Poissons
Rôle de la communication cytokine-microbiote dans l’homéostasie intestinale : étude de la physiologie et de la régénération de l’intestin du poisson zèbre
- Conservation des espèces
- Enquêtes médicolégales
- Enseignement supérieur
- Formation professionnelle
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
À quatre jours de développement, des larves de poisson zèbre ont l'intestin sectionné en deux sous anesthésie, geste que le porteur chiffre à dix secondes. 29 200 poissons zèbres vont être utilisés, 16 645 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 11 205 un niveau modéré et 1 350 un niveau sévère. La mortalité annoncée après cette section intestinale atteint environ 20 %, et le porteur prévoit que certains inhibiteurs testés altèrent la régénération, ce qui pourrait encore l'augmenter. 16 725 individus restent vivants au titre de l'élevage des lignées, les autres sont tués par surdose d'anesthésique après cinq séances d'observation au microscope, pour analyse post mortem.
Objectifs
Les cytokines sont des acteurs essentiels du système immunitaire, assurant la communication intercellulaire grâce à des récepteurs spécifiques situés à la surface des cellules cibles, qui transmettent leur signal. Produites principalement en réponse à un agent infectieux (virus, bactérie ou constituant) par les cellules lympoides innées (ILC), elles agissent comme médiateurs de l’immunité. La colonisation intestinale par les micro-organismes commensaux (organismes vivant dans l’hôte sans lui nuire) débute avec l’ingestion de nourriture et s’intensifie avec l’introduction d’aliments secs dans l’alimentation des poissons. Cytokines et microbiote participent à des processus cellulaires comme la prolifération, la mort et la migration des cellules. Ils jouent aussi un rôle clé dans l’inflammation et la fonction de barrière intestinale, qui empêche le passage du contenu (microbes, toxines, etc) de l’intestin vers l’intérieur du corps. Cependant, leurs interactions restent mal comprises, notamment durant la physiologie normale et la régénération après une lésion grave de l’intestin. L'objectif principal du projet est d'étudier le rôle de l'interaction entre les cytokines et le microbiote dans la physiologie et la régénération de l'intestin après une blessure qui laisse l'intestin non fonctionnel. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons le poisson-zèbre, qui est largement utilisé dans les études biologiques. Ce modèle offre des avantages uniques, tels que sa transparence durant les premiers stades de développement, permettant d’observer les conséquences des interactions entre le microbiote et les cytokines dès les premiers jours de vie. Il présente également une grande capacité de régénération, ce qui en fait un outil précieux pour étudier les facteurs déterminant une régénération tissulaire réussie. L’identification de ces facteurs et la compréhension de leurs mécanismes moléculaires ont pour but d’apporter des connaissances utiles à la régénération intestinale humaine après une lésion.
Bénéfices attendus
La régénération est la capacité à restaurer un organe ou un tissu endommagé par une blessure ou une dégénérescence. Cependant, les mammifères, y compris les humains, ont un potentiel régénératif limité, qui diminue avec l'âge. En conséquence, les dommages graves subis par de nombreux organes essentiels sont irréversibles, ce qui entraîne des problèmes de santé potentiellement mortels. Bien que l'on ait longtemps pensé qu'il avait été perdu au cours de l'évolution, le potentiel régénératif semble persister à l'état latent et pourrait être réactivé. Il est donc très important et utile d'identifier les mécanismes fondamentaux de la régénération chez les espèces qui sont naturellement capables de se régénérer efficacement. Le poisson zèbre, en raison de sa remarquable capacité à régénérer la plupart de ses organes, est devenu un modèle de référence en biologie régénérative. Il a révélé que certains mécanismes de régénération sont conservés chez les mammifères et pourraient être réactivés, ouvrant la voie à des approches innovantes en médecine humaine (doi: 10.3390) Ce projet vise des avancées significatives pour la santé humaine et la médecine régénérative en étudiant le rôle clé des cytokines et du microbiote dans la guérison intestinale. À court terme, il pourrait améliorer notre compréhension des maladies intestinales telles que les MICI (maladies inflammatoires chroniques de l’intestin) et, à long terme, inspirer des traitements innovants pour les lésions graves, réduisant la nécessité d'interventions chirurgicales complexes. Cela bénéficierait non seulement aux humains mais aussi à d'autres espèces, tout en approfondissant nos connaissances scientifiques sur les interactions entre notre corps et les micro-organismes.
Procédures
À 4 jours après la fécondation, les larves subiront une intervention : une partie de leur tube digestif, située près de leur sortie uro-génitale, sera coupée en deux parties après qu’elles aient été profondément anesthésiées (La coupe de l’intestin ne prend pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Une fois remises, les larves seront de nouveau anesthésiées (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) pour être observées au microscope sans stress. Cette observation sera répétée 5 fois jusqu’à leurs 10 jours de développement. Certaines larves seront prélevées après observation et euthanasiées avec une forte dose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. D’autres larves recevront des substances (appelées "drogues" en termes scientifiques) qui pourraient influencer la régénération de l’intestin. Ces drogues seront directement administrées dans l’eau des larves pendant une durée qui est fonction de la drogue mais connue de la littérature. Ensuite, les larves sont remises dans une eau sans droque. Elles seront également observées par imagerie pour voir si ces substances ont un effet (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) Au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem. Enfin, nous ferons grandir des larves dans un environnement stérile, sans microbes grâce à un milieu contenant des antibiotiques. À 5 jours, elles subiront aussi une coupure de l’intestin sous anesthésie (pas plus de 3 minutes entre l’anesthésie et la fin de l’acte). Ces larves seront ensuite placées avec d’autres larves élevées dans un environnement normal (sans antibiotique), contenant des microbes. Ces larves seront observées 5 fois sous le microscope sous anesthésie (l’anesthésie peut durer de 10 à 30 min.) jusqu’à leurs 10 jours de développement. Comme précédemment, au bout de 10 jours, suite à la dernière observation, elles seront tuées par surdose d’anesthésiant pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Il est possible que certaines lignées créées présentent des phénotypes dommageables entraînant par exemple des scolioses prématurées ou des problèmes de reproduction. Pour génotyper le poisson, il est nécessaire de prélever du tissu par biopsie (ici, un prélèvement de quelques millimètres de la queue), ce qui induit une douleur légère lors de l’incision. L’intervention ne dure pas plus de 30 secondes. Le prélèvement de très faible taille induit une gêne légère dans le déplacement, la régénération de la nageoire étant complète en moins de 5 jours. Suite à la coupe de l’intestin, les poissons peuvent ressentir une gêne pour la nage. Le taux de mortalité est autour de 20% suite à cette chirurgie. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement Suite à nos travaux issus d’une autre autorisation, nous ne rencontrons pas de mortalité dû aux antibiotiques présents dans le milieu.dû aux antibiotiques présents dans le milieu. En ce qui concerne l'utilisation d'inhibiteurs, leur utilisation a déjà été rapportée dans des articles de recherche utilisant des larves de poisson zèbre. Nous appliquerons donc les traitements (concentration et durée d'exposition) décrits dans la littérature. Nous nous attendons à ce que certains inhibiteurs altèrent le processus de régénération, ce qui pourrait potentiellement entraîner une augmentation de la mortalité après une blessure.
Devenir
A l’exception de la première procédure d’élevage de poissons utilisés ensuite dans les procédures suivantes, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
Pour notre projet, nous nous appuyonsà la fois sur sur des données déjà accessibles au public et sur nos propres données de séquençage de l’ARN issues du modèle poisson-zèbre. Cettetechnique permet d’identifier et de quantifier le matériel génétique à un moment précis Actuellement, la culture in vitro de l’intestin et sa colonisation par un microbiote restent actuellement impossibles. Par ailleurs, la régénération est une interaction complexe entre les éléments moléculaires, cellulaires et environnementaux. Ceci ne peut pas être transposé dans les cellules et il n’existe pas d’alternative non animale. Il est donc difficile de trouver un remplacement efficace et suffisamment proche des mécanismes que nous souhaitons étudier.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Les tailles des lots ont été déterminées en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet.
Raffinement
Les observations ont été définies selon notre expérience et celle de collaborateurs. Les expériences sont généralement courtes, et les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute intervention, chirurgicale (biopsie de la queue pour l’identification, coupe de l’intestin pour le projet) ou non chirurgicale (imagerie). Pour déterminer le génotype, nous mettons en place l’écouvillonnage (prélèvement d’ADN contenu dans le mucus par frottement de la peau avec un coton) en parallèle de la coupe de queue. Cela permettra de comparer les résultats et d’évaluer si cette méthode, moins invasive, est aussi fiable. À terme, elle pourrait remplacer le finclip. Tout le matériel utilisé sera stérilisé ou décontaminé pour limiter les risques d’infection et favoriser la cicatrisation. Après intervention, les poissons seront placés 24 h dans un bac équipé d’un séparateur transparent, sur fond de galets, contenant un milieu avec analgésique et antifongique. La cicatrisation est obtenue en 1 jour et la régénération de la queue en 5 jours. La coupe prend moins de 30 secondes hors de l’eau. Un suivi du réveil et du bien-être est réalisé selon une grille validée par l’animalerie. Pour la coupe intestinale, la larve est anesthésiée. L’intervention dure 10 secondes. Du matériel stérile à usage unique est utilisé. Après la chirurgie, l’animal est placé dans un milieu contenant un antiseptique. La cicatrisation s’observe en 2 jours, avec un suivi selon une grille établie avec le SBEA. En cas de signe de mal-être d’un poisson, nous agirons pour réduire le stress / douleur.. L’animal est mis à mort si son état le nécessite. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Grâce à cela, les animaux n’ont pas besoin d’être génotypés. Il suffit d’observer les larves très jeunes (autour de 4 jours après la fertilisation des oeufs) pour visualiser l’expression du gène d’intérêt et sélectionner ainsi les animaux.
Choix des espèces
Notre compréhension du rôle des cellules, des gènes de l'hôte et du microbiote dans le développement des organes des vertébrés reste limitée chez les mammifères. Ces modèles rendent difficile la manipulation précise de l'environnement et le suivi en temps réel du développement intestinal. Pour dépasser ces obstacles, nous utilisons le poisson zèbre, un modèle qui allie ses atouts naturels aux avancées technologiques. Partageant 70 % de ses gènes avec l'Homme, le poisson zèbre est idéal pour étudier le développement des vertébrés grâce à sa facilité de manipulation génétique, sa descendance abondante, sa transparence et son développement rapide hors de l’organisme maternel. Ce modèle permet également d'explorer les interactions spécifiques au microbiote et les mécanismes de régénération cellulaire. Enfin, les similitudes immunitaires entre poissons et mammifères renforcent son intérêt scientifique. Pour l’élevage, nous aurons besoin d’animaux de 5j jusqu’à 18 mois. Des protocoles expérimentaux autres que les techniques d’élevage s’effectueront sur des larves de 4 jours jusqu’à 10 jours. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoce.
