Lapins

1050 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée et le reste tué. Ils reçoivent des substances chimiques sur la peau rasée ou dans l'œil pour des tests d'irritation cutanée et oculaire de type Draize, qui peuvent provoquer érythèmes, escarres, œdèmes et atteintes de la cornée et de l'iris. Les lapins sans irritation sont réutilisés pour d'autres essais, ceux plus atteints étant tués. Le porteur indique que les tests in vitro suffisent "dans la grande majorité des cas" et ne recourt au lapin que lorsque la substance est incompatible avec ces méthodes.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer la toxicité des produits chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques pour définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Un des paramètres étudiés pour évaluer la toxicité d’un produit chimique est de savoir s’il peut induire une irritation par contact cutané et/ou oculaire. Cette évaluation est imposée par les instances règlementaires européennes. Pour répondre aux obligations règlementaires avant mise sur le marché de produit chimiques, agrochimiques et pharmaceutiques nous réaliserons des tests d’irritation cutanée et occulaire sur le modèle du lapin (IC : irritation cutanée sur le lapin et IO ; irritation oculaire chez le lapin). Pour cela, le produit à tester est appliqué sur la peau rasée du lapin ou dans le sac conjonctival de l’œil du lapin afin de vérifier, par l’observation d’érythème et autres signes cliniques locaux, si une réaction d’irritation se produit.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer la dangerosité sur la santé humaine liée à une substance chimique, agrochimique ou pharmaceutique. Ces études de toxicité permettront de définir les conditions sécurisées de leur manipulation sur leur lieu de fabrication, leur stockage, leur transport et leur manipulation par les utilisateurs. Sur un plan plus large, ces évaluations basées sur des normes reglementaires très strictes permettent d’évaluer l’inocuité de médicaments ou denrées alimentaires à usage humain ou vétérinaire.

Procédures

- Irritation cutanée : C'est un traitement local par patchage / dépatchage (mise d’un pensement puis retrait), sur un animal vigile. Il y a 3 applications pour l’animal de l’essai initiale puis 1 application pour les 2 animaux de l’essai de confirmation. Les animaux sont pesés à J0 et à la fin de l’étude. Les sites de traitement sont soumis à des observations marcroscopiques à J0, J1, J2, J3, J7 et J14. A la fin de l'étude les animaux sont euthanasiés par injection intraveineuse. - Irritation oculaire : C'est un traitement local par instillation dans le sac conjonctival sur 1 à 3 animaux vigiles. Des injections sous cutanées sont faites aux animaux pour l'analgésie (3 à J0 puis 2/jour si nécessaire). Ils sont pesés à J0 et à la fin de l’étude. Les sites de traitement sont soumis à des observations marcroscopiques à J0, J1, J2, J3, J7, J14 et J21, nécessitant une instillation de fluoréscéine 10%. A la fin de l'étude, les animaux ne pouvant pas être utilisé pour une autre étude sont euthanasiés par injection intraveineuse.

Impact sur les animaux

Un phénomène d’irritation peut apparaître. Les réactions attendues sont locales, limitées à la zone de traitement. Les effets locaux peuvent rester jusqu’à la fin de l’étude, soit 14 jours pour l’irritation cutanée et 21 jours pour l’irritation oculaire. - test IC : peuvent apparaître des érythèmes pouvant aller jusqu’à la formation d’escarre et/ou de croûte, une destruction de l’épiderme et du derme, de l’œdème, de la sécheresse cutanée, une perte de souplesse de la peau pouvant provoquer une douleur à l’animal. Un stress physique peut être engendré dû à la pose du patch de traitement que l’animal garde 4h. - test IO : peuvent apparaître du larmoiement, de l’œdème des conjonctives, de l’érythème des conjonctives, une atteinte cornéenne (opacité, néovascularisation, œdème cornéen), une atteinte de l’iris pouvant provoquer une douleur à l’animal. De plus un stress physique au moment du traitement et des observations post traitement.

Devenir

- IC : Les lapins n’ayant pas présenté de signes d’irritation cutanée ou très légers et uniquement sur les trois premiers jours d’observation peuvent être récupérés pour être réutilisés dans une autre procédure utilisant une voie d’administration de la substance d’essai différente. Ceci dans un souci d’éthique animale et de réduction des animaux utilisés. Si les signes d’irritation cutanée observés sont plus importants, alors les animaux ne pourront être réutilisés car ils auront été traités avec une substance d’essai classée à minima d’irritante pour la peau. - IO : Les lapins n’ayant pas présenté de signes d’irritation oculaire ou très légers et uniquement sur les trois premiers jours d’observation peuvent être récupérés pour être réutilisés dans une autre procédure utilisant une voie d’administration de la substance d’essai différente. Ceci dans un souci d’éthique animale et de réduction des animaux utilisés. Si les signes d’irritation oculaire observés sont plus importants, alors les animaux ne pourront être réutilisés car ils auront été traités avec une substance d’essai classée à minima d’irritante pour les yeux.

Remplacement

Ces tests ne sont réalisés qu’après avoir évalué, par une analyse du poids de la preuve, toutes les données relatives au caractère potentiellement corrosif ou irritant de la substance pour la peau. Ces tests ne sont réalisés qu’après l’évaluation sur le produit chimique des données existantes en in-vivo humaine, en in vitro et de ses propriétés physicochimiques. - IC : Dans la grande majorité des cas, il n’est pas nécessaire de mettre en œuvre un test in vivo pour évaluer l’irritation cutanée. Les tests in vitro selon l’OCDE 439, l’OCDE 431 et l’OCDE 435 suffisent pour évaluer cet effet. Le test in vivo n’est mis en œuvre que lorsque le produit à tester n’est pas compatible avec le système d’essai in vitro (résultats faux positifs, faux négatifs ou interaction empêchant la réalisation du test).

