Poissons

24 petites roussettes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, douze réintroduites en mer et douze, nées en captivité, tuées à l'issue. Chaque individu passe seize heures en chambre de respirométrie pour mesurer sa consommation d'oxygène puis subit une biométrie sous anesthésie courte, pour calibrer un modèle qui doit prédire la taille des populations de requins et raies ovipares en 2100 selon deux scénarios climatiques. Le porteur décrit une méthode non invasive et revendique un projet destiné à terme à remplacer l'expérimentation animale par la modélisation. Il indique que les individus capturés en mer ont de fortes chances de survivre au relâcher, les jeunes éclos en captivité étant tués selon la réglementation.

Objectifs

A partir d’un nombre très limité d’individus (24 au total) et d’une procédure légère (respirométrie statique à flux intermittent, méthode non invasive communément employée chez les poissons), le projet doit permettre la mise au point d’une approche couplée de bioénergétique et de modélisation qui doit permettre de prédire la taille des populations de petite roussette (Scyliorhinus canicula) en 2100 dans le cadre de 2 scénarios climatiques : (i) les émissions de CO2 se maintiennent aux niveaux actuels jusqu'en 2050, puis diminuent sans atteindre l'objectif de zéro net d'ici 2100 et (ii) les émissions de CO2 triplent d'ici 2075.

Bénéfices attendus

Une fois le modèle calibré sur la petite roussette (Scyliorhinus canicula), il pourra être utilisé pour prédire la taille des population de d'autres espèces d'élasmobranches ovipares tempérées ayant les mêmes dépenses énergétiques, c’est-à-dire que la taille des populations de d’autres espèces pourra être connue sans avoir à réaliser d’expérimentation animale. Ces estimations pourront servir à guider les mesures de gestion de ces espèces dont près de la moitié sont menacés d’extinction en Atlantique Nord-Est, le changement climatique pouvant exacerber les pressions anthropiques directes existantes.

Procédures

Après stabulation aux températures désirées (15,5°C; 17,5°C, 19,0°C) pendant 1 mois, les capacités métaboliques des individus seront mesurés gràce à une méthode non invasive. Les individus seront placés dans des chambres de respirométrie pendant 16h et surveillés toutes les heures. Le test alternera des phases de mesure de consommation d’oxygène (20 à 60 minutes en fonction de la température) et de 60 minutes de renouvellement d’oxygène (i.e. 10-12 mesures en tout pour un individus). L’estimation des capacités métaboliques étant rapportés au poids de chaque individu, une biométrie (longueur totale et standard, masse) sous anesthésie courte sera réalisée après chaque test.

Impact sur les animaux

Le transport des individus subadultes et adultes (2h) pourra engendrer un stress qui sera diminué en transportant les individus dans des mésocosmes oxygénée et dans lesquels les animaux seront dans le noir. Les températures appliquées (15.5°C; 17,5°C; 19°C) sont des températures rencontrés par l'espèce (gamme de température allant de 10 à 20°C), par conséquent les conditions d'élevage ne représenteront pas de nuisance supérieures à celles rencontrées dans le milieu naturel. La nuisance associée à la découverte d'un nouvel environnement sera atténuée par une heure consacrée à l'acclimatation des individus aux chambres de respirométrie enrichie d'une cachette et de pierres. L'isolement pendant la procédure pouvant entrainer une nuisance légère (animaux non grégaires), les chambres de respirométrie transparentes seront placées par paires dans des mésocosmes. Le stress associé à la biométrie sera réduit grâce à une anesthésie courte.

Devenir

Tous les animaux prélevées en milieu naturel seront réintroduits. Les individus n'ayant été qu’acclimatés au maximum pendant 3 semaines, placés en stabulation pendant un mois puis 18h dans des chambres de respirométrie, pesés et mesurés, ils ont de fortes probabilité de survivre lors de leur réintroduction dans leur milieu naturel. La réintroduction de juvéniles en milieu naturel est couramment employée en conservation des raies et requins ovipares. Ceux nés en captivité seront euthanasiés conformément à la réglementation.