Étude d’efficacité chez la truite arc-en-ciel d’un additif alimentaire à base d’acide guanidinoacétique
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Pour compléter un dossier réglementaire européen visant à étendre aux salmonidés un additif déjà autorisé chez les volailles et les porcs, 480 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un jeûne de vingt-quatre heures avant chaque pesée, des pesées collectives sous anesthésie aux jours 21, 42 et 63, et des pesées individuelles hors de l'eau au début et à la fin des quatre-vingt-quatre jours d'essai. Le porteur juge ces données "indispensables" à l'autorisation de mise sur le marché, et présente l'extension de l'additif comme un levier d'amélioration des performances de croissance en aquaculture. En fin d'essai, 176 truites sont tuées pour le prélèvement de leur carcasse, de leur foie et de leurs viscères, les 304 autres partant dans des bassins extérieurs de la pisciculture, hors du circuit expérimental et de la chaîne alimentaire.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’efficacité d’un additif alimentaire chez la truite arc-en-ciel. Cet additif est déjà autorisé en Europe pour les volailles et les porcs, classé dans la catégorie des additifs alimentaires. La société demandeuse souhaite étendre son utilisation aux salmonidés.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ce projet est de générer des données expérimentales robustes et scientifiquement validées sur l’efficacité de l’additif alimentaire chez la truite arc-en-ciel. Ces données sont indispensables pour compléter le dossier réglementaire demandé par l’Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA), en vue d’une autorisation de mise sur le marché de l’additif pour les salmonidés. Cet additif est déjà autorisé en alimentation animale pour les monogastriques (volailles et porcs) en Europe, où il est classé dans la catégorie des acides aminés, leurs sels et analogues. Son extension à l’alimentation des poissons pourrait constituer un levier d’amélioration des performances de croissance et de l’efficacité alimentaire dans les systèmes aquacoles.
Procédures
Au début et à la fin de l’expérimentation, tous les poissons seront individuellement pesés et mesurés, après une période de jeûne de 24 heures visant à limiter le stress lié à la manipulation. La durée de manipulation hors de l’eau est estimée à moins d’une minute par poisson. Aux jours J21, J42 et J63, la biomasse de chaque bassin sera estimée par une pesée collective des poissons, réalisée sous anesthésie. Les 304 poissons restants seront anesthésiés pour une pesée individuelle comme mentionné précédemment, puis replacés dans les bassins extérieurs de la pisciculture, hors du circuit expérimental et de la chaîne alimentaire. La durée des pesées collectives de l’ensemble des poissons à chaque point de mesure sera d’environ une heure, tandis que les pesées individuelles réalisées en début et en fin d’essai sont estimées à trois heures.
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles liées à cette expérimentation restent limitées. Elles concernent principalement une tolérance individuelle éventuellement variable à l’additif testé, bien que celui-ci soit reconnu comme sûr aux doses administrées. Par ailleurs, les manipulations nécessaires (pesées toutes les trois semaines après 24 h de jeûne, prélèvements finaux) peuvent générer un stress transitoire, réduit au minimum par l’anesthésie et la réalisation des procédures par du personnel habilité.
Devenir
En fin d’essai (J84), 176 poissons seront euthanasiés pour permettre la réalisation de prélèvements post-mortem (carcasse, foie, viscères) et mesurer des paramètres qui ne peuvent pas être obtenus sur des animaux vivants (composition corporelle, indice somatique, rétention des nutriments). Les 304 poissons non prélevés ne seront pas remis dans le circuit d’élevage de recherche ou de la chaine alimentaire mais dans le circuit hors expérimentation (replacés dans les bassins extérieurs de la pisciculture).
Remplacement
La finalité de cette étude est de mesurer les effets d’un additif nutritionnel sur la croissance et l’efficacité alimentaire de la truite arc-en-ciel dans des conditions d’élevage aquacole standardisées. Ces paramètres dépendent d’interactions physiologiques complexes incluant la digestion, le métabolisme, le comportement alimentaire et la dynamique de croissance à l’échelle de l’organisme entier. Ce type d’évaluation ne peut pas être réalisé avec des modèles in vitro (cultures cellulaires) ou in silico (modélisation mathématique).
Réduction
La réduction du nombre d'animaux est un objectif central de ce protocole. Le nombre de poissons par bassin a été défini au minimum, en tenant compte à la fois de la variabilité biologique observée lors d’expériences antérieures et des exigences en matière de bien-être animal (prévention des comportements agressifs liés à des effectifs trop faibles). Des analyses de puissance statistique ont été réalisées pour justifier le nombre minimal de réplicats (bassins) et de poissons par traitement. Cette approche permet donc d’optimiser le nombre d’animaux tout en garantissant la robustesse des résultats scientifiques.
Raffinement
Des conditions d’élevage classiques et optimisées seront utilisées : photopériode naturelle, température stable à 17°C +/- 1°C, qualité d'eau optimale avec dégazage (afin d’éliminer l’azote dissous) et niveau d’oxygène dissous compris entre 8,5 et 9,5 ppm avec un débit adapté de 0,3 litre par seconde permettant un renouvellement de 5 à 7 fois par heure. La taille et le type de bassins seront adaptées à la taille des poissons (bassins extérieurs de 80 cm de diamètre et de 50 cm de haut à 220 L d’eau munis d’un couvercle et demi-couvercle occultant assurant la sécurité des poissons vis-à-vis des nuisibles (oiseaux) et permettant aux poissons de disposer d'une zone d'ombre et d’un espace pour se cacher, réduisant ainsi leur stress), la densité des truites sera optimale, et un nettoyage des bassins sera effectué régulièrement lors de chaque pesée toutes les 3 semaines. Les animaux seront nourris manuellement à satiété visuelle deux fois par jour. Un suivi quotidien du bien-être animal sera évalué à l’aide d’une fiche d’évaluation quantitative des points limites. Les critères évalués sont : la prostration et l’isolement prolongé de l’animal, la nage anormale, la prise alimentaire perturbée et la position inhabituelle dans la colonne d’eau. Le second critère physique évalue le changement de volume anormal, les lésions comportementales dues aux blessures ou maladies, l’apparition de malformations, ainsi que l’aspect général de la peau. En cas de détection de dépassement de points limites, l’animal sera euthanasié via les procédures réglementaires.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est la première espèce piscicole produite en France et a donc un poids agronomique et commercial important, ce qui en fait un choix privilégié pour cet essai. Les poissons utilisés dans cette étude seront au stade juvénile au démarrage de l’essai, et élevés jusqu’à atteindre le stade portion (taille commerciale). Ce choix est justifié par les lignes directrices de l’EFSA concernant l’évaluation de l’efficacité des additifs pour l’alimentation des poissons. Pour que les résultats soient recevables, l’EFSA recommande une durée minimale d’essai de 84 jours, une taille finale des poissons comprise entre 200 et 300 g. Ces critères garantissent la représentativité des conditions d’élevage commercial et la pertinence des résultats pour l’évaluation réglementaire du produit.
Réponses des cellules T du poisson zèbre à des lésions d’organes chez des individus jeunes et âgés : promotion de la régénération des tissus
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Soumis à une cryolésion du cœur ou à l'amputation de leurs nageoires, 1 704 poissons zèbres vont subir des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, auxquels s'ajoutent 888 poissons génotypés par prélèvement de quelques millimètres de nageoire caudale, soit 2 592 individus en tout. Tous sont tués pour que leur cœur, leurs nageoires et d'autres tissus soient prélevés. L'objectif déclaré est d'identifier les programmes de cellules T qui stimulent ou freinent la régénération des organes, le poisson zèbre reformant son cœur là où les mammifères produisent une cicatrice définitive. Le porteur limite les effets indésirables aux douze premières heures, tout en décrivant des poissons anxieux ou résignés qui cessent de s'alimenter, et d'autres à la nage erratique qui "meurent généralement en quelques heures" et sont alors tués.
Objectifs
Les mammifères, y compris les humains, sont généralement incapables de régénérer leurs organes, ce qui constitue un obstacle aux nouvelles stratégies thérapeutiques pour plusieurs événements traumatiques et maladies dégénératives (infarctus du myocarde, ostéoporose, fracture osseuse, entre autres). Cette incapacité à se régénérer contribue à une diminution à long terme de la fonction des organes et à une augmentation de la morbidité, et devient particulièrement importante dans les populations âgées. Après un infarctus du myocarde, par exemple, le tissu mort est remplacé en permanence par du tissu cicatriciel, ce qui diminue la fonction cardiaque. D'autres maladies dégénératives, comme l'ostéoporose, qui est de plus en plus répandue dans les populations âgées et qui est associée à des conditions pro-inflammatoires, diminuent également la qualité de vie et constituent un fardeau important pour la santé. Contrairement aux mammifères, le poisson zèbre peut régénérer entièrement ses organes, y compris le cœur et la nageoire, et retrouver leur fonction. Alors que la régénération du cœur implique la formation d'un tissu cicatriciel transitoire qui se résorbe avec la formation de nouveaux muscles, la régénération de la nageoire ne s'accompagne d'aucune formation de tissu cicatriciel.
Bénéfices attendus
Ce projet propose d'identifier les programmes de cellules T qui stimulent la régénération des organes et ceux qui l'inhibent. Cela permettra d'identifier des stratégies immunomodulatrices pour stimuler la régénération des tissus tout en minimisant les dommages causés aux tissus après une blessure.
Procédures
Un nombre de 1776 animaux seront soumis au génotypage, où quelques millimètres de la nageoire caudale seront prélevés sous anesthésie pour extraire l'ADN génomique et identifier les individus porteurs des mutations souhaitées. Parmi ceux-ci, certains individus (888) seront soumis à une cryoblessure cardiaque pour étudier le processus de régénération et la réponse immunitaire correspondante. L'intervention elle-même dure environ 2 minutes. Le processus de régénération sera suivi pendant les 7 à 14 premiers jours, avec un petit nombre d'animaux (48) suivis jusqu'aux stades de régénération tardive et complète. Le 888 animaux restants (le nombre équivalent d'animaux hétérozygotes) sera seulement génotypé et ne sera pas soumis à la cryoblessure ou à tout autre traitement. Un nombre de 816 animaux seront soumis à une amputation des nageoires. La procédure prend quelques secondes et le processus de régénération sera suivi jusqu'à 14 jours. Les autres interventions légères comprennent l'imagerie en direct (jusqu'à 10 minutes), la coloration des os en direct (15 minutes) et l'incorporation d'EdU par injection (quelques secondes pour la procédure ; 24 heures jusqu'à l'analyse). En résumé, 888 poissons seront soumis à des traitements considérés comme modérés (génotypage uniquement) et 1704 seront soumis à des traitements considérés comme sévères, notamment des cryolésions (888) ou une amputation des nageoires (816).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indesirables chez le poisson concerné : - La cryoblessure pour étudier la régénération cardiaque. Les effets indésirables potentiels surviennent généralement dans les 12 premières heures suivant la blessure. Il s'agit notamment de l'hyperventilation et de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Occasionnellement, un petit nombre d'animaux peut présenter une nage erratique (c'est-à-dire des poussées de nage verticale) immédiatement après l'opération. Ces animaux meurent généralement en quelques heures et sont donc immédiatement euthanasiés lorsque ce comportement est observé.
