Poissons

Trente bars communs seront tués pour récupérer les marques implantées dans leur corps, quatre-vingt-dix autres gardés en vie et susceptibles d'être réutilisés. Ces 120 poissons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, non pour produire des connaissances mais pour entraîner des stagiaires aux gestes techniques. Chaque animal subit en une seule séance un marquage intramusculaire, une prise de sang et un prélèvement d'écailles et de nageoire, ou une chirurgie d'implantation, ou encore une stimulation hormonale suivie d'une collecte d'ovocytes ou de gamètes. Le porteur écrit que ni mannequin ni animal mort ne conviennent, l'observation de l'endormissement et du réveil faisant partie de la formation, et conclut qu'il n'existe "pas d'alternatives non animales" pour ces ateliers.

Objectifs

Les projets scientifiques menés au sein de l'établissement nécessitent que les intervenants habilités à la conception ou à la réalisation de procédures expérimentales, qu’ils soient titulaires, étudiants ou partenaires, aient acquis la maitrise des gestes techniques courants, en amont des expérimentations. Ces ateliers techniques seront réalisés dans le cadre de l’acquisition ou du développement des compétences individuelles, conformément aux exigences requises, et seront délivrés par des experts de ces techniques à des groupes de 5 stagiaires maximum.

Bénéfices attendus

Ces ateliers techniques sont nécessaires pour toutes les personnes habilitées à concevoir ou réaliser des procédures expérimentales qui seront amenées à pratiquer des gestes techniques récurrents. Une bonne maîtrise des techniques appliquées sur les poissons réduit les nuisances conséquentes à un geste mal réalisé, optimise le temps de réalisation des procédures, et assure une meilleure reproductibilité des résultats attendus.

Procédures

Un premier lot de 6 poissons sera soumis à un marquage intramusculaire, à une prise de sang, à un prélèvement d'écailles et à deux prélèvements de tissu selon deux méthodes différentes. L'ensemble de ces gestes ne sera pratiqué qu'une seule fois et durera moins de trois minutes. Un deuxième lot composé de 6 femelles et de 6 mâles sera soumis à une évaluation du stade de maturation et à une collecte d'ovocytes pour les femelles, et à une collecte des gamètes pour les mâles. Ces gestes ne seront pratiqués qu'une seule fois et ne dureront que quelques minutes au total. Un troisième lot de 6 poissons sera soumis à une chirurgie pour l'implantation d'une marque interne. Un marquage externe sera également effectué. Ces deux gestes ne seront effectués qu'une seule fois et dureront moins de cinq minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont limitées et sont (1) le stress des poissons lors des manipulations, (2) une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de la prise de sang, lors de la stimulation hormonale des femelles, et lors du marquage intramusculaire, (3) une lésion bénigne engendrée par le prélèvement de l’extrémité d’une nageoire et d’écailles, (4) une incision lors du marquage interne liée à la chirurgie et à la suture après implant. Les effets indésirables sont également limités et peuvent être consécutifs à une mauvaise réalisation du geste enseigné, et être caractérisés par une reprise partielle de la mobilité après anesthésie. Les animaux seront surveillés scrupuleusement tout au long des procédures, par les stagiaires mais également par leur encadrant. Les gestes techniques hors chirurgie sont réalisés en moins de trois minutes. La chirurgie sera réalisée en moins de cinq minutes.

Devenir

18 poissons par an (90 sur la durée du projet) sont gardés en vie et seront susceptibles d'être réutilisés. 6 poissons par an (30 sur la durée du projet) seront euthanasiés afin de récupérer le matériel implanté.

Remplacement

Ces formations, sous forme d’ateliers pratiques, sont destinées à acquérir la dextérité de gestes techniques pratiqués de manière récurrente dans des projets de recherche. Chaque atelier est précédé d'un cours théorique détaillé, des supports illustrés sont fournis aux stagiaires. Des enregistrements vidéos seront réalisés dès la première session de formation pour servir de support pédagogique aux sessions suivantes. La sédation et l'anesthésie des poissons font parties intégrantes de la formation, l'observation du comportement des animaux étant essentielle dans les phases d'endormissement et de réveil, il est donc indispensable que ces ateliers techniques soient réalisés sur des poissons vivants. L'utilisation de mannequins ou d'animaux morts n'étant pas envisageable, il n’y a pas d’alternatives non animales pour délivrer ces enseignements techniques.