Réduction

Ces tests ne sont réalisés que si nécessaire et après obtention des données montrant l’absence d’effet corrosif par la peau. Les animaux utilisés dans ces études peuvent être issus d’autres études de tolérance locale par une autre voie d’administration et dans lesquelles aucun effet ou des effets très légers ont été observés, ou de test d’évaluation de la pyrogénécité dont les résultats sont négatifs. Les animaux utilisés dans ces études sont de sexe indifférent. Ces tests sont réalisés par étapes pour réduire au maximum les souffrances et le nombre d’animaux utilisés. L’étude nécessite de traiter trois animaux mais seulement un animal est traité dans un premier temps. Si le produit n’induit pas d’effet corrosif sur le premier animal alors uniquement dans ce cas les deux autres animaux seront traités.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux sont mis en cage par l’animalier qui effectue un premier contrôle de leur état de santé. En vue de leur acclimatation aux conditions du laboratoire, les animaux sont gardés pendant au minimum 5 jours avant le début des procédures, dans des cages individuelles, pour garantir leur bien-être. La taille des cages est adaptée aux critères de bien être animal, elles sont équipées de plateformes, de cloisons transparentes, d’un fond perforé en noryl et un enrichissement par briquettes de bois est mis à leur disposition. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et le plateau contenant les fécès et les urines est nettoyé 3 fois par semaine. - IC : Ce test est réalisé par étapes pour réduire au maximum les souffrances et le nombre d’animaux utilisés. Le produit est appliqué à des temps croissants (3 minutes, 1 heure puis 4 heures). Si un effet corrosif est obtenu à l’un des premiers temps alors le produit ne sera pas appliqué à un temps plus long. S’il n’y a plus de réactions observées 72 heures post-traitement, l’étude peut être arrêtée. - IO : Ce test est réalisé par étapes pour réduire au maximum les souffrances et le nombre d’animaux utilisés. Un protocole d’analgésie générale et d’anesthésie locale permet d’éviter toute souffrance pendant ces études. L’anesthésie locale est réalisée avant traitement, l’analgésie générale est réalisée pré et post traitement le jour du traitement ainsi que quotidiennement si des lésions importantes de l’œil ou un comportement de souffrance est perceptible chez l’animal. S’il n’y a plus de réactions observées 72 heures post-traitement, l’étude peut être arrêtée. Des points limites sont définis pour chacun des tests afin d’éviter toute souffrance inutile aux animaux.

Choix des espèces

Le lapin reste le modèle de choix utilisé pour les tests de tolérance locale comme l’irritation cutanée et oculaire. Il est décrit dans les lignes directrices de l’OCDE 404 et de l’OCDE 405 dont les versions originales ont été adoptées en 1981 et ont été mises à jour en juillet 2015 et en juin 2021, respectivement. De plus, le lapin est historiquement l’espèce utilisée pour l’évaluation du potentiel irritant par contact cutané et oculaire des produits chimiques, comme décrit dans le test de Draize mis au point en 1944. L’espèce et le stade de développement des animaux à utiliser sont imposés par les normes OCDE correspondantes. Lapins jeunes adultes de 9 à 15 semaines. Si des femelles sont utilisées elles doivent être nullipares et non gravides.

204 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur inocule dans le tibia une bactérie Gram-négatif multirésistante, puis on leur administre des antibiotiques deux à trois fois par jour pendant sept jours avant une mise à mort à J24 pour disséquer la patte infectée. Le porteur indique que l'ostéomyélite provoque une douleur justifiant un traitement antalgique dès l'inoculation. Il affirme que ces modèles apportent des données "indispensables" et vise notamment à appuyer l'autorisation de mise sur le marché de l'antibiotique Ceftazidime-avibactam.

Objectifs

Dans ce travail nous évaluerons l’efficacité des antibiotiques seuls et en association dans un modèle d’infection ostéo-articulaire à bacilles Gram-négatif (BGN), bactéries de plus en plus fréquemment en cause en pathologie humaine. Ce modèle permettra d’évaluer l’histoire naturelle des ostéomyélites à BGN résistants aux antibiotiques (infections à germes multi résistants de plus en plus fréquemment rencontrées en raison de l’augmentation importante de la résistance aux antibiotiques dans le monde), et l’efficacité des traitements, ce qui n’a jamais été abordé dans ce type d’infection complexe. Trouver le meilleur traitement efficace, permettra en modèle chez l’homme de débuter de façon empirique un traitement antibiotique optimal avec la plus grande chance de succès thérapeutique pour une infection réputée difficile à traiter.

Bénéfices attendus

Les modèles expérimentaux apportent des informations indispensables pour l’utilisation optimale des antibiotiques et le traitement des infections bactériennes chez l’homme. Les modèles expérimentaux sont particulièrement utiles pour évaluer l’impact d’un mécanisme de résistance sur l’activité d’une antibiothérapie en termes d’effet bactéricide et de sélection de mutants résistants. Les données expérimentales peuvent, par ailleurs, servir de base aux recommandations de traitement des sociétés savantes, notamment quand les données cliniques manquent comme c’est le cas pour les ostéomyélites à bactéries Gram négatif (BGN). Notre travail sur l’antibiotique Ceftazidime-avibactam permettra également de donner des données solides pour l’approbation de son indication dans le traitement de l’ostéomyélite (AMM).

