Poissons
Edition du genome de poisson zebre par CRISPR-Cas9 en vue de creation de lignees
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Le génome de ces poissons est modifié par CRISPR-Cas9 pour livrer des lignées stabilisées à des laboratoires privés ou publics, clients de la prestation, qui réaliseront ensuite leurs propres expériences. 6 500 poissons zèbres sont utilisés dans des procédures déclarées légères et sévères, ceux qui portent le génotype recherché étant gardés comme géniteurs, les autres tués. Chacun subit une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, et le porteur reconnaît que les modifications génétiques apportées peuvent être physiquement dommageables, occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Il décrit une espèce dont les femelles pondent jusqu'à 200 œufs par semaine et qui atteint l'âge adulte en trois mois, l'élevage d'un grand nombre d'individus étant "aisé".
Objectifs
Ce projet a pour but de créer des lignées génétiquement modifiées par la technique CRISPR-Cas9 sur le modèle poisson-zèbre pour des laboratoires privés ou publics dans le cadre de prestations. Les lignées stabilisées seront alors délivrées à l’organisme demandeur pour réaliser ses expériences. Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. En 3 mois il atteint l’âge adulte et est capable de se reproduire. Les femelles peuvent pondre jusqu’à 200 œufs par ponte et ce chaque semaine. Son développement externe permet la micro-injection et donc facilite les procédures d’édition du génome.
Bénéfices attendus
Notre unité d’appui et de recherche a pour mission de fournir de nouvelles lignées de poissons zèbres à la communauté de chercheurs utilisant les modèles poissons zèbres. Les lignées ainsi produites permettront de mieux comprendre la fonction des gènes invalidés (knock-out) ou modifiés (mutations ponctuelles) ou insérés (knock-in).
Procédures
Biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie, de maximum 3 mm², 1 fois par animal. Temps de la biopsie (anesthésie incluse) : environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les modifications génétiques apportées peuvent potentiellement être physiquement dommageables pour le poisson, lui occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Le génotypage, qui s’opère par une biopsie de la nageoire caudale, est réalisé rapidement sous anesthésie en balnéation (pas d’injection traumatisante). Le prélèvement n’impacte que temporairement voire pas du tout l’animal grâce à la régénération totale du membre en quelques jours. Parmi les effets indésirables potentiels nous pouvons donc lister : comportement d'aversion pour l'anesthésique, douleur suite à la biopsie si le geste est mal effectué, comportements de stress (tels que la désorientation) suite au réveil ou à la manipulation à l'épuisette.
Devenir
Les animaux présentant le génotype d’intérêt seront gardés en vie et utilisés comme géniteurs. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt seront euthanasiés.
Remplacement
Notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre pour étudier des phénotypes complexes par exemple des modifications du comportement ou des modifications à l’échelle d’organes entiers, l’espèce animale utilisée ne peut donc être remplacée par des expériences sur cellules ou organoïdes.
Réduction
Une attention particulière sera portée à la gestion du cheptel, notamment via un suivi informatisé, afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaires à la création de lignée. Un bon suivi des lignées permet par exemple d’éviter de produire davantage d’individus alors que des juvéniles sont déjà prêts à être utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Comme le poisson zèbre est une espèce grégaire, il est donc placé en groupe dans les aquariums d'élevage. Pendant le moment où les individus sont isolés (génotypage) les aquariums sont enrichis avec des structures ou objets (algues synthétiques, tuyaux de PVC) permettant aux individus de s’isoler temporairement si nécessaire ou de pallier un manque de compagnie (statut temporaire, généralement durant un séquençage pour identification génétique ou lors d’un isolement dû à une lésion observée sur un animal et qui requiert une convalescence). Deux ou trois congénères au phénotype différent visible (long fin ou nacre) seront également ajoutés à l’aquarium afin de limiter l’isolement pendant la période d’isolement qui n'excède pas deux semaines. Les paramètres de la qualité de l‘eau seront surveillés, ainsi que le bien-être et la santé des poissons. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, modification de la pigmentation. Si des signes de douleur sont observés suite à la biopsie, une administration par balnéation de lidocaïne (analgésique) à 2 mg/L sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. Il permet l’obtention non invasive et indolore de plusieurs centaines d'œufs par ponte nécessaires à la mutagénèse. L’élevage d’un nombre important d'individus est aisé et la caractérisation génétique est peu traumatique. La création de lignée nécessite d’utiliser des animaux en âge de se reproduire, dans notre cas le poisson zèbre atteint ce stade à 3 mois. Ils seront utilisés pour générer une lignée mutante stable afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses expériences sur le modèle. Pour le génotypage, les biopsies des nageoires sont effectuées sur des individus entre un mois et trois mois.
Évaluation de l’efficacité des anesthésiants pour l’euthanasie des poissons zèbres en fonction de leur âge.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Pour déterminer quel anesthésique tue le plus vite les poissons zèbres selon leur stade de développement, 945 individus vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun passe une heure dans un bain d'anesthésique, puis vingt-quatre heures de suivi pendant lesquelles les expérimentateurs observent ses battements de cœur et ses réflexes à trois, six et vingt-quatre heures. Ceux qui survivent peuvent présenter des signes d'intoxication, des difficultés respiratoires ou des troubles de la nage, avant d'être tués au terme des vingt-quatre heures pour cause de détérioration jugée irréversible. Le porteur range ce travail sous le principe de raffinement : neuf méthodes de mise à mort testées sur trois stades de développement, à trente-cinq individus par méthode.
Objectifs
La Directive européenne 2010/63/CE autorise l'euthanasie des poissons par surdose d'anesthésiques ou l'étourdissement électrique. Chez le poisson zèbre, la directive prend effet à partir de 5 jours post-fécondation. Dès lors, la méthode d'euthanasie la plus utilisée dans les laboratoires est la surdose de tricaine (MS-222). Bien que l'efficacité de cet anesthésique soit démontrée chez les poissons zèbres adultes, peu d'informations sont disponibles sur son efficacité pour les stades larvaires, juvéniles. Toutefois, il a été montré que le MS222 est inefficace pour l'euthanasie des poissons zèbres aux stades embryonnaires. La différence d'efficacité du MS222 par rapport aux adultes peut être expliquée par les transitions importantes lors du développement du poisson, liées aux changements métaboliques et au développement des organes, qui peuvent affecter la sensibilité des poissons aux anesthésiants en fonction de leur stade de développement. L'objectif de l'étude est d'identifier des protocoles d'euthanasie respectueux du bien-être animal pour parvenir à l'euthanasie des poissons zèbres, pendant leurs premiers stades de vie, notamment pour les stades larvaires, juvéniles. L'accent est mis sur la réduction de la durée de la procédure et l'amélioration du confort des animaux lors de l'euthanasie. Cette étude s'inscrit dans le cadre du principe de « Raffinement » en expérimentation animale, visant à minimiser la douleur et la détresse des animaux de laboratoire lors de l'euthanasie. Dans cette optique, l'étude vise à déterminer le meilleur choix d'anesthésiant pour garantir une euthanasie rapide et sans souffrance à différentes étapes du développement du poisson zèbre, couvrant les stades larvaires, juvéniles.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer la méthode d'euthanasie la plus efficace et rapide à différents stades de vie des poissons zèbres, tout en minimisant la douleur et la détresse de l'animal. Les résultats de ce projet serviront de base à des recommandations qui seront bénéfiques à la communauté des chercheurs qui travaillent sur le modèle du poisson zèbre en France et en Europe.
Procédures
Les animaux seront soumis à une exposition aux anesthésiques pendant 1 heure par balnéation (dans l’eau de nage), suivie d'une période de suivi de 24 heures. Les battements du cœur et les réflexes des animaux sont observés pendant 1 heure en présence d'anesthésiants, puis pendant 1 heure de récupération. Ensuite, les poissons sont surveillés, pour les mêmes paramètres, trois fois post-récupération : à 3 heures, à 6 heures et à 24 heures. A l’issue de cette période, les animaux seront euthanasiés (24h post-exposition).
Impact sur les animaux
Lors de la phase de récupération, les animaux peuvent présenter des signes d'inconfort ou des effets indésirables, notamment des signes d'intoxication, tels que des difficultés respiratoires ou des troubles de la nage.
Devenir
Étant donné que l'exposition aux surdoses d'anesthésiants pendant une heure pourrait entraîner une détérioration irréversible et un inconfort prolongés des animaux, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.
Remplacement
L'étude dont il est question vise à trouver des méthodes d'euthanasie qui soient rapides, efficaces et qui minimisent la souffrance des animaux. Le remplacement des animaux par des modèles in vitro ou in silico n'est pas possible dans ce cas. En effet, ces modèles ne permettent pas de reproduire l'expérience de l'euthanasie chez les animaux. Ils ne peuvent donc pas être utilisés pour évaluer l'efficacité et la sécurité des protocoles d'euthanasie.
Réduction
La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Nous aurons ainsi besoin de 35 individus pour chaque méthode d'euthanasie, totalisant ainsi 315 individus pour les neuf méthodes. En testant ces méthodes sur les trois stades de développement, nous utiliserons un total de 945 animaux sur une période de 5 ans. Cette approche nous permettra d’obtenir des données statistiquement valides et une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergements des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont enlevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères (nourriture vivante), ce qui leur permet de chasser. Les poissons sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Un suivi des animaux rigoureux sera effectué avec attribution de note qui dicteront des actions (point limites). Les poissons zèbres sont maintenus à une température de 26 degrés Celsius. Les poissons sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est largement utilisé dans la recherche scientifique, notamment en raison de la transparence de ses larves et de sa génétique similaire à celle des humains. L'euthanasie par immersion de surdose d'anesthésiants est une pratique courante pour ces poissons. Bien qu'elle soit efficace chez les adultes, aucune étude n'a encore évalué son efficacité aux premiers stades du développement du poisson zèbre. Notre objectif est de déterminer l'efficacité de différents agents anesthésiques pour l'euthanasie des poissons zèbres à trois moments clés de leur développement : la formation des organes (embryons), l'acquisition des comportements sociaux (larves) et la transition de la larve au stade juvénile. En étudiant l'euthanasie par immersion de surdose d'anesthésiants à ces moments critiques du développement du poisson zèbre, nous pourrons mieux comprendre leur efficacité et garantir une euthanasie sans douleur pour ces animaux. Cette étude contribuera à améliorer les pratiques d'euthanasie des poissons zèbres dans les laboratoires de recherche.