Remplacement

A ce jour il est impossible de quantifier la consommation en dioxygène en fonction de la température autrement que par respirométrie statique à flux intermittent (méthode non invasive communément employée). Toutefois, à partir d’un nombre très limité d’individus (24 au total) d’une espèce modèle (Scyliorhinus canicula) et d’une procédure légère, le projet doit permettre de calibrer un modèle permettant de prédire la taille des populations de nombreuses espèces de raies et de requins ovipares en 2100 dans le cadre de 2 scénarios climatiques. Ce projet a donc pour but final d’utiliser la modélisation en remplacement de l'expérimentation animale.

Réduction

Un nombre très limité d’individus (24 au total) d’une espèce commerciale (Scyliorhinus canicula), classée > sur la liste rouge de l’Union International pour la Conservation de la Nature (UICN) est nécessaire et suffisant pour calibrer un modèle permettant de prédire la taille des populations de nombreuses espèces de raies et de requins ovipares en 2100 dans le cadre de 2 scénarios climatiques sans avoir à utiliser d’animaux en expérimentation animale. Ce petit nombre d'individus a déjà permis d’obtenir la relation recherchée pour calibrer le modèle sur d’autres espèces. Par ailleurs, l’hébergement et la procédure légère mis en place doivent permettre la réintroduction des animaux en milieu naturel. La réintroduction est couramment réalisée pour la conservation des raies et requins qui pondent des œufs.

Raffinement

Le stress associé au transport des individus (2h) sera diminué en transportant les individus dans des mésocosmes oxygénée et dans lesquels les animaux seront dans le noir. Chacun des aquariums de 700 L permettra d’héberger des groupes de 8 individus (4 juvéniles séparés de 2 subadultes et 2 adultes par une cage grillagée en plastique). Les bassins seront alimentés par de l’eau de mer pompée directement en Manches afin de proposer une eau dont la composition chimique est la plus proche du milieu naturel et équipés indépendamment d’un système de filtration externe (limitation des champs électrique), mécanique et biologique. La température sera mesurée en continu et ajustée automatiquement. La salinité, l’oxygène et les nitrates seront mesurés hebdomadairement tandis que l'ammonium et les nitrites seront mesurés quotidiennement. L'eau des aquariums sera renouvelée d'un tiers quotidiennement. Les individus seront nourris ad libitum, deux fois par semaine (digestion très longue) avec des calmars et du merlu préalablement décongelées (limitation des risque d’infection parasitaire). L'alimentation avec des aliments ayant des valeurs nutritives variées (merlu et calmar) augmentera la probabilité que la plupart des éléments essentiels soient ingérés. L’alimentation sera complétée si nécessaire par un supplément en vitamines (C) et minéraux pour éviter toute carence chez les animaux hébergés. Une surveillance quotidienne sera assurée en plus des périodes de nourrissage afin de détecter des modifications de l’aspect physique et du comportement des poissons. Des abris en plastique permettront de fournir des cachettes tandis que des tunnels offriront des possibilités de jeu. L'anesthésie courte permettra de limiter le stress lié à la biométrie.

Choix des espèces

Les élasmobranches (raies et requins) constituent la deuxième classe de vertébrés la plus menacée d’extinction à ce jour (près de 50% des espèces sont menacés d’extinction en Atlantique Nord-Est). Le réchauffement des eaux représente un défi supplémentaire pour la survie de ces espèces qui ne régulent pas leur température interne. L’approche couplée de bioénergétique et de modélisation a déjà permis de prédire la taille des populations de Rhinoptera bonasus. Cependant, le modèle développé n'a pas été construit pour qu'il soit transposable à une autre espèce et en particulier à une espèce tempérée et ovipare. A l'heure actuelle, il est donc impossible de prédire la taille des populations des différentes espèces de raies et requins ovipares tempérés. La petite roussette (Scyliorhinus canicula), classée « préoccupation mineure » selon la liste rouge de l’UICN, couramment rencontrée au sein des aquariums (conditions optimales de développement connues) est un organisme modèle pour l'étude des raies et des requins en Atlantique Nord-Est, c'est donc cette espèce qui a été choisie pour calibrer le modèle développé pour les raies et requins tempérée ovipares. Le modèle doit être calibré sur des individus de différentes tailles (i.e. stades de développement) pour correctement décrire la consommation en dioxygène en fonction de la taille des individus. Une plus grande variabilité étant attendu chez les juvéniles, leur nombre est plus grand. Le nombre de subadultes et adultes est quant à lui limité par les capacités d’accueil des animaux dans des conditions optimales (déterminées par la capacité de filtration des pompes). La dynamique des populations est contrainte par la fécondité des femelles, par conséquent, l’approche mise en place est basée sur les femelles. La taille à maturité des femelles n’est pas précisément décrite, ce qui implique d’inclure des individus selon une fourchette de taille assez grande, c’est pourquoi le projet comptera 6 subadultes femelles (maturité non certaine) et 6 adultes femelles (maturité certaine). Enfin, il est impossible de déterminer le sexe des embryons dont la durée d’incubation est de 6 mois avant leur éclosion. Par conséquent, nous avons valorisé tous les individus éclos (6 femelles et 6 mâles) sachant que l'énergie allouée pour l'investissement reproducteur est nul la première année pour les petites roussettes et donc n’entrainera pas d’erreur pour la calibration du modèle.

