Procédures sévères
Rôle des protéases sur l’hypersensibilité dans un modèle d’inflammation induit par le TNBS
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une solution irritante instillée dans le côlon leur provoque une colite, avec perte de poids, diarrhée, sang dans les selles et hypersensibilité viscérale. 520 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvement de tissus, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 110 d'entre eux et sévère pour 410. Deux fois par semaine pendant quatre semaines, chaque animal passe une heure d'habituation puis une heure de test de nociception, l'objet déclaré étant de valider un récepteur comme cible contre la douleur viscérale des maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur affirme que le recours à l'expérimentation animale est "indispensable" et "incontournable", et décrit en quatre lignes les atteintes subies par les 410 rats classés en souffrance sévère.
Objectifs
Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin (MICI) sont des pathologies qui affectent 22 millions de personnes en Europe. Leur incidence a augmenté régulièrement au cours des 3 dernières décennies. Ces pathologies sont caratérisées par une réponse inflammatoire incontrôlées du contenu luminal. L'évolution clinique de ces pathologies est caractérisée par des périodes de poussées aigües et des phases de rémission. La barrière intestinale est gravement altérée chez ces patients et des douleurs sont souvent associées. La maladie de Crohn et la Rectolite Hemorragique affectent gravement la qualité de vie des patients. Proposer de nouvelles options thérapeutiques visant à retrouver la fonction tissulaire et à réduire les symptômes douloureux constituerait donc un bénéfice important. Nous avons déjà démontré le rôle de l'activation de récepteur activé par les protéases 1 (PAR1) dans l'inflammation intestinale et dans les voies de la douleur. Un antagoniste spécifique de PAR1 pourrait être bénéfique à la fois pour soulager l'inflammation et la douleur.
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes de régulation de la nociception est indispensable au développement de nouvelles cibles thérapeutiques pour soulager la douleur nociceptive. Une douleur viscérale atteignant le tractus intestinal est communément retrouvée chez les patients atteint de MICI non seulement en phase de poussée mais également en phase post inflammatoire. A ce jour il a ete mis en évidence le role de médiateurs présents au niveau du tissu intestinal modulant l’hyperexcitabilité des entéroneurones, incluant des protéases épithéliales, leurs inhibiteurs et leurs récepteurs PAR (Proteases Activated Receptor). Comprendre comment la balance protéolytique est régulée au niveau de la barrière intestinale est essentiel pour palier à l’hypersensibilité viscérale. Notre projet vise à évaluer le rôle des récepteurs activés par les protéases en commençant par PAR1 dans l'hypersensibilite viscerale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour la douleur viscérale. Dans le cadre de ce projet, l’expérimentation animale est indispensable dans la mesure où les méthodes alternatives permettant l’évaluation de la sensibilié viscérale de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine.
Procédures
Une administration intracolique (1 min par rat en contention) en début de procédure et un test de nociception: 1 h d'habituation puis environ 1h pour chaque jour d'application (2 fois par semaine pendant maximun 4 semaines). Administration des molécules à tester minimum 1 fois sur la durée de l'expérimentation, maximum une fois par jour.
Impact sur les animaux
Nous induisons une colite. Celle ci est caractérisée par la perte de poids des animaux et l'apparition de diarrhée et de sang dans les féces ainsi qu'une hypersensibilité viscérale. L'administration sur animaux vigiles peut induire du stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Des prélèvements de tissus post mortem seront réalisés.
Remplacement
Les méthodes alternatives, permettant une évaluation du statut douloureux de l'animal sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours a l’experimentation animale afin de valider de nouvelles cibles therapeutiques pour les douleurs viscerales. De plus, la douleur induite par le stress est une des reaction integree de l'organisme entier impossibles a reproduire in vitro dans son integralite.
Réduction
La technique de mesure de la douleur utilisée ici peut être reproduite sur un même animal au cours du temps et peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal, (par opposition à d’autres méthodes d’évaluation de la douleur viscérale comme par exemple l’implantation d’électrodes au niveau des muscles abdominaux par chirurgie) permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, les résultats des tests de nociception obtenus peuvent être utilisés pour comparer plusieurs groupes entre eux (exemple: groupe contrôle versus traité) ainsi que pour comparer le même animal au cours du temps (exemple: avant traitement versus après traitement). Cependant, il existe de la variabilité de la réponse au test de nociception au sein du même animal au cours du temps et entre les animaux entre eux. Cette variabilité peut être associée notamment au stress, ainsi, pour réduire cette variabilité au maximum, nous habituons les animaux avant la première série de test afin de réduire le stress et donc la variabilité intra et inter-individus et en conséquence le nombre d’animaux requis pour une étude. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale.
Raffinement
Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des tunnels et des carrés de coton purs ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Par exemple nous avons mis en place une période d’habituation des animaux durant 1heure le jour précédant la première série de test afin de réduire le stress. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechniciens. Pour chaque procédure des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure.
Choix des espèces
Le rat est communément utilisé dans ce modèle d'inflammation de l'intestin. Le modèle est plus reproductible qu'avec la souris et la mortalité est plus faible. Nous utiliserons des rats et des souris âgés d’au moins 6 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures.
Etude fonctionnelle des vésicules extracellulaires dans la cachexie associée au cancer colorectal EU2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
544 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 224 d'entre elles, modéré pour 208 et sévère pour 112. Greffées sous la peau de cellules cancéreuses colorectales ou injectées de vésicules tumorales, elles développent une cachexie, cet affaiblissement qui associe fonte musculaire, perte de poids, gonflement de la muqueuse intestinale et saignements. Elles sont pesées et passées à l'appareil de résonance magnétique tous les deux à trois jours pendant deux à quatre semaines, avec des tests comportementaux dont le RNT donne la durée sans les nommer. Le porteur écrit que "tout sera mis en œuvre" pour le bien-être des souris, tout en précisant qu'aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne pourra leur être administré, ces molécules risquant d'altérer les biomarqueurs mesurés.
Objectifs
Le cancer colorectal prend naissance dans les cellules du côlon ou du rectum. La tumeur cancéreuse (maligne) est un groupe de cellules cancéreuses qui peuvent envahir les tissus voisins et les détruire. Avec près de 45 000 nouveaux cas et 18 000 décès par an, le cancer colorectal reste le 2e cancer le plus meurtrier en France. La cachexie est un affaiblissement profond de l'organisme (perte de poids, fatigue, atrophie musculaire, etc. ) lié à une dénutrition très importante. Dans le cas du cancer colorectal avancé, jusqu'à 60 % des patients souffrent de cachexie qui est fortement associée à un mauvais pronostic de survie. L’impact dévastateur de la cachexie sur le patient et ses proches souligne l'urgence de ce besoin médical non satisfait. La fonction musculaire est également profondément altérée au cours de la cachexie cancéreuse, avec une forte réduction de la force musculaire squelettique. Cependant, les mécanismes impliqués dans le développement de la cachexie liée au cancer colorectal restent incompris. Il a été décrit que des vésicules étaient produites par les tumeurs, assurant une communication entre la tumeur et des organes. Démêler la communication entre le muscle squelettique, le tissu adipeux et la tumeur constitue un enjeu capital pour mieux comprendre les origines de la cachexie cancéreuse. Trouver des biomarqueurs capables d’être détectés avant l’apparition de la cachexie devient primordial pour améliorer la prise en charge et le bien-être des patients. Notre équipe étudie les fonctions d’une protéine régulatrice qui pourrait jouer un rôle dans le développement de la cachexie associée au cancer colorectal en influençant les tissus musculaires distants. Le but de ce projet, qui se déroulera dans deux établissements différents, est de démontrer le rôle de notre protéine dans le développement de la cachexie associée au cancer colorectal.
Bénéfices attendus
Cette étude s’appuie sur des résultats précédents obtenus sur des lignées cellulaires en culture. Cependant l’étude du phénomène cachectique n’est possible que grâce à l’utilisation de modèles murins qui ont fait leur preuve dans la littérature. Ces modèles modifiés permettront d’aller voir plus en avant les effets de la protéine d’intérêt
Procédures
Une pesée de tous les animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées tous les 2 à 3 jours à l'aide d'un appareil RMN (Résonnance magnétique) qui permet d’obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent moins de 2 minutes par souris et sont réalisées sur des animaux vigiles pendant toute la durée des procédures (2 semaines, ou 4 semaines selon les animaux). Ils auront à disposition une roue d’activité spontanée pendant la durée des procédures et seront libres de courir ou non. Ils réaliseront des tests comportementaux (3 fois 5 minutes et 3 fois 10 secondes / deux sessions pour tous les animaux). 432 animaux vigiles recevront une injection unique (5 secondes). En fin d’expérience, tous les animaux du projet (544) recevront une injection d’anesthésique et d’analgésique (5 secondes) avant d’être euthanasiés.
Impact sur les animaux
Le développement tumoral induit un état de cachexie progressif s'accompagnant d'une réduction de masse maigre et d'une perte de poids corporel. Les tumeurs colorectales peuvent provoquer des gonflements de la muqueuse intestinale et des saignements qui apparaîtront les deux dernières semaines de l’étude. Les animaux pourront être stressés lors des mesures de poids et de la taille de la tumeur (mesure hebdomadaire pendant 15 jours), lors de l’évaluation de la composition corporelle (tous les 2 jours pendant 2 ou 4 semaines) et lors des tests comportementaux. Les mesures de tumeur et les injections peuvent également générer une légère douleur pour l'animal.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés. Cette mise à mort limite la souffrance des animaux. Nous prélèverons le sang et différents tissus afin d’analyser les marqueurs et l’avancement de l’état cancéreux.
Remplacement
Bien que nous menions en parallèle des études sur des cultures de cellules adipeuses et musculaires, la cachexie liée au cancer est un syndrome global qui implique des échanges complexes entre les organes. Les vésicules extracellulaires font partie des messagers qui permettent cette communication. Afin de tester l'effet de différentes vésicules sur la physiologie et le métabolisme, nous ne pouvons pas nous passer de tests chez l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux a été réduit au minimum après calcul à l’aide d’un logiciel pour études statistiques. De plus, nous mutualiserons les données issues d’une étude d’une autre équipe qui sera réalisée en même temps, ce qui nous évite d’inclure deux groupes contrôles de 14 animaux.
