Poissons

Déjà présents dans les installations du laboratoire, 20 poissons Astyanax mexicanus adultes, dix mâles et dix femelles, vont être génotypés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, un morceau de nageoire caudale leur est prélevé et un marquage à l'élastomère leur est posé, avec un isolement de moins de 24 heures. Aucun n'est tué : les vingt sont élevés et reproduits pour constituer des lignées avec et sans le chromosome surnuméraire qui semble déterminer le sexe. Le porteur affirme que ce chromosome est trop propre à l'espèce pour être étudié chez le poisson zèbre et que la culture cellulaire ne rendrait pas compte des stades de développement.

Objectifs

La détermination du sexe reste une question centrale en biologie, et les poissons sont des modèles particulièrement intéressant dans ce contexte, en raison de la grande diversité de leurs mécanismes de détermination du sexe, souvent liés à des changements de leurs chromosomes sexuels. Les chromosomes B, sont des chromosomes surnuméraires et accessoires qui peuvent être impliqués dans divers processus biologiques dont la détermination du sexe. Chez la population d’Astyanax mexicanus de de surface, il existe un chromosome B qui contient un gène majeur déterminant du sexe. Cependant on a observé des mâles avec et sans chromosome B ains que de rares femelles avec un chromosome B. L'objectif de cette partie du projet est d'effectuer un génotypage des animaux présents dans nos installations afin de réaliser des lignées spécifiques pour comprendre le rôle de ce chromosome dans le déterminisme sexuel de cette espèce.

Bénéfices attendus

La création de ces lignées permet d'avoir des poissons modèles pour étudier le rôle te les mécanismes de transmission des chromosomes B.

Procédures

Nous prélèverons un morceau de nageoire caudale et marquerons à l'élastomère sous anesthésie sur 20 poissons géniteurs.

Impact sur les animaux

Les procédures de biospsie, de marquage et d’isolement (

Devenir

Les 20 animaux génotypés seront élevés et reproduits pour générer les lignées souhaitées.

Remplacement

La présence du chromosome B est très espèce spécifique et ne peut être étudié sur des poissons modèles type zebra fish. De plus le système de déterminisme du sexe chez les poissons par un chromosome B met en jeu des mécanismes complexes et encore inconnus. L’étude de ces systèmes en modèle in vitro par culture cellulaire ne prendrait pas en compte l’interaction des différents types cellulaires ni les différents stades de développement lors de la maturation et n’est pas pertinent dans le cadre de notre étude.

Réduction

Sur 20 animaux qui seront génotypés nous avons 10 mâles et 10 femelles ce qui constitue le minimum pour réaliser une fécondation et pour avoir les génotypes attendus.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans les conditions optimales de l’espèce (température, photopériode, qualité d’eau, densité). Les enrichissements faits de plantes artificielles seront aussi installés dans les aquariums. Les manipulations des animaux comme la manipulation pour la biopsie de la nageoire, le marquage ou la mise en balnéation seront réalisées par du personnel compétant, sous anesthésie et le plus rapidement pour limiter le stress dû à la préhension. Le comportement des animaux sera observé quotidiennement par des zootechniciens en suivant la grille Bien Être Animal qui permet de déterminer les points limites qui mèneraient à l’arrêt de l’expérimentation.

Choix des espèces

Les espèces et populations de poissons du groupe Astyanax seront utilisées comme espèces modèles dans cette étude du fait que les mâles possèdent un chromosome B qui, d’après des études préliminaires, semblent liées au sexe. De plus les Astyanax possèdent des qualités de poisson modèle (génome entièrement séquencé, petite taille, temps de génération réduit (maturation à 6 mois), reproduction toutes les 2 semaines, fécondation in vitro possible). Les 20 poissons de cette procédure seront utilisés à l'âge adulte et à maturité sexuelle pour réaliser des reproductions.

Pêchés au filet, anesthésiés trois à cinq minutes, mesurés et pesés hors de l'eau, 2 000 poissons reçoivent une puce électronique implantée dans l'abdomen par une incision de trois à cinq millimètres. Onze espèces sont concernées, dont cent salmonidés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont ensuite remis à l'eau, l'objet du projet étant de vérifier si une passe aménagée dans un grand fleuve laisse effectivement passer les migrateurs. Le porteur reconnaît qu'aucune analyse statistique n'est prévue et justifie l'effectif par les puces perdues en cours de route, certaines femelles les expulsant lors de la reproduction.

