Procédures sévères

Un AVC est provoqué chirurgicalement chez des souris éveillées, après pose d'un cathéter veineux et, pour 1 280 d'entre elles, d'une prothèse crânienne, l'opération durant de quarante-cinq minutes à une heure et demie. 1 760 souris vont être utilisées, 1 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Le porteur écarte tout maintien en vie au motif qu'il n'est pas concevable de réhabiliter ou de réutiliser des souris ayant subi une ischémie, et affirme que les procédures ont un caractère de "stricte nécessité". Deux tests comportementaux sont annoncés pour évaluer la récupération sensorielle et motrice avant l'AVC puis vingt-quatre heures après, sans que le texte précise lesquels.

Objectifs

L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur à la fois pour la santé publique et pour les patients eux-mêmes. Chaque année environ 17 millions de personnes dans le monde connaitront un épisode d'AVC pouvant entrainer des séquelles plus ou moins sévères voir la mort de l’individu. Actuellement, le traitement des AVC repose sur l’injection intraveineuse d'un médicament aidant à dissoudre le caillot sanguin (tPA ou activateur tissulaire du plasminogène) associée ou non intervention pour retirer le caillot (thrombectomie). Toutefois, seule une faible proportion des patients (moins de 10%) y sont éligibles. L’AVC est donc un problème de santé publique et nécessite le développement de nouvelles approches thérapeutiques afin d’élargir la prise en charge des patients. Pour cela, un travail doit être réalisé afin de se placer dans les conditions les plus proches de la clinique humaine et permettre ainsi de mieux appliquer les résultats obtenus en laboratoire aux phases cliniques. Dans cette volonté d’adopter une démarche translationnelle dans les projets de recherche, un modèle davantage en adéquation avec la clinique doit être mis en place. C’est ce qui a été fait précédemment au laboratoire via la mise en place d’un modèle murin d’AVC ischémique chez l’animal éveillé permettant d’exclure tout impact de l’anesthésie qui pourrait perturber les résultats. Les anesthésiques peuvent modifier le fonctionnement cérébral et notamment la circulation sanguine ce qui peut interférer avec l'évolution de l’AVC mais aussi biaiser les résultats obtenus quant à l’efficacité de certaines traitements. Le but de ce projet est de caractériser les évènements vasculaires survenant au plus proche de l'AVC ainsi que les modifications et altérations des vaisseaux sanguins post-AVC afin de déterminer de nouvelles stratégies thérapeutiques et diagnostiques. Les différents modèles utilisés dans cette étude permettront de recréer les différents profils d’AVC ischémiques observés en clinique. Cette étude pourra à terme permettre d'améliorer la prise en charge de patients suspectés d'AVC et minimiser ainsi ses conséquences à long terme. Enfin, une nouvelle méthode d’imagerie par ultrasons sera utilisée pour évaluer si elle peut être utilisée en tant que technique de diagnostic rapide, directement au lit des patients, pour confirmer la présence d’un AVC.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre les évènements vasculaires précoces survenant très tôt après le début d'un AVC afin de déterminer leur rôle dans le développement de l'ischémie et des séquelles à long terme. Les différents modèles utilisés dans cette étude permettront d’être au plus proche des situations rencontrées en clinique humaine. Dans ce but, nous proposons de caractériser les différents évènements vasculaires survenant au cours d’un AVC ischémique chez l’animal éveillé à l'aide de deux approches permettant d'induire un AVC avec des caillots sanguins de compositions différentes comme cela est le cas en clinique mais également chez l'animal anesthésié présentant une diversité des zones cérébrales atteintes de part une localisation aléatoire des caillots sanguins formés. Le bénéfice de ce projet serait donc de pouvoir caractériser et étudier les différents évènements vasculaires survenant lors d’un AVC ischémique et cela au plus près de la survenue de ce dernier. Ceci nous permettrait également de comprendre les mécanismes physiopathologiques survenant au plus près de l’AVC et amènerait ainsi l’opportunité de déboucher sur des études cliniques et la possibilité d’augmenter le succès de transpositions de résultats précliniques à la clinique humaine. De plus, ce projet offre la possibilité d'évaluer le potentiel diagnostique d'une nouvelle méthode d'imagerie à ultrasons offrant l'avantage de pouvoir être réalisée au lit du patient. In fine, ce projet offrirait la possibilité d’adapter les pratiques cliniques en modifiant les protocoles de prises en charge et/ou thérapeutiques des patients sujets à un AVC et adopter une approche d'imagerie plus accessible en clinique.