Raffinement
Le syndrome cachexique cancéreux induisant un affaiblissement de l'organisme (perte de poids, fonte musculaire, etc.) nous effectuerons un suivi quotidien des animaux grâce à une grille de score et appliquerons des points limites définis. L’alimentation sera déposée directement dans la cage pour faciliter l’accès et permettra de contrôler la perte de poids. Nous utiliserons des tapis anti-escarres lors des examens des animaux et au fond des barquettes de pesées ce qui apporte confort et chaleur le temps de la mesure (pesée dynamique, 5s). Les animaux seront préalablement habitués aux tests comportementaux. Pour le change et les tests, les animaux seront déplacés à l’aide d’un tunnel de contention auquel ils seront habitués (enrichissement présent dans les cages). Ce tunnel permet aussi l’habituation à la mesure de composition corporelle où l’animal est maintenu dans un système équivalent le temps de la mesure (moins de deux minutes). Tout sera mis en œuvre pour assurer le bien-être des animaux même si aucun médicament anti-douleur ou anti-inflammatoire ne pourra être administré aux animaux car susceptible d’altérer les biomarqueurs du cancer.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur trois modèles murins. Le premier modèle consiste à injecter des vésicules chez des souris âgées de 10 semaines. Le deuxième modèle consiste à greffer des cellules murines colorectales cancéreuses sous la peau de souris âgées de 10 semaines. Les cellules cancéreuses utilisées, une fois greffées, sont connues dans la littérature pour induire la cachexie dans les deux semaines suivant la greffe. Nous prenons des jeunes adultes car les animaux auront atteint un poids suffisant qui permet d’observer une cachexie sans entraîner une perte de poids trop rapide. Le troisième modèle est constitué de souris génétiquement modifées répondant spécifiquement à nos besoins en terme d’expression des protéines d’intérêt. La mutation de notre protéine d’intérêt dans ce modèle permettra d’évaluer son rôle dans l’apparition de la cachexie. Ce modèle génère lui aussi la cachexie à partir de l’âge de 16 semaines, âge que nous avons choisi pour débuter nos observations.
Développement pharmaceutique d’une nouvelle thérapeutique dans un contexte de traitement in utero de la maladie de Menkes (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Piquées chaque jour sous la peau pendant toute leur gestation, 54 souris femelles porteuses d'une mutation mettent au monde 54 mâles malades, eux-mêmes injectés quotidiennement dès l'âge de cinq jours et jusqu'à trente-huit jours. Ces 108 souris subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 72 d'entre elles et sévère pour 36, afin de tester une forme pharmaceutique à base de nanoparticules de cuivre contre la maladie de Menkes. Quatre tests neurocomportementaux s'enchaînent entre le vingt-sixième et le trente-septième jour, décrits comme portant sur l'exploration, la coordination et la mémorisation, sans que les protocoles employés soient nommés. Les 54 mâles sont tués à trente-huit jours pour prélever leur foie, leur cœur, leur cerveau et leur sang, tandis que les femelles restent en vie pour perpétuer la lignée.
Objectifs
La maladie de Menkes est une maladie génétique rare qui ne touche que les jeunes garçons, et elle est causée par un problème de transport du cuivre au niveau des intestins, du placenta et du cerveau. Le traitement actuel est peu efficace et le devenir de ces enfants reste extrêmement pauvre causant de nombreux troubles sur la santé et un décès dans les premières années de vie. Cette maladie est donc liée à un blocage du cuivre au niveau des barrières physiologiques. Le développement et l’étude des « nanoparticules » a montré qu’elles étaient facilement transportées dans l'organisme grâce à leur petite taille. L’utilisation de très petites particules composées de cuivre, très inférieures à un micromètre, est une solution thérapeutique prometteuse car il a été montré une tolérance à ce nouveau médicament et une absence de toxicité. Une dose optimale a été établie et le transport biologique validé par une augmentation de cuivre dans le cerveau des animaux malades traités avec le médicament. Ce médicament améliore la survie de la souris malade et les fonctions locomotrices (déplacement) et cognitives (mémoire et apprentissage), tout en restaurant différentes activités biologiques endommagées dans le cerveau, dépendantes du cuivre, et impliquées dans des mécanismes physiologiques essentiels (production d’énergie, protection contre les agressions de l’oxygène). Dans cette étude préclinique visant à traiter les femmes enceintes présentant un risque d’avoir un enfant atteint de la maladie de Menkes, nous devons valider l’efficacité de la forme pharmaceutique chez la souris malade. Pour cela, les femelles porteuses de la mutation génétique seront accouplées puis traitées pendant la gestation avec la forme pharmaceutique. Ce traitement sera poursuivi chez les descendants mâles, malades (issu de ces mères traitées), dès l’âge de 5 jours après la naissance durant la lactation, et cela jusqu’à l’âge de 38 jours, fin du protocole. Des tests comportementaux non invasifs et non douloureux seront pratiqués chez les jeunes souris tout au long de leur croissance.
Bénéfices attendus
1/ Amélioration de la survie des souris mutantes traitées 2/ Amélioration des fonctions locomotrices et des fonctions d'apprentissage et de mémorisation grâce à un meilleur développement cérébral. 3/ Un traitement pendant la gestation des femelles porteuses de la mutation permettrait de palier aux troubles musculosquelettiques observés chez les souris malades même lorsqu’elles sont traitées avec le médicament dès l’âge de 5 jours.
Procédures
1/ Injections sous cutanées répétées de médicament 7 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas pour les femelles porteuses. Chaque piqure durant moins de 30 secondes. 2/ Injections sous cutanées répétées de médicament 7 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie. 3/ Tests neurocomportementaux au nombre de 4 allant de J26 à J37 pour les souris mâles malades. Les tests durent en moyenne moins de 5 minutes pour chaque animal.
Impact sur les animaux
Les souris porteuses de la mutation, malades et non traitées ont une espérance de vie réduite, des troubles musculosquelettiques et un retard de développement des fonctions cérébrales. On constate également des défauts de croissance, des difficultés d'alimentation et un risque de mort de ces animaux par hémorragie interne. Les femelles gestantes porteuses de la mutation subiront des piqures quotidiennes de médicaments pendant toute la durée de la gestation, les mâles porteurs de la mutation seront traités quotidiennement et toute leur vie dès l’âge de 5 jours. Ces souris mâles suivront une série de tests comportementaux (exploration, coordination des mouvements, capacité de mémorisation) qui ne génèrent aucune souffrance chez l’animal, hormis un léger stress lié au changement d’environnement et à la manipulation de l’expérimentateur.
Devenir
Les souris femelles gestantes et porteuses de la mutation seront gardées en vie afin de perpétuer la lignée de souris mutantes utilisées dans ce projet. En revanche, l’ensemble des souris mâles porteurs de la mutation (54 animaux) seront mis à mort à la fin du protocole expérimental à l'âge de 38 jours, c'est-à-dire après avoir réalisé le dernier test comportemental, afin de prélever l'ensemble des organes nécessaires pour réaliser les analyses biologiques (foie, coeur, cerveau, sang).
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie et l’amélioration du comportement de l’animal porteur de la maladie de Menkes en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L’étude complète nécessitera 54 femelles porteuses de la mutation génétique réparties en 3 groupes d'étude, afin de générer 54 mâles mutants (malades) répartis selon les mêmes groupes et traités jusqu’à l’âge de 38 jours. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude.
Raffinement
Tout au long de leur vie, les souris ne sont jamais isolées et vivent dans un environnement comportant des éléments d’enrichissement de type buchette ou papier de nidification. Toutes les procédures sont réalisées dans un environnement contrôlé et sécurisé pour l'animal. Une démarche d’estimation et suppression de la douleur est mise en place par évaluation quotidienne de l'état général de l'animal. Le stress généré par les tests comportementaux va diminuer avec l'habituation des souris et les manipulations répétées de l'expérimentateur.
Choix des espèces
La souris Moblo mime parfaitement la maladie de Menkes car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. Le protocole expérimental débutera dès le premier jour de gestation puis sur les souriceaux durant la lactation et la croissance et jusqu’à l'âge de 38 jours.
Etude du comportement chez la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Proposer une expertise en tests comportementaux aux équipes du centre de recherche et à la communauté académique ou privée : 2 000 souris sont utilisées à cette fin, 1 900 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 100 dans des procédures sévères. Chaque souris subit jusqu'à cinq tests, environ 2 h 45 en cumulant les plus longs, ou une chirurgie stéréotaxique suivie de un à deux tests. Le porteur indique que certains tests reposent sur un stimulus aversif pouvant causer douleur et stress modéré, que d'autres induisent un état de résignation mesuré par le temps d'immobilité, et que des souris sont isolées. Il écrit ne pas pouvoir dire combien seront tuées, les animaux étant mis à mort en fin de procédure sauf si l'utilisateur demande leur retour dans son animalerie, et qu'il est "très difficile de prévoir le nombre exact d'animaux".
