Poissons

Piégées au verveux, anesthésiées par balnéation, ouvertes pour recevoir dans la cavité abdominale un émetteur acoustique de deux grammes et une puce RFID, puis remises à l'eau au point exact de leur capture : 200 anguilles européennes et 30 silures subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'émetteur posé sur les anguilles porte un capteur qui réagit à l'acide gastrique, de sorte que la digestion d'une anguille par un silure se lise à distance. Aucun poisson n'est tué, et le porteur affirme n'avoir jamais observé de mortalité à court terme lors des marquages précédents. Les 200 individus opérés appartiennent à une espèce classée en danger critique d'extinction, ce que le porteur donne précisément comme raison de vérifier si le silure les prédate.

Objectifs

Ce projet a pour but d’identifier les éventuelles relations trophiques entre une espèce en danger critique d’extinction (l’anguille européenne, statut Union International pour la Conservation de la Nature) et une espèce considérée comme exotique envahissante (le silure glane, classé par le centre de ressource Espèces Exotiques Envahissantes coordonné par l’UICN et l’OFB). L’impact de cette espèce sur d’autres espèces migratrices de la même famille que les anguilles a déjà été mis en évidence, notamment chez les lamproies, les aloses et les saumons. Des relations trophiques entre silure et anguille sont donc possibles, et sont déjà souvent mises en avant par une partie de la société (pêcheurs professionnels et loisirs) mais n’ont pas encore été étayées de manière scientifique et rigoureuse. Ce projet vise donc à vérifier dans un premier temps si les silures prédatent les anguilles, et si oui à quantifier cette relation trophique dans un second temps. Pour répondre à ces objectifs, un suivi en télémétrie acoustique sera réalisé sur des anguilles et des silures. Les anguilles seront équipées avec des marques à capteurs de prédation, capable d’identifier un événement de prédation. Des silures seront aussi équipés avec des marques acoustiques afin de donner des informations sur l’utilisation temporelle des habitats.

Bénéfices attendus

La gestion du silure doit se faire sur la base de faits scientifiques avérés et robustes. Si le silure a un effet important sur les populations d’anguilles, compte tenu du statut critique de cette espèce, il sera nécessaire de prendre en compte très rapidement des mesures afin de limiter l’expansion géographique et démographique des silures. A ce titre, il est attendu de cette étude de délivrer des informations fiables sur : - la réalité d’une prédation des anguilles par les silures ; - ce taux de prédation, le cas échéant. Ces données seront utilisées dans les plans de gestion des poissons migrateurs amphihalins dont font partis les aloses, les saumons, les anguilles, ou les mulets par exemple .

Procédures

Cette étude sera composée de plusieurs volets : - premièrement, un suivi en télémétrie acoustique avec marques à capteurs de prédation sera réalisé sur les anguilles. Ces marques sont des marques de télémétrie classiques (donc programmées pour émettre un signal ultrasonique régulièrement afin de pouvoir suivre les individus marqués dans le milieu) auxquelles un capteur supplémentaire a été ajouté. Ce capteur va réagir avec l’acide présent dans les estomacs des poissons prédateurs et il est donc possible de savoir si le poisson hôte dans lequel la marque a été placée au début a été prédaté ou pas. Les données issues du capteur sont envoyées classiquement par la marque acoustique via des ultrasons, qui sont captés dans le système d’étude par un réseau de récepteurs acoustiques. Sur cette action, 200 anguilles jaunes (plus de 40 cm) seront marquées en 4 lots de 50 individus, en avril, juillet 2024 et 2025. Ces marques seront placées dans la cavité péritonéale par opération chirurgicale sous anesthésie générale. Les marques mesureront 7 mm de diamètre, 1.5 cm de long et pèse 2 g, ce qui en théorie autorise le marquage dès 100 g soit 300 mm environ. Par mesure de sécurité, cette limite a été relevée à 400 mm. Les poissons seront ensuite suivis sur le marais de 2024 à 2026. Ces marques sont encapsulées dans une coque moulé en résine époxy de manière à ce que à l’échelle de la vie d’un poisson, aucun effet de ces marques n’a jamais été observée ou mis en évidence. A l’inverse, de nombreux poissons sont suivis des années sans montrer aucune modification comportementale. Un second émetteur de type RFID (aussi appelé pit-tags) sera introduit dans la cavité en même temps (donc n’entraine aucune manipulation supplémentaire) afin que les anguilles marquées puissent être identifiées facilement par le pêcheur. Ces marques sont de taille très réduite (moins de 2 mm de diamètre pour un dixième de gramme), et leur innocuité sur cette espèce a été déjà et fréquemment démontrée (moulage dans une capsule de verre incassable). - en parallèle, 30 silures seront marqués aussi avec des marques de télémétrie acoustique classiques, sans capteur de prédation, en suivant exactement la même procédure que pour les anguilles. Ce marquage a pour but d’estimer le taux d’occupation du marais par les silures en fonction de la saison et donc ainsi de relativiser une éventuelle prédation.

Impact sur les animaux

Comme toutes expériences en écologie comportementale, le stress lors des captures doit être pris en compte. Pour cela, pour les anguilles, seuls des verveux (grandes nasses en filet non maillant) seront utilisés pour les captures. Ces engins sont des pièges et non des filets, et disposent d’un volume assez conséquent dans lequel les poissons sont piégés. De plus, ces pièges sont relevés quotidiennement afin de réduire le stress d’une captivité prolongée. Les silures seront aussi capturés avec des verveux mais adaptés à leur grande taille. Ces pièges seront aussi relevés quotidiennement afin de réduire le stress d’une captivité prolongée. Malgré les précautions prises, un problème lors de l’insertion chirurgicale est toujours à envisager. Mais l’expérience de l’équipe et la robustesse des deux espèces (anguilles et silures) nous amène à être très confiants sur l’absence d’effets létaux ou délétères lors du marquage. Sur les marquages précédents, aucune mortalité à court terme n’a jamais été observée sur ces deux espèces. De plus, sur les anguilles, des tests d’effet à plusieurs semaines ont déjà été réalisés et n’ont jamais montré aucune mortalité ni effet délétère. Le marquage chirurgical sera réalisé sous anesthésie générale, qui, dans l’état actuel des connaissances et bonnes pratiques vétérinaires, semble agir aussi comme analgésique chez les poissons.