224 bars vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont élevés seuls en aquarium pendant huit semaines et subissent cinq prélèvements de nageoire et d'écailles ainsi qu'une prise de sang sous anesthésie, plus l'implantation d'une puce, pour mettre au point une mesure de l'efficacité alimentaire par les isotopes stables. Le porteur vise une sélection génétique plus simple des poissons sur ce caractère et présente les prélèvements comme des nuisances mineures qui cicatrisent vite. Il indique tuer les animaux faute de pouvoir les placer, leur fonds génétique interdisant selon lui un retour en milieu naturel, ces bars étant destinés à la consommation.

Objectifs

L’objectif du projet est la mise au point d’une méthode utilisant les isotopes stables du carbone et de l’azote comme indicateur de l’efficacité alimentaire chez le bar européen. Pour cela, le projet propose de coupler les mesures d’efficacités alimentaires en élevage individuel et en alimentation restreinte avec la vitesse d'absorption des isotopes stables du carbone et de l'azote de l'aliment par le poisson. L’élevage individuel des bars permettra de quantifier l’ingéré et la croissance individuelle des bars ce qui permettra de mesurer l’efficacité alimentaire individuelle des poissons. Avant de réaliser cette évaluation, les poissons seront acclimatés et nourris avec un aliment A. Lors de l’évaluation, les poissons seront nourris avec un aliment B. Les aliments A et B auront des valeurs d'isotopes stables du carbone et de l'azote différents grâce à l’utilisation de sources de matières premières différentes telles que du blé ou soja versus du maïs. Les valeurs des isotopes stables du carbone et de l'azote seront étudiées dans différents tissus comme les globules rouges, les écailles ou les nageoires par spectroscopie. La corrélation entre les facteurs de discrimination trophique de chaque individu et leur efficacité alimentaire sera ensuite évaluée.

Bénéfices attendus

Cette nouvelle méthode d’évaluation de l’efficacité alimentaire basée sur les isotopes stables permettra d’évaluer facilement les performances individuelles de poissons élevés en groupe, rendant ainsi plus simple et plus applicable à grande échelle une sélection génétique sur ce caractère.

Procédures

Pour réaliser ce projet, les animaux seront élevés individuellement et seront prélevés à cinq reprises d'un bout de nageoire et d'écailles. En fin de projet une prise de sang sera réalisée. Chacun de ces prélèvements prend moins d'une minute et sera réalisé sous anesthésie. L'élevage individuel durera 8 semaines.

Impact sur les animaux

Pour les besoins de l'expérimentation, les poissons seront élevés dans des aquariums individuels. Par ailleurs les poissons seront prélevés 5 fois au cours de l'expérimentation d'un bout de nageoire, d'un prélèvement d'écailles et une prise de sang sera réalisée en fin d'expérimentation. Les lésions engendrées par ces prélèvements cicatrisent rapidement, les poissons régénèrent en quelques semaines les écailles et les bouts de nageoires perdus. Les prélèvements répétés de nageoires n'engendrent pas d'effet négatif sur la nage des poissons. Les prélèvements de nageoires sont réalisés à l'aide d'un biopsie punch de faible diamètre , ce qui permet une reconstitution du tissu prélevé en moins de deux semaines. Enfin les poissons seront identifiés à l'aide d'une puce RFID injectée dans le muscle dorsale. Ces prélèvements et le marquage sont des nuisances mineures pour cet espèce.

Devenir

À la fin de l'expérimentation, les poissons seront euthanasiés. Les animaux ne seront pas utilisés dans un autre projet et ne peuvent être gardés dans les installations expérimentales. Le placement des animaux de bouche n'est pas aisé, ceux-ci étant destinés à la consommation humaine. Leurs fonds génétiques restreints ne permettent pas une remise dans le milieu naturel.