Réduction

Le nombre minimal d’individus est de 1 poisson par stagiaire, et 1 poisson pour l’enseignant, par atelier. Pour chaque procédure, il sera exécuté l'ensemble des gestes techniques sur chaque poisson. Un cours théorique préliminaire aura pour intérêt d’aborder de manière exhaustive la technique enseignée avant la mise en pratique.

Raffinement

Tout sera mis en place dans le cadre des formations pour limiter la souffrance et le stress des animaux. Le protocole de manipulation et d’anesthésie est optimisé et parfaitement maîtrisé par l’enseignant, les gestes techniques hors chirurgie sont réalisés en moins de trois minutes, même en condition de formation de stagiaires, et la chirurgie sera réalisée en moins de cinq minutes. Les animaux seront surveillés scrupuleusement tout au long des procédures, par les stagiaires mais également par leur encadrant, ainsi que durant la phase de réveil. Après complète récupération, les poissons seront replacés en condition d’élevage standard avec une surveillance quotidienne durant deux semaines pour s’assurer de leur bien-être.

Choix des espèces

Le bar commun (Dicentrarchus labrax) est un modèle de poisson marin d’aquaculture dont la physiologie et l'élevage sont parfaitement connus et maitrisés. Tous les animaux utilisés seront des individus juvéniles ou adultes. Pour la procédure de marquage intramusculaire, de prise de sang, de biopsie de nageoire et de prélèvement d’écailles, le poids des poissons sera compris entre 100 g (juvénile) et 500 g (adulte). Pour la procédure de contrôle de maturation, collecte d’ovocytes et collecte de gamètes, les poissons seront âgés d’au moins 2 ans et leur poids sera d’au moins 2000 g . Pour le marquage interne, le poids des poissons sera d’au moins 400 g, cette taille permettant le placement des marques.

La montée en température s'arrête quand le poisson perd l'équilibre. 176 médakas vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, tous tués à l'issue. 128 d'entre eux, 64 femelles et 64 mâles, subissent ce test par paires pendant quatre heures au maximum, puis sont mis à mort. Les 48 autres sont tués pour des analyses moléculaires, l'objet déclaré étant de savoir si deux semaines d'acclimatation à une eau plus chaude repoussent la limite thermique de l'espèce.

Objectifs

Les effets du changement climatique sur la biodiversité sont déjà bien visibles. Un des grands défis en écologie est donc d’identifier les effets de ce changement sur la survie des espèces et la biodiversité. Dans cette étude, nous voulons étudier si la tolérance thermique (c.-à-d. la température maximale que peut tolérer un individu) du poisson médaka peut être augmentée après une phase d’acclimatation à des températures un peu plus chaudes. Nous voulons également tester si les effets de l’acclimatation de courte durée se conservent dans le temps. Pour cela, nous voulons conduire des expériences en laboratoire pour tester la tolérance thermique de poissons Médaka provenant de populations élevées à 20°C et à 30°C et exposées à une courte (2 semaines) augmentation de la température. Ces résultats serviront à comprendre si les poissons peuvent repousser leur limite thermique dans le contexte du réchauffement climatique.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances essentielles à propos de l’adaptation des poissons à des températures plus chaudes.

Procédures

Les poissons seront soumis à des manipulations en laboratoire ou en mésocosme comme des transferts entre aquarium ou des pesés corporelles. Ces manipulations sont rapides (1 minute par poisson) et le poisson reste immergé. Les poissons subiront un stress léger avec le réchauffement en mésocosmes. La température des mésocosmes réchauffés ne devrait pas dépasser les 30°C maximum ce qui représente une température non-stressante pour cette espèce de poisson qui vit habituellement en milieu chaud en Asie du sud-est. De plus, nous élevons le médaka à 30°C depuis plusieurs années et les poissons se portent très bien à cette température. Pendant l’expérience de tolérance thermique, les poissons subiront une augmentation rapide de la température. L’expérience durera 4h au maximum pendant lesquelles les poissons seront exposés (par couple) à une montée rapide de la température jusqu’à la perte de l’équilibre du poisson. Les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Tout d’abord, les poissons subiront un léger stress lors des manipulations en laboratoire (transfert entre aquariums, photographie et pesées) ou du réchauffement en mésocosme. Les poissons subiront un stress plus important lors des expériences de tolérance thermique. Néanmoins, ce type d’expérience est pratiqué sur les poissons depuis des décennies et n’entraîne pas de mortalité. Dans notre cas, l’expérience sera de courte durée (4 heures maximum) et les poissons ne feront l’expérience qu’une seule fois.