Devenir
Tous les poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés après la dernière intervention, car nous devons prélever le cœur ou la nageoire caudale (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les cellules et les composants moléculaires (réponse immunitaire et marqueurs de régénération), ce qui nécessite de prélever du tissu pour un traitement ultérieur après l'euthanasie du poisson.
Remplacement
Dans le cadre de ce protocole, nous prévoyons d'étudier la réponse immunitaire et la capacité de régénération, en utilisant une combinaison de plusieurs outils transgéniques. Ces outils génétiques, ainsi que le pouvoir exploratoire du modèle du poisson zèbre, le rendent unique pour ces processus de manière intégrée chez les mêmes individus. En raison de la nature systémique et physiologique de la réponse régénérative, ainsi que de la réponse immunitaire, des modèles plus simples tels que les systèmes in vitro et organoïdes sont incapables de répondre aux questions scientifiques de ce projet.
Réduction
Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe et de la durée des protocoles, des groupes de 6 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction).
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental (principe de raffinement).
Choix des espèces
Le poisson zèbre, ou Danio rerio, est génétiquement modifiable, ce qui permet de réaliser des études à grande échelle de même portée plus rapidement et à un coût bien moindre qu'avec les rongeurs. En outre, les approches invasives, un grand nombre d'événements biologiques peuvent être quantifiés par des approches non invasives, y compris l'imagerie en direct. Aujourd'hui, un très grand nombre de lignées transgéniques et mutantes ont été générées et sont à la disposition de la communauté scientifique, apportant des réponses à des questions biomédicales réelles et pertinentes. En tant que laboratoire académique, nous avons facilement accès à un grand nombre de lignées transgéniques (peu coûteuses). Le poisson zèbre est également un modèle pertinent pour l'étude des dysfonctionnements liés à l'âge, et récapitule de manière similaire aux rongeurs les processus physiopathologiques du vieillissement observés chez l'homme.
Le raccourcissement des télomères affecte l’intestin et le comportement du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une partie des poissons zèbres utilisés porte une mutation de la télomérase qui les fait vieillir prématurément : dès six à neuf mois, ils perdent en fertilité et en mobilité, maigrissent et développent infections et cancers. 4 976 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 1 280 d'entre eux relevant du niveau sévère. Ils subissent des gavages, des traitements antibiotiques, des transplantations de microbiote fécal, des injections, des prélèvements sanguins et des tests d'endurance, de fertilité et de cognition, une partie étant suivie jusqu'à la mort. Tous sont tués, avec ou sans prélèvement, pour savoir si l'intestin déclenche le vieillissement du reste du corps.
Objectifs
Le raccourcissement des extrémités des chromosomes, appelées télomères, est lié au vieillissement et favorise l'apparition de maladies liées à l’âge. Ces télomères jouent un rôle essentiel dans la protection de notre matériel génétique. L’enzyme télomérase aide à ralentir leur raccourcissement, mais son action devient moins efficace avec l’âge. Des recherches ont montré que chez la souris, une augmentation temporaire de la télomérase peut allonger la durée de vie sans effets secondaires importants. Cependant, d’autres études indiquent qu’une activation permanente de cette enzyme pourrait favoriser le développement de cancers. Cela montre que la manière dont la télomérase est utilisée est cruciale : une activation ponctuelle semble bénéfique, alors qu’une stimulation continue peut-être risquée. Le vieillissement d’un organe peut aussi affecter l’ensemble du corps, mais ce phénomène reste encore mal compris. Le poisson zèbre est un modèle idéal pour étudier ces mécanismes, car son vieillissement ressemble à celui de l’être humain. Dans notre laboratoire, nous avons développé un modèle de vieillissement accéléré en modifiant la télomérase. Les poissons affectés par cette mutation montrent dès 6 à 9 mois une baisse de fertilité et de mobilité, une perte de poids importante, ainsi qu’un risque accru d’infections et de cancers. Chez les poissons non modifiés, ces signes apparaissent plus tard, vers 18 à 24 mois. L’intestin est l’un des premiers organes touchés par ce vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de définir si l’intestin possède un rôle central d’initiateur du vieillissement. En repoussant le vieillissement, ce projet permettra ainsi d'approfondir la compréhension du rôle du microbiote et des télomères dans le vieillissement et de tester de nouvelles approches thérapeutiques, en particulier à travers la manipulation du microbiote et des métabolites, pour ralentir le déclin comportemental lié à l’âge.
Procédures
Les poissons-zèbres seront soumis à différentes interventions au cours de l’étude. Certains recevront une modification génétique unique visant à activer ou inactiver le gène tert dans les cellules intestinales. Des analyses ponctuelles seront réalisées sur l’intestin ainsi que sur des organes périphériques comme les testicules, le cerveau, les muscles et le foie. Les animaux participeront également à des tests fonctionnels : l’endurance et la fertilité seront évaluées vers l’âge de six mois, les capacités cognitives à l’âge adulte, et la longévité sera suivie tout au long de la vie. Le microbiote intestinal sera modifié soit par gavage, soit par traitement antibiotique sur quelques jours, soit par transplantation de microbiote fécal ; chaque poisson sera exposé à une ou deux de ces interventions, généralement autour de deux mois d’âge. Certains groupes recevront des molécules anti-inflammatoires, administrées par gavage ou ajoutées dans l’eau, sur des durées variables selon le protocole. Enfin, les animaux pourront être soumis à des manipulations courantes comme des injections, des prélèvements sanguins, des transports ou des tests comportementaux.
Impact sur les animaux
Les interventions prévues peuvent entraîner différents effets secondaires. Les injections et prélèvements sanguins provoqueront une douleur locale ponctuelle et un inconfort transitoire, parfois accompagnés de stress aigu. Les manipulations répétées, telles que la contention, pourront générer un stress, une agitation ou une détresse comportementale. Le transport et les changements d’environnement risquent d’entraîner une désorientation et une anxiété passagère. Les tests comportementaux peuvent causer de la fatigue et du stress liés à l’exposition à des environnements nouveaux ou stimulants. Enfin, l’administration de substances expérimentales peut provoquer des effets secondaires tels que de la léthargie, une perte d’appétit ou une réduction de l’activité.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort avec ou sans prélèvements.
Remplacement
Les études faites en laboratoire sur des cellules (appelées "in vitro") ont permis de mieux comprendre le vieillissement des cellules. Mais ces modèles ne permettent pas d’étudier comment les différents organes interagissent entre eux dans un corps vivant. Comme nous nous intéressons aux maladies liées à l’âge, qui touchent tout l’organisme, il est nécessaire d’utiliser un animal vivant pour faire ces recherches. Nous avons donc choisi un poisson comme modèle, car il vieillit de façon similaire à l’humain, notamment à cause du raccourcissement de ses télomères (des structures liées au vieillissement des cellules).
Réduction
Nous utilisons des modèles génétiques spéciaux qui permettent d’avoir, dans une même portée, à la fois les poissons testés et les poissons témoins (non traités). Cela garantit qu’ils ont exactement le même patrimoine génétique, ce qui rend les résultats plus fiables et évite d’avoir besoin de poissons témoins en plus. Cela permet donc de réduire le nombre total d’animaux utilisés. Après la fin des expériences, plusieurs analyses seront faites sur différents organes d’un même poisson. Cela permet d’obtenir un maximum d’informations sans avoir à utiliser plus d’animaux. Le nombre de poissons nécessaires a été estimé à partir de nos expériences précédentes, et confirmé à l’aide de logiciels statistiques. Ces outils nous aident à calculer le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables dans nos tests scientifiques.
Raffinement
Toutes les expériences pouvant causer une douleur aux poissons seront faites sous une anesthésie générale de courte durée (5 à 10 minutes). Après les expériences, les poissons seront suivis tous les trois jours par les chercheurs, en plus d’un contrôle quotidien effectué par le personnel de l’animalerie. Pour s’assurer du bien-être des poissons, une grille d’observation spécifique à chaque procédure sera utilisée. Elle permet de repérer des signes de souffrance ou de malaise, comme des problèmes de nage, de respiration, d’alimentation, ou des saignements. Si un poisson montre des signes de détresse importants ou atteint un certain niveau de souffrance, il pourra recevoir un traitement antidouleur ou être endormi de façon définitive, pour éviter toute souffrance prolongée. Certains poissons présentent des problèmes de santé liés à leur âge ou à des caractéristiques génétiques. Si ces problèmes apparaissent (comme un arrêt de l’alimentation ou un état affaibli prolongé), cela sera également considéré comme un signal pour mettre fin à leurs souffrances, selon les mêmes procédures.
Choix des espèces
Nous nous intéressons aux effets du vieillissement de l’intestin sur l’ensemble du corps, en particulier sur le risque de développer des maladies comme le cancer, et à leur lien avec la longueur des télomères, des structures situées à l’extrémité des chromosomes. Pour explorer ces mécanismes, nous avons besoin d’un organisme dont le vieillissement reflète celui de l’être humain, notamment en ce qui concerne le raccourcissement des télomères avec l’âge. Le poisson-zèbre est un modèle particulièrement pertinent pour cette recherche. Nos travaux antérieurs ont montré qu’il présente de nombreuses similarités avec l’humain en matière de vieillissement, notamment le développement de cancers liés à l’âge. Contrairement à la souris, qui est pourtant souvent utilisée dans les études sur le vieillissement mais qui ne présente pas de raccourcissement progressif de ses télomères, le poisson-zèbre possède des télomères de longueur comparable à ceux des humains et qui se raccourcissent naturellement avec le temps. C’est pourquoi nous avons choisi d’utiliser le poisson-zèbre pour mieux comprendre l’impact des télomères sur le vieillissement. Les manipulations expérimentales seront réalisées uniquement chez les poissons adultes, car c’est à ce stade que nous pouvons étudier les effets du vieillissement. Certaines études nécessiteront le suivi des poissons tout au long de leur vie pour évaluer leur fertilité, leur durée de vie et l’apparition de tumeurs. D’autres examens impliqueront l’analyse de tissus à différents âges clés, notamment à 3, 9 et 18 mois, ce qui nécessitera l’euthanasie d’un certain nombre de poissons à ces moments-là pour effectuer des prélèvements. Les plus jeunes poissons, comme les embryons et les larves, ne seront utilisés que pour produire les lignées adultes nécessaires aux expériences.
Etude des mécanismes des réponses immunitaires spécifiques du poisson-zèbre contre des agents infectieux viraux et bactériens
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 640 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils sont anesthésiés puis injectés, ou plongés deux à quatre heures dans un bain contenant l'agent infectieux, certains subissant ensuite une épreuve virulente destinée à mesurer si le vaccin protège. L'infection peut provoquer une nécrose au point d'injection, une perte d'appétit, une nage erratique et la mort, et les résultats intéressent autant la recherche sur les maladies humaines que les industriels de l'aquaculture, avec une mise sur le marché en perspective. Le porteur formule le tout ainsi : "pour autant que le niveau de douleur puisse être évalué chez un poisson zèbre", il sera nul chez les témoins et sévère chez les infectés.