Etude du rôle de gènes du système immunitaire chez les lamproies
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Capturées en rivière par lots de dix, transportées en bacs aérés puis anesthésiées à la benzocaïne le lendemain, jusqu'à 150 lamproies de Planer subissent un prélèvement de gamètes d'environ deux minutes. Elles sont ensuite tuées par une dose létale du même produit, sans reprise de conscience. Les embryons obtenus servent à inactiver des gènes du système immunitaire, pour éclairer l'évolution de ce système chez les vertébrés. Le porteur justifie la mise à mort par la biologie de l'espèce, qui ne se reproduit qu'une fois dans sa vie avant de mourir, alors que ces individus ont été prélevés dans le milieu naturel et n'y retourneront pas.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de tester la fonction de gènes du système immunitaire des lamproies en inactivant ces gènes dans des embryons. Les lamproies sont des vertébrés anciens (environ 500 millions d’années) et l’étude de leur système immunitaire permet de comprendre l’évolution de ce système chez l’ensemble des vertébrés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension du fonctionnement du système immunitaire des lamproies et donc à plus grande échelle il contribuera à améliorer les connaissances sur l’évolution de ce système chez les vertébrés.
Procédures
Les gamètes seront prélevés sous anesthésie sur chaque individu, en une seule fois (durée = environ 2 minutes).
Impact sur les animaux
Le moment de stress le plus élevé est probablement celui subi au moment de la capture en milieu naturel. Les lamproies sont ensuite placées et transportées dans des bacs aérés à température de la rivière afin de minimiser le stress thermique. Au laboratoire, l'environnement artificiel peut représenter une nuisance pour les animaux mais des abris sont placés dans les bacs afin que les lamproies puissent s’y réfugier. Lors des fécondations in vitro, les nuisances potentielles sur les individus (stress ou douleur) sont minimisées par l'anesthésie par balnéation.
Devenir
Les animaux sont mis à mort après le prélèvement de gamètes car la lamproie de Planer ne se reproduit qu'une seule fois dans sa vie puis meure.
Remplacement
Ce projet d'étude des gènes du système immunitaire des lamproies nécessite de disposer d'embryons de lamproies et ne peut pas se faire à partir, par exemple, de cultures cellulaires.
Réduction
Le nombre de géniteurs utilisés (15 mâles et 15 femelles / an pendant 5 ans, soit 150 au total) est le nombre nécessaire afin de disposer de 1800 larves à élever. Chaque femelle produit de 300 à 600 œufs mais parfois les femelles sont surmatures et le sperme de certains mâles est de mauvaise qualité. De plus, les géniteurs étant prélevés en milieu naturel, la variation de survie entre les pontes est élevée. Pour avoir 1800 larves à élever (larves modifiées et contrôles), il faut disposer environ du double d’œufs, soit environ 4000. En théorie, 12 femelles peuvent produire cette quantité mais étant donné les fortes variations de qualité individuelle des géniteurs, 15 sont nécessaires. Néanmoins, comme nous procédons par lots de 5 mâles et 5 femelles capturés dans la nature (procédure répétée 3 fois), si après la deuxième capture (soit 10 mâles et 10 femelles) nous disposons d’assez d’œufs (soit environ 4000 œufs) nous ne capturerons pas de géniteurs supplémentaires cette année-là. Le nombre de 30 géniteurs / an est donc un maximum et moins d’individus seront utilisés si la cible d’environ 4000 œufs est atteinte avec moins de géniteurs.
Raffinement
Pour minimiser le temps passé en captivité par les individus, les captures en milieu naturel ont lieu en plusieurs fois : 3 sessions avec 10 individus capturés à chaque fois (5 mâles et 5 femelles). Seuls des individus en bonne état sanitaire seront collectés sur le terrain et utilisés pour la récupération de gamètes. Le milieu de stabulation des lamproies est enrichi avec des abris (tuyaux ou briques). Les fécondations in vitro ont lieu le plus rapidement possible après la capture, en général le lendemain. Pour réaliser les fécondations in vitro, les individus seront anesthésiés par balnéation à la benzocaïne, les gamètes récoltés, puis les individus seront mis à mort par balnéation avec une dose létale de benzocaïne.
Choix des espèces
Les lamproies sont des vertébrés anciens (environ 500 millions d'années), l'idée de ce projet est de comprendre le fonctionnement de leur système immunitaire en vue de mieux comprendre l'évolution de ce système chez l'ensemble des vertébrés. La lamproie de Planer (Lampetra planeri) est l’espèce de lamproie la plus abondante et ayant le meilleur statut de conservation en France : préoccupation mineure selon l’Union Internationale de Conservation de la Nature. Des individus adultes seront utilisés pour produire les gamètes nécessaires au projet.
Mise en place d’un dispositif d’identification par radiofréquence chez le poisson clown
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
Une puce de radiofréquence de douze millimètres de long injectée dans la cavité abdominale : trois poissons clowns nés en captivité subissent cette procédure, déclarée de souffrance modérée, et sont ensuite gardés vivants dans une structure d'aquariologie. Ils sont anesthésiés par balnéation, marqués, puis placés une semaine dans un bassin de 100 litres pour vérifier que les antennes détectent bien la puce. Le porteur reconnaît un risque de complications inférieur à 5 %, comprenant inflammation de l'abdomen, infection, ulcération et perforation d'un organe interne. Ce test doit préparer le marquage de trente poissons clowns sauvages en Polynésie française, dont l'étude en milieu naturel rend selon lui l'usage d'animaux "incontournable".
Objectifs
L'objectif du projet de doctorat est de travailler sur la structure sociale des poissons clowns, qui vivent en symbiose mutualiste avec les anémones de mer. Parmi les traits biologiques généraux communs aux 28 espèces d'anémones, une caractéristique particulière est l'organisation de leur hiérarchie de taille à l'intérieur d'une colonie "classique" composée d'une anémone de mer, d'un couple monogame reproducteur et de zéro à quatre juvéniles immatures non reproducteurs. Néanmoins, d'autres types d'assemblages ont été décrits dans la littérature comme de "grandes colonies", composées de manière atypique d'agrégations de plusieurs anémones de mer dans lesquelles 2 couples au moins et des juvéniles vivent ensemble, que l'on peut trouver principalement au Japon et en Polynésie française. Le terme de "mégacolonie" a été récemment introduit pour décrire toutes les colonies à l'exception des colonies "classiques". L'organisation des mégacolonies remet en cause ce que l'on sait de celle des colonies classiques notamment en ce qui concerne la sexualité et la reproduction, la hiérarchie, les territoires et toutes les interactions entre les individus. Ce projet de thèse vise à étudier l'organisation sociale et spatiale des poissons clowns vivant en mégacolonies en Polynésie française et au Japon, en analysant le statut écophysiologique des populations de poissons clowns et les conséquences sur leur système neuroendocrinien. Dans l'objectif de répondre à la première problématique concernant l'organisation spatiale des poissons clowns, il est nécessaire de pouvoir établir un suivi de leurs déplacements au sein d'un champs d'anémones. Cette problématique sera étudiée sur les mégacolonies de Polynésie française. La turbidité élevée de l'eau à ces endroits et la surface des zones étudiées ne permettent pas un simple suivi de leurs déplacements par l'utilisation de caméras. Afin de récolter des données précises quant à leurs mouvements au sein des territoires, ce projet vise à utiliser un dispositif de télémétrie d'Identification par Radio Fréquence (RFID) avec l'implantation de puces (2,12x12mm) par injection dans la cavité abdominale des poissons clowns adultes. Les mouvements des poissons équipés de puces pourront ainsi être précisément détectés et enregistrés par des antennes reliées à des lecteurs placées au sein du champs d'anémones de mer.
Bénéfices attendus
Acquérir des mesures précises quant aux déplacements des adultes au sein des territoires du champ d'anémones de mer nous permettrait de mieux comprendre la gestion des territoires par les individus, et de mieux comprendre la hiérarchie sociale au sein des mégacolonies de poissons clowns.
Procédures
Une première phase de test est prévue en laboratoire, afin de vérifier la détection de la puce RFID (identification par radio-fréquence) par les antennes. Trois individus poisson clowns (A. frenatus) reproduits et élevés en captivité, seront anesthésiés par balnéation (MS222) et équipés d'une puce RFID et placés dans un bassin de 100L d'eau de mer artificielle en présence des antennes afin d'enregistrer leurs mouvements. Cette expérimentation est prévue sur un intervalle d'une semaine. La deuxième phase du projet consiste à utiliser ce dispositif en milieu naturel sur les mégacolonies en Polynésie française.
Impact sur les animaux
La survie liée à l'injection intra-coelomique de puces RFID est jugée optimale pour des poissons de taille supérieure à 6cm selon plusieurs études scientifiques. Ainsi, aucun individu adulte ou juvénile de taille inférieure à 6cm ne sera considéré dans cette étude. L'emplacement de l'injection dans la cavité intra-coelomique ne gêne pas les mouvements natatoires du poisson. Enfin, l'enveloppe en verre de la puce est conçue pour ne pas se dégrader, il n'est pas nécessaire de retirer par chirurgie la puce à l'issue de l'expérimentation. Même si elles sont rares, des complications post-injection, de l'ordre inférieur à 5%, peuvent survenir avec des degrés de gravités différents (inflammation de l'abdomen, infection, ulcération, perforation d'un organe interne). Tous les actes pré- et post-opératoires sont réalisés de sorte à minimiser les risques de survenue de ces complications. L'absence de ces effets, et plus généralement l'absence de toute indication d'inconfort, seront systématiquement vérifiés par un examen à un et deux jours après l'injection des animaux ayant subi cette procédure, vérification d'absence d'anomalie de l'abdomen (gonflement, infection), vérification que les comportements natatoires sont normaux.
Devenir
Phase 1 : Les 3 individus seront gardés en captivité au sein de la structure d'Aquariologie de Banyuls-sur-mer. Phase 2 : Les 30 individus ayant subi successivement les deux procédures resteront dans leur milieu naturel.