Procédures

Pour tous les animaux, inoculation localement dans le tibia d’une souche de bactérie type BGN multi-résistant sous cédation par Ketamine/Xylazine durant 30 minutes par animal, 1 jour donné. Pour tous les animaux, réalisation d’un prélèvement de 0,3 ml de sang après désinfection cutanée, à partir de la veine marginale de l’oreille à J1 et J24 pour la réalisation d’hémoculture sur animaux vigiles. Injection antibiotique sur animaux vigiles durant 7 jours 2 à 3 fois par jour en injection SC ou 1 fois en IM selon l’antibiotique pour tous les an

Impact sur les animaux

L’osteomyélite induite du tibia génère une douleur qui justifie un traitement antalgique dès l’innoculation initiale. Des signes neurologiques, des difficultés respiratoires pourraient être observés en cas d'extension de l'infection depuis le tibia. Des diarrhées sont possibles en lien avec l'administration d'antibotiques.

Devenir

Pour tous les animaux, mise à mort de tous les animaux par injection létale (de pentobarbital) puis dissection de la pate entière infectée de chaque lapin en fin de traitement (à J24).

Remplacement

Les modèles expérimentaux apportent des informations indispensables pour une utilisation optimale des antibiotiques et le traitement des infections bactériennes complexes. Les modèles expérimentaux sont particulièrement utiles pour évaluer l’impact d’un mécanisme de résistance sur l’activité d’une antibiothérapie en termes d’effet bactéricide et de sélection de mutants résistants. Les données expérimentales peuvent, par ailleurs, servir de base aux recommandations de traitement des sociétés savantes, notamment quand les données cliniques manquent comme c’est le cas pour les ostéomyélites à bactéries Gram négatif (BGN), en particulier BGN multirésistants.

Réduction

Douze animaux sont utilisés dans chaque groupe de traitement. Onze animaux par groupes permettent de mettre en évidence une différence de 50% entre les groupes avec une puissance de 80% et un risque de première espèce a de 5%, tout en considérant le risque de décès prématuré, soit 12 lapins dans chaque groupe. Ce nombre est le nombre minimal pour pouvoir interpréter les résultats, compte tenu de la variabilité inter-individuelle. Une analyse statistique non paramétrique par tests Mann-Whitney et Kruskal–Wallis, déjà utilisée dans nos travaux antérieurs compte-tenu du faible effectif (n

Raffinement

- La surveillance est particulièrement renforcée dans les 24 heures suivant l’inoculation de la bactérie où l’animal peut-être transitoirement géné par la procédure. - De notre expérience cette expérimentation est bien vécue par les animaux avec de façon exceptionnelle de rares animaux qui peuvent présenter une douleur résiduelle au niveau de la pate infectée. En effet, la procédure antalgique permet de couvrir largement la période douloureuse et permet une phase longue d’observation avant la suite de la procédure avec un délai entre l’expérimentation (inoculation) et la mise en place du traitement antibiotique 14 jours plus tard.

Choix des espèces

Le modèle d’infection sur prothèse ou d’ostéomyélite chez le lapin est facile à réaliser et il mime de façon très proche l’infection humaine. Ce modèle a déjà été évalué dans de multiples études, et dans nos travaux antérieurs déjà publiés. Jeunes adultes (12 à 14 semaines pour des raisons de croissance osseuse)

3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.

Procédures

Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

11 lapins vont être utilisé·es, gardés en vie en vue d'une adoption, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale pour accéder au foie, puis une seconde intervention de prélèvement, l'ensemble pouvant durer jusqu'à une heure et demie, pour tester un pansement hémostatique à base d'alginate. Le porteur décrit l'accès au foie comme une "chirurgie lourde pour le lapin" et prévoit une euthanasie sous anesthésie en cas de complications, les autres animaux étant maintenus en vie. Il présente ce dispositif comme un futur pansement résorbable pour la chirurgie.

Objectifs

Le pansement idéal n’existe pas. Cependant, il doit présenter quelques caractéristiques, parmi lesquelles : 1/maintenir la plaie en milieu humide et chaud, 2/être modifié selon les stades de cicatrisation, 3/ être perméable aux échanges gazeux mais non aux bactéries, 4/absorber l’excès d’exsudat produit par la plaie, 5/ ne pas coller à la plaie mais adhérer à la peau saine sans se décoller ou s’abîmer rapidement, le tout en étant facilement applicable et confortable, 6/ ne pas être toxique et être hypoallergénique, 7/ protéger des chocs, 8/ être transparent afin de pouvoir visualiser la plaie sans retirer le pansement, 9/ être le moins coûteux possible et réduire le temps de traitement. Le pansement à base d’alginate de calcium répond à l’ensemble de ces critères mais son utilisation est réservée à la prise en charge de plaies cutanées mais très peu sur les organes internes lors de chirurgie. Pour maitriser les saignements, les chirurgiens ont recours à différentes techniques conventionnelles. Lorsque ces techniques sont insuffisantes, notamment lors d’hémorragies capillaires dites « en nappe », des hémostatiques chirurgicaux résorbables non naturels sont utilisés comme traitement adjuvant. L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate d’un pansement tissé, et de suivre sa résorption et son impact au niveau du tissu lésé et des zones proches à différents temps post-opératoire. Il y aura 3 groupes de 3 lapins qui seront opérés (chirurgie d’implantation). Et à J+2 semaines, J+1 mois et J+3mois post-opératoire, nous opérons les lapins pour faire un prélèvement histologique de la zone d’intérêt (chirurgie d’exérèse). Si les conditions le permettent, les animaux ne seront pas systématiquement mis à mort au moment de la chirurgie d’exérèse afin de pouvoir être mis à l’adoption. Nous prévoyons 2 lapins supplémentaires en cas d’un décès lors de la chirurgie ou à cause d’une mise à mort liée à un point limite. Ce projet portera sur 11 lapins au total. Pour ce faire, il sera réalisé une série de lésions calibrées sur le foie du lapin, suivie de l'application d'une quantité prédéfinie de produit. L'évaluation de l'arrêt du saignement est faite selon la grille de score d'ADAM. En cas de reprise de saignement, le chirurgien fera une cautérisation avec le bistouri électrique (pince bipolaire) ou posera des points de suture. La biocompatibilité du pansement tissé a été testé en in vitro.

