Lapins

Produire des sérums sur commande, un par animal, pour équiper en anticorps polyclonaux les services de diagnostic de l'établissement : 300 souris, 75 cobayes et 50 lapins vont être utilisés sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections intrapéritonéales d'antigènes inactivés avec adjuvants, deux prélèvements sanguins à la lancette au niveau de la jugulaire pour les souris et les cobayes, puis une injection létale avant les prélèvements post-mortem. Aucun n'est gardé vivant ni placé, le porteur invoquant l'immunisation avec des agents pathogènes de classe 2 ou 3, même inactivés. Il indique que les méthodes existantes, phage display, fusion cellulaire, puces, in vitro, servent la production d'anticorps monoclonaux et ne visent pas "l'ensemble des anticorps ciblant le maximum d'épitopes d'un antigène ou d'un organisme entier", d'où le caractère "incontournable" du recours aux animaux.

Objectifs

De nombreux et nouveaux agents biologiques voire pathogènes sont découverts régulièrement dans le monde entier chaque année. L’intérêt de ce projet est de développer des outils de recherche et de diagnostic afin de détecter et suivre ces agents en recherche médicale humaine et/ ou vétérinaire. Nous avons besoin pour cela de produire des anticorps dirigés contre ces agents biologiques après une immunisation effectuée soit chez la souris soit chez le lapin ou le cobaye. Le choix de l’espèce se fait en fonction de l’affinité et de la quantité souhaité ainsi que de l’agent biologique étudié. Tout agent pathogène sera inactivé avant injection afin de préserver l’animal. Des adjuvants pourront être utilisés pour favoriser les réponses immunitaires. Le nombre de sérum obtenu dépendra du nombre d’antigène à tester dans l’année. Nous évaluons nos besoins sur 5 ans pour la production d’anticorps polyclonaux : entre 24 à 60 souris par an, 5 à 10 lapins par an et 5 à 15 cobayes par an et autant de sérum. On peut ainsi produire 300 sérums avec les 300 souris pour 60 à 100 Antigènes qui nous seraient fournis. Pour les cobayes, 75 sérums pour 25 à 75 antigènes et pour le lapin : 50 sérums pour 25 à 50 antigènes, le tout sur 5 ans.

Bénéfices attendus

De nombreux et nouveaux agents biologiques voire pathogènes sont découverts régulièrement dans le monde entier chaque année. L’intérêt de ce projet est de développer des outils de recherche et de diagnostic afin de détecter et suivre ces agents en recherche médicale humaine et/ ou vétérinaire.

Procédures

Les interventions sur les animaux seront les 3 injections en IP pour l'immunisation, l'injection en IP des solutions d'anesthésiant avant les 2 prélèvements (préimmuns et intermédiaires). Puis, in fine, l'injection en IP d'anesthésiant/euthanasiant avant les prélèvements post-mortem. La durée de chaque injection contenant des adjuvants est d'environ 2 minutes maximum par animal. Pour les prélèvements intermédiaires à l'aide des lancettes au niveau des jugulaires pour les souris et les cobayes, le geste est rapide (1 minute environ par animal). Pour les lapins, une attente de 20-30 minutes pour s'assurer de l'effet de la crème lidocaïne avant le prélèvement dont la durée variera en fonction du débit sanguin (soit 2-3 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles potentiellement dûes aux injections en IP pour les immunisations puis des solutions d'anesthésiant/ euthanasiant avant les prélèvements finaux.

Devenir

Euthanasie. Les animaux sont majoritairement immunisés avec des agents pathogènes de classe 2 ou 3 qui même inactivés ne sont pas compatibles avec la possibilité de réutiliser ces animaux dans une autre procédure ou d’envisager un placement.

Remplacement

A ce jour, seul l’utilisation d’animaux permet la production d’anticorps polyclonaux sur la totalité de l'antigène afin d'obtenir des tests de diagnostic et des outils de recherches efficaces et fiables (Immunofluorescence en particulier) utilisés dans les services concernés dans notre établissement sur des microorganismes identifiés ou pas encore, pathogènes ou non. Les méthodes alternatives existantes à ce jour telles que Phage display ou fusion cellulaire, puces, in-vitro ou ex vivo, sont des méthodes développées et utilisées à des fins de production d’anticorps monoclonaux ou test thérapeutiques ou pharmacologiques. Ils ne sont pas adaptés à nos besoins qui sont de viser l’ensemble des anticorps ciblant le maximum d’épitopes d’un antigène ou d’un organisme entier. L’utilisation des animaux reste alors incontournable pour nous.

Réduction

Un minimum d’animaux est utilisé pour des productions polyclonales ciblant la totalité de l’antigène. Chaque animal est son propre témoin : avant l’immunisation, du sérum pré-immun est prélevé pour s’assurer de la réponse immunitaire attendue. Nous évaluons nos besoins sur 5 ans pour la production d’anticorps polyclonaux : entre 24 à 60 souris par an, 5 à 10 lapins par an et 5 à 15 cobayes par an. Au total nous aurions au maximum : 300 souris, 50 lapins et 75 cobayes sur 5 ans.