Remplacement
Les mégacolonies représentent une structure particulière ne pouvant pas être reproduites en laboratoire ou modélisées. Afin d'étudier les déplacements des poissons clowns au sein de ce type de structure (deuxième phase), il est indispensable de suivre directement et précisément leurs déplacements en milieu naturel à l'aide d'un système de télémétrie. Ainsi, le modèle animal et en particulier l'utilisation des poissons clowns en milieu naturel est donc le plus prédictif et le plus pertinent pour espérer comprendre ce processus d'organisation sociale. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l'utilisation d'animaux vivants par des méthodes alternatives. De fait, l'utilisation du modèle animal est incontournable.
Réduction
Toutes les procédures expérimentales qui seront mises en oeuvre ont été optimisées statistiquement, de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés et prélevés dans la nature tout en obtenant des résultats significatifs (3 individus pour la première phase de test, et 15 couples (soit 30 adultes) pour la mégacolonie durant la deuxième phase en Polynésie Française. L'approche expérimentale choisie est la plus optimale pour enregistrer les mouvements des poissons clowns tout en minimisant l'impact sur leur état physiologique.
Raffinement
Durant la première phase de test, une attention particulière sera accordée au bien être des individus via la présence de personnel compétent 7j/7j pour l'observation et le soin des animaux. Concernant la deuxième phase, pour minimiser tout stress avant anesthésie des poissons en milieu naturel, les animaux ne seront pas sortis de l'eau et seront directement anesthésiés sous l'eau à l'aide d'eugénol. Les deux marquages se feront rapidement en simultané après la capture de l'animal et celui-ci sera relâché près de son anémone de mer et surveillé pendant plusieurs minutes jusqu'à récupération complète de ses fonctions natatoires. Afin de réaliser une intervention rapide et la plus précise possible, la personne compétente réalisera plusieurs injections intra-coelomiques de puces RFID et d'injections sous cutanées d'élastomères en entraînement sur des poissons non vivants récupérés dans le commerce. De plus, la survie liée à l'injection intra-coelomique de puces RFID a été étudiée et jugée optimale pour des poissons de taille supérieure à 6cm. Ainsi, aucun individu adulte ou juvénile de taille inférieure à 6cm ne sera considéré dans cette étude. L'emplacement de l'injection dans la cavité abdominale ne gêne pas les mouvements natatoires du poisson. Enfin, l'enveloppe en verre de la puce est conçue pour ne pas se dégrader, il n'est pas nécessaire de retirer par chirurgie la puce à l'issue de l'expérimentation.
Choix des espèces
Depuis plusieurs années, les poissons clowns sont un excellent modèle d'étude dans les domaines de l'écologie, de l'évolution et du développement. La symbiose établie entre les poissons clowns et leur anémone de mer et en particulier l’organisation hiérarchique de ces poissons représentent un intérêt majeur pour ce projet. La structure particulière en mégacolonie n'ayant été observée jusqu'à présent uniquement chez cette famille, les poissons clowns représentent un modèle de choix pour comprendre l'organisation sociale. Afin de réduire au maximum les effets indésirables mais non délétères de l'implantation d'une puce dans la cavité abdominale d'un individu, seulement des individus juvéniles et adultes de plus de 6cm sont sélectionnés.
Impact de l’hyperglycémie sur la réparation cérébrale chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour mesurer comment l'hyperglycémie freine la réparation du cerveau, 280 poissons zèbres adultes vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyse de leurs tissus. 140 relèvent de procédures menées sous anesthésie sans réveil, 140 d'un niveau de souffrance léger. Une partie des animaux passe quatorze jours immergée dans une eau sucrée à 20 grammes de glucose par litre, renouvelée deux fois par jour, et 140 subissent une lésion du cerveau sous anesthésie, l'acte durant moins de quinze secondes. Le porteur n'attend aucune nuisance notable tout en reconnaissant que la littérature ne rapporte pas cette information, et fixe comme points limites des nages en cercle, une flottabilité anormale, une couleur anormale ou l'incapacité de se nourrir.
Objectifs
Le diabète est une maladie caractérisée par une hyperglycémie chronique (glycémie à jeun supérieure à 1,26g/L). Cette pathologie constitue un enjeu majeur de Santé Publique à l’échelle mondiale car sa prévalence augmente depuis plusieurs décennies. De façon intéressante, il a été démontré que le diabète/hyperglycémie était associé à une perturbation de l’homéostasie cérébrale (trouble de la mémoire, perte de substance grise) favorisant les accidents vasculaires cérébraux et aggravant leurs conséquences neurologiques. Ainsi, la condition d’hyperglycémie semble être délétère pour le fonctionnement du cerveau. Plus largement, lors des dommages cérébraux, l'hyperglycémie/diabète a un impact négatif sur la taille des lésions et la récupération fonctionnelles (élocution, locomotion, sensibilité, ...). Cependant, les impacts réels de l'hyperglycémie sur les mécanismes propres à la réparation cérébrale ne sont pas bien connus. Les objectifs du projet sont de comprendre l'impact de l'hyperglycémie sur les mécanismes de réparation cérébrale en utilisant le poisson zèbre. Cet animal est un modèle reconnu de plasticité et de réparation cérébrales. C'est aussi un modèle permettant de mimer des situations d'hyperglycémies chroniques. Dans ce contexte, nos sous-objectifs sont de déterminer l'impact de l'hyperglycémie sur la mort cellulaire à la suite d'une lésion cérébrale, (2) sur l'angiogenèse régénérative (création de nouveaux vaisseaux), (3) sur le recrutement de la microglie (cellule immunitaire du cerveau) au site de la lésion, et enfin (4) la neurogenèse régénérative permettant de générer de nouveaux neurones pour remplacer ceux qui sont morts à la suite de la lésion.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu et affectés par l'hyperglycémie lors d'un dommage cérébral. Il pourrait permettre d'identifier des problèmes de réparation induite par l'hyperglycémie (ex: suractivation microgliale, problème d'activation des cellules souches). Ainsi, cette meilleure compréhension du fonctionnement régénératif en condition hyperglycémique pourrait permettre de mettre en œuvre des thérapies favorisant ou limitant ces processus (ex: limiter la mort cellulaire, limiter la neuroinflammation, favoriser la neurogenèse). A terme, ce projet a pour but de favoriser la réparation cérébrale dans des conditions qui lui sont délétères (ex: hyperglycémie) afin de limiter les conséquences de dommages cérébraux.
Procédures
La moitié des animaux (soit 70) sera plongée dans de l'eau contenant du D-glucose (20g/L) afin de mettre en place une hyperglycémie chronique chez ces derniers. Ce traitement est effectuée pendant une période de 14 jours. La solution eau/D-glucose dans laquelle sont immergés les animaux est renouvellée 2 fois par jour (une fois le matin et une fois le soir). L'eau des animaux contrôles est également changée deux fois par jour pour respecter les mêmes contraintes expérimentales (cela se fera donc sur les 70 animaux contrôles). Les animaux seront soumis à des lésions cérébrales (140 animaux) avant la fin de l'expérimentation pour étude de la mort cellulaire induite par la lésion cérébrale (1 jour après lésion, soit lésion à J13), de l’angiogenèse et réactivité des microglies (2 et 3 jours après lésion, soit lésion à J11 et J12) et neurogenèse (3 jours après lésion, soit lésion à J11). La durée de la lésion est de moins de 15 secondes une fois l'animal anesthésié. La durée totale anesthésie, lésion et réveil est inférieure à 5 minutes.
Impact sur les animaux
Des expériences précédentes sur les modèles de lésions chez le poisson zèbre n'ont pas révélé de nuisances notables (ex: surmortalité, troubles du comportement, stress, douleur). Il en est de même sur les modèles d'hyperglycémie chez le poisson zèbre. Aussi, même si des lésions cérébrales chez le poisson zèbre hyperglycémique pourraient impacter certains processus régénératifs, nous n'attendons pas de nuisances et/ou effets indésirables par rapport aux données précédentes de la littérature pour lesquelles ces informations importantes n’ont pas été rapportées, ni même observées au laboratoire.
Devenir
A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés pour analyse tissulaire par immunohistochimie.
Remplacement
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de la réparation cérébrale ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de réparation impliquent plusieurs types cellulaires: microglies, oligodendrocytes, macrophages, cellules endothéliales, neurones, et cellules souches neurales. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de la réparation : hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.
Réduction
Chaque expérimentation sera scindée dans la mesure du possible en deux expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le deuxième groupe d'animaux. De part notre expérience et les données de la littérature, de tels effectifs permettent de fournir des données statistiques solides. Nous réaliserons des tests statistiques (t-test) pour déterminer la significativité de nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront observés plusieurs fois par jour dans leur milieu contrôle et/ou hyperglycémique. Après lésion, ils seront observés de façon intensive dans les premières 30 minutes, puis une fois toutes les heures. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal sera assuré. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Différents points limites spécifiques tels qu'un comportement anormal (mouvements circulaires), nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), flottabilité anormale, couleur anormale seront analysés. Si un de ces paramètres ou points limites est atteint, nous en ferons part au vétérinaire pour arrêt de l’expérimentation et par conséquent euthanasie pour limiter les souffrances de l’animal (sédation profonde puis euthanasie). Les données bilbiographiques et notre expérience ne montre pas de signes de souffrance, stress, modifications majeures du comportement alimentaire et locomoteur à la suite de la balnéation dans le glucose ou de la lésion. Nous resterons néanmoins vigilants sur l'ensemble des points limites.
Choix des espèces
Le poisson zèbre partage de 70 à 85 % de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement. La situation diabétique (d'hyperglycémie) peut être mimée en mettant les animaux dans de l'eau supplémentée en D-glucose. De plus, c’est également un modèle de réparation cérébrale reconnu avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères. Animaux adultes entre 3 mois et 18 mois. A ces stades, les activités neurogéniques sont globalement similaires.