Devenir

Le principe est de suivre les animaux dans leur milieu naturel et d’observer une éventuelle prédation des anguilles par les silures en utilisant des marques acoustiques à capteurs de prédation qui réagissent avec l’acidité des estomacs. Tous les animaux marqués seront donc replacés dans leur milieu naturel, à l'endroit précis de leurs captures.

Remplacement

L’étude vise à étudier des relations de type Proies-Prédateurs en milieu naturel, il n’est donc pas possible de remplacer les animaux dans cette étude.

Réduction

Cette étude vise à vérifier et à quantifier (le cas échéant) le taux de prédation des anguilles par les silures. La méthode retenue est la télémétrie acoustique avec des marques à capteurs de prédation, capable d’identifier une évènement de prédation. Cette prédation, si elle existe, pourrait être variable en fonction de la saison, les silures étant une espèce plus active au printemps et à l’été. Ainsi, l’étude doit porter sur une longue durée (36 mois) qui pourrait entrainer des pertes d’individus marqués par émigration naturelle. Ainsi, il est nécessaire d’avoir un effectif suffisant. L’ensemble du protocole, dont les nombres d’individus à marquer, a été validé par un comité de pilotage composé de spécialistes français en télémétrie. Le protocole prévoit 4 lots de 50 anguilles, soit 200 anguilles en tout. Ce nombre a été défini par le comité de pilotage en tenant compte de 1 – la taille du site ; 2 – les taux de perte (migration et prédation) attendus ; 3 – le respect de l’espace acoustique (trop d’individus marqués en même temps dans un même espace clos réduit les probabilités de détection). Ce nombre est donc l’effectif minimal qui permettrait de voir si la prédation a effet significatif sur les populations d’anguilles, compte tenu de toutes les limites évoquées ci-dessus. C’est la taille utilisée dans les études précédentes du même genre. Le protocole prévoit aussi le marquage d’un lot de 30 silures. La taille de ce lot est celle classiquement utilisée dans les études du même genre, et permet d’obtenir des données assez robustes pour définir l’utilisation spatio-temporelle d’un habitat par une espèce.

Raffinement

Plusieurs mesures ont été mises en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors des captures et des marquages. La capture se fera avec les engins les plus adaptés pour limiter les blessures des espèces concernées, ainsi que leur stress. Les pièges seront relevés tous les jours afin de limiter le temps de captivité. La pose des marques télémétriques s’effectuera sous anesthésie générale en balnéation, avec entretien par flux continu et ajustement si nécessaire de manière à maintenir la stabilité de l’anesthésie tout au long de l’intervention. Les animaux seront placés en réveil dans un bac d’eau oxygéné jusqu’à récupération complète avant relâche dans le milieu naturel. En même temps, un second émetteur, passif (RFID) et de plus petite taille, sera aussi introduit dans chaque individu afin que le pêcheur titulaire du droit de pêche sur le marais puisse vérifier que les individus péchés par la suite lors de son activité professionnelle ne soit pas des individus suivis. Cette marque sera placée au même endroit que la marque acoustique. En cas de capture d’un individu marqué, le pêcheur aura l’obligation de le remettre immédiatement à l’eau. Après marquage, chaque individu est gardé dans un bac de réveil jusqu’à dissipation totale des effets de l’anesthésiant, puis remis à l’eau à l’endroit exact de la capture.

Choix des espèces

L’anguille européenne est une espèce animal en danger critique d’extinction. Toutes les mesures visant à alléger les pressions subies par cette espèce doivent donc être mises en place de manière rapide. Les espèces exotiques envahissantes, et notamment le silure, sont une pression déjà identifiée sur certaines espèces migratrices comme les lamproies, les saumons et les aloses. L’impact sur les anguilles est donc possible et cette étude servira à démontrer l’effet (ou non) des silures sur les anguilles. L’étude portera sur les anguilles jaunes, le stade sédentaire de croissance des anguilles européennes, et sur les silures adultes de plus de 3 ans (30-40 cm). L’impact du silure sur la phase migratrice des anguilles (anguilles argentées) a déjà été réalisé. Ce projet vise quant à lui à étudier l’impact sur la phase de croissance sédentaire.

Gavées sous anesthésie d'un antibactérien cancérogène et mutagène interdit dans l'Union européenne depuis 1995, 38 truites arc-en-ciel juvéniles subissent ensuite une à deux prises de sang dans les vingt-quatre heures. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit pourtant que l'exposition à la nitrofurazone n'entraînera "aucune nuisance" et que les prélèvements de sang et d'organes n'en entraîneront pas davantage, la seule gêne reconnue tenant à l'acte de gavage. Toutes sont tuées pour prélever muscle, foie et plasma et y doser un métabolite susceptible de trahir l'usage frauduleux de ce produit en pisciculture.