Raffinement

Chaque groupe ou animal sera stabulé dans une cage dans un même portoir ou armoire ventilé durant la totalité de l’expérimentation. Chaque groupe ou animal sera suivi de manière quotidienne, un enrichissement approprié (en fonction de l’espèce : igloos, matériel de nidification) sera disposé dans chaque cage. La nourriture et l’eau sont disponibles à volonté. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel compétent et expérimenté (pelage, respiration et mobilité) et pesés (2 fois par semaine) afin de relever tout signe d’anormalité. Une grille de Morton et Griffits adaptée sera utilisée pour suivre les animaux immunisés. Tout signe de douleur et/ou souffrance entraînera l’arrêt de la procédure et les animaux seront euthanasiés par injection de surdosage de produit létal précédée d’une sédation profonde. Lors de procédures de prélèvements des anesthésies générales et/ou locales seront réalisées en fonction de l’animal.

Choix des espèces

Les espèces choisies (souris, lapin et cobaye) sont celles retenues pour la production d'anticorps avec un titre relativement élevé en fonction de l'affinité du microorganime pour son hôte. Des souris âgées de 4-6 semaines seront utilisées. Des lapins âgés de 3 mois seront utilisés. Des cobayes âgés de 5-6 semaines seront utilisés. Le jeune âge de chaque espèce est favorable à une bonne réponse immunitaire.

Injectés sous la peau ou dans le derme, des dispositifs médicaux de type III sont testés sur des rats, des lapins et des cochons, ces derniers pouvant subir jusqu'à vingt biopsies cutanées sous anesthésie générale. 300 animaux non-humains, 200 rats, 50 lapins et 50 cochons, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La plupart sont tués pour prélever les sites d'injection, et une partie des cochons biopsiés peut être gardée en vie pour une réutilisation, 10 animaux non-humains étant déclarés réutilisés toutes espèces confondues, le tout pour constituer des dossiers de mise sur le marché. Le porteur invoque le règlement européen 2017/745 et la norme ISO 10993, et affirme que seule l'implantation "dans un organisme complet et vivant" renseigne sur la réponse inflammatoire.

Objectifs

Le projet a pour objectifs d'obtenir des informations relatives à la tolérance locale de dispositifs médicaux injectables, ainsi qu'au comportement de ces derniers au sein des tissus, notamment en ce qui concerne leur résorption et leur intégration.

Bénéfices attendus

Les projet permettra d'obtenir des données fiables concernant la tolérance, l'intégration et la dégradation des dispositifs médicaux injectables. Il permettra également de répondre aux exigences réglementaires concernant la constitution des dossiers en vue d'une mise sur le marché. Ceci afin d'assurer la sécurité des patients recevant ces produits.ainsi d'assurer la sécurité des patients recevant les produits.

Procédures

Les animaux auront des injections sous anesthésie génér le à J0, pour une durée totale de 5 à 15 minutes/animal. D'autres actes sont envisagés mais non systématiques: Prises de sang: rats sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 1/mois maxi, 30 seconde par acte. Lapins vigiles avec anesthésie locale: 1 fois par semaine maximum pendant 1 mois, puis 1 fois par mois maximum, 1 minute maximum par acte. Porcs: sous anesthésie générale 1/semaine maxi pendant 1 mois, puis 2 fois par mois maximum. Biopsies cutanées chez le Porc: sous anesthésie générale (injection intramusculaire, 30 secondes), maximum 20 biopsies réparties sur la durée de l'étude, durée 15 minutes environ par biopsie.

Impact sur les animaux

Les produits développés sont constitués de produits biocompatiblesen solution aqueuse plus ou moins visqueuse. Il s'agit de composants très bien documentés pour une utilisation chez l'Homme. Ils sont par ailleurs évalués en premier lieu in vitro: les effets néfastes attendus chez l'animal après implantation sont donc mineurs, et constitués majoritairement d'inflammation locale légère à modérée. Dans de rares cas, les implantations intradermiques chez le Lapin peuvent générer des réaction un peu plus fortes, mais restant localisées au niveau du site d'injection.

Devenir

Dans la majorité des cas, les animaux devront être euthanasiés, afin de prélever les sites d'injection à des fins d'analyse. Cependant, chez les porcs, lors d'injections intradermiques, il sera parfois possible de réaliser les prélèvements par biopsie avec un biopsy punch (sous anesthésie générale) et de conserver les animaux en fin d'étude en vue d'une réutilisation.