Objectifs

Suite à différents aménagements au niveau des fleuves ou de cours d'eau plus petits, la migration des poissons n'est plus possible. Ainsi des "passes à poissons" sont mises en place pour aider le passage des poissons au niveau de ces ouvrages et ainsi permettre notamment leur reproduction. L'objectif de ce projet est de vérifier l'efficacité d'une "passe à poisson" en suivant le passage des individus au travers de celle-ci. Pour ce faire, un éventail des poissons représentatifs du cours d'eau correspondant est pêché par différentes techniques. Les caractéristiques des poissons sont rapportées (taille, poids, sexe) sous-anesthésie générale et une puce, dont la taille est adaptée aux mensurations du poisson est implantée dans la cavité abdominale par chirurgie. Le poisson est ensuite remis en eau sous surveillance avant d'être relâché. Le poisson portant la puce pourra être détecté s’il passe au travers de la passe à poissons, ce qui permettra de vérifier que l'aménagement réalisé est bien efficace pour permettre le passage des individus au travers de l'ouvrage.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de vérifier l’efficacité de la passe à poissons pour les espèces présentes. Il est indispensable de réaliser ce type de suivi biologique en milieu naturel pour vérifier s’il est nécessaire de réaliser des travaux d’amélioration de la passe à poissons, pour que les poissons puissent librement circuler.

Procédures

Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et une puce électronique sera implantée manuellement sur 2000 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.

Impact sur les animaux

La capture, le transport, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress modéré sur les animaux. Il existe également un risque de douleur légère post-anesthésie suite à l’incision.

Devenir

Tous les individus seront replacés dans leur habitat naturel

Remplacement

Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement d’un aménagement (ici une passe à poissons) doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées.

Réduction

L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements des poissons par espèce et par stade, et évaluer la franchissabilité de la passe à poissons. Il est adapté au gabarit du milieu (grand fleuve) et à la diversité spécifique et la densité de population. L’effectif tient compte de plusieurs facteurs, pour garantir un certain nombre de détections : - L’implantation des puces ne génère en principe pas ou très peu de mortalité post-opératoire en respectant les préconisations de tailles minimales. Toutefois, certains individus peuvent perdre leur puce dans les semaines suivant l'implantation. - Certaines femelles peuvent également expulser la puce lors de la reproduction. Tous les individus d'une même espèce ne vont pas forcément migrer. Les individus pêchés en amont de la passe à poissons (50%), seront transportés en aval de la passe, où ils seront pucés puis relâchés, de manière à privilégier l'étude sur des individus enclins à migrer et in fine réduire le nombre d'individus marqués. Il n'est pas prévu d'analyses statistiques dans le cadre de cette étude comportementale menée en milieu naturel, en-dehors des statistiques descriptives (taux de franchissement, durée moyenne de franchissement).

Raffinement

Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. La solution d'anesthésie sera renouvelée toutes les 30 minutes, pour éviter que la température du bain n’augmente et soit toujours suffisamment fraiche pour éviter le stress des poissons et l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie, sachant que les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière. L’application de points limites stricts et spécifiques du projet limitera les risques de douleur tout au long de la procédure.

Choix des espèces

11 espèces de poissons sont ciblées et sont représentatives du fleuve et de la zone concernée : - Poissons d’eau courante : barbeau fluviatile, hotu, chevaine, truite commune - Poissons d’eau calme : brème, gardon, rotengle, lote - Carnassiers : Brochet, silure, perche 1 stade de développement est retenu : subadultes-adultes.

Capturés en rivière, anesthésiés puis marqués par une injection de colorant sous la peau, 120 gobies à tache noire mâles sont chauffés dans un bac de terrain jusqu'à perdre l'équilibre, en séances de deux heures trente. Suivent un mois en animalerie, jusqu'à trente-six heures de jeûne, des passages isolés en tunnel de nage et en chambre de respirométrie sous oxygène réduit, et un second échauffement mené jusqu'à l'arrêt de la nage. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à la fin pour prélever leur cœur, leur cerveau et leur muscle et relier ces défaillances à l'état de leurs mitochondries.