Devenir

Pour cette expérience, n=176 individus seront utilisés au total pour inoculer les mésocosmes. Parmi ces 176 individus, 128 individus (64 femelles, 64 mâles) seront utilisés pour la mesure de tolérance thermique. Après la mesure de CTmax, ils seront mis à mort. Les 48 autres individus qui n’auront pas servi aux mesures de CTmax seront également mis à mort pour des analyses moléculaires. De plus, tous les individus seront stockés dans une banque de tissus pour des analyses ultérieures.

Remplacement

L'écologie a pour objet l'étude des populations et des écosystèmes. Il n'est donc pas possible de substituer des cellules ou des tissus à des individus pour de telles recherches. Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné qu’il s’agit d’étudier les réponses comportementales et physiologiques des poissons.

Réduction

Nos lignées de poisson Médaka élevées depuis plusieurs générations à des températures contrastées représentent une opportunité unique de tester l’adaptation à la température dans le contexte du réchauffement climatique. Pour les mesures de tolérance thermique, nous prévoyons d’utiliser 128 poissons. La mesure de tolérance thermique aura lieu 2 fois, une première fois directement après le réchauffement puis une seconde fois 2 semaines après mais ce ne seront pas les mêmes individus qui seront utilisés pour les 2 sessions (pour réduire la quantité de stress infligée à un seul poisson). Puisque les mâles et les femelles ont des réponses physiologiques différentes, il est nécessaire de tester les deux sexes (mâles et femelles). Notre choix pour ce nombre de poisson est justifié par des tests statistiques qui indiquent que l’on doit tester 128 poissons pour pouvoir détecter une différence entre les traitements.

Raffinement

Les animaux sont hébergés selon les standards prévus par la règlementation, en groupes sociaux, dans un environnement adapté et enrichi. En effet, les médakas sont élevés dans des mésocosmes de grande taille (1000L de contenance par mésocosme), en groupes sociaux (11 individus par mésocosmes), et leur environnement est enrichi (bordures des mésocosmes bleues opaques pour limiter le stress, présence de substrat naturel au fond, de végétation aquatique et algue, et alimentation uniquement constituée d’organismes vivants (zooplancton naturellement présent dans les bacs et le substrat)). Pour les transferts entre aquarium (durée : 30 secondes), nous utilisons un bac de 2L avec un fond noir pour ne pas stresser les poissons. Les poissons sont également immergés pendant les pesées et celles-ci durent moins d’une minute et sont effectuées sous lumière tamisée. Les mesures de tolérance thermique seront les plus courtes possible (4 heures maximum). Les poissons seront par deux au sein d’un même aquarium et pourront observer leurs congénères dans les aquariums voisins ce qui permettra de diminuer leur niveau de stress. Nous contrôlerons les paramètres abiotiques (température et oxygène) et stopperons l’expérience si la montée en température n’est pas conforme au protocole (1°C par 10 minutes) ou si la saturation en oxygène dissout < 85%.

Choix des espèces

Nous avons choisi le médaka car il vit naturellement dans les milieux peu profond et riches en nutriments, typiquement les rizières (d'où le nom du genre, Oryzias). Ces milieux sont très chauds en été et très froids en hiver. Ils sont donc naturellement très rustiques. Nous utiliserons des poissons adultes à l’optimum physiologique (âgés de 200 jours) correspondant à un standard concernant les mesures physiologiques puisque ces dernières peuvent différer selon l’âge des poissons.

Remis à l'eau sur leur lieu de capture, 9 070 des 9 200 poissons annoncés dans ce projet sont déclarés rendus vivants au milieu, l'écart de 130 individus restant sans explication dans le résumé. Les procédures impliquent un niveau de souffrance légère pour 9 150 poissons et modéré pour 50 d'entre eux, capturés par 126 traits de chalut de fond de trente minutes par an. Les esturgeons européens, espèce en danger critique d'extinction, sont anesthésiés puis marqués par pit-tag intramusculaire et marque transmusculaire, biopsiés à la nageoire, échographiés, photographiés et, pour 70 à 75 % d'entre eux, soumis à un lavage gastrique provoquant des spasmes pour faire régurgiter leur contenu stomacal. Le porteur estime à une cinquantaine par an les esturgeons capturés et juge cet effectif "raisonnable pour une espèce en danger critique".