Impact de différentes procédures de prélèvements sanguins sur la truite Arc-en-ciel et durée de régénération sanguine
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
Nage sur le dos, apathie, lésions cutanées, exophtalmie bilatérale sévère : ces signes déclenchent le retrait de l'étude et la mise à mort par surdosage d'anesthésique. 108 truites arc-en-ciel de plus de 300 grammes vont être utilisées dans des procédures classées sévères, toutes tuées à l'issue. Elles subissent des ponctions répétées du sinus veineux de la queue sous anesthésie générale, de une à trois le premier jour, une autre vingt-quatre heures plus tard, puis une tous les quinze jours pendant dix semaines. L'objet du projet est de déterminer combien de sang on peut prélever à une truite et en combien de temps elle le régénère, afin de produire un référentiel pour les prélèvements des futures expérimentations sur les poissons, le porteur relevant lui-même l'absence de tout consensus sur la question.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de déterminer les conditions à respecter pour mettre en place des suivis sanguins longitudinaux dans les protocoles d’expérimentation animale sur poissons (volume de sang à prélever, temps de régénération sanguine, qualité de la régénération sanguine). Ce travail permettra de proposer un référentiel quant à la réalisation de prélèvements sanguins pour la truite Arc-en-ciel, assurant un respect à la fois de la physiologie particulière de l’animal, de la qualité des résultats expérimentaux obtenus et du bien-être animal. Dans le cadre de la règle des 3R, ce nouveau référentiel garantira à la fois une réduction du nombre d’animaux utilisés (les suivis longitudinaux nécessitant moins d’animaux) et un meilleur raffinement expérimental (influence de prises de sang répétés sur les résultats).
Bénéfices attendus
L’absence de consensus quant au volume de sang que l’on peut prélever sur une truite, et quant à la vitesse de régénération sanguine dans cette espèce, est une contrainte majeure pour rédiger des protocoles expérimentaux plus en phase avec les exigences actuelles de réduction du nombre d’animaux utilisés, et de raffinement des protocoles expérimentaux. Ce projet a vocation à répondre aux questions suivantes : - Quel volume de sang peut-on prélever chez la truite Arc-en-ciel, en prélèvement unique ? en prélèvement multiple ? - Quelle est la durée de régénération sanguine chez la truite Arc-en-ciel à 14 °C, en fonction de la quantité de sang prélevée ? - Comment évolue la composition sanguine (maturité, taille et quantité des hématies) au cours du temps suite à un prélèvement sanguin ? Cette étude participera à l’établissement de nouvelles recommandations pour les poissons en expérimentation animale (le poisson est l’animal le plus utilisé en expérimentation animale après la souris).
Procédures
Les animaux seront soumis uniquement à des prélèvements sanguins répétés, tous effectués sous anesthésie générale, par un personnel qualifié et expérimenté. En fonction des groupes, il y aura de un à trois prélèvements sanguins le premier jour. Ensuite, tous les poissons seront prélevés une seule fois 24h plus tard, puis une fois tous les 15 jours pendant 10 semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances prévues sont les ponctions de sang répétées dans le sinus veineux caudal, sous anesthésie générale. La douleur correspond à la piqure d’une aiguille. Les cinq libertés individuelles de l’animal, telles que définies par l’OMSA, seront assurées tout au long de la procédure, grâce à un personnel formé et expérimenté et une station expérimentale adaptée aux besoins spécifiques de ces animaux. Dans la mesure où il n'existe aucun consensus quant à la possibilité de réaliser des prises de sang répétés chez la truite, ni de référentiel quant au volume de sang effectivement ponctionnable pour cette espèce, il a été décidé de classer cette procédure en catégorie sévère dans un premier temps, suite à des échanges avec le comité d'éthique. Une réévaluation sera réalisée postérieurement.
Devenir
Les animaux seront euthanisiés à la fin de la procédure.
Remplacement
L’objectif étant d’évaluer l’impact clinique, zootechnique et biologique de prélevements de sang plus ou moins importants ou de prélèvements répétés chez la truite Arc-en-ciel, cela ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n’existe pas actuellement de modèle qui permettrait de s’affranchir de ces manipulations.
Réduction
Pour ce projet, nous avons calculé le nombre minimum de poissons nécessaires pour répondre à la question de recherche autour de la quantité de sang qui peut être prélevée chez la truite Arc-en-ciel. Pour ce faire, nous avons utilisé une méthode statistique s’appuyant sur des données hématologiques préliminaires. Chaque poisson sera identifié par puce électronique, ce qui permet de réduire le nombre de poissons qui seront utilisés dans le cadre de cette expérimentation, par rapport à une approche qui ne s’appuierait que sur des moyennes de groupe. Par ailleurs, il n’y aura pas de lots pour lesquels serait réalisé un prélèvement de sang délibérément excessif (pas de groupe témoin positif) : chaque procédure évaluée devrait permettre de conclure sur la durée de récupération des animaux, et l’absence d’effets significatifs sur leur santé.
Raffinement
Les animaux sont observés deux fois par jour durant toute la durée du protocole. Les points limites sont : (1) les paramètres d’ambiance de l’élevage (oxygène, qualité de l’eau). Les paramètres de températures et d’oxygénation sont mesurés en permanence via des sondes. La qualité de l’eau (pH, teneurs en nitrites et en nitrates) est vérifiée chaque semaine ; (2) la santé des poissons. Les poissons seront qualifiés de moribonds si l’on observe l’un des signes suivants : nage sur le dos, apathie, lésions cutanées significatives, ou exophtalmie bilatérale sévère. Dans ce cas, les animaux seront retirés de l’expérimentation et euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Dans les bacs, la densité en poissons sera limité, environ 20 kg/m3. Par ailleurs, chaque bac est enrichi de tubes permettant aux poissons de se cacher. Enfin, le choix des volumes de sang que l’on pourrait prélever chez la truite, a été défini en s’appuyant sur des travaux antérieurs sur le poisson, et également sur des travaux plus récents menés chez les mammifères.
Choix des espèces
La truite Arc-en-ciel est l’espèce modèle de notre structure d’expérimentation animale. C’est un salmonidé d’eau douce. Les salmonidés sont les espèces piscicoles les plus fréquemment rencontrées en aquaculture en Europe. La truite est également un modèle habituel dans les laboratoires d’expérimentation animale. Les truites utilisées pèseront plus de 300g. Ce poids a été retenu pour deux raisons. D’une part, le volume minimal pour conduire les examens hématologiques est de 0,2 mL, ce qui représente 0,07% du poids vif d’une truite de 300g. De ce fait, un poids en début d’étude significativement inférieur à 300g pourrait trop influencer les résultats attendus. D’autre part, du fait de la contrainte de la station aquacole (taille des bassins), il ne nous est pas possible de loger des truites Arc-en-ciel de poids trop important en nombre suffisant. Or la croissance à cet âge est importante. Nous travaillons donc classiquement avec des truites de ce poids en début d’étude, pour prendre en compte leur croissance sur des suivis de longue durée (plusieurs mois). De ce fait, les résultats enregistrés correspondront aux animaux sur lesquels sont habituellement conduites les études expérimentales. A ce poids (300g), les animaux sont considérés comme physiologiquement proches des animaux d’un poids plus élevé (hors période de gamétogenèse).
Evaluation de la franchissabilité d’une passe à poissons
- Conservation des espèces
- Protection de l’environnement
1 600 poissons sauvages, barbeaux, brèmes, aspes, hotus et anguilles européennes, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous relâchés dans le fleuve après leur marquage. Capturés à la nasse ou par pêche à l'électricité, ils passent moins de quinze minutes dans un bac anesthésiant, sont mesurés, pesés, marqués par l'injection d'un transpondeur en deux minutes environ, transportés en cuve puis remis à l'eau après réveil complet. Le marquage doit permettre de vérifier qu'une passe à poissons construite sur un grand fleuve laisse effectivement passer les espèces migratrices. L'ouvrage hydroélectrique qui coupe le fleuve n'est pas en question, seule l'est l'efficacité du dispositif censé le compenser, et le porteur prévoit un succès de franchissement d'environ soixante-dix pour cent.
Objectifs
L’objectif principal de cette étude est d’évaluer, grâce à l’utilisation de la technologie Radio Frequency Identification (RFID) la franchissabilité d’une passe à poissons localisée sur un grand fleuve français. Compte tenu du dimensionnement des ouvrages hydroélectriques présents sur de tels fleuves, les dispositifs de franchissement qui y sont construits relèvent de réels challenges techniques afin de garantir la continuité écologique pour un grand nombre d’epèces ayant des comportements et capacités de nage variés. Il s’agit ici d’analyser le comportement et de suivre le déplacement de différentes espèces de poissons dans un dispositif de franchissement mixte (bassins, rivière pseudo-naturelle, canal de liaison) afin d’en valider la franchissabilité. Les résultats pourront permettre d’orienter la conception d’ouvrages aux enjeux similaires.
Bénéfices attendus
Cette étude doit servir à vérifier la franchissabilité d’une passe à poissons et notamment vérifier que les poissons empruntant le dispositif n’éprouvent pas de réticences comportementales lors de leurs parcours. Les conclusions de cette étude pourraient amener à procéder à des modifications du dispositif de franchissement étudié si des points bloquants pour les poissons devaient être mis en évidence, mais également orienter la conception des futures passes aux enjeux complexes.
Procédures
L’objectif est de capturer puis de marquer à l’aide de transpondeurs (puces d’identification individuelle) 1200 poissons d’espèces holobiotiques (barbeau, brème, aspe, hotu) et 400 anguilles, puis de les relâcher vivants dans le milieu naturel en aval de la passe à poissons à étudier. Les marquages seront répartis sur deux années afin de disposer de suffisamment de réplicats par espèce dans des conditions environnementales variées. Les poissons seront capturés dans le milieu naturel à l’aide de dispositifs de piégeages spécifiques (nasse localisée dans une passe à poisson, pêche à l’électricité) régulièrement employés dans l’étude des peuplements piscicoles et n’induisant pas de blessures. Après leur capture, les poissons seront placés dans des bacs d’eau contenant de l’anesthésiant (temps variable, moins de 15minutes selon l’espèce considérée) afin de pouvoir procéder à leur marquage en résuidant au mieux le stress et la douleur. Une fois anesthésiés, les poissons seront mesurés, pesés et marqués par injection d’un transpondeur. La procédure étant réalisée par des personnels compétents et formés, celle-ci durera environ 2 minutes. Les poissons sont ensuite placés dans des cuves de transport, avec de l’eau régulièrement renouvelée et oxygénée, pour être amenés à l’aval de la passe à poissons à étudier. Une fois réveillés, ils seront relâchés dans le milieu naturel.