Remplacement

Les produits étudiés sont d'abord évalués de façon approfondie grâce à des expériences in vitro: culture cellulaire, modèles de peau artificielle, organe isolé. Les essais de tolérance/biocompatibilité in vivo sont indispensables en complément des tests in vitro, lors de la mise au point d'un dispositif médical. En effet, seule l'implantation dans un organisme complet et vivant permettra d'évaluer d'éventuelles réponses immunitaires/inflammatoires ainsi que l'intégration des produits dans les tissus environnants. Par ailleurs, le recours aux animaux est rendu obligatoire par le règlement Européen (UE) 2017/745 tout en suivant la norme ISO 10993, pour l'élaboration des dossiers pour l'obtention d'un marquage CE (équivalent de l'AMM mais pour les dispositifs médicaux) et également demandé pour les dossiers équivalents dans les pays tiers.

Réduction

Le nombre d'animaux à utiliser dans les études réglementaires est imposé par la norme ISO 10993, les préconisations sont donc suivies, sans augmenter inutilement le nombre d'animaux et sans répéter les protocoles. Dans le cas d'études non réglementaires, on veille à n'utiliser que les animaux strictement nécessaires pour l'obtention des résultats voulus, généralement un nombre très inférieur aux exigences réglementaires. La possibilité d'injecter plusieurs produits en différents sites chez un même animal, permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Une période d'acclimatation systématique est respectée (durée selon l'espèce animale, mais toujours minimum 1 semaine). Les animaux sont hébergés en groupe et ont accès à un enrichissement spécifique à leur espèce (matériel de nidification pour les rats, blocs/objets à mâcher pour tous les animaux, jouets…). Des points limites, suffisamment prédictifs, permettent de sortir un animal de l’étude en cas d'effet secondaire sévère, ou de mettre en place des traitements pour des réactions locales (application de cicatrisant, administration d'antidouleur) afin que l'animal soit impacté le moins possible. Toues les manipulations des animaux seront réalisées dans un contexte de renforcement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Les actes trop stressants ou douloureux sont effectués sous anesthésie générale: injections à J0, prises de sang chez le Rat, chez le Porc, et biopsies cutanées chez le Porc. Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de la procédure (observation quotidienne et suivi clinique avec pesée minimum une fois par semaine). Quelles que soient les procédures, toute éventuelle douleur est, si nécessaire, rigoureusement contrôlée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (anesthésie/analgésie).

Choix des espèces

Les 3 espèces font parties des espèces préconisées par la norme 10993-6. Le rat et le lapin sont des modèles d'implantation utilisés et maitrisés dans l'établissement utilisateur depuis 2006. Leur taille est suffisante pour permettre l'implantation de plusieurs produits chez un seul animal, l'utilisation de techniques d'imagerie et d'appareils de mesures de paramètres cutanés. Le porc est l’espèce animale se rapprochant anatomiquement le plus de l’Homme ; notamment dans la structure de la peau (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent). Cette similitude permet d'évaluer avec une plus grande certitude l’effet attendu en clinique. Sa taille, plus importante, permet également l'implantation de plus de produits chez un seul animal, permettant alors de réduire le nombre d'animaux utilisé. Ces modèles sont des modèles de choix (nombreuses données dans la littérature). Leurs comportements sont bien connus, ce qui permet de détecter facilement tout signe de douleur et/ou de mal-être. Les rats utilisés seront de jeunes adultes, environ 300g (=en fin de croissance, paramètres physiologiques stables). Les lapins seront âgés d'environ 14 semaines, soit environ 3.5kg (= présence d'un derme suffisamment épais pour que l'implantation intradermique des produits ne génère pas une contrainte mécanique trop importante). Les porcs utilisés seront de jeunes adultes. En effet, leur taille doit permettre un hébergement en animalerie conventionnelle dans de bonnes conditions. D’autre part, leur poids de 35kg à 70kg permettra de travailler sur des structures épidermiques, comparable à celles de l'homme (couche cornée et ratio derme/épiderme équivalent) ; indispensable pour reproduire les conditions attendues en clinique.

Trois lignées de souris, dont une modifiée pour ne plus produire le sucre alpha-Gal, et des lapins blancs de Nouvelle-Zélande retenus parce qu'ils fournissent de gros volumes de sang : 300 souris et 9 lapins vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les souris portent sur le dos une capsule contenant des tiques qui se nourrissent sur elles, ce qui impose un hébergement individuel puisqu'elles arrachent les capsules de leurs congénères et mangent les tiques. Les lapins reçoivent deux immunisations, puis un prélèvement dans la veine de l'oreille et enfin un prélèvement intracardiaque sous anesthésie. Toutes et tous sont tués pour récupérer sang et organes, alors que le calcul de puissance annonçait 33 souris par groupe et que le porteur en retient cinq.