Objectifs
La structure permet la mesure des comportements moteurs et locomoteurs simples (activité locomotrice, force musculaire, coordination motrice, fatigue), des comportements anxio-dépressifs (anxiété, résignation, anhédonie...), ainsi que l’évaluation des fonctions cognitives et des capacités d’apprentissage et de mémoire chez la souris (attention, motivation, mémoire sociale, spatiale, associative). L'objectif premier de cette demande est de proposer cette expertise aux équipes du centre de recherche, mais également à toute la communauté scientifique académique ou privée. Dans le cadre de ces projets, notre structure peut être amenée à proposer le développement de nouvelles procédures d'étude du comportement ou d'adapter les protocoles existants aux besoins et aux questions scientifiques spécifiques d'un utilisateur. Pour cela, les procédures standards proposées par la structure doivent donc être testées et validées. Ainsi, le but de ce projet est 1) de permettre la réalisation d'expériences de validation de procédures, 2) de faciliter le déroulement d'expériences qui souhaiteraient utiliser une procédure comportementale non décrite dans leur projet initial et 3) de faciliter l'accès à des extérieurs, en leur permettant d'écrire seulement le projet concernant les procédures réalisées dans leur établissement.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre le fonctionnement de l’organisme et plus particulièrement le fonctionnement du cerveau, dans le cas normal et dans le cas de pathologies, pourra permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. C’est dans ce cadre que s’inscrit l’objectif de notre projet d’étude du comportement des souris, qui peut avoir comme bénéfice une meilleure compréhension des processus liés au vieillissement normal et pathologique (maladie neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer par exemple), aux troubles physiologiques, neurologiques et psychiatriques. De nombreuses équipes de recherche travaillant à une autre échelle que celle de "l'animal entier" manquent de cette expertise comportementale. Actuellement, les recherches en physiologie et/ou biologie exploitent la connaissance des génomes afin de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les grandes fonctions biologiques. L'utilisation de ces outils va croissante, et l’analyse comportementale de ces animaux génétiquement modifiés, nécessite des compétences spécifiques et des moyens importants. De même, les effets de nouvelles molécules issues de la pharmacologie doivent impérativement être testés in vivo afin de connaître leurs actions sur le comportement et de rechercher d’éventuel effets secondaires sur le comportement des animaux. Par ailleurs, un autre aspect positif de la mise en place d'un tel projet réside dans la possibilité à plus ou moins long terme de contribuer à réduire le nombre d'animaux utilisés et de raffiner les procédures pour améliorer le bien-être des animaux. En effet, la standardisation et le raffinement des procédures et des conditions expérimentales, pourrait permettre d’améliorer la reproductibilité et la comparabilité des résultats entre équipes et entre projets, ce qui pourra peut-être conduire à une réduction du nombre d’animaux utilisés.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests visant à évaluer certains aspects de leur comportement. Une très grande variété de tests est proposée pour mieux comprendre les caractéristiques phénotypiques des lignées de souris testées. L’activité sensorimotrice, l’anxiété, les symptômes pseudo-dépressifs, les capacités d’apprentissage et de mémoire des animaux pourront être mesurées grâce à ce projet. Plus précisément, chaque souris pourra être soumise soit à un ensemble de 1 à 5 tests comportementaux au maximum parmi ceux proposés, soit à une étape de chirurgie stéréotaxique suivie de 1 à 2 tests comportementaux au maximum Il est très difficile de prévoir le nombre exact d’animaux qui seront utilisés dans cette procédure, car ce dernier dépendra des projets demandés par les utilisateurs. Au maximum, les aniamux suivront un total de 5 tests comportementaux, pour une durée maximale d'environ 2h45 en combinant les tests les plus longs.
Impact sur les animaux
Les tests comportementaux impliquant un stimulus aversif sont susceptibles de causer une douleur ainsi qu'un stress modérée aigu (de courte durée). D'autres tests, qui entraînent un état de résignation de courte durée, peuvent engendrer un stress modéré chez nos animaux. La résignation des animaux, mesurée par le temps d'immobilité, sert à évaluer un potentiel "état dépressif" ou un effet antidépresseur par exemple. Dans les deux cas, une vigilance particulière est apportée aux animaux pendant et après le test (avec des critères d'arrêt strict si un signe de stress prononcé est détecté). Les souris sont isolées lors de certains tests, ce qui peut induire un stress durant les premières heures de l'expérience. Enfin, les chirurgies peuvent induire une douleur modérée au stade post opératoire (pendant 48h environ).
Devenir
Il est difficile de prévoir le nombre d'animaux mis à mort car celui-ci dépendra du projet. Certains utilisateurs souhaiteront un retour des animaux dans leur animalerie d'origine afin d'effectuer des études complémentaires dans le cadre de leur propre projet. Dans ce cas, la justification sera donnée dans une demande multisite spécifique. Dans le cas contraire, tous les animaux issus de notre élevage ou provenant d’un éleveur agrée seront mis à mort en fin de procédure suivant les méthodes décrites dans notre demande de projet.
Remplacement
Le but du projet étant de proposer une évaluation comportementale dans des conditions très variées (fonction d'un gène, modification de l'expression d'une protéine, effets de substances pharmacologiques...etc), il est donc indispensable de travailler sur un modèle animal dans son intégrité, qu'il s'agisse de valider un modèle, de comprendre le rôle d'un gène, d'une structure cérébrale, d'évaluer une stratégie thérapeutique, ou d'évaluer les potentiels effets secondaires négatifs de cette stratégie.
Réduction
Ne connaissant pas à l'avance les études qui seront demandées, nous ne pouvons pas répondre sur un cas précis. Cependant, de façon générale, pour chaque test comportemental, le nombre d’animaux par groupe sera déterminé sur la base 1) de nos études antérieures ou 2) de la littérature correspondante, afin de réduire les effectifs au minimum pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les analyses. D'une façon générale toujours, en fonction du test comportemental, nous estimons qu'un total de 8 à 12 animaux par groupe expérimental devrait être suffisant. Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons envisageons de tester les animaux de façon séquentielle dans un maximum de paradigmes différents.
Raffinement
En expérimentation, au cours des 3 jours qui précèdent un test comportemental, les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de séances quotidiennes de manipulation d'au moins 2-3 minutes par souris. Ces séances se déroulent dans la pièce où aura lieu le test, hors de la pièce de stabulation, afin d'habituer les animaux à être transportés sur chariot vers les pièces expérimentales, et plus spécifiquement vers la pièce de test. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlés dans toutes nos pièces de comportement. Nous avons également modifié les systèmes d'éclairage de l'ensemble de nos pièces afin que ceux-ci permettent d'obtenir une luminosité modifiable au lux près, et que la source lumineuse soit indirecte, moins stressante pour l'animal. Dans la mesure du possible, les pièces d'expérimentation sont aménagées afin que les ordinateurs contrôlant les dispositifs soient positionnés à distance des dispositifs de comportement. Ceci a pour but de réduire le stress potentiel causé par les ultrasons provenant des PC sur le comportement des souris. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par du personnel formé au soin.
Choix des espèces
Notre projet est centré sur le modèle souris car celui-ci offre les plus larges potentialités pour l'application des méthodes d'ingénierie génétique et d'étude expérimentale du comportement. Selon le projet confié au plateau d'analyse du comportement souris, les souris adultes pourront être testé à partir de 2 mois jusqu'à 24 mois.
Evaluation du potentiel thérapeutique de molécules antigrippales administrées par différentes voies sur modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
Les souris qui franchissent les points limites sont tuées avant la fin, les autres au 21e jour après l'infection ou au 4e selon la procédure. 1 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever tissus respiratoires et sang. Elles sont infectées par le virus de la grippe, ce qui provoque une hyper-inflammation pulmonaire, des lésions du poumon, des difficultés respiratoires, de l'hypothermie et de l'anorexie, effets qui peuvent aller jusqu'à la mort. Elles reçoivent cinq molécules candidates par instillation nasale sous anesthésie, par gavage sous contention et par injection dans la veine de la queue, la perte de poids et la mortalité servant de critères pour décider quelles molécules passent à l'étape suivante.
Objectifs
Chaque année, la grippe saisonnière infecte plus d'un milliard de personnes (environ 20 % de la population mondiale). La versatilité de l’efficacité vaccinale, et l’absence d’antiviraux efficaces, peine à juguler les 500 000 décès annuels dus à la grippe. Par conséquent, des stratégies innovantes sont essentielles pour améliorer les traitements contre le virus de la grippe. La pathologie grippale est liée à la fois aux effets néfastes du virus et à la réponse immunitaire de l'hôte. Alors qu'une réponse immunitaire robuste est essentielle pour l'élimination du virus, un recrutement cellulaire excessif et la libération de certaines molécules conduisent à une hyperinflammation pulmonaire, entraînant des lésions tissulaires, la morbidité et la mort. Des recherches récentes ont misent en évidence le lien étroit entre métabolisme et immunité, aboutissant à la découverte de propriétés antimicrobiennes de certaines molécules du métabolisme. Nos études précédentes ont démontré que parmi ces petites molécules, appelés métabolites, 5 molécules possèdent des activité antigrippale. In vitro, ces composés ont démontré un double effet : inhibition de la réplication du virus de la grippe et propriétés anti-inflammatoires suffisamment puissantes pour perturber les cascades inflammatoires au cours de la grippe. Afin de confirmer le potentiel thérapeutique de ces molécules, il est à présent nécessaire de valider leur effets anti-grippaux in vivo. Pour cela, nous désirons administrer ces molécules via les différentes voies d’administrations couramment utilisés en médecines humaines (intraveineuse, per os, intranasale), à des souris atteintes d’infection grippale. Par la suite, nous comparerons l’effet anti-viral et anti-inflammatoire de ces molécules, selon la voie d’administrations choisis. Enfin, nous évaluerons le potentiel protecteur de ces molécules via des expériences de survie. Ces résultats nous permettrons de déterminer quel est la molécule la plus prometteuse pour poursuivre le développement préclinique de ce nouvel antigrippal en clinique humaine.
Bénéfices attendus
L’infection grippale est un problème de santé publique majeur ; à l’origine d’épidémies saisonnières et de pandémies de grippe, avec un impact clinique et économique considérable. Ces virus infectent entre 10 et 20% de la population mondiale et entraînent des maladies graves chez 3 à 5 millions de personnes. En conséquence, ces virus tuent entre 290 000 et 650 000 individus par an dans le monde, dont 5 à 18 000 personnes en France et jusqu’à 56 000 autres aux États-Unis. La mise au point d'agents thérapeutiques efficaces et sûrs constitue un élément important pour la gestion de la grippe saisonnière et est essentielle pour répondre aux crises épidémiques et pandémiques futures. Récemment, nos recherches ont permis de développer 5 molécules, inspiré du métabolisme cellulaire et possédant des propriétés anntivirale et anti-inflammatoire démontrée in vitro, là où les molécules antigrippales actuelles ciblent seulement le virus. La découverte est innovante et importante car : (i) elle propose l’utilisation d’un nouveau champ de molécules pour le traitement des infections virales pulmonaires, (ii) elle repose sur un mécanisme doublement bénéfique pour l’hôte (i.e. antivirale et anti-inflammatoire), (iii) elle présente une efficacité là où les médicaments actuellement « sur le marché » échouent. Ce projet vise à valider les propriétés antigrippales de ces molécules in vivo, et selon les voies d’administrations utilisées usuellement en clinique humaine. Ces données pré-cliniques seront le socle du développement de ces molécules vers un nouveau médicament antigrippal surpassant les capacités protectrices des traitements actuelles. A terme, ce projet vise à proposer un antigrippal innovant capable de diminuer l’impact sanitaire et économique considérable de la grippe dans le monde.