Objectifs

Dans un contexte de changement climatique global, les milieux aquatiques continentaux sont de plus en plus soumis à des stress environnementaux (chaleur, hypoxie, etc.) sévères, affectant la physiologie, le comportement et la survie des espèces qui y vivent. Les poissons, ectothermes, sont particulièrement exposés à ces changements. Ainsi, les espèces les plus résilientes pourraient être avantagées et coloniser de nouvelles niches écologiques. Ces espèces invasives entraînent un déséquilibre des réseaux trophiques impactant l’ensemble du milieu. Comprendre les mécanismes qui sous-tendent leur plasticité est donc essentiel pour anticiper les conséquences des contraintes naturelles sur la biodiversité aquatique et orienter les politiques de conservation. Ce projet vise à caractériser les limites de tolérance thermique chez le gobie à tache noire (Neogobius melanostomus), une espèce benthique invasive en forte expansion dans les rivières européennes, notamment en France. Cette espèce semble capable d’occuper des habitats plus contraignants que ceux d’espèces endémiques, notamment des zones de fond à faible teneur en oxygène. Cette tolérance à l’hypoxie contribuerait à son succès invasif en lui permettant d'exploiter une niche écologique plus large. Le projet repose sur une approche expérimentale comparative combinant plusieurs indices de tolérance thermique basés sur les performances de nage qui seront mesurés dans des dispositifs dédiés à la fois sur le terrain et en laboratoire. La comparaison de ces deux situations n’a jamais été effectuée auparavant et sera complétée par des mesures en condition d’oxygène réduite, caractéristique importante des milieux dégradés. En combinant mesures de performances/tolérances thermiques (CTmax terrain et laboratoire, CTswim) et analyses mitochondriales sur cœur, cerveau et muscle, ce projet vise à fournir une compréhension multi-échelle de la tolérance thermique chez une espèce envahissante, et à identifier les traits qui favoriseraient sa progression dans les milieux aquatiques soumis au changement global. Ce projet implique la capture de gobies sauvages dans la Saône et des expérimentations en conditions de terrain et en animalerie agréée.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à affiner notre compréhension des limites de tolérance thermique chez le gobie à tache noire, une espèce invasive largement répandue dans les grands cours d’eau d’Europe. Il s’agit notamment de comparer différents indicateurs de tolérance thermique : la CTmax, mesurée soit en conditions naturelles, soit en conditions contrôlées, et la CTswim correspondant à une perte fonctionnelle locomotrice sous contrainte thermique. (1) Sur le plan fondamental, cette étude permettra d’identifier les mécanismes écophysiologiques impliqués dans la défaillance thermique, en reliant les seuils critiques comportementaux (perte d’équilibre, arrêt de nage) au fonctionnement des mitochondries de plusieurs organes (cerveau, cœur, muscle). L’approche multi-échelle utilisée (de l’organisme à la cellule) contribuera à clarifier les processus qui limitent les performances thermiques des poissons dans leur environnement. (2) Sur le plan méthodologique, le projet interroge la robustesse d’un indicateur largement utilisé (la CTmax) selon le contexte expérimental (terrain vs laboratoire), et propose une alternative potentiellement plus pertinente d’un point de vue écologique : la CTswim, qui intègre la composante locomotrice, essentielle à la survie (fuite, alimentation, reproduction). (3) Sur le plan appliqué, les résultats aideront à reconsidérer les indicateurs utilisés pour la gestion thermique des milieux aquatiques. Si la CTswim se révèle plus sensible que la CTmax, notamment en conditions hypoxiques, elle pourrait constituer un nouveau seuil critique pertinent à intégrer dans les modèles de niche thermique, la planification de la restauration écologique ou l’évaluation des risques liés aux canicules aquatiques. Enfin, l’étude du gobie comme modèle invasif permettra d’identifier des traits fonctionnels susceptibles de favoriser la résilience thermique et l’occupation de niches écologiquement stressantes, offrant ainsi des clés pour mieux comprendre les dynamiques d’invasion dans un contexte de changement global.