Impact sur les animaux
Les animaux vigiles pourront subir un stress au moment de la capture, de leur manipulation avant anesthésie ou bien à l’occasion de leur transport depuis le site de marquage vers les points de lâcher. Les procédures de marquage des poissons seront réalisées sur des individus anesthésiés pour le bon déroulement de la procédure et réduire la douleur chez le poisson. De manière générale, les manipulations et procédures de marquage ne seront réalisées que par des opérateurs compétents, habilités et formés afin de réduire au maximum la durée des phases stressantes ou douloureuses pour les poissons.
Devenir
L’objectif étant d’analyser le comportement des poissons dans une passe à poissons, il est nécessaire que tous les animaux capturés et marqués d’un transpondeur soient relâchés vivants dans le milieu naturel, en aval de la passe dont on cherche à évaluer la franchissabilité.
Remplacement
L’étude vise à étudier la franchissabilité d’une passe à poissons, et donc d’étudier entre autres le comportement des poissons dans le dispositif de franchissement. Leur comportement est intégrateur de facteurs biologiques (instinct, anatomie et physiologie), environnementaux (température de l’eau, luminosité, débit, autres individus présents dans la passe) et physiques liés au dimensionnement de la passe à poissons elle-même (vitesses, hauteurs de chute, etc..). Les poissons sont ici au centre du questionnement ; il n’est donc pas envisageable de remplacer le modèle animal dans cette étude.
Réduction
Le rétablissement de la continuité écologique est une obligation règlementaire qui doit bénéficier à un maximum d’espèces avec des comportements et capacités de nage variés. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, seules 5 espèces ont été retenues (barbeau, brème, hotu, aspe, anguille européenne) parmi plus d’une vingtaine empruntant ce type de dispositif. Ces espèces ont été choisies car elles comptent parmi les plus abondantes dans le fleuve où est implantée la passe à poissons étudiée, ont des capacités de nage variées et ont déjà été utilisées dans le cadres d’études similaires (comportements attendus bien documentés). Le nombre d’individus minimum nécessaire prend en compte le nombre d’espèces, de paramètres environnementaux étudiés, la large gamme de dimensionnement de l’ouvrage de franchissement (de 500 à 2000m3/s), les taux de redétection des individus marqués attendus (50% en moyenne) ainsi que les succès de franchissement de l’ouvrage attendus (70% environ). L’effectif total par espèce est réduit au maximum mais doit permettre de disposer d’un nombre d’individus suffisant franchissant le dispositif pour garantir des analyses statistiques robustes afin de vérifier la significativité des facteurs comme l’espèce, la rive de relâcher ou le choix des entrées sur les différentes métriques caractérisées (taux de retour, succès de franchissement, temps de franchissement). Ainsi, sur la base des études précédentes, environ 300 poissons pour chacune des 4 espèces de cyprinidés seront étudiés ainsi que 400 anguilles. Au total, un maximum de 1600 poissons sera étudié, réparti sur deux campagnes de marquage.
Raffinement
Capture : Les poissons seront capturés dans des passes à poissons au printemps, période propice à l’activité migratoire. Plusieurs méthodes non dommageables aux poissons ont été retenues pour leur complémentarité : nasse de piégeage et pêche à l’électricité. Stabulation (post capture et réveil) : Les poissons utilisés dans le cadre du projet seront maintenus dans des conditions de stabulation optimales : grand volume d’eau renouvelé et provenant directement du milieu dans lequel ils ont été capturés pour garantir une bonne oxygénation et une température stable. L’anguille étant une espèce lucifuge, les individus seront mis en stabulation à l’obscurité. Manipulations : Seront retenus pour l’étude les poissons présentant un état sanitaire satisfaisant (non moribond, absence de malformations, blessures majeures…). Les manipulations des poissons et leur marquage seront réalisés sous anesthésie afin de limiter au mieux la douleur et le stress au moment de la procédure. Des points limites sont établis au préalable et régulièrement vérifiés pendant la durée de la procédure. L’objectif est de retirer des procédures (avant marquage par exemple) d’éventuels individus ayant une mauvaise réaction à l’anesthésie, de s’assurer du bien-être des animaux à toutes les étapes du protocole. Dans le cas où un poisson présenterait un ou des signes cliniques sévères, l’individu pourra être euthanasié selon un protocole défini en amont. Enfin, les poissons ne seront relâchés dans le milieu naturel qu’après réveil complet (retour à une nage normale, absence de perte d’équilibre), vérification visuelle du rythme respiratoire et réactions aux stimulis extérieurs (fuite). Transport : Afin de garantir de bonnes conditions de transport des poissons marqués jusqu’au site de lâcher, l’eau de transport sera alimentée en continu en oxygène et un anesthésiant sera utilisé afin de diminuer le stress et la douleur (diminution de la consommation d’oxygène, pas de choc sur les parois des cuves).
Choix des espèces
Les espèces étudiées sont le barbeau fluviatile, la brème commune, l’aspe, le hotu et l’anguille européenne. Des comptages réalisés sur les passes à poissons ont montré que ces espèces totalisent plus de 90% des migrations dans le fleuve où est implantée la passe à poissons étudiée. Ces espèces présentent des comportements et capacités de nage différentes dont le franchissement de passe à poissons a déjà été documenté ce qui permettra des comparaisons. Elles sont suffisamment abondantes pour envisager des analyses statistiques robustes. Dans le cas des espèces holobiotiques (barbeau, brème, hotu, aspe), les individus étudiés seront des adultes en recherche active d’habitats favorables à leur reproduction. Pour l’anguille, espèce migratrice amphihaline se reproduisant en mer, le stade biologique concerné par l’étude est l’anguille jaune ; juvénile en migration de montaison pour coloniser le bassin en recherche de zones de grossissement.
Développement d’une méthode pour estimer les abondances de larves de lamproies
- Conservation des espèces
Aspirées dans les sédiments d'une rivière par un prototype d'échantillonnage, 1 000 larves de lamproies sauvages vont être utilisées, 500 relâchées après anesthésie et mesure, 500 tuées parce qu'elles mesurent moins de cinq centimètres et ne peuvent être identifiées qu'après analyse génétique. Le porteur anticipe les blessures que son dispositif peut causer, des œdèmes, des plaies et des hémorragies, des dommages à la colonne vertébrale, et prévoit de tuer tout individu blessé ou dont le comportement reste anormal après l'anesthésie. La lamproie marine est classée en danger d'extinction en France, la lamproie fluviatile vulnérable, et le projet vise à mettre au point une méthode d'échantillonnage en eau profonde pour mieux gérer ces populations. Rien n'indique combien de larves le dispositif devrait blesser, ni sur quelle base l'effectif de 1 000 a été fixé, la rubrique réduction se limitant à décrire le plan de prospection.
Objectifs
Mise au point d’une méthode d’échantillonnage d‘ammocètes (larves de lamproies) en rivière dans des milieux profonds. La lamproie marine Petromyzon marinus est une espèce migratrice dont une partie du cycle de vie s’effectue en rivière reproduction et phase larvaire), alors que sa principale phase de croissance se déroule en mer. A l’état d’ammocètes, cette espèce comme les larves d’autres espèces de lamproies passent les premières années de sa vie enfouie dans le sédiment avant de se métamorphoser et rejoindre la mer. Menacée par différentes pressions (rupture de continuité écologique, développement de prédateurs exotiques…), la lamproie marine voit ses populations décroitre à l’échelle nationale et au-delà. Pour tenter d’enrayer cette diminution, des plans de gestion basés sur une bonne connaissance des habitats et de la répartition des animaux dans les cours d’eau doivent être mis en œuvre. Si les types d’habitats utilisés par les ammocètes sont globalement décrits (bancs de sédiments fins), la dynamique spatiale des premiers stades en rivière reste largement méconnue. Une des hypothèses avancées serait que les larves de lamproie marine colonisent, au fur et à mesure de leur développement, des milieux de plus en plus profonds situés en aval des zones de frayères. Actuellement, aucune méthode satisfaisante ne permet d’échantillonner efficacement les habitats en eau profonde (> 50 cm). Ce projet, vise à tester un prototype d’échantillonnage des ammocètes de lamproies marine dans ces habitats « profonds ».
Bénéfices attendus
Disposer d’une méthode d’échantillonnage des larves de lamproies pour 1) la déployer et produire des connaissances sur l’état des populations de lamproies, 2) identifier les habitats larvaires de ces espèces et 3) proposer des plans de gestion adaptés à la préservation de ces animaux en eau douce.
Procédures
Le temps pour atteindre l’anesthésie est d’environ 2 min. La manipulation de biométrie (et la détermination pour les individus >à 5cm) est ensuite réalisée en quelques secondes.
Impact sur les animaux
Blessures éventuelles causées par la méthode de prélèvement. Nous pensons que les blessures que nous pourrons observer seront des œdèmes, des plaies et hémorragies, ou des dommages à la colonne vertébrale.
Devenir
A l’issue de chaque procédure les animaux supérieur à 5 cm seront remis à l’eau. Les animaux plus petits ne pouvant pas être déterminés visuellement seront euthanasiés pour être déterminés par analyse génétique.
Remplacement
La mise au point de la technique de prélèvement sera réalisée en bassin sans animaux avec des objets simulant les lamproies (leurres souples), permettant de limiter le nombre d’animaux manipulés. Le test in situ se fera avec des animaux sauvages naturellement présents dans le milieu naturel, l'objectif étant d’étudier les organismes dans leur milieu naturel, le remplacement n’est pas possible pour cette partie du projet.
Réduction
L’objectif est de développer une méthode pour capturer les larves de lamproie. La bibliographie nous indique que ces animaux vivent dans les milieux constitués de vase, de sable et de matière organique (feuilles en décomposition, rameaux). Ces habitats sont nombreux et notre prospection portera sur une infime partie. Nous organisons notre prospection suivant un plan d’échantillonnage de manière à avoir une image de la répartition des ammocètes à l’échelle du cours d’eau.