Procédures
Toutes les souris seront anesthésiées, 3 fois par injection intrapéritonéale pour une durée de quelques minutes, et une fois par anesthésie gazeuse pour une durée de quelques secondes, durant lesquelles elles recevront une instillation intranasale des molécules antivirales potentielles. Ces instillations ne durent que quelques secondes. Des administrations des molécules par voie orale et intraveineuses sur animal vigile seront également réalisées. Dans le cas d’une administration par voie orale, les souris sont tenues en contention permettant l’immobilisation de la souris vigile. La molécule est administrée à l’aide d’une canule de gavage. L’administration des molécules dans la veine caudale ne nécessite pas d’anesthésie. En effet, les souris sont placées 10min sous lampe chauffante afin de provoquer une dilatation de la veine. Les animaux sont ensuite placés dans un appareil de contention permettant l’immobilisation de la souris vigile. La molécule est administrée à l’aide d’une seringue.
Impact sur les animaux
L’anesthésie générale par voie intrapéritonéale, l’administration par voie orale et l’intraveineuse nécessite une contention ce qui peut engendrer du stress pour les animaux ainsi qu’une légère douleur au niveau du site d’injection pour l'intraveineuse et l'intrapéritonéale. L'anesthésie peut également entrainer un refroidissement de l’animal. Lors des anesthésies au temps le plus critique (J3) une lampe chauffante pourra être utilisée si la température des souris est faible. Une température trop faible entraînera l’euthanasie de l’animal. L’infection grippale provoque une hyper-inflammation pulmonaire aboutissant à des lésions du poumon et des difficultés respiratoires, de l’hypothermie, et de l’anorexie. Ces effets entrainent une perte de poids et peut mener à la mort de l’animal. Les instillations pulmonaires intranasales provoquent un stress pulmonaire qui se caractérise par une respiration saccadée et accélérée pendant 1 ou 2 minutes. Le liquide est ensuite rapidement absorbé par les tissus et lors du réveil de la souris, la respiration est revenue à la normale. L’infection grippale provoque une hyper-inflammation pulmonaire aboutissant à des lésions du poumon et des difficultés respiratoires, de l’hypothermie, et de l’anorexie. Ces effets entrainent une perte de poids et peut mener à la mort de l’animal.
Devenir
Procédure 1 « L’ensemble des animaux seront euthanasiés. Soit suite au franchissement de points limites ou en fin de procédure 1 après reprise du poids initial (21 jours post-infection)». Procédure 2 : « L’ensemble des animaux seront euthanasiés 4 jours post-infection (PROCEDURE 2). Les tissus respiratoires et sanguins seront collectés. Des analyses de charges virales, de médiateurs inflammatoires, de recrutement de cellules immunitaires et de lésions pulmonaires seront réalisés pour évaluer les propriétés protectrices de chaque traitement. »
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que le modèle murin d’infection par le virus de la grippe est bien établi et maîtrisé par l’équipe.
Réduction
Les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, tout en permettant la réalisation de tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal. Dans cette optique, la procédure 1 sera réalisée en premier pour évaluer le potentiel protecteur de chaque molécule. Si une molécule ne permet pas de diminuer la perte de poids ou la mortalité induite par le virus grippal, elle ne sera pas incluse dans les tests de la procédure 2. Cela nous permettra de sélectionner uniquement les molécules ayant montré des effets bénéfiques visibles sur l’état général de l’hôte, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés au cours de la procédure 2. De plus, nous développons actuellement des modèles de coupes de poumons humains et murins. Cette technique permet de réaliser un grand nombre d'expériences à partir d’un seul donneur, tout en conservant la structure pulmonaire, la diversité cellulaire et l’interface air-liquide du poumon. Ainsi, nous pouvons effectuer un grand nombre de tests au plus proche de la physiologie pulmonaire, réduisant le nombre d’animaux utilisés. Les échantillons pulmonaires récupérés lors de la procédure 2 serviront notamment à consolider cette technique, qui, à terme, pourra permettre de s’affranchir d’une partie des tests animaux.
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. A l’arrivée des souris dans l’établissement d’hébergement, une habituation de 7 jours sera réalisée avant toute manipulation. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Toute procédure d’instillation intranasale sera précédée d’une anesthésie des souris par voie intrapéritonéale ou gazeuse pour les animaux déjà infectés. Le réveil des animaux à lieu au maximum 20 minutes après l'anesthésie. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon quotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi des points limites, les souris présentant un de ces critères seront mises à mort.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris. Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris. Cette espèce est la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires, réduisant le besoin d'animaux pour des études préliminaires. Les souris sont facilement infectables par des souches adaptées de virus influenza humain et présentent des symptômes cliniques similaires à l'homme (anorexie, hyperinflammation pulmonaire, perte de poids et mortalité). Les de la souche selectionnée sont les plus couramment utilisées dans les études de physiopathologie et mécanistiques, mais également pour le développement d’outils thérapeutiques. Cette souche est appropriée pour étudier l’inflammation et les réponses immunitaires et est un modèle bien établi d’infection grippale. Enfin, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 semaines pour avoir un système immunitaire mature.
Maintien des compétences et validation des gestes de base et de différentes chirurgies sur les rongeurs et lagormorphes
- Formation professionnelle
Rats : 150
Cochons d'Inde : 10
Hamsters dorés : 5
Hamsters de Chine : 5
Lapins : 20
Former une dizaine de personnes par an aux gestes techniques : 490 animaux non-humains vont être utilisés puis tués, 300 souris, 150 rats, 20 lapins, 10 cobayes et 10 hamsters, dont 31 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les stagiaires leur administrent du sérum physiologique par huit voies différentes, sur animal vigile ou anesthésié, puis pratiquent une chirurgie par animal, injection de sérum dans le cerveau ou au contact du cœur, pose d'un cathéter dans l'intestin grêle ou dans la jugulaire, retrait d'un fragment d'os lombaire ou fémoral, lésion de la cornée, lésion cutanée, extraction dentaire. Le porteur indique que ces actes peuvent laisser des boiteries, des troubles neurologiques, intestinaux ou cardiaques "à plus ou moins long terme", et que les animaux dont l'état ne s'améliore pas au bout de deux semaines sont tués. Il justifie l'ensemble par la formation du personnel avant les études de toxicité et d'efficacité menées dans l'entreprise, sans préciser le nombre d'animaux affecté à chaque geste.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de décrire tous les gestes réalisés à des fins de formation du personnel. Une dizaine de personnes seront formées par année.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est de pouvoir avoir un personnel formé à tous les gestes qu’il est susceptible de réaliser, afin de limiter le stress et le mal-être chez les animaux manipulés.
Procédures
Les animaux sont utilisés dans le cadre de formation, le personnel formé interviendra ensuite dans différentes études de toxicité et d’efficacité. Les animaux reçoivent des administrations de solution saline par différentes voies (intrapéritonéales, intramusculaires, intraveineux, intradermiques, intravaginales, intranasales, sous-cutanés et voie orales), ces administrations peuvent être réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés si l'animal présente un stress et/ou que le geste ne peut être réalisé sur animaux vigiles. Ces administrations peuvent être quotidiennes mais ne peuvent excéder certains volumes définis. Les animaux ne recevront qu'une seule administration par jour, par une seule voie. Les animaux ont, à minima, un jour de repos entre chaque administration. Dans le cadre de formation de chirurgie, les animaux sont analgésiés puis anesthésiés avant le début de la chirurgie. Pour les modèles de chirurgie intracérébrale, les animaux reçoivent une solution saline dans le cerveau. Pour le modèle de pose de cathéter intraduodénal, un cathéter est posé dans la partie initiale de l'intestin grêle pour administrer en direct une solution saline. Pour le modèle de chirurgie cardiaque, les animaux reçoivent une solution saline au contact du coeur, ou dans le coeur. Pour le modèle de retrait d’une partie de l’os, une petite partie de l’os au niveau des lombaires ou du fémur est retirée. Pour le modèle de plaie cornéenne, une lésion de la cornée est réalisée. Pour le modèle de plaie cutanée, une lésion au niveau de la peau est réalisée. Pour le modèle de chirurgie dentaire, une ou plusieurs dents sont retirées à l'animal. Pour le modèle de cathétérisation jugulaire, un dispositif vasculaire est mis en place au niveau du cou permettant l’injection de solution saline. Une seule chirurgie sera réalisée par animal, les animaux sont gardés en vie à la suite des chirurgies. La durée maximale de tous les actes chirurgicaux énoncés est de 2h30. La durée maximales des administrations de solutions saline est de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les modèles de délétion osseuse peuvent générer de la douleur et des boiteries modérées à plus ou moins long terme. Le modèle de plaie cornéenne peut générer une douleur modérée et une sensibilité ophtalmique jusqu’à cicatrisation. Le modèle de plaie cutanée peut générer une douleur modérée, une sensibilité dermique et une réaction inflammatoire jusqu’à cicatrisation. Le modèle de chirurgie dentaire peut générer une douleur modérée, une réaction inflammatoire, des difficultés à s’alimenter et se toilleter jusqu’à cicatrisation. Le modèle de cathétérisation jugulaire peut générer une douleur modérée et de l'incofort lié au dispositif pendant toute la durée de la formation. Les modèles d’injections intracérébrales peuvent générer de la douleur et potentiellement des troubles neurologiques à plus ou moins long terme. Le modèle d’administration intraduodénale peut générer de la douleur et potentiellement des troubles intestinaux à plus ou moins long terme. Les modèles de chirurgies cardiaques peuvent générer de la douleur et potentiellement des troubles cardiaques à plus ou moins long terme. Ces effets peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, auto-mutilation, …). Ces effets sont limités dans le temps et ne dépassent pas deux semaines. Si les effets indésirables provenant de la chirurgie s’étendent au-delà de deux semaines sans aucun signe d’amélioration, alors les animaux seront mis à mort. Les administrations par voie orales, intradermiques, intravaginales, intrapéritonéales, intramusculaires, sous-cutanée peuvent générer une légère douleur et un léger stress qui ne dure pas dans le temps.
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux sont mis à mort. Des organes peuvent être récupérés pour des analyses vitro et ex-vivo.