Procédures

Les animaux seront soumis a: 1 - Pose d’un cathéter intraveineux (n=1760, durée de la procédure :15 minutes); 2 - Chirurgie pour induire un AVC (n=1760 souris, durée de la procédure entre 45 minutes et 1.5 heures); 3 - Pose de prothèse crânienne (n=1280, durée de la procédure: 30minutes); 4 - 5 procédures d'imagerie : (n=1780, durée de la procédure : 30 minutes); 5- 3 protocoles comportementaux : 5.1 Habituation à la contention et aux examens d'imagerie : une habituation par jour pendant 5jours consécutifs, avec des sessions augmentant progressivement de 15minutes jusqu'à 1h30 au total (n=1280). 5.2 2 tests comportementaux pour évaluer la récupération des fonctions sensorielles et motrices (avant induction de l'AVC et 24heures après; durée de la procédure: 5min, n=1760).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre chez les animaux lors de la procédure seraient : - un stress lors des premières sessions d'habituation à la contention, - des douleurs postopératoires après la pose de prothèse, - une perte de masse corporelle après les anesthésies et l'induction de l'AVC, - des douleurs post-opératoires après la chirurgie d'accès à l'ACM, - un stress dû à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée, - des douleurs post-opératoires après l'induction de l'AVC sous anesthésie, - des déficits fonctionnels à la suite de l'AVC. Ces effets sont connus dans l’expérimentation au laboratoire. Une surveillance accrue sera réalisée à chacune de ces étapes. L’animal sera gardé en vie uniquement dans le cas où une personne compétente atteste de l’état de bien-être de l’animal suite à chaque étape de la procédure.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet (1760) feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure. Il a été décidé de ne garder aucun animal en vie car il n'est pas concevable pour leur bien-être de réhabiliter ou réutiliser des souris ayant subi une procédure sévère telle qu'une ischémie. De plus, les tissus générés permettront des observations histologiques étudiant ainsi l'intégrité anatomique et vasculaire ainsi que les altérations induites suite à la survenue d'un AVC.

Remplacement

Nous ne pouvons souscrire au principe de remplacement dans ce protocole. En effet, il est nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de notre protocole. Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, il s’agit d’étudier un modèle vivnat avec tous les mécanismes vasculaires survenant lors d'un l'AVC. Les effets de molécules pharmacologiques sur le développement des lésions cérébrales ainsi que la récupération fonctionnelle ne peuvent être investigués autrement que via un modèle in vivo. Ce projet concerne les modèles animaux les plus utilisés dans le cadre d’étude sur l’AVC et les connaissances acquises notamment dans la réalisation de procédure chez l’animal éveillé rendent l’emploi de la souris particulièrement intéressantes pour les études portant sur l’AVC. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines). L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce (souris) particulièrement intéressantes dans le cadre des études portant sur l'AVC.

Réduction

Conformément à la règle des 3R, avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour obtenir des résultats significatifs en réduisant le plus possible les effectifs afin de souscrire au principe de réduction . Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. A partir de ces données, nous avons utilisé des outils statistiques afin de déterminer le nombre minimal d'animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Ainsi, les procédures décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasif (IRM, échographie) permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés et de réaliser un suivi longitudinal contribuant à la réduction des groupes expérimentaux tout en disposant de données obtenues à partir des différents paramètres étudiés. L'utilisation d'un animal pour un enchainement de procédures légères et modérées réduit également le nombre total d'animaux.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les animaux seront hébergés dans des cages standards. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Les cages seront enrichies (coton et papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid, ainsi que des paillettes et un morceau de bois). Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, au comportement de chaque animal et à leur bien-être. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans les neurosciences, et notamment dans le développement de thérapies et d'outils diagnostiques. C’est également l’espèce de référence pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. Les connaissances et acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’AVC ischémique. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. De plus, un travail préliminaire de développement du modèle d’AVC ischémique chez l’animal éveillé a été mené au laboratoire chez la souris et permet d’avoir une expertise pour l’application du protocole. Deux types de souris, présentant des réseaux vasculaires et des réponses à l'ischémie différentes comme observées chez l'homme, seront utilisés. Ces souris sont régulièrement utilisées en recherche, d'où l'intérêt de valider ce modèle sur ces dernières. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, entre 5 et 9 semaines (5 semaines lors du début du protocole, et 9 semaines arrivées à la fin du protocole). Nous réaliserons nos modèles sur des jeunes adultes soit des animaux de même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC nous permettant ainsi de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données obtenues au laboratoire sur les modèles d’AVC. Les animaux seront commandés à l'âge de 5 semaines afin de leur laisser un temps d'acclimatation à leur nouvel environnement.