Remplacement

Ce type d'expérimentation, où la variation observée et recherchée est liée à l'individu, ne peut se faire que sur animaux vivants. Il n'y a donc pas de remplacement possible. La mesure de l'efficacité alimentaire (ingéré/gain de poids) est un caractère complexe mettant en jeu une multitude de mécanismes comme la capacité à assimiler les nutriments, le métabolisme énergétique, l'activité de nage des poissons, la microflore intestinale... Ce caractère complexe étudié au niveau individuel n'a pas d'alternative non animale disponible du fait de ses nombreuses composantes et des variabilités individuelles qu'explore l'étude.

Réduction

Les effectifs ont été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes sur le bar pour assurer une puissance de détection suffisante des effets escomptés.

Raffinement

Pour réduire la souffrance et l'angoisse, les animaux sont manipulés uniquement sous anesthésie pour toutes les mesures individuelles, et sont diposés dans des aquariums leur permettant un contact visuel avec des congénères. Les prélèvements de nageoire et d'écailles seront réalisés à chaque fois à une localisation différente. Tout au long de l'expérimentation, les poissons seront surveillés individuellement et soustraits à l'expérimentation en cas de souffrance.

Choix des espèces

Le bar est une espèce majeure de l'aquaculture méditerranéenne, pour laquelle la question de l'efficacité alimentaire se pose avec acuité, cet élevage consommant aujourd'hui, à quantité de production égale, près de deux fois plus d'aliment qu'un élevage de truite ou de saumon. Les animaux seront au stade juvénile (entre 20 et 100g de poids moyen) pour à la fois pouvoir mesurer des croissances significatives et permettre que les animaux soient dans un confort relatif dans les bacs individuels de 10 litres qui seront utilisés

100 poissons d'eau douce vont être utilisés, sans mise à mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des étudiants de master s'exercent sous anesthésie au marquage par puce intramusculaire ou marque externe sur des cyprinidés et des percidés, et à l'échographie de reproduction sur des esturgeons du Danube. Le porteur reconnaît que l'injection de la marque dans le muscle dorsal correspond à une plaie cutanée pouvant pénétrer les fibres musculaires selon le geste de l'étudiant. Les poissons marqués sont ensuite relâchés ou remis dans leur bassin, une partie des esturgeons pouvant être réutilisée l'année suivante, et le porteur affirme qu'il est difficile de remplacer entièrement l'animal vivant dans cette formation.

Objectifs

L’objectif du projet est de faire acquérir aux étudiant(e)s la démarche pratique du biologiste aquacole. Dans un premier temps, les étudiant(e)s observent les différentes espèces de poissons d’eau douce vivant en canal ou bassins sur la station d’expérimentation, puis assistent à leur capture (deux méthodes montrées : la pêche à l’électricité et le guidage manuel vers une bâche de contention, méthode adaptée aux spécimens de grande taille) avant de réaliser quelques manipulations de base, nécessaires pour mettre en œuvre des contrôles et suivis biologiques. Après des démonstrations vidéos des gestes attendus, il s’agit, à l’occasion de deux ateliers, de faire pratiquer les étudiant(e)s sur poisson vivant et leur permettre ainsi l’apprentissage des gestes et bonnes pratiques d’échantillonnage/manipulations. L’identification des espèces, l’anesthésie du poisson et un marquage “simple” (injection intramusculaire d’une micropuce électronique de 12mm ou insertion d’une marque visuelle (spaghetti) externe) font l’objet de l’atelier “Marquage” effectué sur des espèces communes d’eau douce, essentiellement des Cyprinidés et des Percidés. Anesthésie, biométrie, contrôle d’identification (lecture du pit-tag porté par l’animal) et examen échographique de l’avancement de la maturité font l’objet de l’atelier “Echographie” effectué chez l’esturgeon du Danube Acipenser ruthenus conservé à la station. Dans le 3ème et dernier atelier, les méthodologies de suivi des espèces aquatiques par biotélémétrie sont présentées et les étudiant(e)s s’initieront à la pratique d’un suivi manuel par télémétrie radio ou acoustique sans utilisation d’animaux (attachement du capteur sur objet inerte téléguidé).