Objectifs

La nitrofurazone (NFZ) est un principe actif antibactérien présentant une toxicité avérée (cancérogène, mutagène) pour l’homme interdit depuis 1995 sur tout le territoire Européen. Malgré cette interdiction, la nitrofurazone peut être trouvée dans les denrées alimentaires d’origine animale destinées à la consommation humaine. Différentes études démontrent que cette molécule est rapidement métabolisée et ce dès les premières heures suivant son administration. De ce fait, la surveillance des résidus de nitrofurazone dans les denrées d’origine animale est basée uniquement sur la surveillance d’un métabolite, le semicarbazide (SEM). Cependant, le SEM n’est pas spécifique de la nitrofurazone et il peut être détecté dans certains produits alimentaires d’origine animale ayant subi une transformation industrielle, et ce bien qu’il n’y ait pas eu de traitement vétérinaire au cours de l’élevage. Ce manque de spécificité implique que le contrôle basé uniquement sur le SEM peut engendrer des résultats d’analyse faussement positifs. Un autre métabolite a été identifié et pourrait être utilisé pour détecter l’utilisation de nitrofurazone en élevage. Ce métabolite est le 5-nitrofuraldéhyde (5-NF). Cependant, aucune information n'a été publiée sur sa cinétique et en particulier sur sa vitesse d’élimination en élevage aquacole. Ce projet a donc pour objectifs de générer des connaissances sur le devenir, la persistance et la demi-vie de la nitrofurazone et de son métabolite le 5-nitrofuraldéhyde dans différents tissus de la truite arc en ciel (plasma, muscle, foie), et d’établir si ce métabolite pourrait être un traceur pertinent pour détecter l’utilisation frauduleuse de la nitrofurazone dans les élevages aquacoles, en particulier lors d’importations.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra : (i) de démontrer la présence du 5-NF dans les tissus musculaires, hépatiques, et le plasma chez les truites traitées à la NFZ ; (ii) d’étudier la cinétique de la NFZ et de son métabolite 5-NF dans ces compartiments et d’établir un modèle pharmacocinétique ; (iii) d’obtenir un profil de disparition du 5-NF après arrêt de l’exposition à la NFZ; (iv) de déterminer si le 5-NF est un marqueur pertinent pour détecter un traitement thérapeutique illégal en élevage aquacole à base de nitrofurazone. La finalité sera une amélioration de la méthode de détection actuelle de la NFZ, basée sur l'intégration d'un métabolite traceur plus spécifique, et donc une meilleure efficacité dans la détection des fraudes.

Procédures

Durant l'expérimentation, un acte de gavage sera réalisé sur chaque animal. Un à deux prélèvements de sang chacun seront également effectués sur chaque poisson, et répartis sur les 24 premières heures après l'administration orale. L'acte de gavage sera fait sur animal anesthésié et ne durera pas plus de 1 minute. Les prises de sang sur les poissons de cette taille se font aisément et très rapidement sur animaux vigiles, avec une bonne contention.

Impact sur les animaux

La voie de contamination par gavage, bien qu’elle se fasse sous anesthésie, peut entrainer des nuisances modérées. L’exposition au NFZ sera réalisée à de faibles doses n’entrainant aucune nuisance. De même, les prélèvements de sang et d’organes cibles n’entraineront aucune nuisance.

Devenir

Tous les poissons seront mis à mort pour prélever de la matrice biologique et ainsi réaliser les futures analyses chimiques.

Remplacement

Les méthodes alternatives pour étudier le métabolisme sont souvent des méthodes basées sur des lignées cellulaires ou des enzymes de mammifères. Il n’existe pas d’équivalent basée sur des cellules de poissons permettant ces études. Seul le recours à l’utilisation d’animaux permettra d’obtenir des informations sur le métabolisme. De même, seule une étude globale sur les individus permet de caractériser les processus d’absorption, de distribution et de disparition des composés de l’organisme et de caractériser également la variabilité individuelle nécessaire à la compréhension des processus biologiques mis en jeu.

Réduction

La procédure expérimentale sera menée en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en conservant une pertinence scientifique. Le nombre de points de prélèvements formant la cinétique ainsi que le nombre de poissons prélevés par temps a été estimé au plus juste pour limiter l’impact des prélèvements sur chaque poisson et pour générer suffisamment de données pour construire les modèles de pharmacocinétique.

Raffinement

Les mesures de raffinement viseront : - à assurer des conditions optimales d’hébergement des animaux afin de s’assurer de leur bien-être : une biomasse (nombre d’animaux par bassin) contrôlée permettant l'expression des comportements alimentaires et natatoires attendus de l'espèce étudiée, un volume d'eau adapté et renouvelé en continu, une saturation en oxygène suffisante, un rythme jour/nuit naturel, et une alimentation adaptée à leur stade de développement et la biomasse. - réaliser des observations quotidiennes de l’état de santé général des poissons et de leur comportement natatoire et alimentaire. - à mettre à mort de façon compassionnelle des animaux présentant un comportement anormal et/ou des signes cliniques de mal-être (selon une grille d’évaluation du point limite).

Choix des espèces

La nitrofurazone peut être potentiellement utilisée de manière illicite et venir contaminer les produits de pisciculture. La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) présente un grand intérêt économique pour la filière piscicole et représente donc un bon modèle de poisson d'élevage pour réaliser ce projet ; c'est une espèce facile à élever en laboratoire. Les animaux seront utilisés au stade juvénile, âgés environ d’un an (environ 100g) pour assurer assez de matrice biologique pour les analyses.

Certains poissons subissent une montée de la température de l'eau jusqu'à perdre l'équilibre, pendant deux heures au maximum, pour déterminer leur température critique. 2 000 chevaines et spirlins pêchés dans le Rhône vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 800 tués pour l'analyse de leurs cellules et 200 relâchés sur leur lieu de capture. Chaque individu est anesthésié pour être marqué, puis à chaque transfert entre bassins, et reste isolé jusqu'à vingt-quatre heures dans un tunnel de nage. Le porteur inscrit ce travail dans un objectif de conservation des espèces du Rhône, et mentionne 800 poissons supplémentaires tués sans expérimentation préalable, qu'il choisit de ne pas comptabiliser dans le tableau récapitulatif.