Objectifs
L’étude des maladies infectieuses repose sur la caractérisation de l’agent pathogène (nature, propriétés de virulence…) et de la réponse de l’animal infecté, par une combinaison d’approches expérimentales menées in vitro en culture cellulaire et in vivo chez l’animal. La complexité des mécanismes engagés nécessite la reproduction expérimentale des maladies étudiées. Cela nous permet d’aborder des études de virulence des agents pathogènes causant les infections. Ces études sont effectuées dans une perspective de comparaison entre les agents émergents qui affectent les élevages et ceux qui causent des maladies chez l’Homme. Nous disposons de multiples modèles d’infections du poisson zèbre par des agents pathogènes de poissons ou de mammifères. Les infections par injection permettent de contrôler finement la dose de pathogène administrée à chaque poisson et constituent donc un modèle d’infection reproductible. Les infections par balnéation restent une alternative importante pour reproduire la voie naturelle d’infection des poissons. Les protocoles engagés peuvent être associés à des vaccins et à des prélèvements de matériel biologique après euthanasie des animaux pour caractérisation de la réponse immunitaire induite par les infections. Les antibiotiques sont le seul moyen de lutte contre les maladies bactériennes quand il n’existe pas de vaccin efficace. Pour limiter leur utilisation et les risques associés, la mise au point de stratégies alternatives de lutte faisant appel à des immunostimulants est une solution possible pour améliorer les performances de l’aquaculture. Les objectifs de ce projet sont donc, en utilisant le poisson zèbre (1) de caractériser les mécanismes des réponses immunitaires des poissons lors d’infections par des virus ou des bactéries, (2) d’évaluer les effets protecteurs des vaccins et de comprendre les réponses immunitaires qu’ils induisent chez ces espèces, et (3) d’évaluer la capacité de nouvelles stratégies d’immunostimulations à augmenter la résistance à une infection expérimentale maîtrisée avec des pathogènes d’intérêt agronomique (Flavobactérie, virus responsable de la septicémie hémorragique virale (SHV), virus de la Nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI), …).
Bénéfices attendus
Les résultats attendus en fin de projet sont les suivants : - Compréhension des mécanismes de réponses à l’immunisation - Compréhension des mécanismes de la pathogenèse associée aux infections - Validation expérimentale de nouveaux vaccins contre différents virus chez le poisson zèbre - Evaluation des effets immunostimulants et/ou protecteur des différentes conditions pour les industriels de la filière aquacole avec une potentielle mise sur le marché de ces nouvelles stratégies. Ces résultats seront utilisés pour valider les modèles d’étude des maladies infectieuses, des mécanismes de réponses associés, et des stratégies de prévention ou de lutte contre ces maladies. Ces éléments sont essentiels pour le développement du modèle poisson zèbre en infectiologie, qui permet de remplacer en partie les modèles mammifères et qui peut offrir un contexte expérimental particulièrement pertinent. Ces résultats seront utilisés pour prévenir les maladies ou réduire leur impact, et donc améliorer le bien-être des poissons en élevage. La prévention des pathologies est un élément essentiel du développement d’une aquaculture plus « durable ».
Procédures
Les immunisations ou infections expérimentales réalisées par injection sont réalisées sous anesthésie et une injection est réalisée par des personnes compétentes en moins de 15 secondes. L’immunisation des poissons par injection implique une ou deux injections (si rappel nécessaire) effectuées sous anesthésie. Le cas échéant, les prélèvements de mucus sous anesthésie seront effectués une ou deux fois, à un intervalle de temps d’au moins 3 jours. L’anesthésie associée est courte (de l’ordre de la minute) comme pour les injections. L’immunisation des poissons par balnéation implique une séance de 2 à 4 heures éventuellement réalisée de nouveau une seconde fois si rappel nécessaire, l’injection nécessite une anesthésie de 1-2 minutes. Les infections par injection ou par bain correspondent à une unique intervention de mise en contact avec le pathogène. Dans le cas d’épreuve virulente post immunisation, pour tester l’efficacité d’un vaccin, l’infection correspond à une unique intervention de mise en contact avec le pathogène.
Impact sur les animaux
Le stress lié à la manipulation (tri, pesée, transfert, injection, imagerie) est compensé par anesthésie par bain. Pour autant que le niveau de douleur puisse être évalué chez un poisson zèbre, il sera nul chez les contrôles non infectés, très modéré chez les animaux immunisés et sévère chez les animaux infectés chez qui l’infection peut conduire à la mort. Le niveau de douleur sera modéré chez les animaux vaccinés/immunostimulés et protégés, même après infection. L’infection peut conduire chez certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’injection et une nage erratique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles cellulaires permettant d’étudier les réponses immunitaires systémiques des poissons. La compréhension de la pathogenèse liée à l’infection, la quantification des réponses immunitaires à l’échelle de l’organisme entier et en particulier la protection induite par les vaccins/immunostimulants, les migrations des lymphocytes B ou T responsables de la protection et de la mémoire immunitaire, plus généralement la compréhension des interactions hôte-agent infectieux nécessitent de soumettre l’animal à une immunisation ou à une infection expérimentale. Le projet associé à cette DAP chez le poisson zèbre ne peut donc être réalisé avec des méthodes alternatives. Seul un animal ayant un système immunitaire adaptatif permet d’évaluer l’induction d’une réponse spécifique de l’antigène par les lymphocytes B ou T, ou l’efficacité d’un vaccin/immunostimulant lors d’une épreuve d’infection expérimentale en quantifiant la protection apportée.
Réduction
Les infections par balnéation ou par injection, et les expériences de vaccination/immunostimulation permettent de comparer plusieurs conditions expérimentales (différents génotypes, différents agents infectieux, différents protocoles d’immunisation/immunostimulation, etc). Les effectifs requis pour la mise en évidence de différences significatives de survie et de réponses entre les conditions dépendent de l’homogénéité des réponses et de la mortalité, et sont calibrés sur la base de notre connaissance de la sensibilité du poisson zèbre à chaque virus, chaque fois que cela est possible. Les groupes peuvent être de 10 à 15 individus, selon les informations disponibles. Les effectifs sont fixés pour l’obtention de résultats statistiquement représentatifs permettant d’apporter des résultats interprétables dans nos études. Des tests statistiques sont utilisés La taille des groupes (10-15 individus) a été fixée pour permettre à la fois d’évaluer des taux de survie ou de protection et de réaliser les échantillonnages pertinents sur un nombre suffisant d’individus. Un effectif minimal de 15 poissons permet de mettre en évidence une protection qui doit assurer 90 à 100% de survie pour une vaccination efficace. Par ailleurs, les groupes de 15 poissons permettent d’évaluer la mortalité induite par un agent pathogène chez des poissons non vaccinés ou stimulés, en utilisant un minimum d’animaux et en gardant des conditions d’effectif standardisées. Cet effectif permet de réaliser des prélèvements en nombre suffisants pour étudier la réponse immunitaire induite par une immunisation, une infection, ou une vaccination/stimulation chez les survivants. Un effectif de 10 à 15 permet en effet, pour un même groupe de poissons, de consacrer 3 à 5 poissons entiers à des expériences d’histologie et 7 à 10 à des prélèvements de tissus pour des études d’expression ; il doit être noté que la taille du poisson zèbre peut imposer pour certains tissus, de réaliser des pools de prélèvements de 2 individus. Des groupes de 10-15 individus permettent donc de travailler dans des conditions reproductibles (même taille de groupe, mêmes conditions expérimentales par exemple, même taille d’aquarium), et correspondent à des effectifs minimums, des groupes plus petits ne permettraient pas de fournir, de manière systématique et standardisée, les échantillons et informations requises pour nos projets de recherche. Ainsi ces effectifs permettent une utilisation optimale des animaux.
Raffinement
Le stress lié à la manipulation et à l’injection est compensé par anesthésie jusqu’à sédation pour une durée < 2 min. Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères. L’enrichissement mécanique dans ce type d’expérimentation n'est sera pas sans impact sur les résultats (blessure avec voie d’entrée du pathogène, difficulté d’observation des poissons situés dans les caches, développement de biofilm, …). Sous les aquariums, nous positionnerons un poster imitation « substrat ». Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle d’étude important des relations hôte-pathogène. La transparence des premiers stades de développement de cette espèce facilite la mise en œuvre des techniques d’imagerie in vivo. Des outils de manipulations de l’expression des gènes, de nombreux mutants, et la séquence complète du génome de cette espèce concourent aussi à son succès. De nombreux modèles de maladies humaines ont été développés chez le poisson-zèbre, non seulement chez la “larve” ou le jeune alevin, mais aussi aux stades plus tardifs. Le modèle poisson zèbre est aussi un modèle de criblage de drogues. Il est donc important de comprendre les mécanismes et modalités des réponses immunitaires contre des agents infectieux, dans ce modèle. Pour l’étude des réponses immunitaires spécifiques et de la protection vaccinale/immunostimulant, le système immunitaire des poissons doit être mature, et ils sont donc utilisés au stade adulte, à 4-6 mois. L’étude des réponses immunitaires innées et de la pathogenèse sera effectuée à différents stades, chez les juvéniles (3 à 8 semaines) et chez l’adulte (4-6 mois)
Evaluation de l’efficacité des effets antiage d’un probiotique chez le killifish
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
Tués à l'issue de l'étude pour prélever leur sang, leur intestin, leurs muscles et leur cerveau, 30 killifish turquoise vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Ils sont hébergés seuls dans des bacs de trois litres pendant un mois, entre trois et quatre mois d'âge, pesés et transférés à l'épuisette par gestes de quinze secondes. Les atteintes attendues tiennent au vieillissement accéléré propre à l'espèce, perte de pigmentation, amaigrissement, prostration au fond du bac ou nage exclusive en surface, avec arrêt du protocole au-delà de 20 % de perte de poids. Le probiotique évalué est développé par une société privée et déjà commercialisé pour la nutrition humaine.
Objectifs
Caracteriser les effets anti-ages d'un probiotique (conjugué à l'aliment) au cours du viellissement spontané de l'African Turquoise Killifish. Cette molécule qui est développée par la société privée, et est par ailleurs déjà utilisée sur d'autres applications en nutrication chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les effets bénéfiques potentiels sur le viellissement liés à un changement potentiel de microbiote intestinal. Nous pourrons évaluer si le probiotique à un effet important sur le déclin locomoteur et/ou cognitif. Ceci permettra possiblement de planifier de nouvelles approches thérapeutiques comme les modulations nutritionnelles afin de mieux prendre en charge les pathologies liées à l'âge.