Raffinement
Le but de ce projet est de développer une méthode de prélèvement permettant de capturer les larves de lamproies sans les blesser. Lors des premiers essais in situ, les animaux seront examinés à la loupe binoculaire pour observer les éventuels lésions occasionnées par le dispositif. Les réglages de l’outil de prélèvement (débit d’aspiration) permettront de réaliser le meilleur compromis entre nécessité de prélever efficacement les lamproies et nécessité de limiter les blessures ou tout autre traumatisme. Le raffinement sera concrètement basé sur les points limite suivants : 1-observation d’éventuelles blessures (tout individu blessé sera euthanasié) et 2-observation du comportement des lamproies avant l’anesthésie (tout individu présentant un comportement post-anesthésie anormal sera euthanasié).
Choix des espèces
Les lamproies sont des espèces menacées, et les connaissances à leurs sujet sont nécessaires pour améliorer leur gestion. En France, la lamproie marine est classée en danger d'exctinction selon les critères de l'Union Internationale pour la Conservation de la Nature (UICN) et la lamproie fluviatile est considérée comme vulnérable. Les animaux seront utilisés au stade larvaire qui se nourrit car c’est celui qui permet d’évaluer le recrutement de l’espèce.
Création et maintien de nouvelles lignées transgéniques de poissons zèbres dans des modèles tumoraux pour l’étude du rôle physio-pathologique des vésicules extracellulaires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Anesthésiés cinq minutes, amputés d'un morceau de nageoire caudale, puis isolés jusqu'à trois jours pour le génotypage, 910 poissons zèbres subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous anesthésie, au stade larvaire, et sont tués au plus tard huit jours après la fécondation. Le porteur écrit avoir réduit à dix le nombre de poissons reproducteurs, tout en prévoyant qu'un grand nombre d'œufs sera produit puis trié avant cinq jours. Les poissons retenus pour perpétuer les lignées sont gardés en vie jusqu'à un an et demi, puis mis à mort.
Objectifs
La communication intercellulaire est indispensable pour réguler les grandes fonctions de l’organisme. Récemment, une nouvelle voie de communication prend une place croissante dans la plupart des processus physiopathologiques : les vésicules extracellulaires. Ces vésicules de 100nm à 1µm sont relarguées par tous les types cellules dans tous les organismes. Leurs propriétés ouvrent de nouvelles perspectives, aussi bien du point de vue fondamentale que thérapeutique, notamment dans leur utilisation comme marqueurs ou véhicules thérapeutiques. Ces vésicules sont impliquées dans la progression des cancers mais leur étude se fait principalement in vitro, du fait que leur taille limite leur étude et utilisation in vivo. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé un modèle de poisson zèbre qui permet de suivre ces vésicules en temps réel, à l’échelle de la vésicule unique par imagerie. L’utilisation du poisson zèbre apparait maintenant comme une solution incontournable pour étudier les vésicules dans la communication entre la tumeur et son micro-environnement, dans une situation la plus physiologique possible que ne permet pas les études in vitro. Notre projet aura pour but de générer différentes lignées transgéniques pour suivre ces vésicules et manipuler leur production et leur ciblage, en exprimant de façon stable des constructions d’ADN modifié. Nous pourrons alors étudier la communication médiée par ces vésicules entre différents types cellulaires et entre ces types cellulaires, des cellules cancéreuses greffées dans les larves obtenues à partir de ces lignées. L’évolution et le maintien de ces lignées seront suivis afin de parer à l’éventuelle apparition de phénotypes dommageables. Pour cela, une observation macroscopique quotidienne sera réalisée dès la microinjection, puis une vérification du génotype sera réalisée à partir du deuxième mois. Par la suite, pour perpétuer ces lignées, une sélection d’animaux reproducteurs sera réalisée après maturité sexuelle qui apparait vers 3 mois. Ces lignées permettront ensuite de caractériser les propriétés biologiques et fonctionnelles des vésicules in vivo en temps réel, dans des protocoles expérimentaux effectués dans des embryons de moins de cinq jours post fertilisation. Ce projet permettra alors une meilleure compréhension de la biologie des vésicules, notamment sur leur rôle dans la propagation des cancers et plus particulièrement dans le cancer de la prostate ou le cancer cérébral (glioblastome).
Bénéfices attendus
La création de ces nouvelles lignées contribuera à une meilleure compréhension de la biologie des vésicules extracellulaires chez l’animal et fournira des données cruciales sur leur rôle dans la progression tumorale in vivo dans un contexte physiologique (flux sanguin, barrière biologique). Nos études sur les embryons de poisson zèbre permettront également d’établir cet organisme modèle comme un modèle préclinique pour tester in vivo le potentiel thérapeutique notamment en tant que véhicules thérapeutiques dans le cadre des cancers.
Procédures
Prélèvement de morceau de nageoire caudale, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes. Isolement pour génotypage, en une fois, pendant 3 jours maximum. Injection de cellules, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes.
Impact sur les animaux
D’après la littérature, aucun phénotype dommageable n’est attendue par l’expression de nos constructions. Bien que peu probable, le ou les phénotypes dommageables pourront se traduire par : l’apparition de malformations de l’animal au cours de son développement (tératogenèse), la formation d’œdème, ou une altération du comportement. Les seules nuisances attendues seront le stress de l’anesthésie, la douleur liée au prélèvement pour le génotypage.
Devenir
A la fin de la procédure 1, les animaux seront toujours utilisés notamment pour maintenir leur lignée et donc perpétuer les futures générations. Cependant, les animaux seront gardés en vie jusqu’à leur un an et demi, après cela, ils seront mis à mort. En ce qui concerne la deuxième procédure, les animaux seront mis à mort après observation de la propagation ou progression des cellules injectées (maximum 8 jours post-fécondation).
Remplacement
Ce projet repose sur la création de nouvelles lignées transgéniques de poissons zèbres pour l’étude du comportement des vésicules extracellulaire en temps réel chez un organisme vivant. En ce sens, aucune méthode de remplacement in vitro n’est possible pour cette question.
Réduction
Dans le but de réduire et selon des calculs de puissance ainsi que des différentes observations concernant le taux d’intégration d’ADN modifié et le pourcentage de survie de nouveaux descendants en général, nous estimons et avons réduit le nombre de poissons à 10, de manière à toujours avoir 90% de chance d’obtenir des différences significatives, bien que la morbidité et viabilité de ces nouvelles lignées transgéniques restent encore inconnues. Dans le but d’obtenir ces 10 poissons, il faut prendre en compte ces différents paramètres de viabilité et morbidité, ainsi théoriquement, un grand nombre d’œufs seront générés, mais seront triés avant les 5 jours post-fertilisation, pour leur expression de l’ADN injecté, de manière à réduire le nombre de poissons nécessaires. Dès l’obtention des 10 poissons avec autant de mâles que de femelles, le génotypage sera stoppé. Dans le cadre des greffes, nos études utilisent des approches de microscopie qui limitent le nombre de poissons à une dizaine de larves de 6 à 8 jours post-fertilisation par expérience.
Raffinement
Afin d’améliorer la qualité de vie des animaux, nous porterons une attention toute particulière à l’apparition très peu plausible de phénotypes dommageables. Nous effectuerons un enrichissement de milieu, notamment par l’utilisation d’un fond imagé lors des accouplements, mais également par l’approvisionnement en plancton une fois par jour, en fonction de la production de plancton au sein de l’animalerie. De la même manière, afin de limiter la souffrance et/ou stress de l’animal lors du prélèvement de nageoire pour le génotypage, un analgésique et un anesthésique seront utilisés. Nous veillerons également à réduire au minimum la quantité du prélèvement, pour cela nous prélèverons un morceau de 1mm au niveau de la nageoire caudale. Un système d’hébergement spécifique au génotypage sera également mis en place et relié au système aquatique, de manière, à ce que les poissons soient séparés les uns des autres mais qu’ils puissent se voir au travers de parois transparentes et bénéficie des mêmes conditions (alimentation en eau donc en oxygène continue) que les poissons hébergés dans le système aquatique. De plus, le temps d’isolement sera le plus court possible, c’est-à-dire le temps de la réalisation des techniques de génotypage, soit maximum 3 jours.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle animal où son développement rapide et en dehors de leur mère permet de réaliser facilement des manipulations génétiques pour l’obtention de lignées dont le génome a été modifié. Du fait de la transparence des embryons, l’observation des organes internes à l’échelle de l’organisme entier est facilitée. Cette caractéristique ainsi que la taille de ce modèle sont un grand avantage pour la visualisation des vésicules extracellulaires (notamment dans les fluides biologiques) et de leur interaction avec des tissus récepteurs. Les poissons seront utilisés jusqu’à leur un an et demi de manière à pouvoir vérifier le génotype de ces poissons, à partir de leur deuxième mois, lorsqu’ils auront une taille suffisamment grande ; mais également pour perpétuer les lignées dont le génome a été modifié, par reproduction sexuée.
Impact des filtres UV issus de crèmes solaires sur le développement larvaire du poisson clown Amphiprion ocellaris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
Toutes anesthésiées, photographiées sous loupe puis tuées au bout de quinze jours, 1 350 larves de poissons clowns vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Réparties par quinze dans des aquariums, elles subissent l'exposition aux résidus de cinq crèmes solaires à quatre concentrations, pour tester si les filtres UV perturbent leur métamorphose. Le porteur attend des malformations, un changement de comportement alimentaire et une gêne des échanges respiratoires liée à l'accumulation de filtres minéraux sur les branchies et la peau. Il retient cette espèce parce que son cycle de vie est entièrement maîtrisé au laboratoire, ce qui permet d'exposer les larves dès l'éclosion.