Objectifs

Une augmentation de la température environnementale peut entraîner des conséquences dramatiques sur les organismes, notamment chez les animaux ectothermes, dont la température corporelle dépend directement de la température ambiante. Ce projet vise à comprendre comment les poissons d’eau douce vont réagir face au réchauffement global. En effet, une augmentation de la température de l’eau entraine une augmentation des dépenses énergétiques des organismes, ayant pour conséquences directes une diminution de la croissance et de la reproduction. Depuis plusieurs années, le réchauffement de la planète est un phénomène qui s’accélère et donc les organismes doivent mettre en place des mécanismes adaptifs plus rapidement s’ils veulent survivre. Pour ce qui est des réponses à la contrainte thermique, 2 principales hypothèses se dégagent : (1) les individus vivant dans des milieux relativement chauds pourraient être plus résistants et mieux adaptés au réchauffement et aux périodes de stress thermique par rapport aux individus vivant dans des milieux plus frais ou (2) le fait de vivre dans des conditions thermiques suboptimales pourrait rendre les organismes ectothermes plus sensibles aux stress subséquents. Cette étude a pour but de définir des températures de tolérance pour les espèces du Rhône et de mettre en lumière les mécanismes d’adaptation à long terme et/ou d’acclimatation plus rapide face à une augmentation des températures. Afin de pouvoir étudier ces réponses physiologiques, deux espèces de poissons seront utilisées comme modèles expérimentaux : le Chevaine, espèce eurytherme présente partout dans le Rhône et le Spirlin, espèce plus abondante en aval des centrales nucléaires productrices d’énergie (CNPE), là où l’eau est plus chaude. Cette zone plus chaude pourrait être considérée comme une condition future étant donné le réchauffement actuel. Donc, étudier les différences d'adaptation entre les populations en amont et en aval s’avère pertinent. Le projet se fera le long du Rhône selon un gradient nord sud et donc les échantillonnages se feront sur 5 sites ; Brégnier-Cordon (nord), en amont et en aval de la CNPE du Bugey, et en amont et en aval de la CNPE du Tricastin (sud) afin de pouvoir comparer les capacités d’acclimatation et les préférences thermiques des différentes populations selon leur lieu d’origine.

Bénéfices attendus

L’étude des conséquences du réchauffement climatique sur la physiologie des poissons d’eau douce est au centre des préoccupations du grand public, des instances gouvernementales et des chercheurs. Ce projet s’inscrit directement dans cet axe d’intérêt, et les résultats obtenus permettront notamment de donner des réponses concrètes sur les effets d’une augmentation de température de l’eau afin de réfléchir à des directives de conservations des écosystèmes basées sur des données physiologiques. Cette étude va définir des températures de tolérance pour les espèces du Rhône et potentiellement permettre de mettre en lumière les mécanismes d’adaptation et d’acclimatation face à une augmentation des températures. De plus, comme nous travaillons sur une espèce eurytherme (chevaine) et une que l’on retrouve de plus en plus en aval des centrales thermiques (spirlin), si ces poissons ont du mal à s’adapter au réchauffement des températures alors nous pouvons supposer que cet échauffement entraînera des conséquences d’autant plus délétères pour des poissons qui supportent moins bien le réchauffement et les variations de température. Donc, ce projet a non seulement un but de caractérisation des adaptations à la température, mais aussi un but de conservation d’espèces plutôt endémiques du Rhône. Le protocole de CTmax permet de définir la température maximale de tolérance thermique, qui n’a jamais été documentée pour les deux espèces étudiées ici. Les protocoles de mesures croisées (répétition de 3 performances de nage à 3 différentes températures) sont indispensables pour élucider les mécanismes d’acclimatation et les réponses aigues aux différentes températures, et le métabolisme énergétique pourra être ainsi abordé selon une double approche in vitro et in vivo. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes adaptatifs mis en place chez différentes populations de poissons distribuées selon le gradient naturel « haut-Rhône » froid et « bas-Rhône » plus chaud d’une part et selon l’amont ou l’aval des deux CNPE d’autre part, mettant en exergue des variations environnementales provenant directement d’activités anthropiques. Ainsi, ce projet a pour but de participer aux efforts de conservation de la biodiversité et via une connaissance accrue des capacités d’adaptation de ces espèces, permettant de mieux appréhender comment ils pourraient réagir face au changement climatique.

Procédures

Suite à leur prélèvement en milieu naturel, tous les poissons seront acclimatés à l’animalerie et stabulés dans des conditions adaptées à leur espèce. Les poissons seront soumis à une anesthésie / analgésie afin de les implanter avec des marques pour les individualiser. Cette intervention dure au maximum 15 minutes par poisson. Les poissons seront ensuite soumis à une période de pré-conditionnement thermique (2 jours à 6 semaines selon la procédure). A chaque manipulation (lors des transferts entre les aquariums de stabulation et les enceintes expérimentales), les poissons seront légèrement anesthésiés afin de limiter le stress du déplacement. Cette anesthésie ne fera pas effet pendant plus d’une minute sur le poisson. Certains poissons subiront une augmentation de la température de l’eau jusqu’à perte d’équilibre (3h). Certains poissons seront mis à mort après une stabulation courte à l’animalerie. Certains poissons subiront des tests de préférence thermique (12h) puis 3 tests de performance de nage (

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de ces protocoles pourrait être un niveau de stress accru faisant suite à la pêche, à la stabulation dans un nouveau milieu, et/ou aux expérimentations. Cette augmentation du stress peut s’exprimer via l’apparition d’infections chez les poissons. En effet, les risques d’infections sont plus hauts que la normale car comme les poissons viennent de milieux naturels, on ne connaît pas leur histoire et ce qu’ils auraient pu rencontrer dans leur habitat. Un autre point de surveillance sera lié à la période d’isolement des poissons (entre 2h et

Devenir

200 individus seront replacés en liberté sur leur lieu de capture. 800 poissons seront euthanasiés sans expérimentation préalable et seront utilisés post-mortem pour la caractérisation des mécanismes cellulaires in vitro. 1800 individus seront euthanasiés pour la caractérisation des mécanismes cellulaires in vitro.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques, surtout lorsqu’il s’agit d’animaux sauvages. Cela permet notamment de caractériser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour étudier de façon complète, les réponses métaboliques de l’animal face à son environnement.