Objectifs

Le projet consiste à réaliser un suivi des populations de poissons en milieu estuarien et plus particulièrement, celui d’une espèce de poisson en danger critique d’extinction, qui a bénéficié d’un plan de sauvegarde national et de soutiens via des programmes européens, l’esturgeon européen. Ces mesures ont permis de maîtriser la reproduction en captivité de ce dernier et de lâcher dans le milieu naturel des juvéniles issus de ces reproductions pour soutenir la population sauvage. Afin de connaître l’évolution de cette nouvelle population dans son milieu naturel et d’évaluer le succès de ces pratiques de repeuplement, un suivi régulier doit être mis en place. Celui-ci sera réalisé dans le milieu estuarien puisque c’est là que ces poissons vont séjourner plusieurs années avant de partir grossir en mer et de revenir en estuaire pour entamer leur migration de reproduction jusqu’aux frayères fluviales. Les possibilités de trouver des individus seront donc beaucoup plus importantes dans ces endroits qu’en pleine mer. L’espèce ayant décliné avant l’acquisition de connaissances la concernant, il est nécessaire de mieux documenter son écologie en milieu naturel (régime alimentaire, croissance, structure en âge, préférences environnementales, migrations). Lors de précédentes campagnes d’échantillonnage, une procédure-pilote de marquage et de monitoring de quelques spécimens par marque satellite a permis de documenter pour la première fois leur comportement en mer ainsi que leurs migrations entre l’estuaire et la mer. Depuis ces dernières années, quelques grands spécimens adultes ont été observés dans les fleuves (déclarations de pêcheurs professionnels), mais il n’y a aucun signe de reproduction naturelle à ce jour. Mis à part la description de sites de frayères historiques potentiels, le comportement de reproduction de l’espèce reste inconnu. Pour l’étudier, nous nous proposons de remplacer la procédure de marquage satellite par des marquages acoustiques chez quelques grands spécimens, ce qui permettra de suivre par télémétrie leurs trajectoires pour la reproduction jusque dans les fleuves.

Bénéfices attendus

L’esturgeon européen (A. sturio) ayant décliné avant l’acquisition de connaissances, il est important de mieux documenter son écologie en milieu naturel. Ce projet permettra la collecte de données sur les régimes alimentaires, structures en âge des populations, croissance, préférences environnementales, migrations. Outre leur intérêt fondamental, les résultats informeront sur l’évolution, dans son milieu, de cette population soutenue et permettront d’évaluer le succès des pratiques de repeuplement. Suite au repeuplement dans le bassin versant de plus de 1.7 M de juvéniles d’esturgeon européen entre 2007 et 2015, les individus sont actuellement en âge de se reproduire. Durant les campagnes d’échantillonnages précédentes, le marquage de grands spécimens avec des marques satellites a documenté pour la 1ère fois leur comportement en mer et leurs migrations trophiques entre l’estuaire et la mer. Cette procédure-pilote s’est avérée très informative. La modélisation des données est en cours pour reconstituer les trajectoires maritimes a posteriori ; les 1ers résultats sont encourageants mais nécessitent une analyse approfondie avant d’envisager la pose de nouvelles marques satellites. Ces dernières années, quelques grands spécimens adultes ont été observés dans les fleuves par des pêcheurs professionnels, mais il n’y a aucun signe de reproduction naturelle. Nous supposons qu’il s’agissait d’individus mâles en exploration et qu’il n’y a pas encore eu de remontée d’individus femelles. Excepté la description de frayères historiques potentielles suite aux concentrations d’individus observées par le passé, le comportement de reproduction de l’espèce reste inconnu. Le marquage par télémétrie acoustique d’une dizaine d’autres grands spécimens entre septembre 2024 et juin 2025 permettra de suivre en continu sur les prochaines années leurs trajectoires jusqu’aux fleuves. Grâce au monitoring dans les fleuves et à l’embouchure de l’estuaire, nous disposerons d’informations sur la migration de reproduction et le retour en mer des individus (trajets, périodes, vitesses). L’intérêt est l’obtention de données individuelles 1/ complémentaires, indépendantes des captures accidentelles déclarées sur la base du volontariat car l’espèce est protégée, 2/ sans avoir besoin de recapturer le poisson et 3/ sur le long terme (jusqu’à 6 ans), certains individus pouvant se reproduire chaque année ou tous les deux ans.