Remplacement
Afin d’utiliser des animaux à des fins scientifiques dans les conditions idéales, le personnel technique a besoin d’être formé aux différents gestes techniques réalisés dans l’entreprise par des formateurs habilités. Ces gestes techniques ne peuvent pas être remplacés par des tests in vitro et nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique et ces gestes doivent être maîtrisés par le personnel pour mener à bien et dans de bonnes conditions éthiques les études réalisées dans l'entreprise.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum tout en permettant d’effectuer le nombre de sessions de formations nécessaires à la validation du geste. La quantité d’animaux peut varier en fonction de la nature du geste et/ou du nombre de personnes à former. Pour des gestes invasifs ou très invasifs, il n’y a qu’une session de formation afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le tout en limitant au maximum le stress, l’angoisse et la douleur provoquée aux animaux.
Raffinement
Pour les rongeurs, de l’enrichissement comme des batonnêts à ronger, des huttes/tunnels et du papier kraft sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. Pour les lapins, une plateforme, des bâtonnets à ronger et/ou du foin sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés par un ou deux, entre animaux socialement compatibles. Pour la chirurgie, une anesthésie générale, adaptée en fonction des espèces, sera réalisée. Elle peut être fixe ou gazeuse. Une couverture analgésique adaptée sera appliquée. L'analgésie est adaptée en fonction des observations quotidiennes des animaux. L'analgésie pré-opératoire peut être complétée par un traitement local. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.
Choix des espèces
Ces animaux (rat, souris, cobaye, hamster, lapin) sont choisis en fonction de la procédure expérimentale qui sera suivie dans les études réalisées dans l’entreprise. Cobayes, rats, hamsters, lapins : Animaux adultes car nécessité d’avoir les systèmes immunitaires et autres organes vitaux fonctionnels. Souris : animaux adultes et nouveau-nés : ces derniers sont utilisés pour la formation du personnel dans le cadre d’études réglementaires de la Pharmacopée Européenne pour l’évaluation de contaminants viraux dans des thérapies cellulaires.
Evaluation de l’effet anticancéreux de nouvelles thérapies cellulaires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Opérées pendant une heure pour qu'on implante des cellules cancéreuses humaines directement dans un organe, jusqu'à 396 souris reçoivent ensuite huit injections intraveineuses. Sur les 1 388 souris du projet, toutes immunodéprimées et toutes tuées à l'issue, 686 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et de 60 à 156 subissent en plus la pose d'une canule dans le cerveau. Chaque animal est injecté une fois par semaine puis anesthésié pour l'imagerie qui suit la croissance des tumeurs, poumon, foie, rein, côlon, pancréas ou cerveau selon les cas. Le porteur écrit vouloir limiter le projet à 980 animaux au maximum, alors que le total déclaré est de 1 388.
Objectifs
La chimiothérapie, la radiothérapie, les anticorps et depuis peu les thérapies cellulaires font partie des traitements actuels contre le cancer. Les thérapies cellulaires sont composées de cellules humaines capables de cibler puis détruire les cellules cancéreuses. Il est possible d'améliorer leur effet en les associant avec des anticorps. L’objectif de ce projet est d'évaluer l'effet anti-cancéreux de ces produits. Des cellules cancéreuses capable de produire de la lumière et représentative de différents types de cancer (poumon, foie, rein, colon, pancréas ou cerveau) seront greffées chez la souris. Grâce à leur capacité à produire de la lumière, nous pourrons facilement surveiller leur croissance. La capacité de nos traitement à cibler et détruire ces cellules cancéreuses ainsi que leur non toxicité seront évaluées.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont scientifiques et humains. Premièrement, les résultats obtenus seront diffusés à la communauté scientifique. Par conséquent, ils permettront d'améliorer les connaissances scientifiques dans le domaine des thérapies cellulaires. Si les résultats sont positifs et que nos produits sont efficaces comme attendu, ces données permettront de poursuivre leur développement jusqu’à la clinique. Ce projet permettra également dans le futur de proposer des nouveaux traitements efficaces et non toxiques aux patients atteints de cancer.
Procédures
2 animaux seront soumis à 1 injection intracérébrale (la durée de l'injection est d'1 minute). Entre 60 et 156 animaux seront soumis à 1 procédure chirurgicale pour canulation intracérébrale (la durée de l'intervention est d'environ 10 minutes par animal). Maximum 396 animaux seront soumis à 1 procédure chirurgicale pour implanter les cellules humaines cancéreuses dans l’organe d’intérêt (la durée de l'intervention est d'environ 1h) suivi de 8 injections intraveineuses (la durée de chaque injection est d'1 minute). 132 animaux seront soumis à 9 injections intraveineuses (la durée de chaque injection est d'1 minute). Dans le cadre des analyses par imagerie de bioluminescence, tous les animaux (1388) seront injectés 1 fois par semaine par voie intra-péritonéale avant d'être anesthésiés (environ 10 minutes).
Impact sur les animaux
Il n'y a pas d'effets secondaires spécifiquement liés à l'imagerie hormis le stress lors des anesthésies ou lors des injections. Des douleurs peuvent également être ressenties au site d’injection ou lors de l’implantation des canules au cours des procédures de chirurgie. Les animaux greffés avec des cellules humaines cancéreuses seront également sujets à des effets pouvant être induits par la croissance de la tumeur. Ces effets sont connus allant de la perte de poids jusqu’à des problèmes de mobilité ou encore des problèmes comportementaux, principalement dans le cas des tumeurs injectées dans le cerveau ou de certaines tumeurs injectées directement dans l’organe cible. Dans tous les cas, les animaux seront étroitement suivis et examinés tout au long des expériences selon notre fiche de suivi clinique.
Devenir
Les souris seront euthanasiées en fin de procédure expérimentale pour effectuer des prélèvements post-mortem
Remplacement
L’alternative non animale principalement utilisée pour caractériser de nouvelles thérapies en oncologie consiste à évaluer leurs propriétés sur des cellules en culture. Cependant, les données obtenues in vitro restent artificielles et loin des effets observables dans un animal et ceci est d’autant plus vrai quand le produit consiste en des cellules immunitaires humaines vivantes. En effet, in vitro, nos produits sont mis en présence de cellules tumorales sans autres paramètres extérieures (pas d’autres cellules, pas de barrières à traverser, pas d’organes et tissus dans lesquels migrer …). Il est donc reconnu et validé par la communauté scientifique, que même si l’utilisation d’animaux doit être réduite et si possible évitée, celle-ci reste une étape obligatoire dans la caractérisation des nouveaux produits pharmaceutiques. En effet, celle-ci permet d’évaluer dans les conditions d’un organisme vivant, avant une utilisation chez l’Homme, l’impact d’un nouveau produit sur la maladie et l’impact de l’organisme vivant animal sur le nouveau produit. Les modèles murins de cancer sont donc les seuls aujourd’hui permettant d’évaluer l’efficacité des nouvelles immunothérapies cellulaires en oncologie.
Réduction
Ce projet, d’une durée maximale de 5 ans, impliquera l’utilisation de souris avec un système immunitaire affaibli (nombre total maximal d’animaux = 980). Ce nombre d’animaux est le nombre maximal que nous envisageons d’utiliser. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons décidé de commencer par des études préliminaires avec le plus faible nombre d’animaux possible. Ces études permettront de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour les études suivantes ; mais également, de s’assurer des conditions expérimentales optimales pour les réaliser. Pour l’ensemble du projet, le nombre minimal de souris a été calculé en fonction des besoins scientifiques et statistiques.
Raffinement
A réception des animaux, une première phase d’acclimatation et d’habituation à la manipulation (1 semaine), permettra d’atténuer tout stress lié au transport et de s’assurer du retour à l’état normal de l’animal. Cette période servira également pour habituer les animaux à la méthode de distribution des aliments et de l’eau et à leur nouvel environnement. Le fait d’habituer les souris à être manipulées permettra également de réduire les répercussions nuisibles de la manipulation. Pour toutes les procédures où une chirurgie sera réalisée, des produits anesthésiques et analgésiques adaptés seront utilisés pour prendre en charge la douleur. L’observation des animaux et de leur environnement se fera quotidiennement (pendant la période d’acclimatation et pendant les différentes études) afin d’évaluer leur santé et leur comportement. Un score clinique complet sera calculé pour déterminer la conduite à tenir. Pour toute souris présentant des blessures, elle sera hébergée individuellement et nous procéderons à un enrichissement augmenté de la cage et à une surveillance accrue.
Choix des espèces
Pour tester l'effet d'un nouveau traitement contre le cancer, la greffe de cellules cancéreuses chez la souris est l'expérimentation standard et la plus pertinente. L’utilisation de souris avec un système immunitaire affaibli garantira l’absence de rejet des cellules cancéreuses humaines greffées et l’absence de souffrances associées pour les souris (choc cytokinique, inflammation au site d’injection, …). Souris adultes (6 - 7 semaines à la réception pour une entrée dans l’étude à 7 - 8 semaines) – âge standard pour 1- greffer des cellules cancéreuses et 2- évaluer l’efficacité de nouveaux traitements anti-cancer
Développement pharmaceutique d’une nouvelle thérapeutique dans un contexte de traitement in utero de la maladie de Menkes (EU 1/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Piquées chaque jour sous la peau pendant toute leur gestation, 54 souris femelles porteuses de la mutation responsable de la maladie de Menkes mettent bas des mâles malades, traités à leur tour quotidiennement de leur cinquième à leur trente-huitième jour de vie. Sur les 108 souris du projet, 36 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, le porteur décrivant chez les souriceaux porteurs de la mutation une espérance de vie réduite, des troubles musculosquelettiques, des difficultés d'alimentation et un risque de mort par hémorragie interne. Les 54 mâles subissent quatre tests neurocomportementaux entre le vingt-sixième et le trente-septième jour, puis sont tués pour prélever leur foie, leur cœur, leur cerveau et leur sang. Les femelles gestantes, elles, sont gardées en vie pour la reproduction de la lignée mutante.