Objectifs

Objectif 1 : Infection des souris pour obtenir des tiques infectées par Borrelia spp. La maladie de Lyme, causée par la bactérie Borrelia spp., est une maladie transmise aux animaux et aux humains qui est en pleine expansion, notamment en Europe, où son incidence a considérablement augmenté ces dernières années, en particulier en France. Comprendre comment les tiques, principaux transmetteurs de cette maladie, sont infectées et comment la bactérie se transmet des animaux ou des humains aux tiques est essentiel pour développer des stratégies de prévention. En infectant des souris avec Borrelia spp., ce projet cherche à générer des tiques infectées de manière contrôlée, afin de mieux comprendre le cycle de transmission et d’examiner les interactions animaux/humains-Borrelia et les tiques. Cette connaissance est cruciale pour identifier de nouvelles cibles permettant d'interrompre la transmission de Borrelia spp. Objectif 2 : Induction d'anticorps spécifiques contre le sucre α-Gal pour protéger contre l'infection par Borrelia spp.Des études antérieures ont démontré que les anticorps contre le sucre α-Gal, générés naturellement en réponse à certains stimuli, peuvent offrir une protection contre divers pathogènes, y compris ceux qui exposent ce sucre à leur surface, comme Borrelia spp. La vaccination avec le sucre ou avec des variantes de la bactérie E. coli qui ne causent pas de maladies et exprimant ce sucre pourrait induire la production de ces anticorps protecteurs. L'objectif de cette partie du projet est de tester cette approche innovante. Si elle s'avère efficace, elle pourrait ouvrir une nouvelle voie pour la prévention de la maladie de Lyme, représentant ainsi une avancée majeure, car aucun vaccin n’est actuellement disponible pour les animaux ou les humains. Objectif 3 : vaccination des lapins pour des études in vitro. Les lapins seront utilisés pour produire des volumes importants de sérum riche en anticorps contre α-Gal et contre E. coli, ce qui est crucial pour les expérimentations complémentaires. Ce sérum permettra de tester en laboratoire, à plus grande échelle, l'efficacité des anticorps produits par les vaccins expérimentaux, garantissant ainsi une meilleure reproductibilité et une plus grande précision dans les résultats. L’utilisation des lapins, qui permettent de récolter un plus grand volume de sérum que les souris, réduit le nombre total d’animaux nécessaires et améliore la qualité des études futures.

Bénéfices attendus

Les tiques sont les principaux transmetteurs de pathogènes provoquant des maladies graves chez les humains et les animaux, comme la maladie de Lyme causée par Borrelia spp. et transmise par les tiques Ixodes. Borrelia burgdorferi est la principale espèce responsable de la maladie de Lyme en Amérique du Nord, transmise par Ixodes scapularis, tandis que Borrelia afzelii est plus courante en Europe, où elle est transmise par l'espèce homologue I. ricinus. Actuellement, il n'existe pas de vaccin efficace contre Borrelia spp., et la lutte contre les tiques repose principalement sur l'utilisation d'acaricides, qui contaminent l'environnement ainsi que les produits animaux destinés à la consommation humaine. De plus, l’utilisation d’acaricides peut entraîner la sélection de populations de tiques résistantes. Étant donné la gravité des maladies transmises par les tiques et l'absence de mesures préventives efficaces, hormis l'évitement des piqûres de tiques, ce projet vise à développer des stratégies de vaccination plus sûres et plus efficaces. En particulier, il cherche à développer des vaccins basés sur le sucre α-Gal, offrant une protection à la fois contre les tiques et contre la maladie de Lyme

Procédures

Les souris recevront deux injections sous-cutanées et un maximum de trois prélèvements sanguins ; ces prélèvement dureront 10 minutes, anesthésie comprise.. Les lapins seront immunisés par voie souscutanée avec des variantes d'E. coli qui ne causent pas de maladies ou avec le sucre α-Gal, avec deux injections. Les jours 0 et 14 après la première vaccination, un prélèvement sanguin sera effectué dans la veine auriculaire ; le prélèvement durera 8 minutes, anesthésie comprise. Le jour 30 après la vaccination de rappel, un prélèvement sanguin intracardiaque sera réalisé sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

L'alimentation des tiques pourrait provoquer un inconfort modéré chez les animaux, et ceux-ci pourraient également ressentir un léger inconfort en raison de la pose de la capsule sur leur dos. Aucune souffrance particulière n'est attendue en raison de l'infection, car les souris sont les transmetteurs naturels de Borrelia et ne présentent pas de symptômes. La pose des capsules a été optimisée pour minimiser l'inconfort tout en maximisant les résultats expérimentaux. Cependant, l'expérience sera interrompue en cas d'événements indésirables tels que : (i) un choc anaphylactique dû aux piqûres de tiques ou à l'infection bactérienne ; (ii) une réaction cutanée généralisée affectant les voies respiratoires ou gastro-intestinales après l'immunisation ; (iii) des blessures auto-infligées par les animaux tentant de retirer la capsule ; (iv) des signes graves après l'exposition aux micro-organismes. Les animaux seront surveillés quotidiennement et, si nécessaire, l'expérience sera arrêtée. Les critères d'évaluation incluent une échelle de 3 niveaux, et tout animal atteignant un score de 3 sera mis à mort : (1) infecté sans signe visible ; (2) poils hérissés, activité réduite, légère posture voûtée ; (3) posture voûtée, difficulté à maintenir la position, prostration, respiration superficielle ; (4) décès.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total et des organes.