Procédures

Tous les 2 mois (6 campagnes/an), un échantillonnage piscicole par chalutage de fond est réalisé dans des secteurs estuariens adjacents aux fleuves dans lesquels les juvéniles d’A. sturio ont été déversés. Il s’agit de recapturer ces individus pour estimer l’évolution de leur abondance et connaître les autres populations de poissons présentes pour identifier les interactions possibles. Par campagne sont réalisés 21 traits de chalut, d’une durée de 30 min. A chaque trait, toutes les espèces présentes sont identifiées le plus rapidement possible, en les maintenant humides ou immergées (viviers), puis relâchés sur le lieu de capture. S’il s’agit d’A. sturio, on renseigne leur nombre, longueur, poids, état et numéro des marques d’identification s’ils en sont déjà dotés au moment de la capture. Si ce n’est pas le cas, les individus sont marqués pour identification (Pit-tag interne et marque numérotée externe) et de petits morceaux de nageoire sont prélevés pour réaliser des analyses génétiques (origine repeuplement ou sauvage) et isotopiques (utilisation des habitats) et estimer leur âge (durée de ces marquages et prélèvements : 2 à 3 min). En fonction de leur état, on réalise une échographie (maturité, sexage), une photographie (morphologie générale) et un lavage gastrique (exploration du régime alimentaire) (durée totale de ces 3 manipulations moins de 10 min). S’ils ont un poids suffisant, une marque à mémoire externe enregistrant température, oxygène et salinité du milieu est fixée à la base des écussons dorsaux pour documenter leurs préférences environnementales (moins de 5 min pour la pose de cette marque). Les plus gros spécimens sont aussi dotés d’une marque acoustique pour suivre leurs trajectoires, posée en interne (cavité abdominale) ou externe (à la base des écussons dorsaux) selon la date de capture et l’avancée présupposée de la maturation (environ 5 min pour cette manipulation). Pour toutes les manipulations, les esturgeons européens sont anesthésiés.

Impact sur les animaux

Ces effets sont liés au stress de capture, voire de stabulation et biométrie (confinement, émersion). La durée de chalutage est de 30 min pour limiter les blessures des poissons prélevés. Les esturgeons européens peuvent aussi subir du stress et/ou blessures occasionnés par les actes expérimentaux successifs suivants : 1) marquage individuel (Pit-tag en intramusculaire et marque numérotée en transmusculaire) et 2) prélèvements de tissus de nageoires, qui peuvent entrainer des blessures tissulaires de type plaie cutanée, mais qui ne sont pratiqués que si nécessaire (i.e. individu échantillonné pour la 1ère fois) ; 3) échographie (état de maturité, sexage) et photographie (morphologie générale), qui bien que non invasives, ne sont opérées qu’en fonction de l’état du poisson ; 4) lavage gastrique provoquant des spasmes transitoires facilitant la régurgitation du bol alimentaire, fait seulement si l’individu est en bon état ; 5) selon sa taille, pose d’une marque DST externe (fixée à la base des écussons dorsaux pour éviter d’endommager la musculature) et 6) pour les plus gros poissons, pose d’une marque acoustique interne (intra-abdominale) ou externe (à la base des écussons dorsaux) si l’individu est en période de reproduction et auquel cas, il n’est pas doté d’une DST.