Objectifs
Les zones littorales connaissent une profonde érosion de la biodiversité marine et une altération des fonctions écologiques des écosystèmes en raison de pressions anthropiques accrues. Or, les écosystèmes marins côtiers jouent un rôle clé de nourriceries pour de nombreuses espèces d’organismes marins, notamment pour des poissons téléostéens. En effet, le cycle de vie de la majorité des espèces de poissons marins est composé de deux phases : une phase larvaire pélagique, suivie de phases juvénile et adulte durant lesquelles les individus intègrent leur habitat côtier définitif. Ainsi, dès leur plus jeune stade de vie, le risque d’exposition à divers stress environnementaux est important, pouvant perturber la transition entre les phases larvaire et juvénile, caractérisée par le processus physiologique sensible de la métamorphose, contrôlée par les hormones thyroïdiennes. Dans ce contexte, notre objectif est d'évaluer la toxicité des filtres UltraViolet (UV) relargués dans les résidus de 5 crèmes solaires différentes sur une espèce de poisson téléostéen marin, le poisson clown Amphiprion ocellaris dont le cycle de vie est maitrisé dans notre laboratoire. D’éventuelles perturbations endocriniennes sur la phase de métamorphose seront recherchées au cours du développement larvaire, par une approche intégrative s’appuyant sur des biomarqueurs de la métamorphose i) anatomiques (croissance, pigmentation), ii) physiologiques (activation de la transcription de gènes de l’axe endocrine hypothalamo-pituitaire thyroïdien, dosages des hormones thyroïdiennes T3 & T4).
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif d’évaluer le rôle des FUV contenus dans les crèmes solaires en tant que perturbateur endocrinien, en observant leur impact sur le développement larvaire d'une espèce tropicale de poisson télostéen. Comprendre quelles sont les répercussions des FUV sur le développement larvaire permet de jauger l'incidence qu'ils peuvent avoir durant la phase cruciale de recrutement larvaire ce qui, à terme pourrait impacter le stock des adultes en milieu récifal.
Procédures
Après éclosion des oeufs les larves seront réparties par 15 dans des aquariums afin d'être exposées aux différentes conditions expérimentales (contrôle ou exposition aux polluants). Après les 15 jours d'élevage, les larves seront individuellement anesthésiées puis photographiées sous loupe binoculaire avant d’être euthanasiées.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux résultent du stress lié à l'exposition des larves d'A. ocellaris aux FUV, un changement de comportement alimentaire, une perturbation du développement larvaire avec l'apparition éventuelle de malformations, ainsi qu’un déréglement des échanges ioniques et/ou de la diffusion de l'oxygène lié à l'accumulation des filtres UV minéraux sur les branchies et/ou la peau des larves.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de l’élevage afin de procéder aux différentes analyses.
Remplacement
L'étude écotoxicologique comprend i) une exposition aux polluants en milieu contrôlé ii) puis le dosage hormonal des larves, iii) et l'analyse de l'expression de gènes cibles. Il s’agit donc de mécanismes non modélisables car s'appliquant à des organismes vivants dans l’intégrité et la complexité qui leur sont propres. Ainsi, aucune expérience in silico ou in vitro ne permet d'accéder à ce type de données. Par conséquent, il n'existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet et l'utilisation du modèle animal est incontournable.
Réduction
La planification du design expérimental a été faite afin de réduire le nombre d’individus échantillonné pour l’ensemble des conditions testées permettant une analyse statistique pertinente, c’est-à-dire en triplicat pour chacune des concentrations de crèmes testées à savoir 5 crèmes FUV * 4 concentrations * 3 (triplicat) = 60 concentrations de FUV. A cela s'ajoute les 2 conditions contrôles (eau de mer et eau de mer avec une crème sans filtre) qui doivent être faite pour chaque ponte élevée. De ce fait, en fonction de la quantité d’œufs par ponte, nous optimiserons l’utilisation de chaque ponte afin de minimiser le nombre de condition contrôle et donc le nombre total d'individu nécessaire à notre projet. De plus, les larves retrouvées mortes durant la période d'élevage ne seront pas remplacées. Nous avons pu réduire notre échantillonnage en adaptant le protocole afin de combiner les mesures morphologiques (patron de pigmentation) et les analyses de biologie moléculaire sur les mêmes individus, au lieu d'utiliser 2 lots d'individus différents pour ces deux types de mesure ce qui aurait doublé le nombre total d'individu utilisé.
Raffinement
Les individus seront élevés selon le protocole développé et maîtrisé au sein de notre service d’aquariologie. Ce protocole a été développé pour que le bien-être des larves soit optimal, permettant une bonne croissance et une bonne survie. Notamment, une attention particulière et quotidienne sera portée tout au long de ce projet sur la température et la salinité de l'eau, deux facteurs importants de source de stress. Par ailleurs, le bien-être des individus sera assuré par un personnel compétent 7J/7J pour l’observation et le soin des animaux. Si toutefois un individu cumul différents points limites tels que le rejet de nourriture, l'hyperactivité ou l'hypoactivité, des comportements inhabituels se traduisant par une perte d'équilibre, alors l'individu concerné sera exclu de la phase expérimentale et sera euthanasié par surdosage d'anesthésique (MS222 tamponné, 200 mg/L).
Choix des espèces
Le poisson clown Amphiprion ocellaris a été choisi comme un modèle adapté pour mener à bien ce projet. En effet, il s'agit d'un modèle pertinent écologiquement pour l'étude du développement larvaire d'un poisson téléostéen tropical caractéristique de milieux pouvant être sujet à la toxicité des filtres UV issus des crèmes solaires. Par ailleurs, le cycle de vie de cette espèce est entièrement maîtrisé au sein de notre laboratoire et permet donc d'exposer les larves aux FUV à des stades précoces de développement. Les larves seront exposées aux FUV de l’éclosion jusqu’à 15 jours post-éclosion. Ce temps d’exposition aux FUV a été défini afin d’évaluer leur impact sur le développement larvaire et plus particulièrement pour réaliser des analyses en encadrant la période de pic de la métamorphose d’A. ocellaris.
Etude intégrative de l’influence du paysage chimique sur les larves de poissons clowns (Amphiprion ocellaris)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Pour mesurer si des larves de poissons clowns préfèrent une eau marquée par des congénères ou par des anémones, 300 larves vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque larve est déplacée au bécher dans un aquarium à deux compartiments, dix minutes d'acclimatation puis vingt minutes de test filmé, avant d'être tuée par surdosage d'anesthésique et congelée pour analyser l'expression de ses gènes. Le porteur affirme qu'aucune expérience in silico ou in vitro ne donne accès à ce type de données et que le recours à l'animal est "incontournable". Une larve qui rejette la nourriture, s'agite, s'immobilise ou perd l'équilibre est retirée de l'expérience, puis tuée si son état se dégrade.
Objectifs
La majorité des poissons des récifs coralliens possède un cycle de vie biphasique comprenant une phase larvaire pélagique suivie d’une phase juvénile et adulte en milieu récifal. Le passage entre la phase pélagique et récifale, appelée recrutement larvaire, constitue une étape clé dans la vie de ces jeunes poissons. Durant cette période cruciale les larves subissent une métamorphose régie par les hormones thyroïdiennes impliquant des changements comportementaux, morphologiques et physiologiques. Ce remodelage intégratif comprend notamment le développement des capacités sensorielles, pouvant contribuer à l’orientation des larves vers leur habitat côtier définitif. Les environnements pélagique et récifal diffèrent notamment par leur paysage chimique, c’est-à-dire un ensemble de molécules chimiques qui émanent des organismes qui les peuplent. Cette différence est notamment le résultat d’une biodiversité riche dans les récifs, avec la présence abondante de différentes espèces de poissons, de coraux, d’anémones dans un espace plus restreint qu'en milieu océanique. L’objectif de ce projet est d’étudier l’influence du paysage chimique au moment de la période de recrutement (15 à 20 jours après l’éclosion des œufs) sur le comportement et la physiologie des larves du poisson clown Amphiprion ocellaris. De cette façon, des eaux caractérisées par différentes signatures chimiques (eau de mer contrôle, congénères ou anémones) seront proposées aux larves afin d'évaluer leur préférence chimique. A la suite de ces tests, nous allons faire des analyses d'expression génique sur ces larves afin d'évaluer l'influence de la présentation de ces signaux chimiques au sein du système nerveux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permet de comprendre l'implication du paysage olfactif lors du processus de recrutement des larves d'A. ocellaris et de cerner les signaux spécifiques impliqués dans l’orientation des larves pour rejoindre leur habitat définitif. Comprendre le processus initial de recrutement des larves est nécessaire pour préserver les populations de poissons de récif coralliens notamment pour, par la suite, évaluer comment un stress d'origine anthropique entraînant une dégradation des récifs coralliens peut altérer cette phase cruciale.
Procédures
Après l'élevage, les larves seront récupérées délicatement à l'aide d'un bécher, afin d'être déposées dans l'aquarium de choix pour une durée de 30 minutes. Le test se déroule en deux partie, une première phase de 10 minutes d’acclimatation des larves dans le compartiment de dépôt, suivi de 20 minutes de test où la cloison qui sépare les 2 compartiments est retirée et les larves sont libres de se déplacer d’un compartiment à l’autre. Les 20 minutes de test sont filmés et serviront à l'analyse comportementale. A la suite du test, les individus seront euthanasiés dans un récipient comprenant une solution d’anesthésique en surdosage (MS-222 tamponné, 250mg/L), puis stockés au -20°C jusqu’aux analyses de biologie moléculaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux résultent du stress lié au déplacement des larves d'A. ocellaris dans un nouvel environnement. En effet, bien que minime, le stress perçu pourrait provenir de la manipulation des larves et de la découverte d'un nouvel environnement avec moins d'espace pour se mouvoir et également moins de congénères que dans le bac d’élevage.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié à la fin de la phase comportementale afin de procéder aux différentes analyses d'expressions géniques de l'axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien (HPT).
Remplacement
L’étude comportementale ainsi que l’analyse d’expression génique sont des mécanismes non modélisables car s’appliquant à des organismes vivants dans l’intégrité et la complexité qui leur sont propres. Ainsi, aucune expérience in silico ou in vitro ne permet d’accéder à ce type de données. Par conséquent, il n’existe aucune méthode alternative à la réalisation de ce projet et l’utilisation du modèle animal est incontournable.