Remplacement

Ce projet consiste à nourrir des tiques sur des souris préalablement immunisées avec E. coli ou α-gal-BSA afin d'évaluer les effets protecteurs des anticorps anti-α-Gal contre Borrelia spp., ainsi que la survie des tiques et l'acquisition de Borrelia spp. par ces dernières. Il n'existe actuellement aucun modèle in vitro capable de reproduire la réponse immunitaire des souris à une infection bactérienne, ce qui empêche d'analyser adéquatement les effets protecteurs et la colonisation de Borrelia spp. chez les tiques. Pour obtenir un plus grand volume de sérum destiné à des études supplémentaires in vitro, nous immuniserons également des lapins, évitant ainsi l'utilisation supplémentaire de souris. L'immunisation des lapins permettra d'obtenir du sérum anti-α-Gal ou anti-E. coli, offrant un meilleur contrôle sur la qualité, la spécificité et l'affinité des anticorps, ce qui garantit la cohérence et la reproductibilité des expériences. De plus, elle permettra la production d'anticorps à plus grande échelle, répondant ainsi aux besoins expérimentaux spécifiques.

Réduction

Nous utiliserons 5 souris par groupe pour obtenir un nombre suffisant de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Le nombre d'animaux sera calculé pour être le minimum requis afin d'obtenir les tiques gorgées, indispensables à nos recherches. Pour développer un test de puissance statistique robuste permettant d’analyser la relation entre les anticorps anti-alpha-gal et la protection, nous avons fixé le niveau de confiance à 5%, en nous basant sur les données publiées disponibles. Nous avons ciblé une puissance statistique de 0,8, en supposant un effet de taille modérée, ce qui indiquait un besoin de 33 souris par groupe pour un test ANOVA. En appliquant le principe des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement), nous avons réduit la taille de l’échantillon à 5 souris par groupe afin de minimiser l'utilisation des animaux tout en maintenant des résultats significatifs.Chaque souris peut nourrir jusqu'à 100 larves ou 30 nymphes. Comme les larves sont plus petites et nécessitent moins de ressources que les nymphes, il est possible d'utiliser 100 larves et 20 nymphes par souris, sans affecter leur santé, tout en garantissant un nombre suffisant de larves et de nymphes infectées pour mener à bien les études expérimentales. Environ 30 % des tiques se détacheront sans avoir pris un repas complet ou mourront, ce qui nous permettra d'obtenir 70 larves ou 20 nymphes gorgées par souris. Parmi les 350 larves obtenues, 200 seront élevées jusqu'au stade de nymphe pour obtenir des nymphes infectées par Borrelia, utilisées dans des études in vitro. Les 150 larves restantes seront réparties de la manière suivante : 75 pour la quantification de Borrelia et 75 pour les études d'immunité des tiques, en lien avec l'immunisation des souris et l'infection. Pour les 100 nymphes, 50 seront dédiées à chaque type d'étude similaire. Par conséquent, il faut prévoir 5 souris par groupe pour obtenir un nombre suffisant de tiques gorgées nécessaires à nos analyses. Le nombre d'animaux a été calculé pour être le minimum nécessaire à l’obtention des tiques gorgées, indispensables à nos recherches. Les souris seront gardées un maximum de 6 jours, temps nécessaire pour que les nymphes complètent leur repas. Nous avons également calculé le nombre minimal de lapins requis pour obtenir le volume de sérum nécessaire à nos futures expérimentations in vivo.

Raffinement

Souris : Les souris seront hébergées en groupes de 5 dans leurs conditions habituelles, avec un enrichissement nécessaire à leur bien-être (carrés de coton, maison en plastique). Elles seront surveillées quotidiennement pour détecter tout signe de malaise ou de symptôme. L’application des capsules contenant les tiques sur le dos des souris se fera sous anesthésie pour minimiser le stress et l'inconfort associés à cette manipulation. Une fois les capsules fixées, les souris seront placées dans des cages individuelles, car elles ont tendance à retirer les capsules des autres et à consommer les tiques. Malgré cet isolement, elles continueront de bénéficier des mêmes conditions d'enrichissement (carré de coton, maison en plastique), et, pour pallier leur isolement, des enrichissements supplémentaires, tels que des bâtonnets à ronger, seront ajoutés. Des points limites stricts seront appliqués pour identifier rapidement toute détérioration de leur état de santé, et les souris présentant des signes de douleur ou de détresse inhabituels seront retirées de l'expérimentation et recevront des soins appropriés. Lapins : À leur arrivée, les lapins seront logés dans des cages équipées de plateformes de repos et d’enrichissements spécifiques à leur bien-être, comme des balles, des branches en bois à ronger et des végétaux. Ils seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation pour garantir leur santé et leur confort. Étant sensibles aux manipulations, les lapins seront régulièrement contrôlés et manipulés par le personnel soignant et les expérimentateurs afin de les habituer à la présence humaine et aux différentes interventions. Avant les prélèvements sanguins, les lapins seront familiarisés avec les expérimentateurs pour réduire leur stress, et des techniques de contention douce seront appliquées pendant les prélèvements. L'anesthésie sera utilisée si nécessaire pour toute intervention susceptible de causer de la douleur ou un inconfort important. Des points limites spécifiques seront appliqués pour détecter tout signe de stress ou d'inconfort. Si un lapin montre des signes d'inconfort significatif, il sera retiré de l’étude et recevra des soins adaptés