Devenir

Etant donné que le projet porte sur le suivi des espèces piscicoles de l’estuaire et notamment sur le suivi, dans son milieu, de la population soutenue d’esturgeon européen, l’objectif de l’étude ne peut pas être atteint en dehors du milieu naturel. A l’issue des procédures, les poissons sont remis en liberté dans leur secteur de capture, ce qui est couvert par une autorisation préfectorale. Les esturgeons européens sont traités à part en priorité (biométrie, échographie, marquage d’identification, prélèvements tissulaires et lavage gastrique). Ils sont ensuite conservés en vie. Ceux dont l’état ou la taille ne permet pas un marquage supplémentaire (avec marque à mémoire et/ou marque acoustique), seront remis à l’eau rapidement sur leur lieu de capture. Il en sera de même pour les plus gros individus qui auront été marqués. De par l’objectif de l’étude, il est nécessaire de relâcher les esturgeons européens marqués au niveau de leur secteur de capture afin d’étudier la population en milieu naturel. La décision du moment du lâcher est prise par les intervenants qui sont formés à l’expérimentation animale et à la pratique de la chirurgie expérimentale. Ce moment sera fonction de l’état du poisson au réveil (reprise d’un comportement de nage normal). Nous bénéficions de toutes les autorisations réglementaires pour impliquer dans ce projet cette espèce d’esturgeon qui est protégée.

Remplacement

Aucun remplacement des poissons étudiés ne peut être effectué puisque les données recherchées ne peuvent être fournies que par les espèces elles-mêmes vivant dans le milieu naturel. Comme indiqué précédemment, afin de connaître l’évolution, dans son milieu, de la population soutenue d’A. sturio et d’évaluer le succès des pratiques de repeuplement mises en place dans le cadre du PNA, un suivi régulier doit être réalisé dans des secteurs estuariens adjacents aux fleuves dans lesquels les juvéniles d’esturgeons européens ont été déversés. Il s’agit de recapturer ces individus pour estimer l’évolution de leur abondance et connaître également les autres populations de poissons présentes dans l’estuaire pour identifier les interactions possibles. Par conséquent, pour réaliser le suivi des populations piscicoles estuariennes et en particulier, de l’état de la population soutenue d’esturgeons européens, il est nécessaire de capturer les poissons pour pouvoir les dénombrer (estimer les abondances), les mesurer, les marquer (suivi individuel de croissance), les équiper de marques spécifiques (étude des déplacements et des préférences environnementales).

Réduction

D’après les échantillonnages historiques, on peut s’attendre à capturer en moyenne une cinquantaine d’esturgeons européens par an au grand maximum. Tous seront marqués individuellement pour identification afin d’avoir un suivi le plus exhaustif possible de la population. En effet, étant donné la faible abondance de l’espèce (soutien de population) et de l’effort de capture ciblant l’espèce relativement faible (campagnes bimestrielles en estuaire, captures accidentelles par des pêcheurs), le taux de recapture attendu est faible (150 cm pour les marquages acoustiques de géniteurs). Cela représente sur l’année environ 10-15 individus marqués avec une DST dont une dizaine par acoustique. Les effectifs capturés dans l’estuaire peuvent varier d’une année à l’autre en fonction notamment des actions de repeuplement. D’après nos estimations, l’effectif envisagé correspond en moyenne, à l’échelle de l’année, au nombre d’animaux qui ont un poids supérieur au poids minimal requis pour le marquage sur le maximum d’individus possible, et il peut être considéré comme raisonnable pour une espèce en danger critique telle que l’esturgeon européen.

Raffinement

- 21 traits de chalut de fond par campagne (soit 126 traits/an) sont effectués dans des secteurs médian et aval chalutables de l’estuaire en suivant 2 grilles d’échantillonnages légèrement décalées alternativement d’une campagne à l’autre. Cela représente environ 1 % de la surface totale de l’estuaire subtidal (i.e. les secteurs non soumis au marnage), soit un impact sur le fond de l’estuaire qui nous parait négligeable sachant que ce dernier est par ailleurs soumis à des dragages réguliers et importants pour les besoins de la navigation. - La durée de chalutage de 30 min est fixée sur la base d’échantillonnages historiques qui mettaient en évidence qu’elle limitait les blessures des poissons prélevés. A la remontée du chalut, les poissons sont réceptionnés sur un matelas, et transférés dans un ou des viviers alimentés en circuit ouvert. - Quelle que soit l’intervention, l’A. sturio est anesthésié au préalable pour limiter stress et douleur (les dosages du produit anesthésiant sont adaptés à sa taille et au type d’intervention). Durant les manipulations, il est immergé, ou alimenté, via un tuyau, d’anesthésique à dose sédative ou arrosé d’eau claire de l’estuaire (maintien humidité cutanée). L’ensemble est réalisé avec le plus grand soin par des intervenants ayant une bonne expérience de ces pratiques et parfaitement conscients de la fragilité de l’espèce. Après son réveil dans un vivier alimenté en eau courante de l’estuaire bien oxygénée et sa reprise d’un comportement de nage normal, l’A. sturio est relâché sur le lieu de capture à l’aide d’un toboggan. Les procédures seront adaptées à la situation : réduction si l’individu est blessé ou maigre et/ou s’il y a beaucoup d’individus, pas de lavage gastrique chez ceux marqués par acoustique.