Procédures

Les poissons seront soumis à plusieurs interventions expérimentales réparties en séquences, selon les deux procédures décrites dans le projet. - Capture et marquage individuel Après la capture en milieu naturel (temps d’émersion

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement liés au stress physiologique induit par : - La capture en milieu naturel, - Le changement d’environnement (transition rivière → laboratoire), - Les manipulations expérimentales (chambre de nage, respirométrie, échauffement thermique). Ce stress peut favoriser des troubles immunitaires et l’apparition d’infections opportunistes, notamment chez des individus déjà fragilisés. Ce risque sera réduit par des phases de récupération post-manipulation, une surveillance rigoureuse de l’état des animaux et une stabulation adaptée (eau filtrée, oxygénée, cachettes, densité contrôlée). Les autres effets indésirables incluent : - Le jeûne alimentaire imposé avant les mesures métaboliques (36h max), potentiellement inconfortable mais nécessaire pour éviter les biais liés à la digestion ; - L’isolement temporaire (

Devenir

À la fin de l’expérience, il est prévu de procéder à des échantillonnages pour analyses mitochondriales (cœur, cerveau, muscle squelettique) sur l’ensemble des individus utilisés. Ces analyses nécessitent l’euthanasie de tous les individus restants, conformément au plan expérimental, afin de relier directement les performances thermiques et locomotrices aux mécanismes cellulaires.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques, surtout lorsqu’il s’agit d’animaux sauvages. Cela permet notamment de caractériser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour étudier de façon complète, les réponses métaboliques de l’animal face à son environnement

Réduction

Compte tenu de la variabilité interindividuelle attendue (taille, masse, capture en milieu naturel), le nombre d’animaux a été réduit au strict nécessaire tout en garantissant la pertinence scientifique et statistique. Le marquage individuel permet d’appliquer des tests à mesures répétées, prenant l’individu comme facteur aléatoire, ce qui réduit fortement le besoin d’effectifs supplémentaires. Notre plan expérimental inclut : • Deux conditions d’oxygénation (100 % vs 20-50 % de saturation en O₂), • Deux statuts expérimentaux (poissons testés en CTmax terrain vs individus naïfs). Nous travaillons uniquement sur des mâles pour limiter la variabilité liée au sexe et réduire le nombre d’animaux nécessaires. L’effectif final (120 individus) est équilibré entre conditions et prend en compte une faible marge pour compenser la mortalité possible (transport, acclimatation, manipulations), inévitable avec des individus sauvages. Cet effectif se base sur la taille d’échantillons décrite dans les articles publiés sur le sujet.

Raffinement

Lors des protocoles in vivo, un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesures et changement de milieu – tunnel, chambre ou nouvel aquarium) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h dans le tunnel de nage avant les protocoles de respirométrie. Après chaque expérience, les poissons seront replacés dans leur aquarium de stabulation et toutes les précautions seront prises pour leur éviter toutes nuisances visuelles et sonores. Les gobies seront maintenus dans des aquariums en densité adaptée à leur espèce, agrémentés de plantes artificielles et de gravier. Des cachettes adaptées des constitués de tubes PVC seront disposées dans les aquariums. Les poissons seront nourris une fois par jour, avec des cubes de moules hachées avec du mix (différentes larves de moustiques, daphnies et de la verdure (épinards, spiruline)) et lors du nourrissage, leur comportement sera particulièrement observé. En effet, si un poisson ne se nourrit pas, des mesures seront prises à son égard. Une observation biquotidienne sera réalisée par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de veiller au bien-être des animaux depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à l’euthanasie. Les états de santé et de bien-être des animaux seront ainsi évalués en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d’évaluation afin de définir des points limites adaptés et précoces pour mettre fin à toute douleur incompatible avec les objectifs du projet. Dès l’apparition de signes cliniques de mal-être, les animaux seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage. Dans le cas où des signes de douleur ou de mal-être devaient persister au-delà de 24 heures après la mise en stabulation, les animaux seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le gobie à tache noire (Neogobius melanostomus) a été choisi comme modèle en raison de son fort intérêt de la communauté scientifique quant à son impact écologique. Espèce benthique exotique envahissante, elle colonise rapidement les cours d’eau français (Moselle, Saône, Doubs) et entre potentiellement en compétition avec des espèces autochtones en occupant des habitats hypoxiques peu accessibles à ces dernières. Son comportement locomoteur particulier (nage par bursts, maintien au substrat) et sa tolérance apparente à l’hypoxie en font un modèle idéal pour explorer les limites physiologiques et bioénergétiques de la tolérance thermique. Par ailleurs, le gobie est classé en préoccupation mineure (LC) sur la liste rouge UICN. Sa capture en milieu naturel, dans le cadre d’autorisations préfectorales spécifiques, n’entraînera aucun impact significatif sur les populations locales, d’autant plus qu’il s’agit d’une espèce prolifique, suivie dans plusieurs programmes de gestion piscicole régionaux. Tous les individus utilisés sont des adultes mesurant entre 8 et 14 cm, ce qui correspond aux tailles adultes couramment observées dans les populations naturelles. Le choix de ce stade de développement est justifié pour deux raisons principales : - Il garantit une compatibilité optimale avec les dispositifs expérimentaux utilisés (tunnel de nage de 5 L, chambres métaboliques, système CTmax). - Il assure une représentativité écologique : les individus adultes sont les plus exposés aux contraintes environnementales (température, hypoxie) et jouent un rôle clé dans les dynamiques de population (reproduction, territorialité, compétition interspécifique).