Procédures
Aucune intervention invasive sur individus vigile ou anesthésiés n'est prévue dans cette étude. Néanmoins, les animaux sont soumis a des interventions de courte durée n'excedant pas 15 secondes comme la pesée ou le transfert d'un bac à un autre avec épuisette.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement naturellement rapide chez l'African Turquoise Killifish. Les autres effets à évaluer concernent les conséquences du traitement avec le probiotique. Les individus peuvent présenter une réduction de la pigmentation de la peau, une perte de poids, ou émaciation, accompagnées de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium).
Devenir
Les animaux (les 30) inclus dans cette étude seront euthanasiés à l'issue de cette étude pour réaliser des prélvements tissulaires (sang, intestin, muscles, cerveau).
Remplacement
Dans le cadre de ce protocole, nous comptons utiliser le Turquoise Killifsih, qui est un modèle unique et indispensable à l'échelle de l'organisme entier pour étudier de manière intégrée l'impact d'un modualtion nutritionelle sur la progression du vieillissement en un temps extrement rapide.
Réduction
Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 15 animaux par condition-déterminé par une approche statistique-seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques.
Raffinement
Les animaux inclus dans les procédures sont hébergés individuellement dans un bac de 3 litres dans l'eau osmosée dont les paramètres biologiques sont trés contrôlés avec notamment une température de 28°C, un pH de 7,5. Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental. NB: Les poissons ne seront pas anesthésiés pour évaluer leur poids. Ils seront placés vigiles dans un bac d’eau sur une balance préalablement tarée. C’est une procédure qui est en cours de validation par notre cellule SBEA et qui dans le futur ne demandera pas à être inclue dans les DAP.
Choix des espèces
Pour étudier les mécanismes en lien avec le vieillissement, l'Arican Turquoise killifish est l'espèce idoine, puisqu'il est le vertébré dont la durée de vie est la plus courte en captivité (6 mois). En tant que vertébré, il possède une anatomie comparable à celle du rongeur et de l'Homme. Une abondante littérature montre comment chez le mâle et la femelle, ce poisson présente un viellissement systémique, là aussi comparable aux rongeurs et à l'Homme (sarcopénie, déclin cognitif ou maladies métaboliques). Pour toutes ces raisons, l'African Turquoise Killifish est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans des laboratoires académiques, de plus en plus nombreux, pour modéliser un large spectre de pathologies liées à l'âge, avec la possibilité d'aller très en profondeur pour l'exploration fonctionnelle in vivo et mécanistique post mortem. Les animaux utilisés danc cette étude sont des adultes de 3 mois pour une durée d'un mois. Fenetre de temps interessante (entre 3-4 mois) puisqu'il s'agit d'un moment critique dans l'existence du killifish, avec notament un déclin important de la locomotion spontané (notamment la distance parcourue en un temps donné).
Suivi de la dévalaison d’espèces piscicoles au niveau d’un ouvrage hydraulique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres poissons : 195
Pour savoir si les poissons qui descendent la rivière sont attirés vers la turbine la plus meurtrière d'un barrage hydroélectrique, 260 individus vont être capturés et marqués, dont 65 salmonidés et 195 poissons d'autres espèces, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sous anesthésie une opération d'une à trois minutes pour implanter un émetteur acoustique, refermée par une suture au fil résorbable. Les atteintes annoncées vont du stress de capture à une inflammation ou une gêne locale pouvant durer plusieurs semaines. Tous sont remis à l'eau en moins d'une heure, une fois leur nage redevenue active, sauf ceux qui atteignent les points limites définis pour la phase de réveil, alors mis à mort.
Objectifs
L’objectif de l’étude est d’établir un état des lieux du comportement des poissons lors de la phase de dévalaison à l’approche d'un barrage et plus spécifiquement un des groupes hydroélectriques, plus mortel. Ce suivi sera réalisé par l’utilisation de la télémétrie acoustique. Ce suivi comportemental permettra de définir le délai d’approche des individus en fonction de l’espèce, les voies de passage utilisées par les individus, le délai de franchissement en fonction de la voie de passage, les zones de concentration éventuelles afin de définir des zones potentielles d’ouvertures d’exutoires, les détections à l’aval de l’ouvrage à la suite de la dévalaison afin d’obtenir un indice de survie. Le projet est étalé sur 3 années afin d’observer la saisonnalité des déplacements piscicoles (reproduction, alimentation, hivernage) mais également pour prendre en compte les variations interannuelles de l’hydrologie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont d’ordres écologiques. Le projet permettra d’évaluer si les poissons sont attirés préférentiellement vers le groupe hydroélectrique étudié, présentant un indice de mortalité plus élevé que les 4 autres turbines. Le cas échéant, les données obtenues permettront d’orienter vers des solutions visant à réduire l’impact de cette turbine. Diverses solutions sont envisagées, du design d’une voie de passage alternative jusqu’au remplacement de la turbine par un modèle moins impactant. Le projet permettra également d’en apprendre plus sur l’écologie des espèces étudiées. En effet, les déplacements migratoires des poissons sur cette partie du cours d'eau sont peu documentés et la première année met en évidence des déplacements importants des poissons vers l’amont et vers l’aval.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'un maximum de 3 minutes.
Impact sur les animaux
Voici la liste des nuisances ou effets indésirables sur les animaux : stress lié à la capture et à la manipulation, effets de l’anesthésiant, effets post-opératoire (inflammation liée à l’implantation ou gêne locale pouvant aller jusqu’à quelques semaines), altération temporaire du comportement (lié au stress, à l’implantation, à l’anesthésie pouvant aller jusqu’à quelques heures).
Devenir
Les animaux sont replacés dans leur milieu naturel à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’objectif du projet étant d’évaluer les voies de passage des poissons au niveau d’un barrage, il est indispensable d’observer les comportements individuels de déplacement en milieu naturel. Le remplacement n’est pas envisageable.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques tout en garantissant la puissance statistique. Un minimum de 35 individus détectés par espèces ou groupes d’espèce est nécessaire pour mener des analyses robustes. Les espèces ou groupes d'espèces sélectionnées sont le barbeau fluviatile, le gardon, les autres cyprins (rotengle, chevaine, brème commune)et les salmonidés (Truite fario, truite lacustre). Pour espérer détecter 35 individus par groupe d’espèces, soit 140 poissons, il faut tenir compte du taux de détection en dévalaison, du taux de survie post marquage et du taux de rétention du tag. Cela donne 372 poissons à marquer sur l’ensemble du projet. Etant donné que 112 poissons ont déjà été marqués pour ce projet, il reste 260 poissons à marquer sur la durée restante du projet (372-112 = 260). Cet objectif est bien sûr à réévaluer en fonction des captures réalisées. Si certains effectifs de poissons ne sont pas atteints, les effectifs restants pourront être reportés sur d’autres espèces.
Raffinement
Les opérations d'implantation sont réalisées sous anesthésie et ont la durée la plus courte possible, entre 1 à 3 minute pour l’implantation d’un tag. Pour les opérations de 3 minutes, une recirculation d’eau avec une légère sédation est installée pour le poisson. Le poids de l'émetteur ne dépasse pas 2% du poids de l'individu. Les émetteurs sont de trois classes différentes. Le choix de l’émetteur se fait en fonction du poids du poisson à marquer. Les tags sont tous encapsulés dans des matériaux biocompatibles. Concernant le marquage, les solutions d'anesthésiant sont changées tous les 20 individus. Les poissons sont manipulés à l'aide d'épuisette en maille en silicone pour éviter l'abrasion provoquée par les mailles classiques en nylon. Les points de suture sont réalisés avec du fil monofilament résorbable. Le fil monofilament endommage moins les tissus et empêche une infiltration d’eau par capillarité. Le matériel est désinfecté avant chaque session de marquage. Les lames de scalpel sont stériles. Les opérateurs portent des gants stériles. Les poissons sont anesthésiés un par un. Un pansement de povidone iodée est appliqué sur la cicatrice du poisson, ayant un effet antiseptique dans les heures suivant le marquage. Lors des stabulations pré et post marquage, les poissons sont placés dans des volumes d'eau adaptés aux espèces, une pompe à air à grande capacité permet de maintenir un taux d'oxygène adapté et une limitation à l'exposition à la lumière est prévue. La température est également contrôlée pour éviter le stress thermique. Afin de limiter le stress, les poissons sont relâchés le plus rapidement possible (
Choix des espèces
Les espèces ont été choisies en fonction des espèces dévalantes répertoriés dans le rapport du suivi quinquennal de la passe à poissons du barrage étudié ainsi que les espèces les plus susceptibles d’être impactées par les turbines du barrage lors de la dévalaison, et les plus abondantes dans le milieu local ont été retenues). Par ailleurs, elles ont été validées par le Comité de Pilotage du projet. Les stades de développement étudiés seront les stades adultes ou juvéniles (dans la mesure où le poids de l’émetteur a un poids inférieur à 2% de celui de l'individu).
Evaluation de la résistance de truites d’élevage à une maladie virale pour une amélioration progressive par sélection génétique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Des alevins de truite arc-en-ciel de 0,5 à 1 gramme sont infectés par le virus de la nécrose pancréatique infectieuse, au stade où ils y sont le plus vulnérables. 8 250 d'entre eux vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, l'infection devant provoquer des signes cliniques et la mort d'une partie des poissons, les survivants étant tués à la fin de l'essai parce que les règles sanitaires interdisent de les renvoyer dans leur ferme d'origine. Le porteur écrit qu'aucune intervention n'est prévue sur les animaux vigiles, ce qui laisse hors du compte l'infection elle-même. Les retombées annoncées, une meilleure santé des poissons d'élevage et une "avance technologique" pour les entreprises françaises, se chiffrent à 2 à 10 % de survie gagnée par génération de sélection.
Objectifs
La nécrose pancréatique infectieuse (NPI) est une maladie virale à forte prévalence en Europe qui affecte principalement les jeunes alevins de truites arc-en-ciel (TAC), générant de nombreuses pertes dans les élevages. Contagieuse, elle peut se transmettre de manière horizontale (d’un animal porteur à un animal sain) ou de manière verticale (les mères porteuses du virus pouvant le transmettre à leurs œufs). Les traitements prophylaxiques étant peu ou pas efficaces, un des leviers existant pour améliorer la résistance de truites à ce pathogène est la sélection génétique. Le couple virus de la Nécrose Pancréatique Infectieuse / Truite a déjà fait l’objet de travaux de Recherche & Développement permettant de générer les paramètres génétiques de la résistance au pathogène. Ce projet s’inscrit dans la continuité des travaux précédents, le processus d’amélioration de la résistance aux pathogènes devant être mené sur plusieurs générations successives afin que la sélection sur un caractère précis soit efficace et porte ses fruits. La truite étant mature à partir de 2 ans, il faut au minimum 4 ans pour tester 2 générations successives. Le premier objectif de ce projet est de déterminer le niveau de résistance au virus de la NPI (vNPI) de la génération actuelle de truitelles de l’écloserie partenaire du projet. Les données recueillies permettront d’estimer l’héritabilité de la résistance au vNPI et seront corrélées avec d’autres données générées par ailleurs. Les projet sera réitéré sur 3 générations successives.