Choix des espèces

- Etant donné que l’étude porte sur le suivi des espèces piscicoles de l’estuaire, l’ensemble des espèces capturées sont identifiées et traitées. En plus des esturgeons européens (Acipenser sturio), on s’attend à capturer en majorité les espèces suivantes : mulet-porc (Chelon ramada), maigre (Argyrosomus regius), anguille européenne (Anguilla anguilla), bar franc (Dicentrarchus labrax) et bar moucheté (Dicentrarchus punctatus), flet (Platichthys flesus), merlan (Merlangius melangus), sole (Solea solea), sprat (Sprattus sprattus), anchois (Engraulis encrasicolus), gobies (Pomatoschistus spp.), raie bouclée (Raja clavata), alose feinte (Alosa fallax) et grande alose (Alosa alosa), congre (Conger conger), lamproie marine (Petromyzon marinus), ainsi que 2 espèces d’esturgeons exotiques suite à des échappements de piscicultures : l’esturgeon sibérien (Acipenser baeri) et l’osciètre (Acipenser gueldenstaedti). - En fonction des espèces capturées et de la saison, il s’agira de poissons de stades juvéniles ou adultes. Pour l’esturgeon européen, il s’agira de juvéniles de plus d’un an. Il est également possible que des adultes en migration de reproduction (âge> 12 ans) soient capturés.

Amputés d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, baignés deux nuits dans un colorant sans nourriture, anesthésiés chaque semaine pendant trois semaines pour des séances d'imagerie, 1 832 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Tous seront tués à la fin du projet. Les poissons porteurs de la mutation étudiée développeront des malformations du crâne et de la colonne, que le porteur annonce sans en faire un critère d'exclusion, l'objectif étant de vérifier qu'une mutation repérée chez des enfants de petite taille cause bien la maladie. Il présente pourtant le poisson comme permettant des approches "largement non-invasives", tout en indiquant que le prélèvement de nageoire à trois jours entraîne aujourd'hui une importante létalité.

Objectifs

En étudiant 400 enfants de petite taille, il a été identifié une nouvelle mutation génétique responsable d'une maladie caractérisée par une petite taille et des malformations du squelette de la tête. Si le rôle de ce gène dans le développement squelettique a déjà été décrit, il n'a jamais été associé à une maladie humaine. Le développement d'un modèle animal est indispensable à la fois pour confirmer la pathogénicité de cette mutation et pour déterminer les mécanismes responsable de cette maladie. Par conséquent l’objectif de ce projet consiste à l’établissement et à la caractérisation d’un modèle de poisson-zèbre exprimant cette mutation afin d’étudier l’impact de la mutation sur le développement du squelette de la tête.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux définir le rôle d'une protéine au cours du développement squelettique. L’utilisation du poisson zèbre permet de développer une approche novatrice pour comprendre les mécanismes impliqués dans les maladies entrainant des défaut de la croissance osseuse . La compréhension de ces mécanismes est essentielle pour l’étude des pathologies osseuses et la mise en place de stratégies thérapeutiques permettant une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Un prélèvement d'un bout de nageoire, sera réalisé sous anesthésie (1 minute) sera effectué sur certains poissons. Certains poissons seront baignés 2 fois dans un colorant pendant une nuit à chaque fois hors flux sans nourrissage Certains poissons seront imagés 1fois/semaine pendant 3 semaines (3 minutes environs). Certains poissons subiront une injection intrapéritonéale sous anesthesie (5 minutes maximum).

Impact sur les animaux

Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d'intérêt, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. D'autre part, les poissons au cours des différentes procédures subiront des stress relatifs 1/ aux anesthésies répétées lors de l’acquisition d’images hebdomadaires, 2/ aux colorations in vivo, 3/ aux isolements nécessaires pour les acquisitions d’images et pour le génotypage des poissons, 4/au prélèvement d’un fragment de 1mm de la nageoire caudale sous anesthésie générale et 5/ à une injection intrapéritonéale sous anesthésie générale.

