunologie et de lésions pulmonaires. Elles ont un système immunitaire bien caractérisé. Les souris sont généralement sensibles à l’infection par le SARS-CoV2 et constituent le modèle de choix pour l’investigation de cette pathologie

Réduction

Une attention toute particulière est portée sur le nombre d’animaux utilisés dans le projet. Nous travaillons avec une compagnie spécialisée dans les biostatistiques. Cette collaboration nous permet d’utiliser le nombre strictement nécessaire pour chaque expérience et de l’optimiser durant toute la durée du projet. Le nombre calculé de souris nécessaires sera au maximum de 3000 sur 5 ans. Le nombre d’animaux inclus dans chaque étude peut varier de 20 à 100, en fonction du nombre de groupes différents à générer dans chaque étude (nombre de molécules antivirales/vaccins à tester, doses différentes de la molécule antivirale/vaccins). Le nombre d'études variera en fonction de la demande des utilisateurs. Cet écart dans le nombre d’animaux par étude justifie la fourchette d’évaluation du nombre de souris requises pour une année.

Raffinement

Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l’angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Pour le confort de l'animal, la prévention du stress est intégrée à la procédure expérimentale par l'utilisation d'anesthésique pendant l’infection, lors des différentes injections des traitements potentiels. Pour l’infection des souris par nébulisation les souris sont mises en place dans les tubes de contention par du personnel habitué à l’utilisation de l’appareil ce qui réduit le stress des animaux. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation et des points limites précoces seront mis en place. Les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Plusieurs modèles animaux d'infection au Sars-CoV-2 sont actuellement utilisés par la communauté scientifique : les primates non humains, les chats, les furets, les hamsters et les souris. Les souris sont largement utilisées par les équipes de Recherche publique et privée dans le domaine des maladies infectieuses pour les études d'immunologie et de lésions pulmonaires. Elles ont un système immunitaire bien caractérisé. Les souris sont généralement sensibles à l’infection par le SARS-CoV2 et constituent le modèle de choix pour l’investigation de cette pathologie. Des souris adultes si possible, âgées entre 5 à 10 semaines seront utilisées pour ce projet.