Bénéfices attendus

Le projet est destiné à confirmer l’intérêt des propriétés hémostatiques du produit sur le saignement d’un organe intra-abdominal comme le foie mais aussi de suivre la résorption du produit dans le temps au niveau des zones d’implantation. L’objectif est de pouvoir avoir un pansement hémostatique naturel (non synthétique) pour le traitement des plaies chirurgicales et qui ne nécessite pas son retrait avant fermeture de l’incision chirurgicale comme les pansements actuels commercialisés.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie d’implantation pour permettre l’accès au foie tout en préservant les autres organes digestifs dans la cavité abdominale et une seconde chirurgie d’exérèse pour faire un prélèvement de tissu. La durée de la chirurgie ne devra pas excéder une durée de 1h30 par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour l’accès au foie, 25 minutes pour les temps de saignement, 10 minutes pour le contrôle final de l’arrêt du saignement, 20 minutes pour la fermeture du plan musculaire et cutanée). L’animal aura une à deux interventions chirurgicales. La chirurgie d’exérèse ne sera faite que si la zone d’implantation ne présente pas trop d’adhérences qui compromettraient l’état de récupération de l’animal. L’animal sera injecté avec un analgésique pour anticiper la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un anesthésique couplé à un analgésique (anti-douleur) pour réduire toutes sensations à la douleur. L’animal est placé sous masque avec un anesthésie gazeux pour le maintien de l’anesthésie et sur une table chauffante afin de maintenir la température corporelle.

Impact sur les animaux

L’accès au foie est une chirurgie lourde pour le lapin. Afin de limiter l’impact et de ne pas risquer un incident de chirurgie, nous avons opté pour un abord chirurgical restreint dans la région sous costal plutôt qu’un abord abdominal plus vulnérant pour l’animal. L’abord abdominal nécessite une incision de grande longueur pour pouvoir placer les écarteurs et accéder au foie. De plus, lors de cette approche, le risque de faire une incision sur le coecum est important étant donné sa grande taille et la mise en évidence des viscères aurait accélérée la perte de chaleur et le desséchement de ces derniers, ce qui auraient entrainé plus de complications à gérer en post-opératoire. L’abord sous costal limite la taille de l’incision et nous ne touchons pas les viscères et ni le coecum. Cette approche permet de garder au chaud les organes et limite leur desséchement.

Devenir

La mise à mort des animaux sera décidée lors de la chirurgie d’exérèse pour faire un prélèvement histologique. Si nous observons trop de complications qui met l’animal dans une balance bénéfice/dommage en sa défaveur, alors l’animal sera euthanasié encore sous anesthésie générale. Dans le cas contraire, il sera maintenu en vie pour une adoption.

Remplacement

L’objectif de cette étude est de vérifier l’efficacité hémostatique tissulaire d’application locale d’un produit à base d’alginate (produit naturel), de constater sa persistance et de suivre sa résorption sur un tissu lésé. La preuve de concept de ce nouveau type de pansement hémostatique tissé permettra de mettre au point un nouveau dispositif médical pour la gestion des saignements intra-cavitaire en cours de chirurgie. Il nous est nécessaire de tester le pansement hémostatique dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent être reproduit en in vitro. Ce passage sur le modèle animal est la dernière étape de la preuve de concept.

Réduction

Nous utiliserons 11 animaux au total dont 9 animaux répartis en 3 groupes (3 lapins/groupe = 3*3 =9), et il est prévu 2 animaux supplémentaires pour compléter l’un des groupes si nécessaires. Le nombre/groupe a été déterminé pour avoir une représentation juste de la physiologie animale. En tant donné que c’est une preuve de concept, nous avons besoin de 3 animaux maximum par groupe pour obtenir la réponse à notre questionnement. Si le pansement ne permet pas de stopper le saignement et amène à faire une intervention chirurgicale pour l’arrêter nous stopperons le projet sans utiliser tous les animaux prévus. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé la voie d’abord chirurgicale ainsi que la finalisation de la prothèse dans notre structure sur des animaux décédés, issus de procédures antérieures. Il s’agit d’une preuve de concept, ce faible nombre d’animaux permettra d’obtenir des résultats suffisants pour cette étape du projet.