Réduction

Le nombre de poissons a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique, compte tenu de l’étendue de la variabilité interindividuelle des processus étudiés dans cette étude. En effet, une forte variabilité interindividuelle est attendue du fait du brassage génétique et de l’impact des différents facteurs environnementaux du milieu naturel. La taille des échantillons a été ainsi définie pour permettre une analyse statistique fiable. Pour ce qui est de la procédure expérimentale pour obtenir la température critique maximale (CTmax), minimum 20 poissons par endroit d’échantillonnage sont nécessaires car comme expliqué ci-dessus, une forte variabilité interindividuelle peut entrer en jeu. Donc 5 endroits x 2 espèces x 20 individus = 200 poissons pour la CTmax au total. Pour les mesures de bioénergétique sur populations naturelles, il y a 5 endroits x 4 saisons x 2 pêches /an x 1 espèce (uniquement les spirlins) x 20 individus = 800 individus. Mais au vu de la courte durée de stabulation au sein de l’EU, ces individus utilisés uniquement post-mortem ne seront pas comptabilisés dans le tableau récapitulatif. Pour ce qui est de la procédure d’acclimatation à la température, 1800 poissons seront utilisés, soit 1200 spirlins (5 endroits x 2 pêches/an x 2 ans x 20 individus x 3 groupes) et 600 chevaines (5 endroits x 1 pêche/an x 2ans x 20 individus x 3 groupes) ; 200 poissons supplémentaires sont prévus afin de palier d’éventuelles morts spontanées.

Raffinement

Lors des protocoles non invasifs in vivo (mesure de la consommation d’oxygène associée aux performances de nage et tests comportementaux), un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesure et placement des poissons dans les tunnels de nage) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h dans le tunnel de nage, avant le protocole de nage (Ucrit) ou de 2h dans les arènes de choix. Après chaque expérience, les poissons seront replacés dans leur aquarium de stabulation et toutes les précautions seront prises pour leur éviter toutes nuisances visuelles et sonores. Les poissons sont maintenus dans des aquariums de 60L ou 90L en densité adaptée à leur espèce. Les spirlins et les chevaines juvéniles sont des poissons vivant en banc. Ils seront donc maintenus à plusieurs dans les aquariums (environ 30 par bac) afin d’optimiser les conditions de stabulation. Des cachettes adaptées (tubes de gros diamètres leur permettant de se cacher en banc), des plantes artificielles et du gravier sont disposés dans chaque aquarium. Un système de pompe filtrante assurera également une circulation d’eau bullée continue dans les aquariums. Les poissons seront nourris une fois par jour, avec des cubes de moules hachées avec du mix (différentes larves de moustiques, daphnies et de la verdure (épinards, spiruline)) et lors du nourrissage, leur comportement est observé. En effet, si un poisson ne se nourrit pas, des mesures seront prises à son égard. Une observation biquotidienne sera réalisée par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de veiller au bien-être des animaux depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à l’euthanasie. Les états de santé et de bien-être des animaux seront ainsi évalués en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d’évaluation afin de définir des points limites adaptés. Dès l’apparition de signes cliniques de mal-être, les animaux seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage. Dans le cas où des signes de douleur ou de mal-être devaient persister au-delà de 24 heures après la mise en stabulation, les animaux seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le chevaine est une espèce plutôt ubiquiste du Rhône, généraliste et eurytherme avec un panel de tolérance thermique large. Le spirlin est une espèce que l’on retrouve de plus en plus en aval des centrales thermiques ce qui laisse supposer une bonne adaptation à des variations de températures. L’étude de cette espèce dans des environnements thermiques élevés permettra d’évaluer précisément ses capacités d’acclimatation et d’anticiper l’impact délétère du réchauffement sur des espèces moins adaptatives. De plus, ces espèces sont en statut préoccupation mineure, sur la liste rouge UICN (Union internationale pour la conservation de la nature), donc les pêcher n’aura pas de grand effet sur les populations naturelles. Enfin, les organismes avec qui nous allons pêcher font des suivis de populations et sont donc au courant des statuts des différentes espèces dans le Rhône. Aucun prélèvement n’aura d’impact négatif sur les populations naturelles. Les spirlins utilisés sont des spirlins adultes. Leur petite taille (30 cm) étant incompatible pour une telle étude, seuls des chevaines juvéniles seront employés.

Tuées trois par bassin à chacun des six temps de prélèvement, pour que le tissu cicatriciel soit analysé, 72 truites arc-en-ciel sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poisson reçoit un transpondeur dans le muscle du dos, puis une lésion cutanée pratiquée au trépan à biopsie. Six prises de sang suivent sur 56 jours, avec une anesthésie cumulée pouvant atteindre soixante-dix minutes et une sortie de l'eau cumulée de treize minutes trente. Le projet sert à caler un modèle de cicatrisation pour tester ensuite des additifs alimentaires, dans une filière d'élevage où les blessures cutanées sont fréquentes et traitées aux antibiotiques.