Réduction
L’ensemble de la planification expérimentale, a été fait dans l’optique de réduire le nombre d’individus permettant une analyse statistique pertinente. Compte tenu de la multiplicité des réponses qui semblent possible au cours des 20 minutes de test (aller-retour multiples) nous avons choisi de faire passer 12 tests par condition. Afin de réduire le nombre d’individus utilisés et optimiser leur utilisation, chacun des individus permettra 3 analyses différentes (comportementale, quantification et localisation de l’expression génique).
Raffinement
Dans le cadre du protocole d'élevage larvaire développé dans notre laboratoire nous élevons les larves dans la pénombre et dans un milieu comprenant une algue verte, ce qui rend l'eau turbide et permet aux larves de se cacher. Une attention particulière et quotidienne sera portée sur la température et la salinité de l'eau, deux facteurs importants de source de stress. Pour améliorer la communication 7J/7J, un cahier de suivi des élevages sera mis en place afin de noter les comportements anormaux des individus au fil de l’expérience. Si un individu cumule différents points limites (rejet de nourriture, hyperactivité, hypoactivité, déplacements inhabituels se traduisant par une perte d'équilibre) il sera exclu de la phase expérimentale afin d’être surveillé dans un aquarium contrôle. Si nous remarquons que l'état de l'individu se dégrade, nous prendrons la décision de l'euthanasier par surdosage d'anesthésique (MS222 tamponné, 250 mg/L).
Choix des espèces
Le poisson clown Amphiprion ocellaris a été choisi comme un modèle adapté pour mener à bien ce projet. Il s'agit d'un modèle pertinent pour les études écologiques du recrutement larvaire. La structure sociale et la relation de symbiose établie entre le poisson clown et son anémone hôte apparaissent comme des ressources clés lors de la phase de recrutement larvaire. Par ailleurs, le cycle de vie de cette espèce est entièrement maîtrisé au sein de notre laboratoire. Nous avons choisi de travailler sur des larves en cours de métamorphose âgées de 15 à 20 jours après éclosion des oeufs. Ces stades ont été privilégiés car ils correspondent à la période de recrutement en milieu naturel (passage du milieu océanique au milieu récifal).
Étude de tolérance d’une nouvelle argile en tant qu’additif alimentaire pour l’élevage de la truite arc-en-ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
1 600 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries pendant 90 jours avec trois doses d'argile, 1 200 d'entre elles peuvent perdre l'appétit et du poids, et 64 subissent un test de stress consistant en une minute de pourchasse à l'épuisette suivie de cinq minutes de confinement dans un seau, avant d'être tuées trente minutes plus tard. Les truites sont ensuite disséquées pour analyser leur sang, leurs organes, la composition de leur chair et son goût. Le demandeur est un exploitant et vendeur de substances minérales qui cherche une autorisation de mise sur le marché pour une de ses argiles, et présente l'essai comme démontrant à la fois l'innocuité du produit et son bénéfice pour le "bien-être" des poissons, dont il prévoit pourtant la mise à mort intégrale.
Objectifs
Les argiles sont une famille de minéraux d’origine volcanique, ayant une très bonne capacité d’échange d’ions, les rendant intéressants dans de nombreux domaines (industrie, agriculture, médecine...), et notamment en nutrition animale. Dans ce domaine, ils sont utilisés comme agents de liaison et/ou fluidifiant pour la fabrication d’aliment. De plus, ils améliorent l’utilisation des nutriments et par conséquent les performances de croissance des animaux en élevage. Un exploitant et vendeur de substances minérales, souhaite étudier la faisabilité d’une mise sur le marché d’une de ses argiles à la composition différente de celles déjà autorisées dans l’alimentation animale. C’est pourquoi l’objectif de cet essai est double, il vise à mettre en évidence 1) l’innocuité d’une nouvelle argile pour l’alimentation des poissons, ainsi que 2) son effet positif sur la nutrition et le bien-être animal. Cet essai a été mis en place en tenant compte des exigences de l’Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (EFSA) afin que les données obtenues puissent servir à l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché en tant qu’additif zootechnique pour l’alimentation des salmonidés. Ainsi, un essai d’une durée de 90 jours va être réalisé sur des truites arc-en-ciel de 15 g, au cours duquel des aliments contenant différentes doses d’argiles seront distribuées. En plus d’un suivi d’élevage traditionnel (rationnement, croissance, mortalité) qui visera à la fois à démontrer l’innocuité et l’intérêt zootechnique de l’additif, des analyses sur le sang et les organes des poissons seront réalisées en fin d’essai afin de confirmer l’innocuité de l’additif, et des études sur la digestibilité de l’aliment, son impact sur le stress des poissons et sur la qualité de la chair (composition et dégustation) seront également menées. La truite arc-en-ciel a été choisie comme modèle d’étude en raison de son importance économique en France et dans le monde, de sa sensibilité aux paramètres environnementaux, et du cahier des charges de l’EFSA pour ce type de test (à réaliser sur truite ou saumon).
Bénéfices attendus
Le premier bénéfice attendu de ce projet est que les quantités d’argile incorporées à l’aliment ne mettent pas en évidence d’effets délétères sur les animaux en essais, contribuant à démontrer que cet additif n’a aucun effet néfaste sur la santé des poissons, et qu’il peut faire l’objet d’une évaluation pour autorisation de mise sur le marché. Le second bénéfice attendu est qu’au moins une des doses d’argile testées mette en évidence un intérêt pour l’élevage de la truite, comme de meilleures performances de croissance, une meilleure digestibilité ou une meilleure résistance au stress. Ces bénéfices pour l’alimentation piscicole seraient à moyen terme, puisqu’ils devront être évalués ensuite par l’EFSA avant d’obtenir une autorisation de mise sur le marché.
Procédures
La pêche à l’épuisette, d’une durée inférieure à la minute, sera réalisée 1 fois sur 1536 poissons (transfert dans bac pour mise à mort), et 2 fois sur 64 poissons (changement de bac, puis test de stress). La procédure expérimentale ‘test de stress’ sera réalisée une fois sur 64 poissons, et durera 6 minutes (1 min de pourchasse dans le bac + 5 min de confinement), et sera suivi 30 min plus tard d’une mise à mort.
Impact sur les animaux
Une inappétence, une croissance moindre et une perte de poids pourront être observées sur les 1200 poissons nourris avec un aliment à base d’argile (3 lots de 400 poissons). Ces nuisances sont considérées comme modérées sur une durée de maximum 7 jours. A l’issu des 90 jours d’alimentation expérimentale, 64 poissons seront soumis à un test de stress aigüe (16 poissons par lot, 4 par bac), nécessitant au préalable un changement de bac, suivi d’une acclimatation de 96h. Les nuisances attendues sont le stress généré par ce transfert qui durera 1 minute (pêche à l’épuisette et changement de bac), puis le test de stress en lui-même qui consiste en une chasse à l’épuisette d’une durée de 1 minute, suivi d’un confinement dans un seau pendant 5 minutes. Afin de limiter la production de déjections et d’éviter une pollution de l’eau, notamment pendant la phase de confinement, les poissons ne seront pas alimentés le jour du test de stress. Cette période de mise à jeun sera inférieure à 24h. Cette nuisance est considérée comme modérée en raison du nombre limité de nuisances et de la durée relativement courte des stress induis.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour la réalisation de différentes analyses (sang, organes, composition nutritionnelle, dégustation).
Remplacement
Il n’existe pas à notre connaissance d’expérimentations déjà décrites dont le but est de montrer l’intérêt de cet argile spécifique. L’objectif de ce projet étant de démontrer que ce produit n’a pas d’effet délétère, et qu’il amène des atouts supérieurs en termes de nutrition et de stress par rapport à d’autres argiles, il n’est pas possible d’en faire abstraction. Pour ce type d’approche, il n’existe pas aujourd’hui de méthodes alternatives à l’expérimentation animale.
Réduction
Il a été choisi en amont de ce test de réaliser 4 répétitions de bac pour chaque régime alimentaire. Ce nombre de répétitions est un bon compromis entre l’effort à réaliser au cours de l’étude (en termes de prélèvements, de matériel, de maintiens des animaux) et la puissance statistique permettant de mettre en évidence des différences significatives. Il a également été décidé de n’intégrer à cette étude, que 100 poissons par bac, permettant d’assurer un comportement normal de truites en élevage et la croissance associée, et un nombre d’animaux suffisant aux analyses post-mortem (30 par bac) et associées au test de stress (4 par bac). Ce nombre d’animaux a été réduit au maximum, en tenant compte du nombre de poissons par bassin pour obtenir un optimum pour le bien-être des animaux, tout en assurant la robustesse statistique de l’analyse de données. Ces données seront étudiées paramètre par paramètre.
Raffinement
La procédure expérimentale a été conçue pour minimiser les dommages causés aux animaux. Les pêches et pourchasses de poissons seront réalisées avec des équipements adaptés (bacs et épuisettes) ne risquant pas de blesser les poissons, et la taille des lots de poissons échantillonnés sera réduite à 10 poissons maximum afin de limiter la compression au sein de l’épuisette. Les poissons impliqués dans les mesures de poids moyens seront préalablement anesthésiés puis, suite à la mesure de poids moyen d’une durée inférieure à la minute, mis à récupérer en eau neuve avant d’être replacé dans leur bac d’origine. Les 16 poissons changés de bacs seront acclimatés pendant 96h avant la réalisation des tests de stress. Lors des phases de confinement des tests de stress, une attention particulière sera portée sur le maintien d’une teneur en oxygène dissous supérieur à 90% dans les seaux, via un bullage faible mais continu d’oxygène. De même, la qualité de l’eau utilisée pour le confinement sera identique à celle des enceintes d’élevage. Tout cela afin que seul le volume restreint et donc la charge plus importante en poissons soit de nature à engendrer un stress.
Choix des espèces
L’espèce truite arc-en-ciel a été choisie comme modèle d’étude en raison de son importance économique en France et dans le monde, et de sa sensibilité aux paramètres environnementaux, et du cahier des charges de l’EFSA pour ce type de test. Les animaux utilisés seront des juvéniles de truites arc-en-ciel de 15 g en début d’essai. Cette taille initiale est demandée par l’Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (taille minimale de 10 g en début d’essai pour la truite) dans le cadre d’une étude de tolérance.