Raffinement

L’animal sera placé 3 semaines en acclimatation et reparti en lot homogène avec d’autres congénères. Le lapin est un animal qui stresse très facilement et qui a besoin de temps pour s’habituer à son nouvel environnement et aux personnes. La veille de la chirurgie, l’animal sera injecté avec un analgésique (anti-douleur) pour anticiper la sensation de la douleur. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un anesthésique couplé à un analgésique. Un cathéter sera mis en place sur la veine de l’oreille pour permettre l’hydratation de l’animal tout au long de la chirurgie. L’animal est placé sous masque avec un anesthésie gazeux pour le maintien de l’anesthésie. L’animal est placé sur une table chauffante afin de maintenir la température corporelle. Une anesthésie locale sera mise en place. En fin de chirurgie, après nettoyage de la peau avec du sérum physiologique et une application d’un gel anesthésique sur les berges permettra d’apporter une anesthésie locale. L’animal sera habillé d’un pyjama pour protéger la cicatrice. Un renfort de protection (une compresse et coton cardé) réduira les frottements des fils des points sur le pyjama et donnera une protection supplémentaire à un grignotage du pyjama par l’animal. L’animal sera placé dans des couvertures polaires et sous-surveillance jusqu’à son réveil. L’animal avec les couvertures polaires seront remis dans la cage. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans la cage des légumes frais, plus appétent, pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. Les légumes frais seront maintenus pendant 72 h post-opératoire. Le poids de l’animal est suivi quotidiennement jusqu’à la reprise de poids. La cicatrice sera surveillée toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. La présence quotidienne du vétérinaire et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet evite toute souffrance, douleur ou stress inutiles. Le transfert des animaux vers la structure d’hébergement sera fait dans les boites de transport propres à chaque animal dans un véhicule adapté.

Choix des espèces

Le lapin est un animal de taille intermédiaire, plus gros qu’un rat et moins gros qu’un cochon, mais assez gros pour avoir accès à un foie dont la taille peut supporter les biopsie punch de 5 mm de diamètre (3 à 4) prévues et l’implantation du produit hémostatique pour obtenir un effet pharmacologique (hémostatique). Les animaux seront réceptionnés à 2.5-3 kg environ pour atteindre 3.5-4 kg (âge adulte). L’utilisation d’animaux adulte permet de de bénéficier d’une taille permettant la chirurgie sur le foie.

300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent l'implantation chirurgicale d'un produit de santé sous la peau ou dans l'os, avec prélèvements sanguins et injections, sur une période pouvant aller jusqu'à vingt-quatre mois, puis sont mis à mort pour analyse des organes et des tissus. Le porteur décrit comme nuisances attendues une perte de poids, des douleurs ostéo-articulaires, des complications de la plaie chirurgicale et l'hébergement individuel d'une espèce sociale. Il présente ces essais réglementaires comme "obligatoires" faute de test in vitro validé, et choisit le lapin pour la taille du dispositif à implanter.

Objectifs

Le projet s’inscrit dans les démarches réglementaires recommandées avant utilisation d’un produit de santé chez l’homme. En effet, tout fabricant doit s’assurer que l’utilisation de son produit ne compromette ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. Dans ce projet, il s’agit plus précisément d’évaluer la toxicité systémique (c’est-à-dire la toxicité non limitée aux effets défavorables au niveau du contact entre le corps et le dispositif) et éventuellement locale d’un produit fini ou de ses différents constituants, après implantation/injection chez le lapin sur une période allant de 14 jours à 24 mois. Le lapin est privilégié du fait de la taille du dispositif à implanter. Toute étude de toxicité systémique peut, par ailleurs, être couplée à une évaluation des effets locaux (= toxicité locale). Dans ce cas, les réactions locales à étudier dépendent directement des caractéristiques du produit à tester (ex : étude de la tolérance locale après implantation/injection dont la localisation est proche de l'utilisation clinique chez l'homme).

Bénéfices attendus

S’assurer avant sa mise sur le marché que l’utilisation du produit de santé ne compromet ni l’état clinique et la sécurité des patients, ni la sécurité et la santé des utilisateurs. Evaluer les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit et s’assurer le cas échéant qu’ils constituent des risques acceptables au regard des bienfaits/bénéfices apportés aux patients et sont compatibles avec un niveau élevé de protection de la santé et de la sécurité des patients comme des utilisateurs. Les résultats seront disponibles à l’issue des études et leur incorporation dans les dossiers de soumissions aux autorités de santé compétentes avant leur mise (ou leur maintien) sur le marché pourront en découler à court terme.

Procédures

Implantation chirurgicale sous-cutanée sous anesthésie : 1 environ 40 minutes maximum en fonction du nombre de sites et de l'implant Implantation chirurgicale intraosseuse sous anesthésie : 1 environ 60 minutes maximum Prélèvement sanguin sur animaux vigiles : 2 (1 en début et 1 en fin d’étude) environ 5 minutes chacun (total de maximum 10 minutes) Injection intramusculaire : 1 environ 1 minute Injection intraartérielle : 1 environ 1 minute par molécule (total de maximum 4 minutes) Anesthésie volatile : 1 environ 10 minutes

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues suivant nos procédures expérimentales sont les suivantes : perte de poids, baisse d’activité, baisse d’appétit, comportements atypiques pour l’espèce, vocalises, hébergement individuel pour les espèces sociales, douleurs myo-arthro-squelettiques, complications post-chirurgie (inflammation de la plaie chirurgicale).

Devenir

Pour les besoins de l'étude, une analyse des paramètres sanguins ainsi qu'une évaluation des tissus au microscope (analyse histopathologique) est nécessaire. Ceci permet d'évaluer les effets potentiels de toxicité systémique et/ou la tolérance locale au niveau de la zone d'implantation du produit de santé à tester. Ces analyses expliquent l'impossibilité en fin d'étude de maintenir en vie les animaux utilisés.