Objectifs

Les poissons interagissent directement avec leur environnement par leur peau, et la fonction d'homéostasie de la muqueuse cutanée dépasse de loin celle des organismes terrestres. La peau des poissons est constituée d'un grand nombre de cellules sécrétrices de mucus, de macrophages et de divers lymphocytes, permettant la fonction de barrière primordiale au maintien de l'homéostasie. En condition industrielle, des lésions cutanées, des abrasions et des ulcères apparaissent fréquemment chez les poissons d’élevage. Cela entraine des pertes de sang et la contamination des tissus sous-jacents par des particules étrangères et des agents pathogènes. Dans ces situations, les plaies cutanées doivent être traitées rapidement afin d'éviter des conséquences encore plus négatives pour les poissons. Cela entraine un accroissement de l’utilisation de traitements et notamment d’antibiotiques. Si le processus de cicatrisation est très bien décrit chez les mammifères, les travaux chez les poissons sont beaucoup plus récents. La principale différence est une inversion des phases d’inflammation et de ré-épithélialisation dans les premiers jours après une blessure chez les poissons. Des travaux ont également démontré qu’ il était possible d’améliorer le processus de cicatrisation par l’ utilisation d’additif alimentaire. Ces travaux sont importants pour améliorer les conditions d’élevage des poissons et participer au développement d’une filière plus durable limitant l’utilisation d’antibiotiques. Ce projet pilote propose de (1) mettre au point un model expérimental subclinique de suivi des processus de cicatrisation du filet après utilisation d’un trépan de biopsie (2) de déterminer la variabilité individuelle et inter-bassin de la mesure des différents paramètres dans nos conditions expérimentales. Cela permettra par la suite, si le modèle est validé, de mener des expériences utilisant ce modèle pour prévenir de la dégradation des lésions par l’utilisation d’additifs alimentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet exploratoire s’inscrit dans l’amélioration des conditions d’élevage des salmonidés. Il permettra, en premier lieu, de suivre et de caractériser toutes les phases de la cicatrisation chez la truite arc en ciel dans les conditions de nos installations. A l’issu de cette étude exploratoire, il sera possible de déterminer quels sont les paramètres à suivre les plus pertinents et d’optimiser le nombre d’animaux nécessaires pour utiliser ce modèle. Enfin, ce projet permettra à terme d’évaluer le bénéfice réel des additifs alimentaires sur l’amélioration de la cicatrisation cutanée chez la truite arc en ciel dans le cadre d’essais ultérieurs.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pou une durée de 56 jours. Au début de la procédure, les poissons (12) seront identifés par un transpondeur (durée introduction 3 secondes) placé dans le muscle du dos après anesthésie, et tous les poissons seront soumis à une lésion à l'aide d’un trépan à biopsie (durée 15 secondes). Aux jours 0, 3, 7, 14, 35 et 56 post-lésion des prises de sang seront réalisées. A chaque temps, un volume sanguin nécessaire et suffisant pour l'analyse des paramètres biochimiques sera prélevé sur chaque poisson anesthésié. Pour chaque prise de sang, le temps ne dépassera pas 1 minute. En fonction du poisson et de la cinétique d'échantillonnage, la durée totale de l'anesthésie durera entre 8 et 70 minutes, et la mise hors de l'eau totale entre 3 et 13 minutes 30 secondes sur trois mois (durée cumulée).

Impact sur les animaux

Changement du comportement alimentaire, saignement localisé au niveau du site de ponction du tissu. Réaction inflammatoire dans les premiers jours de la cicatrisation, guérison anormale de la lésion.

Devenir

Les animaux seront mis à mort au fur et à mesure de la procédure (soit 3 animaux par bassins , 6 temps de prélèvements) afin de réaliser les prélèvements de tissus cicatriciels. Plus d'animaux à la fin de la procédure.

Remplacement

La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut pas être remplacée par une autre stratégie n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. Il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico capable de mimer l’intégralité des acteurs cellulaires et acellulaires participant à la complexité des processus de cicatrisation et à la modulation de cette réponse par la nutrition.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre minimum d'animaux à utiliser pour évaluer ce projet exploratoire. Le nombre d'animaux a utilisé permettra d'obtenir une densité adéquate pour favoriser une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux. Des analyses post mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer un maximum d'information possible par animal afin de valider le modèle exploré dans ce projet. Le nombre d'animaux et la conception expérimentale de ce projet ont été établis en suivant une approche statistique validée par un biostatisticien.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux sont définies afin que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux, l'enrichissement des bassins ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur. Aucun animal ne restera isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux. Avant toute manipulation (pesée ou prélèvement) au cours de cette étude, les truites arc en ciel sont anesthésiées. La capture et le stress dus à la sortie des bassins sont réduits au maximum par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs lors des pesées, des prises de sang et des mesures. Les conditions expérimentales sont également raffinées par un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’une mousse humide pour faire reposer l’animal sur un support de contention adapté, d'un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans une procédure interne qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. Un analgésique sera utilisé par voie intramusculaire afin de réduire la douleur après l’introduction du transpondeur et lors de la réalisation des lésions et de permettre une meilleure récupération et une réduction des effets secondaires comme les frottements de l'animal contre les murs. Utilisation de pansement hydrorésistant antiseptique et antifongique après la réalisation de la lésion pour éviter l'infection de la lésion. Un minimum de deux observations quotidiennes des animaux est réalisé afin de détecter prématurément des signes cliniques de dommages corporels et pour vérifier que les poissons s’alimentent correctement. Dès l’observation d’un signe clinique, les animaux sont suivis au moyen d’une grille de score de point limites.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la truite arc-en-ciel, en tant que modèle animal de salmonidé. La truite est un bon modèle pour les salmonidés car elle est taxonomiquement proche du saumon et les résultats pourront être transposés chez le saumon. La truite est également un animal plus résistant aux conditions d'élevage, aux maladies, avec un taux de croissance plus élevée permettant de rester dans le cadre du développement d’un modèle de cicatrisation subclinique. Au début de l’étude les truites pèseront 50 grammes. Elles seront élevées pendant 4 semaines, puis, à 100 g les poissons seront blessés et un suivi de cicatrisation sera réalisé pendant 56 jours. Le poids final à la fin de l’étude sera de 320g.

Le thon rouge n'étant pas manipulable en captivité, 24 bars d'élevage sont utilisés à sa place pour mettre au point une balise électronique implantée censée suivre les migrations d'un poisson de forte valeur commerciale. Ces 24 individus, tués à l'issue, subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré : implantation d'électrodes sous la peau et dans le muscle dorsal sous anesthésie, moins de trente minutes d'opération, 24 heures dans un couloir de nage, puis exposition à des courants électriques. Les électrodes sont récupérées sur les cadavres. Le porteur cale l'intensité des courants sur les consignes applicables aux êtres humains et en déduit qu'elle ne "devrait pas causer des nuisances", tout en indiquant qu'elle pourrait provoquer un picotement dans le muscle.