Choix des espèces

On utilisera trois variantes de souris et une de lapins : Souris très sensibles aux germes, comme la bactérie Borrelia spp, transmise par les tiques. Elles sont donc utilisées pour produire des tiques infectées par cette bactérie. Souris génétiquement modifiées pour qu'elles ne puissent pas produire le sucre α-Gal, mais elles peuvent créer des anticorps spécifiques contre celui-ci. Elles sont importantes pour étudier comment le corps réagit à cette molécule. Souris non modifiées génétiquement. Elles sont utilisées comme groupe de contrôle pour comparer les résultats avec ceux des autres souris et obtenir des résultats plus proches des animaux sauvages. Lapins blancs de Nouvelle-Zélande : Ils sont utilisés car ce sont les meilleurs animaux pour prélever de grandes quantités de sang en une seule expérience, permettant d'obtenir suffisamment d'anticorps contre l'α-Gal pour les recherches. Les souris auront entre 7 et 8 semaines d'âge, et les lapins entre 4 et 5 semaines. Avant de commencer les expériences, une semaine d'adaptation sera accordée aux animaux pour qu'ils s'habituent à leur environnement.

L'objet réel du projet est de préparer le dossier d'un immunostimulant avant un essai chez l'être humain annoncé pour le second semestre 2025. 20 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue pour recueillir le maximum de sérum et prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à 21 prélèvements de sang sur animal vigile et trois injections intraveineuses sous anesthésie gazeuse. Le porteur passe en revue la modélisation informatique, les tests sur cellules, les technologies omiques, les tissus humains et les organes sur puce, et écarte chacune de ces méthodes au motif qu'elles ne reproduisent pas un "organisme entier".

Objectifs

Ce projet s'intègre dans le cadre du développement d'un immunostimulant du système immunitaire inné en cancérologie. Le but de projet d’étude préclinique chez le lapin est d’évaluer la réponse inflammatoire du produit avant une étude toxicologique qui sera menée chez l’homme au début du second semestre 2025. L’objectif de ce projet est de mesurer l’effet composé injecté aura pour démontrer sa bonne tolérance chez le lapin à travers des prises de sang et la mesure de plusieurs composantes physiologique (cytokinique) et pharmacocinétique.

Bénéfices attendus

Les besoins de nouveau traitement en oncologies sont importants. Malgré des investissements significatifs de nombreux besoins médicaux restent non couvert et nécessite d’explorer de nouvelle voie thérapeutique. La stimulation du système immunitaire est un axe thérapeutique important pour « réapprendre » à l’organisme à éliminer des cellules cancéreuses de manière autonome et efficace. Les points de contrôle immunitaire (Immune-Check points) ont apporté des avancées significatives en oncologie. Ce projet s’inscrit dans cette optique, avec le développement de nouveau immunostimulant du système immunitaire inné. Contrecarrer les mécanismes d’échappement tumorale mis en place par les cellules cancéreuses devrait permettre à l’organisme de pouvoir identifier et éliminer les cellules cancéreuses. Ce type de traitement est d’autant plus efficace qu’il permet une réponse sur le long terme en réduisant les risques de récidives et de rechute des patients.

Procédures

- Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 21 prélèvements. - Injection intraveineuse (sous anesthésies profonde gazeuse), environ 10 min, 3 injections. - Mise à mort sous anesthésie profonde chimique

Impact sur les animaux

Un léger stress peut être causé : - par les prélèvements rapprochés - par les injections. - par les contentions lors de l’expérimentation D’après les études faites sur d’autres animaux aucune autres nuisances ne nous a été rapporté. Nous resterons néanmoins vigilants à tous effets imprévus.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