Entassés une heure par jour pendant dix jours dans un bassin dont on abaisse le volume d'eau, 440 tilapias perdent du poids, refusent de s'alimenter et finissent par perdre une partie de leurs écailles au niveau des nageoires. Ils sont sortis de l'eau dix fois en trois mois pour être pesés et prélevés, subissent une prise de sang, puis sont tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le stress leur est infligé volontairement, pour mesurer si des taux de vitamines supérieurs aux recommandations aident les poissons d'élevage à mieux le supporter, au bénéfice des producteurs. Le porteur écrit que les prélèvements post mortem serviront à optimiser les rations alimentaires "pour leur bien-être", quand le protocole consiste à entasser et affamer les animaux avant de les tuer.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer des taux d’incorporation optimum de vitamines dans les rations alimentaires des poissons face à un stress. L’amélioration des conditions d’élevage participe au développement d’une aquaculture plus raisonnée. La nutrition vitaminique joue un rôle clé dans l'optimisation des performances de production et la résistance au stress. Cependant, les conditions d'élevage actuelles ont révélé que les niveaux de vitamines recommandés ne permettent plus d’optimiser la croissance et la résistance au stress et ainsi de promouvoir la santé des poissons d’eau chaude. En effet, la diminution de l’utilisation de la farine de poisson, au profit d’ingrédients d’origine végétale de plus en plus présents dans les rations alimentaires, ainsi que la pression exercée pour limiter l’usage des antibiotiques, rendent nécessaire une réévaluation régulière des apports en vitamines. Ces derniers doivent être adaptés aux différents stades de développement des poissons ainsi qu’aux divers facteurs de stress auxquels ils sont exposés. Malgré l’importance des fonctions des vitamines, peu d’études ont été réalisées pour déterminer les besoins vitaminiques des poissons d’eau chaude. De plus, ces études, réalisées dans des conditions de laboratoire contrôlées et optimales, se basaient uniquement sur la modification d’une seule vitamine dans la ration alimentaire, négligeant de ce fait les interactions de fonctions entre les vitamines et les autres nutriments. Ainsi, les recommandations précédemment établies pour les niveaux d'inclusion de vitamines alimentaires étaient probablement biaisées et sous-optimales pour des applications pratiques avec des formulations alimentaires modernes. Plusieurs études menées sur la truite et la crevette, dont une réalisée sur la truite arc-en-ciel dans le cadre d’un projet antérieur, ont mis en évidence les effets bénéfiques de l’incorporation de niveaux de vitamines supérieurs aux recommandations nutritionnelles. Ces apports renforcés ont notamment amélioré la croissance et la santé des poissons, en particulier lors d’épisodes de stress. Le concept de vitamine optimale s’avère une stratégie nutritionnelle bénéfique afin d’optimiser la physiologie du poisson et les fonctions du système immunitaire en réponse à des conditions de stress. L’objectif de ce projet est de montrer les effets bénéfiques de taux élevés de vitamines chez les poissons d’eau chaude en utilisant le tilapia comme modèle.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront à court terme de mieux comprendre les effets de taux élevés de prémélange de vitamines sur la capacité des poissons d’eau chaude à faire face à des conditions de stress. La mise à disposition des résultats et leur interprétation permettra aux producteurs de poissons d’améliorer leurs conditions d’élevage et de participer à une pisciculture plus raisonnée. Les résultats de ce projet permettront ensuite de comprendre si la supplémentation du précurseur de la forme active de la vitamine D, seul ou en combinaison avec des taux élevés de vitamines, est bénéfique aux poissons d’eau chaude.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 17 jours, dont 10 jours de stress d'entassement et 7 jours de récupération. Au cours du stress, le volume de l'eau dans le bassin sera diminué une heure par jour pendant 10 jours Sortie hors de l’eau des poissons pour les pesées et les prélèvements (10 fois en trois mois ; moins de 30 secondes). Prélèvement de sang réalisé une fois par animal avec un temps de prélèvement qui ne dépassera pas une minute.