Bénéfices attendus

Ce projet permet aux étudiant(e)s d’aborder le poisson vivant et d’utiliser les anesthésiques en balnéation qui en facilitent l’approche, ainsi que de s’initier à des méthodes de marquage et de contrôle (pit-tag, échographie) peu ou non invasives couramment utilisées dans les suivis biologiques terrestres ou aquatiques en laboratoire ou milieu naturel. Etant en dernière année de leur cursus d’études en M2 Pro-Parcours Biodiversité et suivis environnementaux (BSE), les étudiant(e)s seront amené(e)s à effectuer leur stage dans des structures (laboratoires de recherche, ONG, associations de protection animale et environnementale, conservatoires des espaces naturels, bureaux d'études, ...) mobilisant fréquemment ces compétences, en particulier avec le développement croissant des pratiques de biotélémétrie (qui feront l’objet du 3ème atelier où les étudiant(e)s s’exerceront, sans utilisation d’animaux, aux technologies existantes pour le milieu aquatique). Bien que leurs enseignements théoriques soient plutôt orientés vers l’écologie terrestre, certain(e)s étudiant(e)s seront amené(e)s à côtoyer des espèces aquatiques dans leur pratique professionnelle. La formation sera particulièrement axée sur le bien-être animal (BEA) lors des manipulations, l’objectif étant bien l’apprentissage sur du vivant dans une démarche éthique. Aussi, des documents sur le raffinement des méthodes (« Marquage, bonne pratique et bien-être ») étayé par de nombreux cas d’études chez le poisson seront-ils fournis à chaque étudiant(e), complétés par un cours (1.5h) qui leur sera donné dans la même semaine sur la règlementation en matière de BEA en expérimentation animale.

Procédures

Pas de manipulations sur animaux vigiles, ni de procédures chirurgicales intrusives, ni de prélèvements tissulaires. Les procédures sont rapides, peu ou non invasives et concernent des individus différents (pas d’enchaînement des actes). – Atelier Marquage : les poissons cyprinidés et percidés pêchés à l’électricité dans le canal de la station sont placés en bassin pour observation et détermination des espèces par les étudiant(e)s avant d’être mesurés et marqués. Les poissons seront marqués une fois. Deux types de marque sont implantés : la marque spaghetti (au niveau des rayons de la nageoire dorsale) et le pit-tag (en intramusculaire entre la tête et la nageoire dorsale). Une seule marque est utilisée par poisson. Les repères anatomiques sont présentés aux étudiants avant marquage (vidéo) et ils peuvent s’entrainer au maniement de l’injecteur sur des objets inertes (bananes). L’ensemble des interventions sur l’animal (hors pêche) durent moins de 5 minutes et se font sous anesthésie. Après marquage (un poisson par binôme d’étudiant(e)s), l’animal est placé en bassin de réveil pour observation puis relâché dans le canal à la fin du TP. – Atelier Echographie : des géniteurs d’esturgeon du Danube conservés en bassins d’élevage sont placés 2 à 3 jours avant le TP dans un bassin de stabulation spécifique d’où ils sont ensuite prélevés un à un manuellement par les soigneurs. Le poisson (un pour 2 binômes) est transféré par les étudiant(e)s dans le bain anesthésiant situé à proximité, à l’aide d’une bâche de transport. Une fois anesthésié, l’animal est mesuré, identifié (lecture de sa marque pit-tag), observé (état sanitaire) et échographié (examen des gonades et autres organes). Les poissons seront manipulés une fois et sous la surveillance des soigneurs pour aider à la reconnaissance/interprétation des images de l’échographie et fiabiliser la pré-sélection (ou pas) des individus pour de futures reproductions. L’ensemble des interventions durent moins de 15-20 minutes et se font sous anesthésie. Après l’échographie, l’animal est replacé dans le bassin de stabulation (dans un compartiment dédié au réveil) pour observation jusqu’à recouvrement de sa pleine capacité de nage et de prospection, et libéré (cloison amovible) à la fin du TP.