L'objectif du projet est de mesurer l'impact d'un candidat médicament le) sur un organisme ayant un système immunitaire complet et mature et chez une espèce présentant une sensibilité similaire à l'homme. Après discussion avec l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) il a été conclu que le lapin était l'espèce la plus pertinente. Nous avons réalisé des premiers essais sur du sang frais de lapin pour analyser la réponse des globules blancs sanguins au LipoLPS. En revanche une évaluation de la réponse du système immunitaire complet ne peut être réalisée que sur un organisme entier et nécessite l'administration à des lapins. Nous avons étudié les alternatives qui n’ont malheureusement pas pu être retenues : Modélisation informatique/ in silico : Ces modèles peuvent prédire comment un médicament diffusera dans le corps humain. Néanmoins les modèles informatiques n’arrivent pas encore à prédire comment une réaction de type inflammatoire pourra être quantifiable car les paramètres sont trop nombreux. Méthodes in vitro : Les tests réalisés sur des cellules en culture, permettent d'évaluer en partie la réponse inflammatoire. Dans le cas de ce projet, les modèles in vitro ne peuvent pas mimer une réponse complexe avec de nombreux types cellulaires différents. Méthodes in omic : Les technologies omiques, comme la génomique, la protéomique et la métabolomique, permettent d'analyser les réponses biologiques à un niveau moléculaire détaillé. Ces approches peuvent fournir des informations précieuses sur la réponse inflammatoire, là encore la complexité de la réponse ne permets d’obtenir un niveau d’information suffisante (durée de la réaction, évolution des concentrations des molécules cibles …) Utilisation de tissus humains : Les tissus humains, obtenus par exemple lors de chirurgies, peuvent être utilisés pour des tests ex vivo. Cette méthode ne permet pas de mimer l’organisme en entier. Organes sur puce : Ce sont des dispositifs microfabriqués qui reproduisent les fonctions des organes humains. Ils permettent de tester des médicaments et d'évaluer les réponses inflammatoires dans un environnement contrôlé mais comme l’utilisation de tissus humain, ces organoïdes ne peuvent pas mimer un organisme complet.

Réduction

Afin de réduire autant que possible le nombre d'animaux utilisés nous n'avons prévu que deux groupes d'animaux : un groupe contrôle et un groupe traité. Ceci est possible grâce à des expériences préalables réalisées chez des lapins porteurs de tumeurs et ayant permis de déterminer une posologie sûre dans le cadre d'une administration intraveineuse lente. L'effectif de cinq lapins a été choisi sur la base de la variabilité attendue dans la réponse au médicament. Les comparaisons entre groupe contrôle et groupe traité seront réalisées à l'aide d'analyses non paramétriques de type Mann-Whitney. Nous avons cherché à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés en n'explorant qu'un seul niveau de posologie du médicament. Ceci a été rendu possible grâce à des études préalables montrant qu'une administration veineuse lente n'entrainait aucun effet secondaire sévère ni irréversible.

Raffinement

Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus, les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Les injections intra-veineuses seront réalisées sous anesthésie et sur un tapis chauffant. Lors du prélèvement les lapins sont bien maintenus et rassurés. La surveillance de la douleur sera réalisée en utilisant une grille de douleur du masque faciale (degré d’ouverture des paupières et d’aplatissement des joues, la forme du museau, la position des vibrisses et celle des oreilles) Des points limites seront mis en place suffisamment précocement pour limiter la douleur à son minimum, sans remettre en cause les résultats du projet.

Choix des espèces

Un test de toxicité a déjà été réalisé sur ce modèle (lapin) et cette expérimentation doit donc se poursuivre sur le même modèle avant de poursuivre les essais chez l’homme. L'objectif du projet est de mesurer l'impact d'un candidat médicament sur un organisme immunitaire complet chez une espèce présentant une sensibilité similaire à l'homme. Après discussion avec l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM) il a été conclu que le lapin était l'espèce la plus pertinente était le lapin. Nous utilisons des jeunes adultes (lapins âgés de 12 semaines minimum, environ 1.4kg minimum), cela correspond à l’âge requis pour avoir un système immunitaire mature chez le lapin afin de comparer ces résultats avec l’homme adulte.

Pour calculer des marges de sécurité avant la première administration de médicaments à des êtres humains, 720 souris, 840 rats et 800 lapins vont être utilisés dans 65 études, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés par voie orale, intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, sur des durées allant d'un jour à six mois, avec prélèvements de sang, de tissus, de fèces, d'urine, de salive et de larmes. Des mises à mort intermédiaires sont prévues pour prélever les tissus aux différents temps de l'étude. Le porteur écrit à deux reprises que ce projet est "indispensable" à la première administration chez l'humain, sans que la nature des composés testés soit précisée.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques d'un ou plusieurs composés pharmaceutiques après administration unique ou répétée chez des rongeurs ou des lagomorphes. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme, conformément aux lignes directrices ICH S3 M2 et ICH S3 (TK).

Bénéfices attendus

L'ensemble des études du projet vise à identifier un profil métabolique, pharmacocinétique, pharmacodynamique de biodistribution permettant le calcul de marge de sécurité chez l'Homme en gardant à l'esprit en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme.