Pour reproduire chez le rongeur des défauts de mémoire proches de ceux du trouble de stress post-traumatique, 1 200 souris vont être utilisées, dont 850 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever des échantillons. Elles reçoivent une injection quotidienne pendant cinq jours, une injection d'hormone du stress, puis une injection intraveineuse de traceur. Viennent ensuite trois tests comportementaux d'environ trois heures étalés sur trois jours, que le RNT ne nomme pas, tandis que les injections intrapéritonéales et la contention sont reconnues comme sources de douleur et de stress. Le porteur justifie le recours à la souris par sa proximité phylogénétique avec l'espèce humaine et par le fait que la plupart des données sur les comportements liés au stress reposent déjà sur elle.

Objectifs

Ce projet s’intéresse aux effets négatifs du stress lorsqu’il est intense et explore les conséquences biologiques associées. Cette recherche s’inscrit dans l’étude des maladies liées au stress telles que le trouble de stress post-traumatique (TSPT). Plus spécifiquement, notre objectif est de mieux comprendre les changements biologiques qui surviennent dans les situations de stress élevé. Pour ce faire, nous utilisons un modèle animal qui mime des défauts de mémoire similaires à ceux observés chez les patients souffrant de TSPT. De plus, nous souhaitons étudier les effets de ces changements biologiques sur la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui représente la porte d’entrée du sang vers le cerveau. La qualité de cette barrière dépend de plusieurs types de cellules qui protègent le cerveau des pathogènes et des molécules toxiques présents dans le sang. Ce projet s’intéressera donc également au lien qui existe entre ces différents types de cellules et les défauts de mémoire observés dans notre modèle animal. Ainsi, cette étude, en lien avec des résultats récents obtenus chez l’humain, permettra de définir de nouvelles cibles biologiques afin d’offrir des solutions thérapeutiques innovantes aux patients souffrant de TSPT.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les effets du stress via des changements biologiques dans différentes populations de cellules sur la qualité de la barrière hémato-encéphalique. Si nous observons un mécanisme d’action précis sur la qualité de cette barrière, le développement de traitement visant à réparer la barrière pourrait être envisagé comme traitement lors de l’exposition à un stress intense. De plus, une meilleure compréhension des maladies liées au stress est nécessaire afin de faire évoluer les méthodes de prévention, de diagnostique et de traitement de ces maladies de plus en plus prévalentes

Procédures

Seront effectués une injection par jour pendant 5 jours de solution permettant d'inactiver une protéine, une injection d'hormone du stress, 3 tests de comportements d’une durée d’environs 3h étalé sur une période de 3 jours et 1 injection intra-veineuse

Impact sur les animaux

L’administration des substances par voie intra-péritonéale ainsi que la contention nécessaire à la réalisation des administrations entrainent des douleurs et du stress. Les injections de traceurs en intra-veineux peuvent induire un hématome et de la douleur, et l’anesthésie une hypothermie. Des nuisances pourraient survenir à la suite des procédures pour cela des fiches de suivi adaptées permettant d’estimer la souffrance des animaux seront utilisées.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les échantillons nécessaires pour les analyses proposées dans ce projet.

Remplacement

Il est possible en amont de tester nos hypothèses moléculaires sur des modèles in vitro (cellule en cultures), malgré leurs limitations : 1) ce n’est pas un organisme vivant mais un ensemble de cellules et 2) il n’y a pas de comportements observables et comparables aux conditions humaines. Nous avons utilisé ces méthodes in vitro afin de pré-valider nos hypothèses dans ce projet. L’utilisation d’animaux se justifie par l’impossibilité de remplacer pour plusieurs raisons. 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier des comportements liés au stress. 2) L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’Homme, ce qui permet une extrapolation acceptable des résultats obtenus chez ces espèces à l’espèce humaine.