Remplacement

Les méthodes alternatives existantes ne permettent pas d’évaluer les effets toxiques à moyen ou long terme des produits de santé en raison de la complexité des mécanismes de régulation d’un organisme vivant. Il n'existe pas de test in vitro validé ni de modèle simulé par ordinateur capable de reproduire la complexité d'une réaction tissulaire post-chirurgicale et/ou des effets systémiques. L’utilisation d’animaux est alors obligatoire pour y parvenir.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux* (nombre minimal d'animaux/sites requis par les textes de références, lots témoins communs entre différents essais si possible, engagement du donneur d'orde de non duplication des essais, évaluation de la toxicité systémique couplée à une évaluation de la tolérance locale si possible), l'espèce et la durée de l'essai sont alors définis. * Dans le cadre d'essai de toxicité systémique, le nombre d'animaux doit être suffisant pour permettre une analyse statistique pertinente (e.g. toxicité subaiguë: minimum 4/sexe/groupe; toxicité subchronique: minimum 5/sexe/groupe; toxicité chronique: minimum 7/sexe/groupe. Dans le cadre de l'évaluation des effets locaux, minimum 10 sites sur minimum 3 animaux différent sont nécessaires)

Raffinement

La stratégie de raffinement est établie afin de limiter le stress et la douleur des animaux et repose sur l’acclimatation des animaux pendant laquelle les animaux ne subissent aucune manipulation non indispensable ; la présence d’enrichissements du milieu systématique ; l’utilisation d’anesthésiques et d’antalgiques ; un suivi sanitaire et clinique quotidien et renforcé en phase post-opératoire avec une visite vétérinaire en cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, pour permettre une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. Un suivi des points limites spécifiques au projet sera mis en place (suivi de l'alimentation, du comportement et de la lomotion)

Choix des espèces

Espèce animale définie dans le (ou les) texte(s) de référence. En général, les animaux sont utilisés au stade jeune adulte (lapins de minimum 2,5 kg) ; lorsque la procédure le nécessite (ex : quantité et/ou taille du matériel à tester importante, implantation intra-osseuse), des animaux plus "âgés" (donc d’un poids plus important) peuvent être utilisés. L'implantation intra-osseuse nécessite des animaux plus gros d'au moins 26 semaines.

4 575 animaux non-humains, 1 525 souris, 1 525 rats et 1 525 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après retrait des couches superficielles de la cornée sous anesthésie, un agent pro-inflammatoire est appliqué sur un œil, suivi de traitements en gouttes ou en injections oculaires, les animaux ressentant une douleur et une inflammation de la surface de l'œil pendant toute l'étude. Le projet vise à identifier des traitements de l'inflammation et de la douleur oculaires. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour évaluer un traitement dans un modèle d'inflammation cornéenne et choisit le lapin pour la taille de son œil.

Objectifs

L’objectif du projet est de mettre en place, dans le plus grand respect du bien-être animal, un modèle expérimental induisant une inflammation et douleur modérée chez l’animal afin de pouvoir identifier et évaluer des traitements susceptibles de les réduire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont l’identification et la sélection de futurs traitements pouvant améliorer le bien-être des patients atteints de signes d'inflammations et de douleur au niveau de la surface oculaire.

Procédures

Au premier jour de la procédure, quinze minutes après avoir enlevé sous anesthésie les couches superficielles de la cornée, une goutte d’un agent pro-inflammatoire va être appliquée sur un œil. Au troisième jour, d’une procédure qui en durera cinq, l’application sera renouvelée. Une série de traitements est ensuite administrée suivant les groupes soit sous formes de gouttes soit sous formes d’injections oculaires en fonction du type de produit et de son mode d’action. Ces administrations par gouttes sont quotidiennes et sont répétés une à quatre fois par jour. Les injections oculaires se font moins fréquemment, généralement pas plus de cinq administrations sur la durée de la procédure. Ces administrations peuvent se faire chez l’homme sous anesthésie locale. Ici, l’animal est endormi à l’aide d’une anesthésie générale légère afin de l’immobiliser, de faciliter l’injection et de réduire un stress éventuel. Une série d’observations est ensuite réalisée quotidiennement afin d’évaluer l’efficacité des traitements sur l’inflammation et la douleur oculaire. Tous les examens réalisés durant ces cinq jours de procédure sont des examens réalisés chez l’homme en cabinet d’ophtalmologie ou en clinique vétérinaire. Ils sont de plus totalement indolores et ne durent que quelques minutes (cinq minutes tout au plus). Ils seront éventuellement réalisés sous anesthésie générale légère afin d’immobiliser l’animal, de faciliter la procédure et de réduire un stress éventuel.

Impact sur les animaux

Le projet a pour but de trouver des traitements à l'inflammation et à la douleur oculaire. Les animaux vont sur la durée de l'étude ressentir une douleur légère à modérée et une inflammation de la surface oculaire (cornée, conjonctives).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour l'analyse des tissus.

Remplacement

L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents (très vascularisés ou très innervés pour certains, totalement avasculaires ou faiblement innervés pour d’autres). Il est soumis à d'importantes variations environnementales (température et humidité ambiantes), mécaniques (mouvements des globes, des paupières) et physicochimiques (osmolarité…), ainsi qu'à de nombreuses interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. Contrairement aux tests d’irritation oculaire (test d’irritation oculaire de Draize par exemple) où plusieurs méthodes alternatives permettant de s’affranchir d’essais sur l’animal ont été validées, il n’existe pas à ce jour de méthode alternative permettant d’évaluer l’efficacité et la tolérance d’un nouveau traitement dans un modèle d’inflammation cornéenne. Les mécanismes impliqués dans les phénomènes inflammatoires et neuro-inflammatoires associés à des douleurs cornéennes sont nombreux et font intervenir différents acteurs (cellules immunes, cellules nerveuses, médiateurs pro-inflammatoires, facteurs de croissances…) présents bien sûr au niveau de l’œil mais aussi au niveau d’autres organes voisins (ganglions, noyaux sensitifs, système nociceptif présent dans le cerveau…). C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet, les modèles alternatifs ne pouvant pas prendre en compte ou faire intervenir à ce jour, toutes les interactions et tous les acteurs impliqués dans ces phénomènes neuro-inflammatoires.