Objectifs
La maladie de Menkes est une maladie génétique rare qui ne touche que les jeunes garçons, et elle est causée par un problème de transport du cuivre au niveau des intestins, du placenta et du cerveau. Le traitement actuel est peu efficace et le devenir de ces enfants reste extrêmement pauvre causant de nombreux troubles sur la santé et un décès dans les premières années de vie. Cette maladie est donc liée à un blocage du cuivre au niveau des barrières physiologiques. Le développement et l’étude des « nanoparticules » a montré qu’elles étaient facilement transportées dans l'organisme grâce à leur petite taille. L’utilisation de très petites particules composées de cuivre, très inférieures à un micromètre, est une solution thérapeutique prometteuse car il a été montré une tolérance à ce nouveau médicament et une absence de toxicité. Une dose optimale a été établie et le transport biologique validé par une augmentation de cuivre dans le cerveau des animaux malades traités avec le médicament. Ce médicament améliore la survie de la souris malade et les fonctions locomotrices (déplacement) et cognitives (mémoire et apprentissage), tout en restaurant différentes activités biologiques endommagées dans le cerveau, dépendantes du cuivre, et impliquées dans des mécanismes physiologiques essentiels (production d’énergie, protection contre les agressions de l’oxygène). Dans cette étude préclinique visant à traiter les femmes enceintes présentant un risque d’avoir un enfant atteint de la maladie de Menkes, nous devons valider l’efficacité de la forme pharmaceutique chez la souris malade. Pour cela, les femelles porteuses de la mutation génétique seront accouplées puis traitées pendant la gestation avec la forme pharmaceutique. Ce traitement sera poursuivi chez les descendants mâles, malades (issu de ces mères traitées), dès l’âge de 5 jours après la naissance durant la lactation, et cela jusqu’à l’âge de 38 jours, fin du protocole. Des tests comportementaux non invasifs et non douloureux seront pratiqués chez les jeunes souris tout au long de leur croissance.
Bénéfices attendus
1/ Amélioration de la survie des souris mutantes traitées 2/ Amélioration des fonctions locomotrices et des fonctions d'apprentissage et de mémorisation grâce à un meilleur développement cérébral. 3/ Un traitement pendant la gestation des femelles porteuses de la mutation permettrait de palier aux troubles musculosquelettiques observés chez les souris malades même lorsqu’elles sont traitées avec le médicament dès l’âge de 5 jours.
Procédures
1/ Injections sous cutanées répétées de médicament 7 jours sur 7 au cours de la gestation jusqu’à la mise bas pour les femelles porteuses. Chaque piqure durant moins de 30 secondes. 2/ Injections sous cutanées répétées de médicament 7 jours sur 7 à partir de J5 et ce jusqu’à la fin du protocole à J38 pour les mâles descendants et porteurs de la maladie. 3/ Tests neurocomportementaux au nombre de 4 allant de J26 à J37 pour les souris mâles malades. Les tests durent en moyenne moins de 5 minutes pour chaque animal.
Impact sur les animaux
Les souris porteuses de la mutation, malades et non traitées ont une espérance de vie réduite, des troubles musculosquelettiques et un retard de développement des fonctions cérébrales. On constate également des défauts de croissance, des difficultés d'alimentation et un risque de mort de ces animaux par hémorragie interne. Les femelles gestantes porteuses de la mutation subiront des piqures quotidiennes de médicaments pendant toute la durée de la gestation, les mâles porteurs de la mutation seront traités quotidiennement et toute leur vie dès l’âge de 5 jours. Ces souris mâles suivront une série de tests comportementaux (exploration, coordination des mouvements, capacité de mémorisation) qui ne génèrent aucune souffrance chez l’animal, hormis un léger stress lié au changement d’environnement et à la manipulation de l’expérimentateur.
Devenir
Les souris femelles gestantes et porteuses de la mutation seront gardées en vie afin de perpétuer la lignée de souris mutantes utilisées dans ce projet. En revanche, l’ensemble des souris mâles porteurs de la mutation (54 animaux) seront mis à mort à la fin du protocole expérimental à l'âge de 38 jours, c'est-à-dire après avoir réalisé le dernier test comportemental, afin de prélever l'ensemble des organes nécessaires pour réaliser les analyses biologiques (foie, cœur, cerveau, sang).
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative d’approche in vitro car le projet porte sur l’étude de l’allongement de la durée de vie et l’amélioration du comportement de l’animal porteur de la maladie de Menkes en fonction de la réponse au traitement.
Réduction
L’étude complète nécessitera 54 femelles porteuses de la mutation génétique réparties en 3 groupes d'étude, afin de générer 54 mâles mutants (malades) répartis selon les mêmes groupes et traités jusqu’à l’âge de 38 jours. Il s'agit du nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien cette étude.
Raffinement
Tout au long de leur vie, les souris ne sont jamais isolées et vivent dans un environnement comportant des éléments d’enrichissement de type buchette ou papier de nidification. Toutes les procédures sont réalisées dans un environnement contrôlé et sécurisé pour l'animal. Une démarche d’estimation et suppression de la douleur est mise en place par évaluation quotidienne de l'état général de l'animal. Le stress généré par les tests comportementaux va diminuer avec l'habituation des souris et les manipulations répétées de l'expérimentateur.
Choix des espèces
La souris Moblo mime parfaitement la maladie de Menkes car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. Le protocole expérimental débutera dès le premier jour de gestation puis sur les souriceaux durant la lactation et la croissance et jusqu’à l'âge de 38 jours.
Evaluation de l’effet des antidépresseurs sur les mémoires spatiale et sociale à court et long terme chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Traitées quotidiennement à l'antidépresseur pendant sept à quinze jours, 160 souris porteuses d'une mutation reproduisant la maladie d'Alzheimer sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes tuées à l'issue pour doser les marqueurs de l'épilepsie. La gravité tient au traitement lui-même, les antidépresseurs pouvant aggraver les activités épileptiques de cette lignée et déclencher des crises. Le projet cherche à savoir si certaines de ces molécules accélèrent le déclin de la mémoire, l'hypothèse du porteur étant qu'une partie d'entre elles l'aggrave et une autre le protège. Deux tests par animal évaluent la mémoire spatiale et sociale, un troisième mesure le "niveau de résignation" des souris, sans qu'aucun de ces tests soit nommé.
Objectifs
Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui développent la maladie d’Alzheimer et des activités épileptiques. Nous étudierons les effets de 3 antidépresseurs sur les déficits mnésiques de ces souris à court et long terme dans 2 modalités : spatiale et sociale puis nous vérifierons l'effet antidépresseur de ces 3 molécules via un troisième test évaluant le niveau de résignation des animaux. Compte-tenu des connaissances actuelles sur les mécanismes d’action des antidépresseurs et de nos travaux antérieurs, nous suspectons un effet aggravateur de certains antidépresseurs et un effet protecteur pour d’autres sur les déficits mnésiques présents dans le cadre de la MA. Notre projet pourrait, à long terme, permettre de ralentir l’apparition des déficits mnésiques chez les patients atteints de la MA en remplaçant les traitements antidépresseurs aggravateurs par d’autres traitements ayant des bénéfices au moins similaires mais non responsables de l’accélération du déclin cognitif.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de déterminer si certains antidépresseurs accélèrent le déclin cognitif présent chez les souris modèles de la maladie d’Alzheimer et si d'autres ont un rôle protecteur vis-à-vis de ces mêmes déficits. Ainsi, si notre hypothèse se vérifie, ce projet justifiera la mise en place d’études cliniques permettant de tester cette hypothèse chez les patients. A long terme, ce projet pourrait donc permettre de mieux adapter les traitements antidépresseurs et ainsi apporter un bénéfice considérable aux patients atteints de la MA en évitant de majorer leurs déficits mnésiques.
Procédures
Les animaux recevront un traitement antidépresseur administré quotidiennement par voie orale dans l'eau de boisson ou par injections pendant 7 à 15 jours. Ils seront ensuite soumis à des tests comportementaux (2 tests par animaux) permettant d'évaluer leurs mémoires spatiale et sociale à court et long terme ainsi que leur niveau de résignation, mesure du niveau de dépression.
Impact sur les animaux
Certains antidépresseurs, en traitement chronique prolongé peuvent exacerber les activités épileptiques menant à l'apparition de crises d'épilepsie dans certains cas. Ces crises d'épilepsie sont responsables d'une altération du bien-être des animaux. Degré de sévérité : Sévère. Dans le cas où nous réaliserons des injections, celles-ci peuvent générer un stress modéré de courte durée. Les pesées peuvent entrainer un stress léger de quelques dizaines de secondes. Enfin, le test de résignation peut induire un stress modéré d’une courte durée (6 minutes).
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort afin de quantifier les marqueurs biologiques de l’épilepsie.
Remplacement
Le projet a pour objectif d’évaluer l’effet des antidépresseurs sur les déficits mnésiques dans la maladie d’Alzheimer (MA) à court et long terme. L'épilepsie comme la dépression dépendent d'interactions qui se font entre différentes régions cérébrales au sein de larges réseaux, qui ne peuvent pas être mimées dans de simples cultures cellulaires. Une approche par modélisation informatique des interactions entre maladie d'Alzheimer, épilepsie et antidépresseur ne pourra se faire que sur la base de données expérimentales qui ne sont que parcellaires pour le moment. Ainsi, nous sommes dans l’obligation d’utiliser un modèle murin de la MA qui ne peut donc être remplacé par aucun autre modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe (n= 8) a été déterminé sur la base de nos études antérieures de sorte à avoir une puissance statistique suffisante (>0.80) pour les analyses nécessaires aux comparaisons intergroupes (5 différents traitements) et intragroupes (comparaisons de chaque essai avec la première exposition au stimulus).
Raffinement
Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 10 minutes par souris avant le début des tests comportementaux. Les animaux seront suivis quotidiennement par des personnels formés au soin. Les antidépresseurs utilisés dans ce projet sont susceptibles d’induire une aggravation des activités épileptiques présentes chez les souris modèles de la MA. Ce phénomène pourrait être à l’origine d’une altération du bien-être des animaux. La durée de traitement sera comprise entre 7 et 15 jours dans tous les cas. Les tests comportementaux sont susceptibles d’induire du stress dû à la manipulation répétée des animaux et à leur changement d’environnement. Pour réduire ce stress, les animaux seront soumis à un jour d’habituation. Celle-ci comprendra une période d’habituation à la pièce dans laquelle seront réalisés les tests comportementaux qui durera 30 minutes suivies de 3 sessions de 6 minutes d’habituation.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous utiliserons des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Cette lignée reproduit de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’humain : plaques amyloïdes, déclin cognitif progressif et activités épileptiques, entre autres. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour l’étude des effets des antidépresseurs sur les déficits mnésiques dans la MA. Nous avons bien caractérisé le phénotype épileptique de ces souris et sommes actuellement en train de caractériser l’effet des antidépresseurs sur leur épilepsie. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte, entre 2 et 8 mois selon les traitements antidépresseurs administrés. En effet, à 2-3 mois, les souris modèles de la MA sont à un stade précoce de la maladie d’Alzheimer. Elles présentent déjà des activités épileptiques mais pas encore de déficits mnésiques à court comme à long terme. Ainsi, si notre hypothèse se confirme, il sera plus facile pour nous de mettre en évidence un effet aggravateur des traitements antidépresseurs sur les capacités mnésiques des animaux à cet âge. A 8 mois, les souris modèles de la MA sont à un stade avancé de la maladie d’Alzheimer. Elles présentent à la fois des activités épileptiques et des déficits mnésiques à court et long terme. Ainsi, si notre hypothèse se confirme, il sera plus facile pour nous de mettre en évidence un effet protecteur des traitements antidépresseurs sur les capacités mnésiques des animaux à cet âge.