Réduction

Dans le cadre de la stratégie de réduction, notre expérience au sein du laboratoire nous a permis de déterminer qu’un nombre de 10 souris par groupe expérimental est nécessaires pour les prélèvements et analyses ex vivo et qu’un nombre de 15 souris par groupe expérimental et par sexe est nécessaires pour les analyses comportementales, afin d’obtenir des données représentatives de l’échantillon de population. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles afin de déterminer d’éventuelles différences liées au sexe. Le cas contraire, les données des mâles et des femelles seront regroupées de sorte à augmenter le nombre d’individu par groupe pour étudier les effets du test. Les tests statistiques consisteront au préalable en un test de normalité, puis en un test d’analyse de variance à deux facteurs, suivi si besoin de tests post-hoc. Dans le cas où les données ne suivraient pas une distribution normale, des alternatives non-paramètriques aux tests cités ci-avant seront réalisées.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne. La manipulation des animaux et les soins éventuels seront prodigués par des personnes habilitées à l’expérimentation animale et compétentes, en accord avec la grille de score des points limites. De plus, une personne habilitée sera en charge de vérifier quotidiennement, weekend inclus, le pourcentage d’humidité dans l’air et la température, ainsi que le niveau sonore (si un bruit anormal survient) dans les pièces d’hébergement et d’expérimentation afin de détecter d’éventuelles nuisances et alerter les personnes compétentes pour pallier à celles-ci. A leur arrivé dans l’animalerie, les souris seront maintenues en cages d’hébergement collectives en présence d’enrichissement (carrés de cellulose, sizzle, tunnels en carton), et ce jusqu’à une semaine avant le début des expériences. Durant le déroulement des expériences les animaux seront gardés au minimum deux par deux, dans des cages transparentes et rapprochées les unes des autres afin de maintenir des contacts olfactifs et visuels entre les animaux et en présence du même enrichissement. De plus, les animaux seront manipulés par un expérimentateur habilité à l’aide des tunnels en carton, afin de réduire le stress lié à cette manipulation. Les expériences seront réalisées dans une pièce dédiée dans l’animalerie.

Choix des espèces

- La grande majorité des données relatives aux comportements liés au stress sont basées sur l’utilisation de la souris. - La validation des tests en termes de conditions comportementales et pharmacologiques étant déjà réalisées chez la souris, ceci permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. - La souris est un mammifère qui présente une bonne proximité phylogénétique avec l'espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. - La souris offre de nombreuses possibilités d’animaux transgéniques permettant d’étudier l’effet de molécules/facteurs sur le système nerveux central via l’étude du comportement. Tous les animaux utilisés seront de jeunes adultes (âgés de 10 à 16 semaines environ) car les systèmes étudiés ne subissent pas à cet âge de modifications, comme celles survenant au cours du développement ou au cours du vieillissement, ce qui limite la variabilité intrinsèque des mécanismes étudiés dans ce projet.

L'observation d'un point limite entraîne la mise à mort anticipée, décidée par le responsable du projet. 1 020 souris vont être utilisées, 828 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 192 dans des procédures modérées, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles reçoivent des vaccins à ARN messager par voie intraveineuse, intramusculaire ou intranasale, portent des tumeurs greffées dans la joue ou le poumon, et subissent un lavage broncho-alvéolaire de cinq fois un millilitre sous anesthésie. Le porteur signale des difficultés respiratoires pour les tumeurs du poumon, une nécrose ou une ulcération pour celles de la joue, et annonce que ces vaccins pourront à terme être utilisés chez l'être humain.