Réduction

Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'efficacité d'un traitement sera évaluée à chaque moment à l'aide de tests statistiques; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin non traité. De plus, un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les lapins seront placés préférentiellement par deux dans des cages avec boisson ad libitum, nourriture et enrichissement à ronger. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Il en ira de même pour les procédures plus invasives afin de supprimer la douleur provoquée pendant et en l’atténuant après l’intervention. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum. Ce projet a été soumis pour évaluation à un comité d’éthique et sera suivi par la structure en charge du bien-être animal de l'établissement

Choix des espèces

Les modèles expérimentaux présentés sont largement utilisés et décrits sur le lapin et le rongeur dont les publications de référence citées sur lesquelles le projet est basé. Le lapin sera choisi pour la taille de son œil. Les observations des paramètres observées en sont facilitées. Si la quantité de produit à évaluer est limitée (difficulté à synthétiser, coût), le rongeur sera alors choisi. Il le sera aussi si des analyses histologiques spécifiques sont nécessaires, le catalogue d’anticorps par exemple y est plus développé. Enfin le choix de l’espèce, sera guidé aussi par les données existantes sur le produit à évaluer (spécificité d’action, données historiques sur l’espèce choisie). C’est pour ces raisons que des souris, des rats et des lapins ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les animaux seront de jeunes adultes : les rongeurs auront un minimum de 6 semaines au début de l’étude et les lapins environ 8 à 12 semaines. Ces âges correspondent à la maturité visuelle chez ces animaux.

12 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, déclarés aptes puis proposés à l'adoption via une association. Chaque animal subit l'implantation chirurgicale de cages sous-cutanées sur les flancs, puis leur retrait, et deux à trois prélèvements sanguins, pour tester l'action de bactériophages contre le biofilm staphylococcique. Le porteur présente ce modèle comme une réduction du nombre d'animaux, chaque lapin permettant d'évaluer jusqu'à 36 conditions ex vivo. Il décrit ces premiers résultats comme un préalable à de futurs essais thérapeutiques, dont l'application clinique reste hypothétique.

Objectifs

La recherche d’alternatives thérapeutiques dans le domaine des antibactériens constitue un enjeu majeur de santé publique et a été identifiée comme une priorité, aussi bien au niveau national, qu’international. Les bactériophages sont des virus ciblant spécifiquement les bactéries. S’ils peuvent représenter un support de transfert de matériel génétique (résistance, virulence) via leur cycle lysogénique, leur cycle lytique permet d’envisager leur utilisation en thérapeutique. La phagothérapie représente ainsi une alternative innovante à l’antibiothérapie dans le traitement des infections bactériennes, à l’ère de la diffusion de l’antibiorésistance.

Bénéfices attendus

La description de l’activité anti-biofilm des bactériophages est un prérequis important pour leur utilisation en thérapeutique humaine. Les modèles in vitro actuellement utilisés pour l’évaluation de l’activité anti-biofilm sont soumis à de nombreuses variations liées aux conditions de culture utilisées, justifiant l’utilisation d’un modèle animal. De plus, le modèle proposé permet, à l’inverse des autres modèles animaux développés pour l’évaluation de l’activité anti-biofilm des antibiotiques, d’évaluer un grand nombre de conditions à partir d’un nombre limité d’animaux. Ce projet représentera la première description de l’activité anti-biofilm des bactériophages sur du biofilm formé in vivo, et son caractère concentration et temps dépendant. Ces résultats serviront de base aux choix à des modélisation pharmacocinétiques qui permettront de choisir les posologies et rythmes d’administration à adopter en thérapeutique locale ou systémique. Ces dernières seront validées secondairement dans ce même modèle par injection locale ou systémique de phages, seuls ou en association à des antibiotiques, dans un futur projet. Ces premières données serviront de rationnel et permettront de designer les futurs essais thérapeutiques prévus dans un projet plus global.

Procédures

Chaque animal aura 2 (minimum) ou 3 (maximum) prélèvement de sang. Le prélèvement est effectué après application d’un anesthésique local et dure moins d’une minute. Le temps chirurgical n’excédera pas 30 minutes par animal (5 minutes pour l’abord, 5 minutes pour la mise en place des cages, 5 minutes pour les fixer et 5 minutes pour la fermeture des incisions) et conciste en l'implantation, puis plus tard le retrait d'implants (cages) insérés sur chaque flanc par le biais de 3 incisions cutanées de 1 cm de long réalisées en zone dorsale médiane.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels sont : - i) locaux : troubles cicatriciels, formation d’abcès ; et - ii) généraux : généralisation de l’infection, avec bactériémie. A noter que le modèle est basé sur l’inoculum minimal efficace pour lequel les résultats préliminaires soulignent l’absence d’effets secondaires locaux et gébéraux. Les tensions cicatricielles potentiellement occasionnées par les implants seront réduites par le recours à un nouveau design plus adapté de section ovalaire. La gêne occasionnée devrait être réduite. Selon notre expérience, aucune infection systémique n’a été constatée lors de la validation du modèle tant sur le plan clinique que microbiologiques (hémocultures régulièrement prélevées).

Devenir

Les animaux qui seront déclarés aptes par le vétérinaire seront mis à l’adoption à l’aide d’une association.