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi intramusculaire, sous- cutanée ou intraveineuse…) de façon journalière (voire plusieurs fois/j) hebdomadaire, ou de manière plus espacée (ex: toutes les 2 semaines, mensuel), avec le(s) produit(s) d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure dans le cas de perfusion intraveineuse. La durée des études peut être courte (1j) ou longue [1 semaine, 2 semaines, 1, 3, ou 6 mois]. Des prélèvements sanguins, tissulaires, de fèces, urinaires ou/et de fluides corporels (salive, larmes) seront réalisés au cours du temps et analysés afin de déterminer les niveaux du ou des composés administrés, de leurs métabolites ou d’autres marqueurs pharmacologiques pour permettre l’analyse pharmacocinétique, pharmacodynamique et de biodistribution. D’autres prélèvements sanguins ou urinaires sont également possibles pour bilan urinaire, hémato-biochimique ou hormonal par exemple. L’ensemble de ces prélèvements sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/contrainte pour l'animal). Les animaux seront examinés quotidiennement afin de déceler tout signe clinique. Les consommations alimentaire et/ou hydrique pourront être suivies. Des examens ophtalmologiques, échographiques, radiologiques, comportementaux peuvent être réalisés. Le poids corporel sera mesuré à différents temps au cours du projet. Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et un examen microscopique sera réalisé sur les tissus collectés si nécessaire. La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1h/animal/jour (en considérant par ex. 1 journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant par exemple 1 administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h) pour les rongeurs. Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures [prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle (uniquement pour les rongeurs)] et/ou aux effets systémiques (exemples : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés. Un hébergement en individuel (rare), avec contacts olfactifs, visuels et sonores préservés et enrichissements additionnels, peut être requis (ex. pour suivre la consommation alimentaire individuelle ou pour des études par voie dermale).

Devenir

En parallèle des prélèvements sanguins, réalisés au cours de l’étude, l’évaluation de la pharmacocinétique, de la pharmacodynamie et de la biodistribution, peut nécessiter des euthanasies intermédiaires afin d’effectuer des prélèvements tissulaires et/ou une analyse histopathologique selon les différents temps de prélèvements définis dans l’étude. Ceci pour permettre l'évaluation de l'exposition du composé ou des composés dans le tissu cible, et /ou pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus, respectivement. A ce titre tous les animaux de ce projet seront euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

L'évaluation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution d'un composé ou de plusieurs composés administrés dans un organisme complet ne peut pas être réalisée qu'avec des études in vitro, car il n'existe pas d'alternative complète in vitro pour ce type d'évaluation en raison de la complexité d'un organisme vivant. Seule l’observation sur un organisme vivant dans son ensemble permet d’évaluer les différentes phases d’absorption, de métabolisme, de distribution et d’élimination du/des composé(s), de définir les relations et/ou interactions entre ces différentes phases et de pouvoir déterminer l’exposition du/des composé(s) administré(s) dans l’organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude et du nombre de doses testées. En effet, des animaux des deux sexes seront utilisés uniquement pour permettre l'évaluation de l'effet du sexe sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et sur la biodistribution. Par ailleurs, il peut y avoir une comparaison avec des composés de référence, un criblage de plusieurs produits, etc. Mais le nombre d’animaux par groupe correspondra au minimum permettant une analyse statistique fiable, conformément aux recommandations des lignes directrices. Ce projet permettra de réaliser 65 études, 35 chez le rat; 10 chez la souris et 20 chez le lapin, avec un nombre d'animaux déterminé à minima afin d'obtenir des résultats robustes et fiables permettant d'atteindre tous les objectifs de l'étude en procédant à toutes les analyses nécessaires.

Raffinement

En général, les doses utilisées sont des doses pharmacologiques, faibles et similaires à celles utilisées chez l'Homme. L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité, etc. Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et/ou au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés par des soins (ex : antibiotique/anti- inflammatoire), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des prélèvements sanguins seront effectués selon les bonnes pratiques vétérinaires de fréquence et de volume. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie locale ou générale pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, par ex : les administrations intramusculaires et intra-articulaires. Les rongeurs et les lapins sont hébergés en groupe dans la majorité des situations. Cependant, soit en raison d'incompatibilités sociales observées parfois chez le lapin ou les souris mâles, soit dans certaines situations expérimentales rares (rongeur uniquement) un hébergement individuel peut être nécessaire. Il devra être dûment argumenté (ex : voie d’administration dermale, bilans d'élimination en collectant les urines et fèces). Le cas échéant, des enrichissements supplémentaires seront proposés et le contact visuel et olfactif sera maintenu.

Choix des espèces

Les espèces rat, souris et lapin sont des espèces de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) et sont couramment utilisées pour l'évaluation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution et acceptées par les autorités. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants (essais préliminaires in vitro et in vivo), voie d'administration choisie, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. De façon standard, les rats, souris et lapins seront âgés de 6 à 10 semaines, 6 à 8 semaines et 3 à 4 mois, respectivement, correspondant à un niveau « jeune adulte » de croissance et de développement nécessaire et suffisant pour conduire les expérimentations. Toutefois, ce projet pourra être effectué avec des animaux juvéniles ou avec des animaux plus âgés (> 1 an) en fonction de l’objectif de l’évaluation et de manière à ce que l’état physiologique de l’animal permette une réponse non équivoque des systèmes analysés après traitement avec le(s) composé(s) et ainsi permettre une évaluation adéquate des paramètres ciblés. Les animaux ne doivent pas être gravides.