Objectifs

Le cancer demeure la principale cause de mortalité au monde malgré de réels progrès dans les traitements médicaux. Actuellement les traitements les plus prometteurs reposent sur l’immunothérapie, qui consiste à stimuler et/ou réactiver le système immunitaire afin d’induire des réponses anti-tumorales efficaces et spécifiques. Une des stratégies d’immunothérapie consiste à vacciner avec des antigènes tumoraux. L’efficacité de ces vaccins anti-cancer peut être optimisée en travaillant sur leur composition afin de diminuer la dose injectée et sur la voie d’immunisation la plus adéquate. En effet, la majorité des vaccins est administré par voie systémique (sous-cutanée, intramusculaire ou intradermique). Mais dans le cas de cancers localisés dans les muqueuses comme le cancer du poumon ou de la sphère ORL, des travaux ont montré que la vaccination par voie muqueuse (ex :intranasale) est plus efficace pour d’induire localement une réponse immune plus importante. Dernièrement, le succès des vaccins ARNm dans la lutte contre la Covid-19, a suscité un nouvel engouement pour ce type de vaccin. Et une des premières applications cliniques des vaccins ARNm a été pour traiter le cancer. L’objectif de ce projet est d’optimiser des vaccins à ARNm contre des antigènes tumoraux et d’évaluer leur efficacité chez la souris. Pour cela, les souris seront vaccinées avec différentes formulations de vaccins ARNm et différentes voies d’immunisation et nous analyserons la réponse immune. La meilleure formulation sera ensuite testée chez des souris porteuses de tumeurs du poumon ou de localisées dans la sphère ORL afin de voir si le vaccin peut inhiber la croissance tumorale. Ce projet permettra de développer de nouvelles thérapies innovantes pour traiter le cancer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer et de valider un nouvel outil thérapeutique dans le traitement contre le cancer basé sur la technologie innovante des vaccin ARNm avec une optimisation de : - la formulation de l’’encapsulation de l’ARNm - la voie d’immunisation - la vectorisation de l’antigène Ces vaccins pourront être administré en association avec des traitements actuellement utilisés en clinique ( ex : les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires négatifs comme anti-PD-1) pour en maximiser les effets. Ces vaccins pourront à terme être utilisés chez l’homme pour le traitement des tumeurs localisés dans les voies muqueuses (cancer du poumon, de la sphère ORL).

Procédures

raffInjection par voie intraveineuse sur animaux sous anesthésie gazeuse : 2 injections à 2 semaines d’intervalle ou 3 injections à 1 semaine d’intervalle; durée totale environ 5 min. Injection par voie intramusculaire sur animaux vigiles : 2 injections à 2 ou 1 semaines d’intervalle; durée totale du geste 1-2 min. Injection par voie intranasale sur animaux sous anesthésie générale : 2 injections à 2 ou 1 semaines d’intervalle; durée totale environ 30 min. Injection de cellules tumorales dans la joue sur animaux sous anesthésie générale : 1 injection; durée totale environ 30 min. Injection par voir intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : 4 injections (2 fois/semaine sur 15 jours);durée totale du geste 1-2 min. Sur animaux sous anesthésie générale : Prélèvement de sang ( 500μl), Lavage broncho alvéolaire (5x 1ml), perfusion intracardiaque;durée totale environ 30 min. AMENDEMENT :Injection des cellules tumorales par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse : 1 injection; durée totale environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

La vaccination par voie intranasale peut induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections par voie intraveineuse, intramusculaire et intrapéritonéale ne sont pas connus pour engendrer des nuisances ou douleurs. Sur la durée entière de l’expérience (soit environ 3 semaines), les souris avec les tumeurs peuvent perdre du poids pu présenter des signes évocateurs de souffrances tels que des troubles du comportement (immobilité, isolement...) et de l’aspect physique (dos vouté, apparence du poil...). Pour les tumeurs du poumon les souris peuvent présenter des difficultés à respirer ( bien que dans la littérature ces signes sont généralement décrit à partir de 4 semaines). Pour les tumeurs de la joue, une nécrose, ulcération de la tumeur peuvent apparaitre.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes pour l'étude des réponses immunes

Remplacement

Le microenvironnement tumoral est complexe, de même que les réponses immunitaires impliquées dans la réponse immune antitumorale. L’efficacité d’un vaccin ne peut être évalué que dans des organismes entiers et les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement tumoral. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme.

Réduction

Les paramètres expérimentaux ont été déterminées selon des données déjà publiées (cinétique de vaccination, doses, nombre de cellules tumorales à injecter). Nous avons pu déterminer un nombre d’animaux minimum pour avoir assez de matériel pour garantir une analyse statistique fiable. Des groupes de 10 animaux pour tester l’efficacité des vaccins, et pour le groupe vacciné avec notre vaccin de référence le nombre est réduit à 6. Pour les souris porteuses de tumeurs des groupes de 12 sont nécessaires puisqu’il existe une certaine hétérogénéité de la croissance tumorale. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.