Remplacement

Si les méthodes statiques et dynamiques d’évaluation de la formation, la structure et la composition du biofilm développées in vitro ont permis des avancées considérables dans la compréhension de la physiologie du biofilm, leur analyse comparative montre une importante hétérogénéité dans les résultats obtenus dépendant de la phase de croissance bactérienne, des milieux de culture utilisés et de leurs éventuelles supplémentations en glucose et/ou plasma, du type de matériel, des durées d’incubation, des étapes de lavage et de coloration, etc. Au-delà de ces considérations techniques, le rôle de l’environnement lié à l’hôte est maintenant bien reconnu (insuline, hormones stéroïdes, vitamines, etc.). En conséquence, les évaluations in vitro de l’activité anti-biofilm des antimicrobiens donnent souvent des résultats contradictoires. Des modèles animaux ont été implémentés pour palier à cette variabilité, tous basés sur l’implantation et l’infection de divers matériaux, le traitement des animaux avec les molécules testées avant l’ablation du matériel pour évaluation du biofilm résiduel. Toutefois, ces techniques longues et coûteuses ne permettent l’évaluation que d’un nombre limité de conditions (molécules, concentrations) et dans des conditions parfois éloignées de la pathologie étudiée. Nous proposons ici d’évaluer l’efficacité des bactériophages sélectionnés sur un modèle lapin d’implantation de cages sous-cutanées permettant, avec un nombre limité d’animaux, le screening ex vivo nombreuses conditions (phages, concentrations) sur du biofilm formé in vivo.

Réduction

L’ensemble des techniques utilisées ont été validées in vitro au préalable. Par ailleurs, le modèle utilisé représente en soit un modèle de réduction du nombre d’animaux nécessaire à l’étude du biofilm par rapports aux méthodes existantes in vitro ou in vivo, le système d’implantation de cages/billes permettant d’évaluer, à partir d’un seul animal, 36 conditions ex vivo : - limitation du nombre de conditions : l’évaluation des CMEB (Concentration Minimal Eradicatrice du Biofilm) nécessite l’utilisation de l’ensemble des phages seuls ou en combinaisons, puisqu’il s’agit de l’objectif principal. En revanche, l’évaluation de l’impact du temps de contact entre phages et billes ne sera réalisée que sur 3 conditions selon les résultats des CMEB, et avec seulement 3 concentrations afin de limiter le nombre total d’animaux nécessaires Le nombre d’animaux choisi correspond au minimum nécessaire pour atteindre les standards scientifiques nécessaires à l’interprétation des résultats, incluant 6 réplicas pour les comptes bactériens. Ce nombre de réplicas est le nombre habituellement nécessaire dans les modèles expérimentaux en microbiologie pour assurer la fiabilité et reproductibilité des résultats observés.

Raffinement

L’animal sera placé 3 semaines en acclimatation. Après une semaine et demie d’acclimatation, une puce d’identification électronique permettant de mesurer sa température corporelle tout au long du projet sera implantée sous la peau. L’animal sera habitué au passage du lecteur mais aussi au pyjama pour protéger les cages et les cicatrices afin de faciliter le suivi post-opératoire. Après 3 semaines d’acclimatation et reparti en lot homogène avec d’autres congénères, l’animal sera injecté avec un analgésique pour anticiper la sensation de la douleur la veille de la chirurgie. Le jour de la chirurgie, l’animal sera anesthésié à l’aide d’un anesthésique couplé à un analgésique (anti-douleur) pour réduire toutes sensations à la douleur. Un cathéter sera mis en place sur la veine de l’oreille pour permettre l’hydratation de l’animal tout au long de la chirurgie. L’animal est placé sous masque avec un anesthésie gazeux pour le maintien de l’anesthésie. L’animal est placé sur une table chauffante afin de maintenir la température corporelle. Un renfort de protection avec une compresse et une couche de coton cardé réduira les frottements des fils des points sur le pyjama et donnera une protection supplémentaire à un grignotage du pyjama par l’animal. L’animal sera placé dans des couvertures polaire et sous-surveillance jusqu’à son réveil. L’animal avec les couvertures polaire seront remis dans la cage. L’animal recevra le soir de la chirurgie un analgésique pour la nuit et le maintien de l’analgésie au lendemain de la chirurgie pendant 3 à 5 jours se fera selon les besoins de chaque individu. Le soir de la chirurgie, il sera déposé dans la cage des légumes frais, plus appétent, pour stimuler l’appétit de l’animal et réduire la perte de poids en post-opératoire. Les légumes frais seront maintenus pendant 72 h post-opératoire. Le poids de l’animal est suivi quotidiennement jusqu’à la reprise de poids. La cicatrice sera surveillée toutes les 48 h jusqu’au retrait des points à 15 jours minimum post-chirurgie. Suite au précédent projet, une nouvelle forme de cage imprimées en 3D de section ovalaire pour limiter les tractions cicatricielles sera utilisée par rapport au modèle princeps.

Choix des espèces

Le choix du lapin repose sur un rationnel technique et biologique, en comparaison aux alternatives possiblement envisageables : - le modèle lapin est utilisé depuis le début du 20ème siècle pour l’étude des infections staphylococciques du fait de sa sensibilité à ces infections et à la reproduction d’infections proches de celles observées chez l’homme ; - la taille d’une souris ne permettant l’implantation que d’une seule cage par animal, le modèle perdrait l’intérêt de pouvoir évaluer un large panel de conditions à partir d’un nombre limité d’animaux ; - le rat présente une sensibilité 100 fois moindre aux infections staphylococciques, nécessitant l’utilisation d’inoculum très élevés (et donc non pertinents cliniquement) sous peine d’une clairance spontanée de l’infection par la plupart des animaux Les animaux arriveront à 2,5 kg environ pour atteindre 3-3,5 kg (âge adulte). L’utilisation d’animaux adulte permet de bénéficier d’un système immunitaire mature, et d’une taille permettant l’implantation de 6 cages par animal.