étude du rôle des mécanismes moléculaires et facteurs hormonaux liés aux troubles locomoteurs chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Deux injections dans le canal rachidien à quatre semaines d'intervalle, une pompe osmotique implantée sous la peau, des enregistrements musculaires sous anesthésie et des biopsies de queue : 7 046 souris vont être utilisées, dont 3 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie porte une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, avec la perte des neurones moteurs et la dégradation musculaire qui l'accompagnent. Le porteur écrit pourtant qu'aucun effet indésirable n'a été décrit chez les animaux qui seront utilisés, tout en signalant par ailleurs une mobilité altérée liée au modèle. Chaque souris est mise à mort pour prélever sa moelle épinière et ses muscles.
Objectifs
Le projet vise à comprendre les mécanismes moléculaires à l'origine du déclin locomoteur dans le contexte du vieillissement et des maladies neurodégénératives. La découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques, en lien avec le mécanisme chargé de la dégradation de composants intercellulaires et les neurones, pourrait permettre de prévenir/traiter le déclin de nos fonctions locomotrices lié à l'âge et des maladies associées aux problèmes moteurs. Ces travaux de recherche devraient permettre de tester l’efficacité de ces thérapies. Le projet se déroule sur 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à améliorer notre connaissance des mécanismes impliqués dans le vieillissement et les maladies dégénératives. D'un point de vue biomédical, il pourrait conduire à l'identification de nouvelles stragégies thérapeutiques pour prévenir et/ou traiter le déclin lié à l'âge ou les maladies neurodégénératives, ce qui constitue actuellement un défi prioritaire pour les systèmes de santé du monde entier. Enfin, d’un point de vue thérapeutique, cette étude pourrait conduire à l’identification de cibles thérapeutiques dans le traitement de ces troubles.
Procédures
Les interventions subies par les animaux sont: - Deux injections intrathécales (10 minutes sous anesthésie par intrapéritonéal et sous analgésique en pré (30 minutes avant le début de la procédure) chirurgie puis 24 et 48 heures plus tard) espacées de 4 semaines. Pose d'une pompe osmotique sous-cutanée sous anesthésie et sous analgésie (en pré (30 minutes avant le début de la procédure) chirurgie puis 24 et 48 heures plus tard). Des tests de locomotion seront effectués, ainsi qu’un enregistrement musculaire sous anesthésie par voie intrapéritonéale. Au total, les souris recevront un maximum de 3 injections intrapéritonéal (durée totale de 15 secondes). Ces interventions seront fait dans l'établissement utilisateur 1. De plus, des biopsies de la queue seront effectuées dans l'établissement utilisateur 2 pour génotyper les souris.
Impact sur les animaux
Mobilité altérée liée au modèle sclérose latérale amyotrophique. Injection intrapéritonéale: peut causer une douleur légère due à la piqûre. Chirurgies (injections intrathécales ou pose de pompe osmotique): peut provoquer du stress dû à l'anesthésie et au dessèchement des yeux. Aucun effet indésirable n'a été décrit chez les animaux qui seront utilisés. La biopsie peut provoquer une douleur légère.
Devenir
Chaque animal sera mis à mort afin de prélever des tissus pour l'analyse moléculaire (moelle épinière et muscle).
Remplacement
La souris est le modèle le plus pertinent pour notre étude, car elle présente des similarités physiologiques avec les pathologies humaines. Il n'existe pas de modèle in vitro.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. De nombreux tissus seront collectés après mise à mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et protéomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations. De plus nous avons déterminé le nombre de souris par groupe en fonction de données de la littérature et grâce à l'utilisation d'un outil statistique.
Raffinement
Les souris bénéficieront de coton, de tunnels et de bâtonnets de bois à ronger afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un nid. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré en pré- et post-opératoire. A la suite de la chirurgie la souris sera réveillée au chaud et surveillée pendant les heures qui suivent et la bonne cicatrisation sera observée tous les jours durant la semaine qui suit l’opération par la personne en charge du protocole. Des points limites spécifiques à chaque étape ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour notre étude sur les problèmes de locomotion dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique (SLA). Ce modèle, créé en modifiant un gène spécifique, reproduit bien les troubles moteurs observés dans cette maladie. Il permet d’étudier à la fois les formes familiales et non familiales de la SLA, et simule la perte des cellules nerveuses responsables du mouvement, ce qui conduit à une dégradation des muscles. Ce modèle nous aide aussi à étudier comment certains processus biologiques, comme le fonctionnement des cellules, influencent la locomotion à différents stades de vieillissement. Le projet consiste à utiliser des souris âgées de 3 mois et de 16 mois, soumises à des tests pour observer leurs comportements. Ces deux âges ont été choisis pour représenter les stades jeunes et âgés des souris, ce qui permettra de comparer leurs capacités de mouvement et de mieux comprendre comment le vieillissement affecte ces fonctions. À 3 mois, les souris sont en pleine forme physique, tandis qu’à 16 mois, des signes de déclin moteur liés à l’âge commencent à apparaître. Parallèlement, des souris porteuses d’une mutation génétique associée à la SLA (sclérose latérale amyotrophique) seront utilisées à 10 jours et à 3 mois. À 10 jours, l'objectif est de vérifier leur génotype pour déterminer si elles portent ou non la mutation génétique. À 3 mois, les premières altérations motrices liées à la SLA commencent à se manifester, ce qui permet de suivre l’évolution de la maladie au fur et à mesure.
Impact de l’exposition périnatale à un régime occidental et de nanoparticules de plastique sur la fonction de barrière et la susceptibilité de la muqueuse intestinale à développer des pathologies chroniques
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Des gavages, des injections sous-cutanées et des prélèvements de sang, chez des femelles gestantes puis allaitantes exposées à un régime riche en graisses et en sucres et à des nanoparticules de polystyrène. 2 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dont 768 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Il s'agit de mesurer si cette exposition périnatale fragilise la barrière intestinale et favorise allergies alimentaires, maladies inflammatoires de l'intestin et désordres métaboliques. Le porteur écarte les analgésiques et les anti-inflammatoires, qui "risquent d'interférer" avec l'expérimentation, et décrit les atteintes en une ligne, du stress lié aux gavages et une douleur due aux colites, pour 768 souris classées en souffrance sévère.
Objectifs
Les plastiques sont utilisés dans une multitude d’emballages alimentaires et leur production mondiale atteint plus de 450 millions de tonnes par an et, moins de 10 % des plastiques sont recyclés, ce qui augmente leur rejet dans l’environnement et conduit à une distribution omniprésente de débris plastiques dans l’environnement. Les plastiques persistent longtemps dans l'environnement où, soumis au climat, ils se fragmentent en particules de nanoplastique (NPL). Ainsi, les populations humaines sont exposées au NPL dans leur vie quotidienne avec des effets inconnus sur la santé. Le polystyrène représente plus d’un tiers de la contamination plastique de l’environnement. Il est largement utilisé dans les emballages alimentaires mais son processus de recyclage a été reporté à 2030 en France. Parallèlement à l’augmentation de la production et de l’utilisation des plastiques, le nombre de patients atteints de maladies non transmissibles (MNT) ne cesse d’augmenter dans le monde. Parmi ces MNT, les réactions alimentaires indésirables (RAI) et les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). Les MNT sont multifactorielles impliquant des facteurs génétiques et environnementaux. L’alimentation humaine est un facteur environnemental majeur des MNT, qui a été radicalement modifié au cours des dernières décennies. L'objectif de ce projet est d'étudier tout risque pour la sécurité alimentaire, lié à la dissémination des NPL dans l'environnement et à leur transfert dans l'alimentation (emballages alimentaires…) associés à un régime alimentaire riche en graisses et en sucre (régime occidental). En effet, le régime occidental pourrait exacerber la diffusion du NPL et avoir des conséquences délétères, comme cela a été démontré pour le polystyrène (PS) sur le métabolisme lipidique du poisson zèbre. En fonction des résultats obtenus, nous étudierons les mécanismes impliqués en nous focalisant sur le microbiote et la perméabilité intestinale.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de comprendre l'impact d'une exposition périnatale à une alimentation occidentale couplée à des nanoparticules de plastique vieillies sur le développement et l'homéostasie de la fonction de barrière de la muqueuse intestinale chez le jeune et l'adulte. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de définir l'impact d'une exposition à un régime occidental couplée à des nanoparticules de plastique sur la susceptibilité de la muqueuse intestinale à développer (1) une intolérance ou une allergie orale à certain antigène alimentaire comme l’ovalbumine (2) des inflammations ou (3) un désordre métabolique. Ce projet permettra donc de définir les liens de causalités entre certains composants de l’environnement et le développement de l’intolérance ou l'allergie alimentaire, des MICI ou un désordre métabolique ainsi qu'une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Une meilleure compréhension de ces maladies permettra alors une meilleure prise en charge thérapeutique.
Procédures
Les animaux seront soumis a des gavages (1 maximum par procédures). Des injections sous cutanées (2 maximum par procédures) et des prélèvements sanguins. chacun de ces actes prend moins d'une minute.
Impact sur les animaux
stress suite aux gavages/administrations/prélèvements, la douleur est due aux colites
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. Les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire
Remplacement
Le développement d'intolérance ou d'allergie alimentaire, des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) ou de désordres métaboliques chez l’Homme est un processus long et complexe mettant en jeu de nombreux facteurs génétiques et environnementaux. Les modèles murins mimant les pathologies humaines sont la seule solution actuelle pour obtenir des données avec une relevance physiologique correcte. Pour atteindre les objectifs de nos études, il est nécessaire d'utiliser des modèles in vivo capables de tenir compte de nombreuses voies physiologiques intégrées. Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives à ces études in vivo. L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques concernant les intolérances/allergies alimentaires, les MICI et les désordres métaboliques. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Aucune autre espèce d'animaux n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans chaque expérience a été calculé à minima en tenant compte de la variance biologique des résultats obtenus. Les données obtenus dans les différents groupes seront coomparées statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tous les échantillons prélevés sont stokés à -80°C et dans une banque de données. Ils peuvent être réutilisés ou servir de témoins dans des expériences ultérieures.