Impact sur les animaux

Durant la période de stress : Perte de poids, diminution de l'indice corporelle, refus de s’alimenter, dégradation de l’état corporel (pertes partielles des écailles au niveau de la nageoire pectorale et caudale en fin de période de stress). Douleur transitoire à l'endroit du prélèvement de sang réalisé une fois par animal.

Devenir

Les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements biologiques. Ces prélèvements permettront de mieux appréhender l'effet de concentrations élevées en vitamines sur la résistance des poissons au stress d'élevage et d'optimiser de ce fait les rations alimentaires pour leur bien-être.

Remplacement

La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut pas être remplacée par une autre stratégie n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. En effet, l"apport en vitaminique sera évaluée au niveau des organes et dans la circulation sanguine. Or, il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico intégrés capables de mettre en évidence ce type d’effet sur la stimulation du système immunitaire pour faire face aux stress d’élevage subis par les poissons. Enfin les paramètres zootechniques sont également d’importance pour cette évaluation car étroitement liés à la physiologie du poisson et nécessitent des animaux vivants.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d'animaux adéquat pour ce projet. Les calculs ont été faits sur la base de résultats significatifs obtenus dans d'autres études sur les paramètres du stress (réponse immune, expression de gènes…) chez la truite arc en ciel ayant subis un stress d'élevage. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d'apporter de bonnes conditions d'élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux et d'obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d'informations possibles par animal.

Raffinement

Avant toute manipulation, les tilapias seront anesthésiés. Le stress dû à la capture, à la sortie des bassins et aux les prises de sang seront réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’un mousse humide pour poser l’animal sur le support de contention et d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans la procédure qui définit le volume limite de sang et les périodes de récupération nécessaires. Pour protéger le bien-être des animaux, ils seront suivis au moyen de grilles d'évaluation du bien-être animal, et des points limites adaptés seront appliqués immédiatement si un animal semble éprouver des effets indésirables imprévus. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte à ce que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux (température) ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et répondent à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.

Choix des espèces

Les concentrations de vitamines évaluées chez le tilapia sont destinées à être incorporées dans les aliments comme additif alimentaire pour les poissons d’eau chaude. Le tilapia est le deuxième plus important groupe de poissons élevé, il est peu exigeant et résistant aux conditions d'élevage. Au début de l’étude les tilapias pèseront 30 grammes. Ils seront élevés pendant 12 semaines, pour pouvoir effectuer les échantillonnages d’organes et les prélèvements de sang demandés par la procédure.

Tous tués pour prélèvement d'organes, 169 120 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque individu peut passer sept séances d'imagerie avec coloration in vivo des tissus calcifiés, comptant 45 minutes de coloration et de lavage, et jusqu'à quatre échocardiographies. Certains sont soumis deux fois par jour à un régime riche en graisses pendant 90 jours ou plus, d'autres à un choc thermique local ou à des injections répétées, et les poissons génotypés sont isolés deux à sept jours en attendant le résultat de la biopsie. Le porteur explique cet effectif par la variabilité entre individus et par le caractère progressif de la calcification, et précise que 169 120 correspond au maximum qu'il peut utiliser.