Objectifs

Les expérimentations décrites dans cette demande visent à avancer sur la compréhension du cycle de vie du thon rouge, un poisson migrateur de grand valeur culturel et économique en France. Il est proposé de développer des moyens d’observation pour comprendre la réponse physiologique des animaux à leur environnement. Nous travaillons au développement d’une marque électronique combinant une marque interne pour collecter des informations physiologiques (température corporelle, fréquence cardiaque…) et une marque satellite de type ‘pop-up’ permettant de collecter des informations environnementaux (température, pression, lumière …) pendant les migrations, et de les transmettre par satellite à l’issue du déploiement à la surface de la mer. Pour cela, il est nécessaire d’établir une communication intracorporelle entre le capteur implanté (marque interne) et le concentrateur des informations (marque externe). Notre choix s’est porté sur l'utilisation de la conductivité électrique des tissus biologiques pour transmettre un signal électrique de très faible intensité. Nous souhaitons donc mettre en œuvre deux expérimentations. Avant toute chose, une expérimentation sur le thon rouge n’est pas envisageable. Nous proposons de réaliser ces expérimentations sur une espèce élevée en captivité, le bar, Dicentrarchus labrax. La première expérimentation vise à confirmer que les très faibles courants utilisés restent imperceptibles pour le poisson. La gamme d'intensité des courants de stimulation est basée sur les consignes pour les êtres humains et donc ne devrait pas causer des nuisances. Pendant l'exposition aux courants électriques, nous évaluons leur innocuité avec des indicateurs physiologiques et comportementaux. La seconde expérimentation a pour objectif de mettre en œuvre une communication intracorporelle afin de valider son principe.

Bénéfices attendus

Ces mesures permettront d’une part de vérifier l'innocuité des dispositifs de communication intracorporelle. La deuxième phase permettra de valider la possibilité de faire communiquer deux dispositifs électroniques au travers du corps de l'animal en vue du développement d'un réseau de capteurs implantés. A l’issue de ces deux expérimentations, nous devrions pouvoir concevoir un premier prototype de marque implantée communicante pour le thon rouge.

Procédures

Les poissons seront équipés avec des électrodes en Inox très fines et flexibles, sous cutanées et dans le muscle dorsal, sous anesthésie générale. La durée de l'opération est inférieure à 30 minutes. Cette chirurgie sera suivie par 24 heures de récupération, protégé des perturbations humaines. Puis, chaque individu sera soumis à des stimulations par courant électrique à très faible intensité.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont le stress du poisson lors des manipulations et de l'anesthésie, puis la nuisance d'avoir des électrodes très fines sous la peau et à la surface du muscle. Les individus seront maintenus pendant 24 heures dans un couloir de nage. L'intensité maximale du courant pourrait provoquer un picotement dans le muscle mais cette intensité est imperceptible chez l'homme.

Devenir

A la fin de la procédure, les poissons seront euthanasiés pour récupérer les électrodes.

Remplacement

Cette étude, qui implique la mesure des facteurs de conditions corporelles et des réponses physiologiques doit être réalisée sur des animaux. Il n’est pas possible de remplacer les poissons par un autre modèle pour ce type de procédures.

Réduction

Le nombre de 12 individus pour chacune des procédures (12+12 = 24) est basé sur une analyse de puissance avec le logiciel G*Power.

Raffinement

Le protocole de manipulation et d’anesthésie est optimisé et parfaitement maîtrisé. Les électrodes sont très fines mais très résistantes et flexibles. Leur finesse et flexibilité minimisent la nuisance au poisson, et lui permettent une liberté de mouvement. Pendant les expériences les poissons seront protégés de toute nuisance visuelle et sonore. Pendant l'exposition aux courants électriques, nous évaluons leur innocuité avec des indicateurs physiologiques et comportementaux.

Choix des espèces

Le bar est une des principales espèces élevées en pisciculture et sa physiologie est bien étudiée. Les individus seront tous adultes et sexuellement matures, pour permettre le bon placement des électrodes.

Pêchées à l'entrée des estuaires puis élevées quinze à dix-huit mois en aquarium, avec un taux de survie estimé à 30 %, 3 000 civelles sont collectées pour que 720 anguilles européennes entrent dans les procédures, déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est exposée à l'une de quatre doses de bisphénol S et reçoit, sous anesthésie, une intubation gastrique qui l'infeste d'un ver parasite se nourrissant de son sang. Elles sont tuées par groupes vingt, quarante et soixante jours après le début de l'exposition, les surnuméraires étant relâchées dans leur milieu d'origine. L'anguille européenne est classée en danger critique d'extinction depuis 2008, et le porteur en tire argument pour écrire qu'il n'est pas possible de recourir à des méthodes de remplacement de cette espèce.

Objectifs

Dans leurs environnements naturels, les animaux aquatiques sont exposés à une variété de contaminants biologiques et chimiques. Parmi les contaminants biologiques, les parasites affectent par définition la physiologie de leurs hôtes, les obligeant à réallouer leur énergie pour mieux résister. Parmi les contaminants chimiques, les agents plastifiants, tels que les dérivés du bisphénol, sont des polluants émergents potentiels, présents dans les débris plastiques et les eaux usées industrielles, qui contaminent l'environnement aquatique et induisent de multiples problèmes de santé qui nuisent à la survie des animaux exposés. Bien que de nombreuses études aient rapporté les effets de l'un ou l'autre, les mécanismes immédiats qui sous-tendent les effets néfastes induits par les parasites et les polluants organiques, agissant en combinaison, sur les organismes aquatiques n'ont pas encore été tous examinés. Dans ce projet, nous nous concentrerons sur 1) un ver parasite connu pour être pathogène de l’anguille européenne, espèce sentinelle des milieux aquatiques, menacée d’extinction (depuis 2008, UICN) mais non protégée et, 2) un agent plastifiant, le bisphénol S (BPS), polluant émergent particulièrement préoccupant à l’heure actuelle car de plus en plus utilisé dans l'industrie comme alternative au bisphénol A interdit en France dans tous les contenants alimentaires depuis 2015. L'objectif premier du projet est d'étudier les effets du BPS et/ou du ver parasite sur la physiologie de l’anguille européenne afin de répondre aux questions suivantes : 1. L'exposition à des doses croissantes de BPS rend t’elle l'anguille européenne plus vulnérable au parasite supposé impliqué dans son déclin ? 2. L'infestation par le parasite diminue t’elle la capacité de l'anguille à faire face à l'effet du BPS ? Enfin, au delà de l’apport de connaissance scientifique relatif à l’étude de l’impact combiné de ces deux contaminants, notre deuxième objectif est d’étudier le potentiel du mucus cutané de l’anguille (le mucus est la 1ère barrière des organismes aquatiques face à l'environnement extérieur) pour appréhender de manière non létale l'état de santé/stress de ce poisson.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de répondre aux exigences et recommandations prévues dans les plans de gestion de l’anguille européenne à savoir : 1) améliorer les connaissances sur les mécanismes induits par une double contamination chimique et biologique des anguilles et identifier la réponse de ce poisson vis-à-vis des 2 contaminants ciblés (BPS et le ver parasite individuellement ou en combinaison), 2) développer des biomarqueurs à partir du mucus cutané de l'anguille afin d'évaluer son état de santé/stress à l'aide de méthodes qui ne nécessitent pas de tuer les animaux et, 3) évaluer la potentielle menace, actuelle ou future, induite par le BPS sur l’anguille afin de proposer des recommandations pour sa conservation (niveau seuil de BPS dans l’environnement).