Bénéfices attendus
Les retombées attendues sont une amélioration de la santé et du bien-être des poissons en élevage ainsi qu’une diminution de l’utilisation des médicaments. Ces essais novateurs permettront aux entreprises françaises de bénéficier d’une avance technologique face aux investissements publics étrangers concurrents dans un secteur compétitif et très dynamique, en bénéficiant des avancées des technologies de pointe permettant d’étudier de manière globale les molécules biologiques (comme l’ADN, l’ARN ou les protéines) présentes dans les cellules des organismes. L’amélioration attendue de la survie est estimée entre 2 à 10% par génération de sélection en fonction de la composition des objectifs de sélection et des pressions de sélection appliquées.
Procédures
Il n'y a pas d'intervention prévue sur les animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L’infection virale va induire des signes cliniques plus ou moins marqués et de la mortalité chez certains individus.
Devenir
Du fait de la nature des essais menés dans ce projet et pour des raisons sanitaires, il n’est pas envisageable de transporter les animaux dans leur ferme d’origine. En conséquence, à la fin de la procédure les animaux survivants seront mis à mort.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternative in vitro pour ce projet. L'évaluation de la résistance d'individus à un pathogène à des fins d’amélioration génétique progressive d’une population doit se faire sur des animaux vigiles capables de mettre en œuvre des systèmes de défense complexes (immunité).
Réduction
Le nombre de poissons utilisé est réduit au minimum requis par les méthodes d'évaluation génétique. Les individus testés dans le projet servent à évaluer et classer leurs collatéraux restés en pisciculture. De ce fait, le meilleur compromis doit être trouvé entre un nombre faible de poissons testés et une classification précise de leurs collatéraux en ferme.
Raffinement
Un enrichissement des bassins est réalisé (couvercles pour permettre aux poissons d'avoir une zone d'ombre et de se cacher, bullage). Au cours des tests, une surveillance accrue est réalisée afin d'observer l'apparition des signes cliniques et, de positionner des mises à mort compassionnelles en fonction de la gravité des signes cliniques observés (par exemple : en cas d'absence de réponse aux stimulis).
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est l’espèce d'eau douce la plus produite en France (35000 t/an) et en Europe. Elle est très sensible au pathogène étudié dans ce projet. Les essais seront réalisés environ 2 semaines après le début du nourrissage des alevins, soit à 0,5g-1g car c’est à ce stade de mise en place du système digestif qu’ils sont le plus vulnérable au pathogène.
Suivi à long terme des populations de poissons migrateurs
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres poissons : 3000
Capturés au piège ou au filet, anesthésiés, mesurés, pesés, équipés d'une puce d'identification, amputés d'un morceau de nageoire de 0,25 cm² et dépouillés de quelques écailles, 42 000 salmonidés et 3 000 poissons d'autres espèces passent une trentaine de minutes entre les mains des opérateurs. Les procédures sont classées à un niveau de souffrance modéré. La finalité est double, un observatoire de long terme sur trois cours d'eau côtiers suivis depuis les années 1980, et la fourniture de données aux groupes d'experts qui évaluent l'état des stocks pour la politique commune de la pêche. Tous les individus sont remis à l'eau à l'endroit exact de leur capture, dès la manipulation terminée.
Objectifs
La problématique centrale du projet est d’étudier l'évolution des populations d’amphihalins sous l'effet des changements environnementaux (changements globaux et locaux) qui affectent ces cours d’eau . Ce projet s'appuie sur 3 cours d'eau côtiers en France. Ces rivières font l'objet de suivis biologiques et physicochimiques récurrents et sur du long terme (mission d'observatoire) depuis le début des années 1980 et alimentent des bases de données et des collections d’échantillons (écailles, tissus …) . La collecte de ces données et échantillons a pour objectif de produire des connaissances sur l’état de conservation et les mécanismes de renouvellement et d’adaptation des populations aux fluctuations et évolutions de leur environnement incluant l’exploitation par pêche. Les espèces rencontrées sur nos sites sont le saumon atlantique, la truite de mer, l’anguille, les lamproies marines et fluviatiles, les aloses, les mulets et le flet. Les chroniques de données à long terme observées permettent de documenter les dynamiques passées et en cours. Elles servent de base pour la calibration de modèles à vocation prédictive et prospective.
Bénéfices attendus
Les données collectées et les travaux qui en sont issus ont une vocation opérationnelle pour la préservation de cette biodiversité remarquable et de ses habitats. D'un point de vue réglementaire, les données collectées permettent de répondre au réglement européen (règlement n° 1004/2017) qui impose un cadre général pour la collecte, la gestion et l'utilisation des données dans le secteur de la pêche, visant à soutenir les avis scientifiques sur la Politique commune de la pêche. Les objectifs principaux de cette collecte de données sont de répondre aux appels à données des groupes d’experts internationaux fournissant des avis sur l'état des stocks de poissons et d'évaluer l'état des populations.
Procédures
Les animaux seront soumis à des mesures biométriques (taille et poids), à un marquage individuel à l'aide d'un transpondeur (puce identique à celles utilisées pour l'identification des chiens, chats ...), à un prélèvement d'écailles pour la mesure de l'âge et de la croissance et d'un petit bout de nageoire (0.25 cm²) pour des analyses génétiques, avant d'être rélachés sur leur lieu de capture. Le temps de procédure comprenant l'anesthésie, la manipulation, le réveil et le relâché est d'environ trente minutes.
Impact sur les animaux
La capture de poissons peut générer un stress ponctuel chez le poisson. La manipulation pour les mesures biométriques et les prélèvements peuvent aussi générer un stress ponctuel. L'anesthésie réalisée permet de réduire ces effets indésirables.
Devenir
Tous les individus sont remis à l'eau dans leur secteur d'origine
Remplacement
Il n’existe pas de substitut aux données et échantillons collectées in natura sur des populations réelles de poissons migrateurs. Même les approches par simulation via des modèles statistiques ou informatiques nécessitent en amont d’être calibrées sur des données d’observation réelles.
Réduction
Afin de ne pas échantillonner l’ensemble du cours d’eau tout en étant représentatif de la diversité d’habitats, des populations et de l’environnement, des plans d’échantillonnage (nombre de stations, période d’échantillonnage, répartition sur le cours d’eau) et des protocoles d’échantillonnage ont été développés pour permettre de capturer ces diversités tout en limitant le nombre d’individus manipulés. Pour les collections d’échantillon (écailles, tissus), tout est fait depuis la collecte (plan d’échantillonnage, mise en place de quota) jusqu’à la gestion des collections (subdivision des prélèvements, archivage et mutualisation des données...) pour maîtriser le nombre d’échantillons collectés et leur consommation tout en répondant aux objectifs scientifiques. Pour les programmes de marquage, c’est essentiellement le nombre de marques recapturées qui conditionne la fiabilité des analyses statistiques ultérieures. Les effectifs d’individus marqués ne représentent que quelques % à quelques dizaines de % de la population totale dans nos protocoles.
Raffinement
Pour les échantillonnages réalisés par piégeage, les cages de capture sont spacieuses, leur volume variant entre 2 et 12 m3 selon la taille des poissons recherchés (juvénile vs adulte). Elles sont relevés tous les jours, entre 1 et 6 fois par jour, pour éviter l’accumulation de poissons et limiter le temps de séjour, sources potentielles d’augmentation du stress. Certains dispositifs sont équipés de systèmes de détection consultables à distance pour réduire le temps de stabulation des poissons dans la cage de capture. Une attention particulière est portée à l’amélioration du bien-être animal lors des travaux d’entretien ou de rénovation des installations de piégeage. Lorsque cela a été possible des dispositifs ont été mis en place pour que les poissons ne sortent jamais de l’eau au cours de tout le processus de capture-manipulation-relâche. Lorsque cela n’a pas été possible, des épuisettes à fines mailles et sans nœud sont utilisé pour les transvaser d’un bac à l’autre (stabulation ou anesthésiant) le protocole utilisé limite au maximum le temps de manipulation hors de l’eau du poisson et des bassins oxygénés sont utilisés pour le temps de réveil. Il ne s’écoule en général pas plus de 30 minutes maximum entre l'anesthésie et le relâcher dans le milieu naturel et tous les individus capturés sont relâchés à l’endroit de leur capture dès leur manipulation terminée Les bacs de stockage sont adaptés à la taille et au nombre de poissons. La durée d’émersion et de manipulation (principale source de stress) est limitée au maximum (moins d’une minute en général). Les manipulations se font après une anesthésie légère pendant quelques minutes qui vise à tranquilliser les animaux et à éviter tout risque de blessure. Si les points limites (signes extérieurs d’altération de leur état sanitaire) sont observés, les individus sont sortis de la procédure.
Choix des espèces
Les espèces étudiées sont des animaux migrateurs (saumon, anguille, lamproies …) qui partagent leur cycle de vie entre l’eau douce et le milieu marin. Ces espèces sauvages emblématiques sont fragilisées par de nombreuses pressions anthropiques, telles que la pollution de l’eau, les barrages, l’exploitation halieutique et le changement climatique. Leur fragilité est reconnue par l’Union Européenne, entre autres dans sa directive « Habitat », mais aussi par l’Union Internationale pour la Conservation de la Nature. Ces espèces sont des indicateurs de la fonctionnalité des milieux qu’elles fréquentent et en particulier de leur connectivité. Des mesures de gestion particulières sont mises en œuvre (plan saumon, anguille, etc.) et s’appuient en partie sur les données et les travaux effectués dans ce projet. Ces mesures répondent également à des obligations internationales, tels que le Data Collection Framework (salmonidés et anguilles, règlement (UE) 2017/1004), le règlement européen pour l’anguille (règlement (UE) 1100/2007). Les animaux sont capturés aux stades juvéniles et adultes, que ce soit lors de leur vie « sédentaire » en eau douce ou lors de leurs migrations de dévalaison vers la mer ou de remontée en rivière. C’est la possibilité d’observer ces différents stades qui permet d‘appréhender la dynamique de renouvellement de ces populations et la propagation de la diversité biologique entre les individus au cours du cycle de vie des espèces. Ces deux aspects sont clés pour évaluer la capacité des espèces et de leurs populations à faire face à des environnement changeants.