Objectifs

La calcification cardiovasculaire (CCV) est une anomalie pouvant toucher différents tissus tels que les valves cardiaques, le myocarde ou les vaisseaux sanguins. La calcification vasculaire, qui inclut les pathologies de calcification de l’artère coronaire, touche 90% des hommes et 67% des femmes de plus de 70 ans. Malgré l’incidence mondiale de ces maladies, les traitements sont très limités, ce qui conduit à des taux de morbidité et mortalité élevés pour ces pathologies. De plus, les mécanismes exacts conduisant à la CCV restent mal définis, limitant la découverte de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons le modèle poisson zèbre pour clarifier les mécanismes de la CCV et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques en nous appuyant (i) sur la facilité d’imagerie in vivo (ii) les possibilités de criblage haut débit (test de centaines de molécules sur les poissons présentant une CCV) et (iii) la conservation entre mammifères et poissons zèbres de la plupart des voies impliquées dans les systèmes cardiovasculaires et osseux (facilitant ainsi la translation des données générées chez les poissons zèbres vers les patients). Pour cela, nous caractériserons la dynamique cellulaire et les interactions au niveau moléculaire à travers différentes voies et signalisations, ainsi que l'impact fonctionnel de la calcification in vivo chez des mutants de poisson zèbre présentant des phénotypes de calcification cardiovasculaire. Cette caractérisation permettra l'établissement de nouveaux modèles génétiques de calcification cardiovasculaire, qui pourraient être utilisés dans la recherche de nouvelles thérapies pour bloquer ou inverser la calcification cardiovasculaire, ayant un impact considérable sur la population européenne, gravement touchée par ces maladies.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectifs d’identifier les voies de signalisation impliquées dans la calcification cardiovasculaire puis de tester différentes molécules thérapeutiques pour réduire les taux de morbidité et mortalité associés à cette pathologie.

Procédures

Pour tous les gestes techniques, les animaux seront anesthésiés. Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Les animaux seront analysés par microscopie d'imagerie en direct (10 minutes d'imagerie par point de temps) avec une coloration in vivo pour les tissus calcifiés (45 minutes de coloration et de lavage). Chaque animal sera soumis à cette procédure au maximum 7 fois (à 5, 8, 12, 15, 20, 25 et 30 jours post fertilisation) sur les 30 jours de l’expérience. Une échocardiographie (10 minutes d'imagerie par point de temps) sera réalisée au maximum 4 fois par animal sur une durée maximale de l’expérience de 60 jours. Certains poissons recevront 2 fois par jours une alimentation avec des régimes riches en graisses et occidentaux sur une durée pouvant aller de 90 jours, voire plus. En ce qui concerne les traitements médicamenteux, si l'administration se fait dans un bain, l’incubation varie de 3 à 6h ; si l’administration du médicament se fait par injection, le temps d'anesthésie est inférieur à 2 minutes et l'injection est très rapide (quelques secondes). Les poissons seront traités pendant une durée maximale de 15 jours et seront analysés à différentes étapes. Les médicaments seront administrés en doses uniques ou répétées en fonction de leur durée de vie et des périodes d'absorption. Une autre intervention consistera en un choc thermique local d’une durée inférieure à une minute suivi de 10 minutes d'imagerie par point de temps. L’expérience pourra durer jusqu’à 90 jours, ou plus. Concernant le génotypage des poissons, les animaux seront anesthésiés (moins de 2 minutes) pour une biopsie (quelques secondes). Les poissons seront isolés jusqu’au résultat de la biopsie (2 à 7 jours).

Impact sur les animaux

Les animaux adultes seront soumis, lors de l'administration des médicaments ou des composés destinés au traçage et au marquage des cellules, à une injection d’une durée inférieure à 30 secondes, douleur légère. L'effet du médicament ou du traitement peut entraîner des phénotypes spécifiques d’une durée de 1 à 14 jours dont les douleurs seront de classe légère à modérée. Les études échographiques pourront engendrer une douleur légère de courte durée (5 minutes maximum). Pour les besoins expérimentaux, les animaux pourront être hébergés de manière isolée pouvant durer jusqu'à 14 jours (sévérité légère à modérée selon la durée). Les phénotypes dommageables potentiellement observés sur les lignées mutantes incluent des modifications de la morphologie (déformations squelettiques, variations de taille ou de l’opercule), des atteintes oculaires ou des nageoires, ainsi que des changements d’aspect ou de vitalité liés au vieillissement. Les niveaux de sévérité peuvent varier de léger à modéré sur une durée de 6 mois maximum. Une surveillance accrue sera effectuée afin de prévenir et limiter la souffrance des animaux. Tout individu présentant des effets indésirables entraînant une souffrance significative sera mis à mort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe et analyse.