Impact sur les animaux

Les procédures sont rapides, peu ou non invasives (soit respectivement, l’injection dorsale d’une marque de petite taille ou l’échographie) et concernent des individus différents (pas d’enchaînement des actes). Dans chacun des 2 ateliers, toutes les manipulations pratiquées se font sous anesthésie générale (par balnéation) puis les poissons sont replacés dans le canal ou le bassin d’origine après leur réveil. Il n’y a donc que peu d’effets indésirables attendus. Malgré tout, la nuisance de l’injection d’une marque (même petite) dans le muscle dorsal correspond à une blessure tissulaire de type plaie cutanée au point d’entrée pouvant se prolonger dans les fibres musculaires de façon plus ou moins importante selon le diamètre et la profondeur de pénétration de l’aiguille dans la musculature du poisson. L’injection par voie intramusculaire a été néanmoins privilégiée en première approche pour les étudiant(e)s car elle est adaptée par rapport à la taille des poissons sélectionnés vis-à-vis des marques utilisées et semble la moins risquée pour l’animal, même si le geste de l’étudiant(e) manque de précision (contrairement au marquage abdominal plus complexe pour des néophytes et plus dangereux pour le poisson, avec un risque de perforation des viscères). Donc en plus de la vidéo présentée et de l’entraînement proposé (injection sur bananes), le marquage du poisson sera surveillé de près et de bout en bout par les formateurs qui guideront les étudiants dans leurs gestes techniques à chaque étape pour limiter au maximum la sévérité de la blessure occasionnée.

Devenir

En fin de procédure 1 (pêche à l’électricité suivie d’un marquage dorsal par pit-tag ou marque visuelle spaghetti), les animaux endormis sont placés en eau claire dans un bassin de réveil pour que les étudiant(e)s puissent observer les différentes étapes du réveil. Tous les poissons marqués qui ont un comportement de nage normal à l’issue du réveil seront relâchés dans le canal d’origine. Le relâcher de l’ensemble des animaux (marqués ou non) ne sera effectué qu’à la fin du TP pour éviter tout risque de recapture lors de la seconde séquence de pêche électrique. S’agissant d’un TP prévu annuellement sur une durée de projet de 5 ans, tous les poissons capturés chaque année dans le canal (exclusivement pour le TP) seront systématiquement contrôlés, visuellement et/ou avec un lecteur de marque pit-tag, pour pouvoir être écartés (s’ils sont déjà marqués) des ateliers Marquage ultérieurs. En fin de procédure 2 (biométrie et échographie sur esturgeon du Danube), les animaux endormis sont replacés en eau claire dans leur bassin d’attente. Ils y sont maintenus isolés en compartiment de réveil (séparation par cloison amovible) pour pouvoir être observés jusqu’au recouvrement de leurs pleines capacités de nage et de prospection. La cloison amovible n’est retirée qu’à la fin du TP pour éviter tout double emploi des poissons entre groupes d’étudiant(e)s. Ensuite, les individus dont les indicateurs semblent favorables pour la reproduction seront conservés en bassin d’attente où ils resteront 2.5 mois (mi-janvier à début avril) jusqu’au contrôle final de leur maturation ; les autres, non pré-sélectionnés, seront remis dans le bassin d’élevage par les soigneurs à la fin du TP. En conséquence, ces poissons non pré-sélectionnés en année N et replacés avec le stock peuvent être de nouveau échographiés par des étudiant(e)s l’année suivante (même si la probabilité est faible en raison de la petite taille de l’effectif examiné en TP (n=7 individus/an maximum) par rapport au stock de géniteurs (n≈200 actuellement)). Enfin, les esturgeons qui se sont déjà reproduits ne seront pas ré-impliqués (gestion génétique et démographique du stock captif) et donc pas mis à disposition des étudiant(e)s.

Remplacement

Les étudiant(es) du Master Pro BSE disposent d’assez peu d’enseignements pratiques relatifs aux suivis biologiques terrestres ou aquatiques qu’ils pourront être amenés à faire en tant que biologistes dans leur pratique professionnelle, et il est difficile de remplacer (totalement) les animaux vivants par d’autres outils pédagogiques dans le cadre de leur dernière année de formation. Une vidéo a été réalisée pour expliquer et montrer aux étudiant(e)s la démarche et les gestes techniques inhérents à chaque atelier pour qu’ils voient déjà ce qu’il faut faire avant la séance ; cela remplace l’usage d’un poisson par séance pour la démonstration. Dans l’atelier 3, après présentation des méthodologies de biotélémétrie utilisées en milieu aquatique (vidéos), les étudiant(e)s s’initieront à la pratique d’un suivi manuel par télémétrie radio ou acoustique sans utilisation d’animaux (attachement du capteur sur objet inerte téléguidé).