Etudes comportementales du poisson zébre en Réalité Virtuelle pour étudier son interaction avec des objets perçus visuellement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Tués parce qu'ils ont dépassé vingt-quatre mois : la plateforme ne conserve aucun poisson zèbre au-delà de cet âge. 400 individus adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, le champ structuré déclarant 200 adoptions et 200 mises à mort. Chacun est prélevé à l'épuisette dans un bac collectif puis isolé quatre-vingt-dix minutes dans un dispositif de réalité virtuelle, où neuf stimuli de dix minutes lui sont présentés sans personne dans la pièce, à raison de seize poissons par jour. Le porteur qualifie toutes les techniques de non invasives et présente la réalité virtuelle comme un moyen de réduire le recours aux procédures plus lourdes, alors que la seule raison de devenir qu'il donne est la mise à mort de tous les poissons passé vingt-quatre mois.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui permettent aux animaux d’adapter leurs réponses comportementales à leur environnement en établissant un lien précis entre leurs mouvements et leurs perceptions sensorielles. L’objectif est d’étudier comment les informations visuelles influencent leurs comportements, en s’appuyant sur nos modèles théoriques récents décrivant le rôle du champ visuel dans le contrôle des actions. Pour tester ces modèles, nous utiliserons la réalité virtuelle, qui offre un cadre expérimental contrôlé permettant de manipuler précisément l’environnement visuel et d’analyser les réactions comportementales face à des objets ou des individus dont les caractéristiques visuelles (formes, couleurs, textures, mouvements) sont modulées. Le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour cette approche en raison de son système visuel bien caractérisé et de la disponibilité de systèmes automatisés permettant d’enregistrer et d’analyser précisément ses déplacements tridimensionnels. Cette espèce est particulièrement adaptée à l’étude des comportements sensorimoteurs en milieu aquatique, et ses réponses comportementales ont déjà été largement explorées dans divers contextes expérimentaux, fournissant ainsi un cadre de référence robuste. En exposant ces animaux à des environnements visuels dynamiques et en analysant leurs interactions avec ces stimuli, nous explorerons comment ils perçoivent et interprètent leur environnement, ce qui nous permettra d’affiner nos modèles et de mieux comprendre les représentations cognitives impliquées. Ce projet s’inscrit aussi dans une démarche comparative : les données obtenues sur le poisson zèbre serviront de base pour des études sur d’autres espèces, notamment les insectes et les humains, permettant ainsi d’évaluer la généralité des principes étudiés et d’identifier des mécanismes communs ou spécifiques aux différentes classes d’organismes. Enfin, cette approche contribuera à valider l’usage de la réalité virtuelle comme un outil d’étude du comportement animal, positionné entre l’expérimentation in vivo et la simulation numérique, ouvrant la voie à de nouvelles méthodologies expérimentales tout en réduisant le recours aux procédures plus invasives. En intégrant ces nouvelles technologies aux sciences comportementales, nous espérons également améliorer la reproductibilité des expériences et affiner les protocoles expérimentaux, ce qui pourrait bénéficier à l’ensemble de la communauté scientifique.
Bénéfices attendus
Le projet contribuera à enrichir les connaissances fondamentales en éthologie, à développer des outils méthodologiques innovants sur la réalité virtuelle et à fournir des données exploitables pour des applications interdisciplinaires, au travers d’une base de données riche et diversifiée sur les réponses comportementales des poissons zèbres.
Procédures
Le poisson zèbre adulte est sélectionné avec une épuisette dans un bac contenant une vingtaine d’individus, puis transféré dans le système de réalité virtuelle. Chaque poisson y passe 90 minutes, exposé à 9 stimuli de 10 minutes chacun. Les stimuli sont programmés par ordinateur, sans présence de l’expérimentateur dans la pièce. L’expérience se déroule en 4 sessions quotidiennes, avec 4 systèmes simultanés, mobilisant 16 poissons par jour. Les individus sont sélectionnés indépendamment de leur âge ou sexe..
Impact sur les animaux
Les poissons seront soumis à un stress léger et transitoire lié à deux manipulations à l’épuisette (transfert entre le bac collectif et le système de réalité virtuelle, puis retour au bac collectif). Ce stress est de courte durée (quelques secondes par manipulation). Durant l’expérience, les poissons seront isolés individuellement dans le système de réalité virtuelle pour une durée maximale de 90 minutes. Cette situation peut générer un stress léger, bien que le poisson zèbre soit une espèce grégaire. Toutefois, le dispositif présente des stimulis visuels mimant d’autres poissons, ce qui limite l’impact de l’isolement.
Devenir
La plateforme expérimentale prévoit de ne conserver que les poissons âgés de moins de 24 mois. Tous les animaux sont donc mis à morts après ce délai. Cette restriction permet de garantir des animaux jeunes, en bonne santé et bien adaptés aux protocoles expérimentaux.
Remplacement
L’objectif principal de ce projet est d’étudier le rôle de la perception dans le contrôle du mouvement. Bien que des approches alternatives telles que l’étude de systèmes robotiques, de modèles théoriques, ou de simulations numériques aient été développées, elles ne permettent pas de recueillir des données directes sur les mécanismes biologiques sous-jacents au contrôle du mouvement. Ces méthodes sont néanmoins utilisées en amont pour restreindre et affiner les hypothèses comportementales testées. Nos travaux incluent également l’étude d’autres organismes, comme les plantes, mais les processus perceptifs et les mécanismes de contrôle du mouvement y sont bien moins complexes et riches que chez les animaux. Par ailleurs, des expériences complémentaires sont en cours chez l’humain et l’insecte, ce qui reflète une démarche comparative large. Cependant, les systèmes permettant une analyse fine des réponses comportementales chez l’insecte restent encore à optimiser. L’utilisation d’animaux vivants, en particulier les poissons zèbres, demeure essentielle pour cette étude, car elle permet d’obtenir des données indispensables pour valider les modèles théoriques développés. Cette démarche comparative, incluant plusieurs espèces, est cruciale pour vérifier l’universalité des principes théoriques proposés.
Réduction
Dans une démarche visant à limiter le nombre d’animaux utilisés, nous proposons de ne pas imposer de critères trop stricts concernant l’âge, la taille ou le sexe des poissons zèbres. Cette approche permettra d’élargir les conditions d’inclusion des sujets tout en répondant aux objectifs scientifiques du projet. De plus, les mêmes individus seront utilisés tout au long des expériences, réduisant ainsi le besoin de production de nouveaux animaux. Sur l’ensemble du projet, nous estimons qu’un total de 400 poissons sera nécessaire, soit environ 60 individus par cycle de 21 mois. Cette gestion raisonnée des effectifs reflète notre volonté de minimiser l’impact sur les animaux tout en garantissant la robustesse des données collectées. Enfin, cette méthode de réutilisation et de suivi individuel des animaux permet d’optimiser les observations tout en favorisant une approche respectueuse du bien-être animal.
Raffinement
Toutes les techniques utilisées dans ce projet sont non invasives et visent à minimiser tout stress ou inconfort pour les poissons. L’environnement expérimental est conçu pour être le plus naturel possible, en permettant aux animaux d’interagir avec des stimuli visuels sans contrainte physique. Un suivi comportemental en temps réel sera mis en place afin d’identifier tout signe de mal-être (ex. nage anormale, isolement, agitation excessive). Une grille d’évaluation des points limites spécifique aux poissons zèbres sera appliquée pour déterminer les actions à entreprendre en cas de stress ou de souffrance. Si un poisson présente des signes de détresse persistants malgré des ajustements, il sera retiré de l’étude. En cas de nécessité, une mise à mort sera réalisée selon les recommandations en vigueur, sous la supervision de la Structure chargée du Bien-Être Animal (SBEA).
Choix des espèces
Le choix du poisson zèbre (Danio rerio) pour ce projet repose sur plusieurs critères qui en font un modèle particulièrement adapté : Compatibilité avec le dispositif de réalité virtuelle : Le système de réalité virtuelle utilisé dans ce projet a été développé et optimisé sur plusieurs générations pour permettre un suivi en temps réel des déplacements des poissons et la projection de stimuli tridimensionnels interactifs. Le poisson zèbre, avec sa capacité à se déplacer librement dans les trois dimensions de son environnement, répond parfaitement aux exigences techniques de ce dispositif. Réponse comportementale favorable : Le poisson zèbre réagit de manière robuste et cohérente aux stimuli visuels présentés en réalité virtuelle, ce qui garantit la pertinence des données comportementales collectées. De plus, cette espèce montre une aptitude à s’adapter rapidement aux conditions expérimentales en laboratoire, y compris à l’environnement spécifique de la réalité virtuelle. Modèle biologique bien établi : Le poisson zèbre est une espèce modèle largement utilisée en recherche scientifique, notamment en éthologie, neurobiologie, et biologie du développement. Cette reconnaissance comme modèle standard permet de contextualiser les résultats obtenus dans un cadre scientifique plus large et facilite les comparaisons avec d’autres études. Nous utiliserons des poissons zèbres adultes âgés de 3 à 24 mois. Ce choix repose sur plusieurs considérations. Les poissons zèbres adultes présentent un comportement moteur et cognitif pleinement développé, ce qui est essentiel pour les objectifs de l’étude visant à explorer les réponses comportementales complexes à des environnements visuels tridimensionnels. Travailler avec des larves nécessiterait une production continue et un renouvellement fréquent des poissons, augmentant ainsi le nombre total d’animaux utilisés. En revanche, l’utilisation d’adultes permet de réduire ces besoins, en cohérence avec les principes de réduction des animaux dans les expérimentations scientifiques. Le projet étant exploratoire, il n’est pas nécessaire de restreindre les observations à une tranche d’âge spécifique chez les adultes. Cette approche permet de maximiser les observations et de s’assurer que les résultats obtenus sont généralisables à une large gamme d’individus adultes.
Étude de la résistance à la colonisation dans un modèle d’infection poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
La mort par infection est retenue comme point limite, le porteur indiquant que les signes de souffrance sont mal connus et peu observables au stade larvaire. 42 282 poissons zèbres vont être utilisés, dont 38 700 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Les larves sont plongées trois ou vingt-quatre heures dans une eau contenant une bactérie pathogène, chacune seule dans deux millilitres d'eau au fond d'un puits, la mort survenant en vingt-quatre à quarante-huit heures quand la flore ne protège pas. Le porteur écrit que la douleur et le stress liés à l'infection ne sont pas quantifiables à ce stade, tout en concluant qu'ils restent de courte durée puisque la mort arrive vite.
Objectifs
La flore microbienne joue de nombreux rôles en santé humaine et contribue notamment à la protection contre l’infection, plus communément appelé l’effet probiotique. Cependant, ces effets bien que décrits restent peu caractérisés du fait de la diversité et complexité de la flore intestinale chez les mammifères et des limites pratiques intrinsèques aux modèles in vivo correspondants (coûts d’hébergement, manipulation...). Dans ce contexte, la larve du poisson zèbre constitue un modèle de choix puisque la flore y est moins complexe, l’observation microscopique non invasive plus aisée, tout en arborant un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables aux mammifères, en faisant ainsi un modèle pertinent pour étudier les interactions hôte-pathogène. L’objectif de ce projet est ici de caractériser les mécanismes moléculaires responsables de la protection conférée par la flore contre un pathogène en utilisant un modèle de colonisation par immersion chez la larve de poisson-zèbre. Pour cela, trois aspects seront étudiés : (i) la réponse de l’hôte face au pathogène ainsi que l’influence d’un microbiote, protecteur ou non, sur celle-ci (ii) le pathogène et ses potentiels facteurs de virulence, et (iii) l’établissement et la dynamique de la flore commensale, les interactions entre les différents membres, la composition minimale permettant la protection et les facteurs moléculaires impliqués.