Raffinement
Les souris sont hébergées par 5 dans des cages de portoirs ventilés , avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Elles ont une maison en plastique et des fibres de carton comme enrichissement. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Des analgésiques, des antalgiques ou des anti-inflammatoires risquent d'interférer avec le cours de notre expérimentation. Nous avons mis en place des critères d'arrêt appliqués selon un arbre décisionnel permettant de mettre fin a d'eventuelles souffrances par euthanasie des souris. Un suivi quotidien est assuré par les membres de la SBEA (Structure en Charge du Bien-Etre Animal) pour apprécier leur etat general.
Choix des espèces
L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques (intolérances/allergies alimentaires, les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) et les désordres métaboliques). Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Enfin, les procédures d'intolérance alimentaire (IA) et de MICI utilisées dans ce projet ont été validées que chez la souris. Pour l'expostion périnatale, nous utiliserons des femelles gestantes et allaitantes. Ces souris femelles seront exposées au régime occidental pendant toute la gestation et l'allaitement (sevrage J21). Ces femelles seront également gavaées une fois par jour du 10ieme jour de gestation jusqu'au sevrage des nouveau-nés (J 21). Puis nous étudierons l'impact d'une exposition périnatale au plastique sur: l'homéostasie de la fonction de barriere de la muqueuse intestinale. La mise en place de tolérance orale La susceptibilité et l'aggravation de la colite Le métabolisme du glucose
Etude de l’atteinte multiviscérale dans l’insuffisance rénale chronique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
185 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour les prélèvements, dont 101 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit l'ablation des cinq sixièmes de la fonction rénale en une seule opération de trente minutes, puis une échographie sous anesthésie gazeuse tous les trois mois pendant neuf mois. Le porteur décrit la progression attendue, hypertension pendant trois semaines, stabilisation, puis dégradation vers l'insuffisance rénale terminale pour 20 % des animaux au bout de six mois, qui sont alors tués. Sur le remplacement, il affirme que le modèle animal est "indispensable" parce que l'interaction entre rein, cœur, cerveau et muscles ne se reproduit pas autrement, et ajoute que le témoin sain est lui aussi "indispensable".
Objectifs
L'insuffisance rénale chronique (IRC) est un problème de santé publique mondial en raison de l'augmentation de son incidence et de sa prévalence avec près de 3 millions de patients touchés en France. Cette pathologie entraine dans des stades avancés des troubles généraux impliquant de nombreux organes. Une atteinte cardiovasculaire est observée à des degrés variables lors de l’insuffisance rénale chronique. C’est ce que l’on appelle en clinique le syndrome cardio-rénal. D’autre part, une perte de fonction et une réduction de la masse musculaire est également associée à l’insuffisance rénale chronique. Environ 50% des patients insuffisant rénaux sont affectés par cette myopathie dite urémique. L’atteinte des muscles entraine une faiblesse musculaire et une incapacité à se déplacer. Cette myopathie urémique est corrélée avec une augmentation de la mortalité et de la morbidité. De plus, les données épidémiologiques suggèrent que les individus à tous les stades de l'IRC ont un risque plus élevé de développer des troubles neuropsychiatriques, des troubles cognitifs et de la démence. L'insuffisance rénale augmente la sévérité des troubles cognitifs dans la maladie d’Alzheimer et la dialyse sur des modèles animaux de cette pathologie atténue les déficits cognitifs, la neuroinflammation et les processus neurodégénératifs. Le projet a pour but d’étudier la cinétique des modifications tissulaires et cellulaires des muscles squelettiques et cardiaque et du système nerveux au cours du développement de l’insuffisance rénale chronique. Un objectif important de cette étude est la compréhension de la chronologie de l’installation des atteintes cardiaque et musculaire et cérébrale accompagnant la maladie rénale. Pour cela, l’évaluation de la fonction cardiaque sera effectuée par échographie, l’atteinte cérébrale sera déterminée par des tests de comportement ainsi que le niveau d’oxygénation du cerveau par photoacoustique et la fonction musculaire par des tests d’efforts. Les signalisations impliquant la fibrose cardiaque, l’atteinte neuro-musculaire et la neuro-inflammation du système nerveux central seront évaluées sur ces organes après prélèvements. Cette étude chez l’animal approfondit, complète et étend une étude clinique sur la recherche de biomarqueurs à des fins diagnostiques et pronostiques menée chez le patient à divers stades d’insuffisance rénale chronique.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour but d’étudier, de façon intégrée, comment l’insuffisance rénale chronique altère les fonctions cardiaque, cognitive et musculaire au cours du temps et quelles sont les signalisations cellulaires modifiées et pourquoi. Nous souhaitons également rechercher des biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic de ces différentes atteintes. De plus, un protocole de réhabilitation cardiaque et musculaire par l’activité physique sera également effectué dans cette étude.
Procédures
La moitié des animaux subiront une néphrectomie , l'opération dure environ 30 min. Ensuite, il n'y a pas d'autres interventions sauf des anesthésies gazeuses par isofluorane afin d'effectuer des échographies ou photoacoustique une fois chaque 3 mois.
Impact sur les animaux
Dans les 3 premières semaines il va y avoir une hypertension artérielle chez les animaux liée à la demande du rein restant d'être plus perfusé car ce dernier étant ligaturé sur des artérioles rénales voit son afflux sanguin diminué. Ensuite, comme pour l'Homme, le rein va s'adapter et compenser la perte de la fonction rénale et l'animal restera stable pendant plusieurs mois. Au bout de 3-4 mois (pour la majorité) l'insuffisance rénale va progresser sur plusieurs mois pour arriver à une insuffisance rénale terminale. Au cours de cette progression l'animal redéveloppe une hypertension artérielle modérée qui va entrainer une insuffisance diastolique qui se transformera en insuffisance cardiaque dans les stades terminaux. Dans notre cinétique, la majorité des animaux n'arrivent pas à un stade terminal car ce n'est pas le but de l'étude. 20% des animaux après 6 mois de néphrectomies progresserons vers une insuffisance rénale terminale et ces animaux seront euthanasiés immédiatement afin d'éviter toutes souffranes. Les analyses échographiques, photoacoustique ou tests de comportement n'apporte pas de nuissances pour l'animal.
Devenir
les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer les prélévements biologiques.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable à cette étude sur les effets cardiaques, cérébral et musculaires d'une pathologie rénale chronique. L'interaction entre différents organes (rein-cœur-cerveau-muscles) est nécessaire et elle représente bien la pathologie humaine affectant divers organes cibles à divers stades de l’insuffisance rénale chronique. Le développement du remodelage structurel des tissus ne peut être évalué que sur l’animal. Le rat soumis à une néphrectomie subtotale (Réduction Masse Rénale = RMR) représente le modèle d'insuffisance rénale chronique progressive reconnu entrainant des atteintes du muscle cardiaque et des muscles squelettiques et cérébral. Son témoin sain est également indispensable pour valider nos hypothèses de travail. Ces déterminants ne peuvent pas être reproduits dans leur complexité par des méthodes alternatives.
Réduction
Lors de cette étude nous aurons besoin de 185 animaux. Ce nombre a été calculé par une approche statistique sur le critére échographique diastolique E/e'. Le fait de suivre les animaux en cinétique d'un point de vue échographique, photo acoustique et comportement, permet de réduire le nombre d'animaux utilisés car ils sont également leurs propre contrôles au cours du temps. En effet, si on n'effectuait pas ces analyses en cinétique, il nous faudrait 26 animaux par groupe au lieu de 14 pour la version la plus optimiste et il nous en faudrait 57 par groupe pour la version la plus pessimiste du calcul du nombre d'animaux.
Raffinement
J'effectue la néphrectomie des 5/6 de la fonction rénale en une seule chirurgie contrairement aux protocoles publiés classiquement ce qui permet de limiter le nombres d'anasthésies et d'ouverture de l'animal sur une semaine. Avec cette méthode, nous avons très rarement des décès et nous réduisons les souffrances. Une injection d'analgésique est effectuée pour limiter la douleur en pré-opératoire et post-opératoire 2 fois par jour pendant 48h. L’animal en post-opératoire est placé dans une cage individuelle et surveillé jusqu’à son complet réveil. Les animaux sont gardés dans les pièces de stabulation dédiées, deux par cage et surveillés quotidiennement la première semaine. Ils ont bien sûr un accès libre à la boisson et à la nourriture. Le milieu est enrichi par l’ajout de cubes de bois ou de tunels en carton. Après le suivi quotidien de la première semaine, un suivi bihebdomadaire est effectué pour vérifier l'état de santé des rats. Le poids des animaux est contrôlé toutes les semaines. Si un des animaux est en souffrance selon la grille des points limites (ci-joint) ce dernier sera euthanasié.
Choix des espèces
Le rat est probablement l’animal dont la fonction rénale et les pathologies associées sont les plus proches de celles de l’homme. Ce modèle de réduction de la masse rénale est bien caractérisé et les outils immunologiques, biochimiques et moléculaires sont disponibles pour cette espèce. Les rats auront entre 11 et 12 semaines au moment de la néphrectomie subtotale. Ils seront ensuite étudiés à trois temps, 12, 24 et 36 semaines de la pathologie. Cela correspond à la progression de la pathologie dans les stades 3 et 4 de l’insuffisance rénale chronique. Au stade 3, la fonction rénale est approximativement divisée par deux avec une créatinine (marqueur de la fonction rénale) à 70-80 micromole.l-1 et au stade 4 la fonction rénale est approximativement divisée par 3-4 avec une créatinine d'environ 110-140 micromole.l-1. Au stade 3 l'hypertension et l'insuffisance diastolique commencent à s'installer et au stade 4 les rats ont une hypertension persistante (140-150 mmHg) et une insuffisance diastolique avec une fibrose cardiaque. Les atteintes musculaire et cérébrale apparaissent plutôt au début du stade 4.