Remplacement

Notre projet se déroule dans la continuité de tests in vitro pour comprendre la calcification cardiovasculaire. Cependant, ces modèles ne permettent pas de prendre en considération les caractéristiques complexes de ces maladies, puisqu'elles résultent de l'action de multiples facteurs et types de cellules. Des travaux récents ont proposé comme alternative l’utilisation ex vivo d’aorte de souris ou de rat. Là encore, les résultats peuvent être biaisés par les conditions de culture. L'utilisation de modèles animaux reste donc cruciale.

Réduction

La diversité entre les individus, particulièrement prononcée chez les jeunes poissons zèbres (à leurs stades larvaires), explique pourquoi il est nécessaire d'utiliser un plus grand nombre d'animaux afin d'obtenir une puissance statistique suffisante pour valider nos résultats. De même, la calcification cardiovasculaire, qui évolue progressivement et de manière très variable, requiert également un nombre accru d'animaux pour obtenir des résultats fiables. Cependant, étant donné que chaque fond génétique peut présenter une variabilité différente, nous prévoyons de réaliser nos expériences en plusieurs étapes, augmentant progressivement notre effectif, afin d'éviter d'utiliser un surplus d'animaux si la puissance statistique est atteinte avec un effectif moindre. Par conséquent, le nombre d'animaux requis correspond au maximum que nous pouvons utiliser. Étant donné la nature dynamique et hétérogène de la calcification cardiovasculaire, nous suggérons d'exploiter et de créer un grand nombre de lignées génétiques. Ceci permettra d'explorer les mécanismes moléculaires et cellulaires contribuant à l'établissement et à l'aggravation du phénotype de calcification. En utilisant des techniques d'imagerie en direct, nous serons en mesure de suivre la progression individuelle de la calcification chez les mêmes animaux, réduisant ainsi le recours habituel à un grand nombre d'animaux pour caractériser et quantifier les échantillons post-mortem ainsi que les coupes histologiques de tissus.

Raffinement

Tout au long de notre projet, les animaux seront maintenus dans des conditions optimisées pour assurer leur bien-être. Les paramètres de l’eau (température, conductivité et pH) ainsi que le cycle lumineux seront contrôlés. Un enrichissement sera assuré par l’ajout de nourriture vivante (artémias). Les accouplements sont réalisés dans des aquariums dédiés mimant les conditions naturelles d’accouplement. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Des points limites sont fixés de manière à détecter précocement tout signe de souffrance et à prendre toutes les mesures nécessaires à la réduire. De plus, nous utiliserons des procédures non invasives (imagerie, échocardiographie) afin de caractériser le processus de calcification cardiovasculaire.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle idéal pour la recherche en raison de ses caractéristiques uniques. Sa transparence durant les premières semaines après la fécondation permet des techniques d'imagerie exceptionnelles, impossibles avec d'autres modèles. Sa petite taille et sa grande progéniture facilitent son hébergement et sa manipulation, favorisant les études à haut débit. De plus, ses techniques avancées de transgenèse et de mutation offrent diverses méthodes pour étudier spécifiquement les gènes et les voies de signalisation. La similitude marquée entre le poisson zèbre et les mammifères renforce sa valeur en tant qu'organisme modèle. Sa remarquable capacité de régénération tissulaire tout au long de sa vie le rend particulièrement intéressant d'un point de vue d’application clinique. Pour notre projet, le poisson zèbre offre la possibilité d'acquérir des images en temps réel à différents stades de développement et de cibler des cellules spécifiques grâce à des techniques d'ablation génétique. Cela en fait l'organisme idéal pour notre étude sur l'établissement de la calcification cardiovasculaire, aussi bien au cours du développement que chez les adultes. Nous examinerons les stades larvaires et juvéniles (5, 8, 12, 15, 20, 25, 30 jours post-fécondation) pour comprendre les étapes clés du développement cardiovasculaire, ainsi que les stades adultes (60, 90 et >90 jours post-fécondation) pour observer les tissus sains et malades chez les jeunes et les animaux plus âgés.