Raffinement

Les injections intranasales et les injections de tumeurs dans la joue sont réalisées sous anesthésie générale pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillées jusqu’à leur réveil. Les injections par voie intraveineuse, via la veine de la queue, sont réalisées sur animaux sous anesthésie gazeuse placés sur tapis chauffant. Les injections par voie intramusculaire et intrapéritonéales ne sont pas connus pour engendrer de douleurs particulières et sont réalisées sur animaux vigiles après désinfection à l’éthanol 70% de la surface d’injection. Tous les vaccins et traitements sont préparés dans des formulations déjà utilisés en clinique ou pré-clinique. Les animaux sont élevés en cages enrichies, et regroupés en groupes sociaux afin d’éviter leur isolement ( 5 souris maximum/cage). Les animaux seront acclimatés au minimum 1 semaine avant le début de toute expérimentation. Pour les animaux le nécessitant, la prise alimentaire et l’hydratation seront facilités avec un enrichissement dans la cage de croquettes humidifiées et de gelée hydratante. La croissance tumorale est mesurée 2 fois/semaine à l'aide d'un pied à coulisse par les expérimentateurs. Une évaluation quotidienne de l’état général de l’animal basée sur des points limites sont établis. Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie, en cas de comportement anormal le responsable du projet est alors averti. L’observation de point limite induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris. Ce modèle est parfaitement maitrisé dans l’équipe qui dispose de nombreux outils (lignées tumorales syngéniques, vaccins) Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 8 semaines. Cela permet d’avoir un système immunitaire entièrement développé et à cet âge les souris tolèrent bien une anesthésie générale.

1 824 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses histologiques, 1 152 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 672 dans des procédures modérées. Elles subissent des chirurgies d'environ une heure, sept tests comportementaux totalisant 54 minutes par animal, des injections quotidiennes, des gavages et jusqu'à deux prélèvements de sang, une partie recevant de la corticostérone en continu pour reproduire un état dépressif. Le porteur décrit une possible rétention d'eau, des altérations du pelage, des troubles digestifs et des risques d'infection ou d'inflammation après injection dans le cerveau. Les retombées annoncées, mieux traiter la dépression des personnes âgées, restent à l'état de perspective, quand le porteur affirme que les modèles in vitro ou informatiques ne peuvent pas reproduire cette complexité.

Objectifs

Le vieillissement est un facteur de risque de la dépression en altérant progressivement les fonctions cérébrales et vasculaires. Au fil du temps, certaines fonctions se dégradent et la production de nouvelles cellules nerveuses diminue. A l’heure actuelle, les mécanismes sous-jacents restent méconnus. Dans ce projet, nous cherchons d'abord à restaurer certaines fonctions en augmentant le niveau d’une protéine dans le sang, en vue des résultats antérieurs montrant que cette protéine favorise la régénération des vaisseaux sanguins chez les souris âgées. Ensuite, nous visons à atténuer les effets de la dépression liée à l'âge en utilisant un médicament pour éliminer les cellules souches neurales sénescentes. Nous voulons approfondir notre compréhension de ces traitements pour mieux traiter la dépression chez les personnes âgées.

Bénéfices attendus

En cherchant à comprendre quels sont les mécanismes sous-jacents à un déclin de la neurogenèse associé à un état dit-dépressif lié à l’âge, Cette étude permettra d’une part d’améliorer notre connaissance et notre compréhension de la physiopathologie de la dépression et d’autre part essayer de trouver des thérapies spécifiques pour la dépression liée au vieillissement.

Procédures

Les souris seront soumises à plusieurs types d'interventions expérimentales. Parmi celles-ci, certaines impliquent des procédures chirurgicales d’une durée d'environ 1 heure par animal. En plus des interventions chirurgicales, sept tests (durée totale par animal de 54 minutes =, 10+6+2+6+10+5+15 minutes) comportementaux seront réalisés. De plus, un prélèvement sanguin sera effectué sur chaque souris, d'une durée de quelques secondes. Chaque animal subira un maximum de deux prélèvements sanguins, espacés d’un minimum de quatre semaines. Les tests comportementaux sont réalisés sur des animaux vigiles, sans anesthésie, et leur durée varie entre 2 et 15 minutes par souris en fonction du test.