Devenir

L'ensemble des poissons de ce projet seront mis à mort à la fin de ce projet car l’ensemble des analyses auront été réalisées soit au court des procédures soit seront réalysees en post mortem.

Remplacement

Le développement du squelette est un mécanisme complexe impliquant différent types cellulaires interconnectés. Son développement est une suite d’évènements influencé par de multiples paramètres physiologiques et environnementaux. De ce fait, il est pour le moment impossible de modéliser parfaitement son développement in vitro, et le recours à l’expérimentation in vivo reste incontournable. Néanmoins l'utilisation du poisson comme espèce modèle permet cependant des approches largement non-invasives sans nécessité d’intervention chirurgicale.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour chaque manipulation est basé sur notre expérience au laboratoire. Ce nombre a été pour chaque protocole déterminé afin d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour l’obtention de résultats significatifs en prenant compte de la variabilité de la croissance des poissons observé au cours de précédents projets du laboratoire. Selon l'expérience, les tests d'ANOVA, de Mann Whitney et de Student seront réalisés. Au cours de la procédure 3 afin d’une part d’augmenter la puissance statistique et d’autre part de réduire le nombre d’animaux utilisé, les acquisitions d’image seront réalisées sur le même animal à différents temps. Nous mettons en place actuellement le prélèvement de la nageoire des poissons pour génotypage à 3 jours post fécondation au sein de l'animalerie. A l'heure actuelle ce geste entraine une importante léthalité et nécessite une amélioration. Néanmoins au cours de ces 5 prochaines années, la mise en place de cette technique permettra de réduire le nombre d'animaux par procédure.

Raffinement

Les poissons seront élevés à 28°C dans une eau ayant un pH de 7 avec des cycles jour/ nuit de 14/10h et nous veillerons à fournir un enrichissement aux poissons grâce à l'apport de nourriture vivante et à maintenir un enrichissement social. Des malformations squelettiques sont attendues pour l’ensemble des poissons exprimant la mutation d’interet, l’apparition d’une déformation du squelette crâniofacial et axial ne sera pas un critère éliminatoire. Dans le cas d’un défaut mandibulaire trop important, l’analyse des poissons se limitera à l’analyse des premières étapes du développement crâniofacial jusqu’à 5 jours post fecondation). Dans le cas d’un défaut mandibulaire modéré à faible, Les bacs à surveiller seront indiqués, le comportement des animaux face à la nourriture sera analysé quotidiennement lors du nourrissage par les animaliers. D’autre part l’apparition de symptômes morphologiques ou comportementaux sera suivie et les poissons seront scorés quotidiennement tout au long de leur croissance. Seuls les poissons nécessaires à la création, au maintien des lignées et à l’analyse du squelette post mortem aux stades adultes seront génotypés à 3mois post fécondation sous anesthésie générale en présence d’un analgésique. A la suite du génotypage, les poissons sont mis sous analgésiques pendant 48h. L’acquisition d'image nécessaire au cours des procédures d'imagerie in vivo sera réalisée avec un microscope permettant de réduire au maximum le temps d'acquisition (environ 1min) et par conséquent la durée de l'anesthésie. Le milieu aqueux utilisé pour maintenir les poissons dans la bonne position pendant l’acquisition permet de garder la peau humide, alimente les branchies en eau et oxygène, et limite l’impact sur la peau et les écailles évitant ainsi les suffocations.

Choix des espèces

Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette dela tête. Le squelette de la tête présente de nombreuses similitudes entre le poisson zèbre et l’homme, aussi bien au niveau de sa structure, des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués au cours de son développement. De plus, l'existence de poissons exprimant des protéines fluorescences dans les cellules participant à la formation osseuse permettent d'observer par simple microscopie in vivo (méthode non invasive) les différentes populations cellulaires impliquées dans la formation osseuse. L’analyse du squelette se fera du stade larvaire (7jours post fécondation (jpf) ; formation du squelette pharyngé) jusqu’au stade adulte. Le poisson zèbre ayant une croissance continue tout au long de sa vie il est important d’observer l’evolution du phénotype squelettique à des stades tardifs ( 1 semaines, 2 semaines, 3 semaines, 1 mois, 3 mois et 6 mois).