Bénéfices attendus
La flore joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-microbiote-pathogène sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques et/ou préventives rationnelles. Dans ce contexte, notre projet vise à caractériser les facteurs de protection développés par le microbiote et l’influence de l’hôte, et permettra ainsi de mettre en lumière des bactéries probiotiques capables de protéger les poissons-zèbre contre une infection par des pathogènes invasifs. L’étude du rôle protecteur de ces potentiels probiotiques contre des pathogènes de poissons pourrait être ensuite envisagée chez des poissons économiquement importants en aquaculture tels que la truite. Enfin, l’identification de mécanismes moléculaires responsables de l’effet protecteur aboutira, de manière plus générale, à une meilleure compréhension du rôle du microbiote dans la santé de l’hôte.
Procédures
Les larves de poisson-zèbre vigiles seront exposées une fois à un pathogène par balnéation pendant 3 ou 24 heures selon la procédure. Cela pourra entrainer le développement d’une infection, notamment en l’absence d’une flore protectrice. L’infection est probablement associée avec un certain niveau de douleur et/ou stress non quantifiables à ce stade de développement de la larve, qui peut aboutir à la mort de l’animal en 24 à 48 heures.
Impact sur les animaux
Nos expériences consistant à évaluer soit la protection conférée par la flore contre le pathogène soit la capacité des pathogènes sélectionnés à infecter et tuer les larves, la mort des poissons sera alors majoritairement considérée comme point limite. Des signes de souffrance en amont ne sont en fait que très peu listés et /ou adaptés au stade larvaire et à notre procédure d’élevage. Leur niveau d’appétit ou leur taille exacte ne peuvent pas être mesurés dans notre système et à ce stade de développement, et l’absence de réponse au stimulus souvent synonyme de souffrance n’est pas observée de manière systématique avant la mort de l’animal. Le développement de l’infection doit engendrer une douleur et/ou un stress à l’animal que l’on ne peut quantifier mais qui reste de courte durée puisque la mort intervient alors très rapidement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car : (i) une majorité aura été en contact avec le pathogène et ils ne peuvent ainsi pas être réutilisés, ni replacés, ni adoptés. (ii) cela permettra les différentes analyses prévues (à différents temps ou en fin d’expérience)
Remplacement
Le rôle de la flore dans la protection contre l’infection et les interactions de celle-ci avec l’hôte ne peut être étudié que dans un contexte in vivo. Le poisson zèbre est un modèle in vivo bien caractérisé et nous utiliserons ici des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’être minimum tout en permettant l’application des approches statistiques choisies et est basé essentiellement sur des données de la littérature. L’analyse statistique pour la comparaison de la survie des larves dans de multiples conditions expérimentales au cours du temps s’appuiera sur l’utilisation d’un modèle de survie. Des ajustemenst seront réalisés afin de prendre en compte la multiplicité des tests.
Raffinement
Ce projet a pour objectif de mettre en évidence et comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la protection conférée par la flore contre un pathogène. L’ensemble des procédures consiste ainsi en l’infection des poissons-zèbres en ajoutant l’agent pathogène dans l’eau des larves de poissons et le suivi de la survie en fonction notamment de la composition de la flore reconstituée au préalable. Des mutants du pathogène utilisé seront également testés afin de mettre en lumière les facteurs de virulence impliqués dans le développement de l’infection. Les symptômes chez la larve étant peu connus et non systématiques, la mort de l’animal par l’infection ne peut majoritairement pas être évitée sans interférer avec nos résultats. Certains signes cliniques propres à la pathologie du pathogène donné seront néanmoins recherchés quotidiennement et aboutiront à la mise à mort du poisson par surdose d’anesthésique. Une observation quotidienne des poissons sera ainsi réalisée et les poissons ne seront pas conservés plus de quinze jours post-fertilisation pour limiter leur inconfort au vu de notre procédure d’élevage, à savoir des plaques 24-puits avec un poisson par puits contenant deux millilitres d’eau.
Choix des espèces
La flore intestinale joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-pathogène ainsi que l’identification du rôle du microbiote sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques et/ou préventives rationnelles, et cela ne peut se faire sans le recours à l’expérimentation animale. Le Danio zébré est un modèle in vivo bien caractérisé (notamment du fait de son utilisation en biologie du développement), avec un génome connu et de nombreuses lignées transgéniques déjà disponibles. De plus, nos procédures impliquent de n’exposer aux bactéries pathogènes invasives que des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude. Outre l’obtention de pontes, qui nécessite des poissons-zèbres adultes, mâles et femelles, mais non inclus dans ce projet car simplement géniteurs, nos procédures impliquent de n’exposer aux bactéries pathogènes que des poissons au stade larvaire de développement. L’utilisation de poissons au stade larvaire de développement se justifie au niveau scientifique et éthique puisque ces derniers possèdent déjà un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables à ceux des mammifères.
Validation du protocole de challenge infectieux par balnéation à Lactococcus petauri chez la Truite Arc-en-Ciel
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Hôte naturel de la bactérie Lactococcus petauri et poisson le plus élevé en France, la truite arc-en-ciel est retenue pour 308 individus utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les poissons sont plongés quatre, huit ou seize heures dans une eau chargée de bactéries, vingt-huit d'entre eux recevant en plus une injection intramusculaire, avec deux prises de sang sous anesthésie à trois semaines d'intervalle. Le porteur dimensionne les lots à quatorze poissons en tablant sur une mortalité d'environ 50 % liée à l'infection, de façon à conserver au moins sept survivants par condition. Aucun poisson potentiellement infecté ne pouvant être relâché ni réutilisé, tous sont tués en fin de protocole.
Objectifs
Afin de limiter l’usage des antimicrobiens, la vaccination est considérée comme l’une des meilleures options pour contrôler les maladies infectieuses en aquaculture. Cette demande d'autorisation de projet s’inscrit dans le cadre d’une étude plus globale portant sur l'efficacité de protocoles vaccinaux utilisant différentes voies d'administration, telles que la balnéation ou l’injection intrapéritonéale. Le présent projet constitue une extension de la demande d’autorisation de projet précédemment soumise. La DAP initiale avait pour objectif de déterminer la souche bactérienne et la modalité d’infection les plus appropriées pour établir un modèle de challenge infectieux, par balnéation ou par injection intramusculaire, chez la truite arc-en-ciel. Cette nouvelle demande vise à compléter les résultats obtenus lors de cette première expérimentation, en affinant spécifiquement le protocole de challenge infectieux par balnéation. Cette manipulation est nécessaire pour confirmer la reproductibilité du modèle, ajuster certaines conditions expérimentales (notamment la dose infectieuse et la durée d’exposition), et ainsi valider un protocole robuste permettant d’évaluer de manière fiable l'efficacité des stratégies vaccinales testées.
Bénéfices attendus
La lactococcose est une maladie bactérienne dont l'impact augmente actuellement en Bretagne en lien avec le réchauffement des eaux de surface. La maitrise par vaccination est nécessaire pour contrôler cette maladie et réduire l'usage d'antibiotiques. La maitrise du challenge infectieux par Lactococcus petauri est obligatoire et indispensable pour tester des solutions innovantes de contrôle, notamment la vaccination, facilitant leur mise en oeuvre dans les élevages et limitant le stress des animaux.
Procédures
Prises de sang : deux prélèvements seront réalisés sur animaux anesthésiés (temps T0 et Tfinal 3 semaines plus tard). Chaque intervention, incluant l’induction de l’anesthésie, le prélèvement et la récupération, durera environ 15 à 20 minutes. Infection par balnéation : les poissons seront exposés à une suspension bactérienne de L. petauri pendant 4 h, 8 h ou 16 h selon les modalités, dans un volume d’eau restreint mais oxygéné en continu. Infection par injection (lot témoin positif uniquement, 28 poissons au total) : une injection intramusculaire sera réalisée sous anesthésie. La durée totale (induction, injection, réveil) sera d’environ 15 à 20 minutes.
Impact sur les animaux
L'évaluation de l'efficacité vaccinale nécessite d'infecter des truites par L. petauri. Les manifestations cliniques de l'infection expérimentale peuvent entrainer de la douleur chez les poissons. Le protocole sera arrêté dès l'observation de poissons moribonds (mélanisme, nage erratique sur le dos, arrêt d'alimentation) ou de signes caractéristiques de la lactococcose (exophtalmie).
Devenir
L'euthanasie des poissons est prévue en fin de protocole, pour des raisons sanitaires (impossibilité de relâcher ou réutiliser des poissons potentiellement infectés par L. petauri)
Remplacement
L'évaluation de l'efficacité d'un vaccin nécessite la réalisation d'un challenge infectieux et ne peut se faire que sur animaux vivants. La présente demande est une étape initiale de ce projet sur l'efficacité vaccinale
Réduction
Dans cette nouvelle phase, 11 modalités expérimentales seront testées, correspondant à différentes combinaisons de doses infectieuses et de durées d’exposition. Chaque modalité sera réalisée en duplicat afin de limiter l’effet « bac » et de valider la reproductibilité du protocole. Chaque lot contiendra 14 poissons, ce qui représente un total de 22 lots (11 modalités × 2 répétitions), soit 308 poissons au total (14 × 22 = 308). Ce nombre est déterminé pour permettre une analyse statistique robuste. En considérant un taux de mortalité d’environ 50 % lié au challenge infectieux, 14 poissons par lot permettent de garantir au moins 7 individus survivants par condition. Une analyse immunologique sérique sera réalisée en fin d’expérimentation sur l’ensemble des poissons survivants, afin de vérifier l'infection et de documenter la réponse immune.
Raffinement
Les animaux seront observés 2 fois par jour durant toute la durée du protocole. Les points limites sont d'une part les paramètres d'ambiance de l'élevage (température, oxygène). Si les paramètres critiques sont atteints (température > 20°C, oxygène < 80 %) et ne peuvent pas être rectifiés, l'expérimentation sera arrêtée. Les points limites concernent d'autre part la santé et le comportement des poissons. Les poissons moribonds seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés. La densité sera de 20 kg/m3 environ, ce qui est bien en dessous de ce qui est réalisé en élevage (50-70 kg/m3) et les bacs seront enrichis de tubes permettant aux poissons de se cacher et de fuir.
Choix des espèces
La truite arc en Ciel est un hôte naturel de Lactococcus garvieae/petauri. C'est de plus l'espèce de poisson la plus élevée en France et donc pour laquelle il est important d'améliorer l'efficacité vaccinale. Les truites utilisées pèseront environ 100 à 150g. La lactococcose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage. L'étude sur des poissons de poids de 150 g est un bon compromis entre le poids et le nombre de poissons pouvant entrer dans l'étude. De plus, les protocoles vaccinaux par balnéation seront testés sur des alevins de 4 à 5 g et la durée de l'efficacité vaccinale après quelques mois d'élevage, lorsque les truites atteindront 100 -150 g environ. A ce poids, les truites sont considérées comme immunocompétentes.