Impact sur les animaux

Les injections quotidiennes de molécule d’intérêt, peuvent entraîner une douleur légère et de courte durée au site d'injection, ainsi que des risques de lésions des vaisseaux sanguins ou des tissus environnants, avec un risque d'infection. La piqûre d'aiguille pour l'injection et les prélèvements sanguins de petit volume nécessitent une contention et une introduction d’aiguille conformément aux bonnes pratiques vétérinaires, ce qui peut également provoquer une douleur légère et temporaire. En outre, la manipulation quotidienne des animaux pour ces procédures peut induire du stress et de l'anxiété, affectant leur bien-être général. Le modèle de dépression induit par l'administration chronique de corticostérone peut présenter une rétention d’eau aboutissant à une augmentation du poids, ainsi que des altérations du pelage. L’administration par gavage d’une molécule d’intérêt peut induire un stress physique, notamment en raison de la répétition de la procédure. Ce traitement pourrait également provoquer des troubles gastro-intestinaux. L'administration dans le cerveau du même traitement, présente des risques spécifiques liés à la chirurgie. L'injection dans le cerveau peut entraîner des complications post-opératoires, notamment un risque d’infection ou des inflammations locales au site d'injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Etant donnée la complexité multifactorielle de la physiopathologie du vieillissement et la dépression ainsi que les mécanismes mis en jeu, les modèles animaux sont indispensables pour étudier cette complexité biologique et les interactions dynamiques des systèmes physiologiques intégrés, qui ne peuvent être reproduites par des modèles in vitro ou informatiques. Ils permettent de reproduire des maladies humaines spécifiques, d'étudier les mécanismes de ces maladies et de tester des traitements de manière réaliste. De plus, les données précliniques obtenues sur des animaux sont cruciales pour valider les découvertes et assurer la sécurité des nouveaux médicaments avant les essais cliniques humains. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire le plus possible le nombre d’animaux tout en réduisant tout stress et l'inconfort de l’animal.

Réduction

L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Les taux de perte, ainsi que les amplitudes des effets cage qui ont été considérées seront précisées pour chaque procédure. De plus, nous nous attacherons à décrire au mieux le phénotype des animaux utilisés à l’aide d’une grande batterie de mesures comportementales et physiologiques. Cela nous permettra de réduire la variabilité intra-individuelle de chacun des tests, et ainsi de nécessiter d’un moins grand nombre d’individus pour évaluer l’effet de nos modèles et des traitements. Enfin, lorsque cela s’y prête, nous aurons recours à une étude longitudinale de l’état phénotypique et de la réponse neuronale des individus, ce qui nous permettra également d’augmenter notre puissance statistique et d’avoir besoin de moins d’animaux par groupe.

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place pour réduire au maximum toute douleur, souffrance et angoisse des animaux, conformément aux principes de raffinement. La durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’au moins une semaine pour permettre aux animaux de s'adapter à leur nouvel environnement et réduire leur stress initial. Les animaux seront surveillés tous les jours par l’expérimentateur et le personnel de l’animalerie. Des points limites seront mis en place. Les souris présentant des signes de douleur seront surveillées tous les jours pour évaluer l'efficacité des interventions et ajuster les soins si nécessaire. Si, malgré les interventions, une souris continue de présenter des signes de souffrance nuisant à son bien-être, et en accord avec le vétérinaire, nous procéderons à l'euthanasie gazeuse pour abréger ses souffrances. Pour réduire le stress associé à l'isolement, parfois nécessaire lors de comportements agressifs entre les individus, les cages d’hébergement seront enrichies avec des éléments tels que des igloos et du coton supplémentaire, offrant ainsi des opportunités de cachette et de nidification pour améliorer le bien-être psychologique des animaux.

Choix des espèces

Le choix d'utiliser la souris comme modèle pour étudier le vieillissement et la dépression repose sur ses similitudes physiologiques avec l'Homme, facilitant la compréhension de ces processus complexes. Sur le plan éthique, bien que la souris présente des différences génétiques et physiologiques avec les humains, elle fournit des données pertinentes pour la recherche biomédicale. En permettant l'étude du vieillissement dès 12 mois et l'induction de la dépression dès 2 mois, la souris offre des résultats rapides tout en minimisant la souffrance animale. Ainsi, son utilisation comme modèle animal dans ces études répond efficacement à des questions scientifiques cruciales tout en respectant les normes éthiques et en maximisant les bénéfices potentiels pour la santé humaine. Les animaux seront utilisés à deux stades de développement spécifiques : jeunes adultes (2-3 mois) et adultes âgés (18-22 mois). Cette sélection permet d'étudier le vieillissement à différents moments critiques de la vie des souris : les jeunes pour établir une base des fonctions biologiques avant les effets du vieillissement, et les adultes âgés pour observer les altérations biologiques plus avancées associées au vieillissement. Cette approche nous permettra d'obtenir une compréhension approfondie des processus physiologiques à différents âges, essentielle pour extrapoler ces résultats à la recherche sur le vieillissement humain et pour développer des stratégies de traitement pertinentes.