Procédures

Exposition à 4 doses différentes de Bisphénol S et à une infestation unique par un ver parasite (intubation gastrique), cette dernière étant effectuée sous anesthésie. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales à 3 pas de temps après le début des procédures soit 20, 40 et 60 jours après le début de l’exposition et/ou infestation.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables auxquels on peut s’attendre seront à priori assez réduits dans la mesure où les doses de contaminants chimique (BPS) et biologique (parasite) utilisées dans les procédures sont des doses relativement faibles et environnementales et que la durée de la procédure est assez courte (60 jours). Cependant, on peut toutefois s’attendre à une légère anémie des poissons infestés par le ver parasite qui se nourrit du sang de l’anguille ainsi qu'à de potentielles modification de comportement, réduction de vivacité ou diminution de l'embonpoint à la plus forte dose du contaminant chimique.

Devenir

Les animaux soumis aux procédures expérimentales seront successivement euthanasiés 20, 40 et 60 jours après le début de l’exposition et/ou contamination.

Remplacement

Ce projet visant à évaluer l’impact de 2 contaminants (chimique émergeant, le BPS, et biologique pathogène, le ver parasite Anguillicola crassus) sur la physiologie de l’anguille européenne (espèce classée en danger critique d’extinction depuis 2008 par l’UICN), il n’est pas possible d’utiliser des méthodes de remplacement de cette espèce.

Réduction

Le taux de survie des juvéniles d'anguille, après collecte et au début de leur mise en élevage en aquarium, estimé à 30%, ainsi que les potentiels échecs des infestations expérimentales par le parasite et/ou des contaminations chimiques nous contraignent à collecter et élever 3000 juvéniles d'anguille pour la bonne réalisation de l’ensemble du projet (720 juvéniles d'anguille feront l'objet des procédures expérimentales). En effet, la nécessité du maintien des civelles en élevage pendant 15 à 18 mois avant la mise en œuvre des procédures expérimentales sont des contraintes fortes qui imposent cette démarche. A la fin du projet, les anguillettes surnuméraires n’ayant pas fait l’objet des procédures expérimentales seront relâchées dans leur milieu d’origine.

Raffinement

Dans le cadre de notre projet, plusieurs mesures seront prises pour limiter inconfort, stress et souffrance des individus depuis leur collecte jusqu’à la fin des procédures expérimentales. La manipulation des juvéniles d’anguille sera effectuée à l’aide d’une épuisette à maille fine afin de ne pas les blesser, en pratiquant des gestes lents et délicats afin de ne pas les stresser tout en permettant une collecte rapide et non traumatisante. Par ailleurs, les juvéniles d’anguille étant grégaires et fuyant la lumière, des tuyaux en PVC alimentaire seront placés dans les aquariums pour que ces jeunes stades puissent s’y regrouper et s’y cacher. De même, un éclairage indirect sera privilégié pendant les temps d’éclairement afin de réduire au maximum tout stress induit par une intensité lumineuse trop forte sur les aquariums et de simuler au sein de ceux-ci des zones moins éclairées, refuges naturels pour ces animaux qui se cachent durant la journée. L’alimentation des juvéniles d’anguille sera également adaptée afin de les habituer progressivement à passer à une nourriture artificielle inerte. De plus, toutes les mesures (poids et taille) ainsi que les infestations expérimentales par le ver parasite s’effectueront sous anesthésie, optimisée pour ces jeunes stades de vie.

Choix des espèces

L'anguille européenne joue un rôle écologique majeur et revêt une valeur économique importante. Suite à la diminution drastique de sa population, elle est classée comme espèce en danger critique d’extinction par l’IUCN (2008) mais non protégée. Parmi les facteurs potentiellement responsables de l'effondrement de sa population figurent les contaminants chimiques (dont le BPS) et biologiques (parasite Anguillicola crassus, pathogène de l’anguille). Dans ce contexte de fort déclin et volonté de contribuer à sa préservation (R(CE) 1100/2007), il convient en 1er lieu de combler le manque de connaissances lié à l’impact de ces contaminants agissant en combinaison (conséquences physiologiques du stress induit). Il devient également urgent de tenter de développer un outil non létal de l'état de santé/stress de ce poisson pour en assurer le suivi en conditions naturelles (développement de protocoles non létaux inscrit dans le Plan de Gestion pour les Poissons Migrateurs 2022-2027, volet anguille). Les individus qui feront l’objet des procédures expérimentales sont des juvéniles d’anguille qui auront été maintenus en élevage pendant 15 à 18 mois après leur collecte dans le milieu naturel. En effet, nous devons collecter des individus d’une même cohorte (même âge) à leur entrée dans les eaux de transition (estuaires, lagunes…) afin qu’elles soient exemptes du parasite, dont nous voulons étudier l’impact, avant le début de l’expérience (dans les conditions naturelles, elles s’infestent dans les eaux de transition). En outre, la période d'élevage de 15 à 18 mois avant le début de l’expérimentation est nécessaire pour permettre aux anguillettes d'atteindre une taille suffisante pour être infestées expérimentalement par le parasite (intubation gastrique).