Réduction

Les étudiants travaillent en binôme, un poisson est utilisé pour 2 étudiants pour réduire le nombre de poissons impliqués. Pour l’atelier “Echographie” sur l’esturgeon du Danube, ce sont 2 binômes qui travaillent simultanément sur le même poisson.

Raffinement

Toutes les manipulations se font sous anesthésie générale par balnéation pour limiter le stress des animaux. De plus, - pour les marquages, les animaux sont pêchés à l’électricité par des opérateurs habilités avec un appareil réglé pour une électrotaxie rapide des poissons sans tétanie. Après stabulation en bassin (eau du canal en circuit ouvert) de courte durée pour déterminer les espèces, les poissons choisis (taille suffisante, comportement/aspect normal : absence de lésions, calme, nage régulière) sont anesthésiés par balnéation (environ 4-5 min jusqu’à perte totale de l’équilibre) puis marqués en moins de 5 min par injection d’un pit-tag de 12mm en intramusculaire ou d’une petite marque visuelle externe (type spaghetti) sur leur nageoire dorsale. En routine, les marquages de ce type utilisés pour identifier les poissons, rapides et peu invasifs, sont réalisés sous anesthésie légère (dose sédative) mais ici, une anesthésie un peu plus profonde est privilégiée pour limiter le risque de souffrance animale durant l’apprentissage du geste par les étudiant(e)s. Injecteurs et zone d’implantation des marques sont tous désinfectés et les bains anesthésiants renouvelés et aérés (bulleur) si nécessaire. Enfin, avant de commencer, chaque étudiant(e) peut s’entrainer au maniement de l’injecteur sur des objets inertes (bananes) et les repères anatomiques qui leur ont été présentés au préalable (vidéo) sont rappelés à chaque marquage, surveillé par le(s) formateur-trice(s). - pour les échographies, les esturgeons sélectionnés de la même manière (état physique, comportement, nage) et placés en bassin de stabulation d’attente (eau de rivière ; débits, température et oxygène surveillés quotidiennement) 2 à 3 jours avant l’échographie pour faciliter la surveillance et l’accès aux animaux (densité de poissons réduite : 3-3.5 kg/m2), sont d’abord mis à jeun 24h (pour réduire les risques de régurgitation/contamination fécale) puis transférés un à un dans un bain anesthésiant à l’aide d’une bâche de transport (pour éviter de possibles lésions par frottements et conserver les animaux dans le noir afin de réduire le stress). En routine, le contrôle de pré-sélection d’esturgeons matures par simple échographie se fait sur animaux vigiles, en moins d’1 min par poisson sans provoquer d’altération du comportement. Mais pour le TP, tous les actes sont pratiqués sous anesthésie profonde pour supporter une durée d’intervention a priori de 15-20 min sous la surveillance des soigneurs.

Choix des espèces

Les espèces choisies pour l’atelier 1 (pêche à l’électricité/marquage) sont des cyprinidés et des percidés provenant de la rivière alimentant la station d’expérimentation, qui sont entrés à l’état larvaire et qui grandissent dans le canal approvisionnant les bassins extérieurs. Ces espèces d’eau douce sont communes en France, et sont donc les plus susceptibles d'être rencontrées par les futurs biologistes dans leur pratique professionnelle. L’espèce choisie pour l’atelier 2 (échographie) est l’esturgeon du Danube Acipenser ruthenus, une espèce élevée sur notre site pour des essais de biologie de la conservation. Les poissons utilisés dans l’atelier 1 sont au stade adulte pour faciliter la reconnaissance des espèces, les manipulations et les marquages (ratio poids marque/animal adapté), soit des individus d’environ 20 à 25 cm selon l’espèce considérée. Les esturgeons utilisés dans l’atelier 2 sont des adultes géniteurs des deux sexes, de suffisamment grande taille pour faciliter l’examen échographique et déterminer l’état d’avancement de leur maturité (soit des individus de 80 à 100 cm et de 3 à 5 kg).

640 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des lésions du cerveau sous anesthésie et des injections, pour étudier l'effet d'une surnutrition sur la formation et la réparation des neurones. Le porteur affirme une mortalité quasi nulle et l'absence de signe visible de souffrance après lésion. Il conclut que la complexité de la réparation cérébrale ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

Les objectifs du projet sont de mieux comprendre l'impact d'une surnutrition sur les mécanismes de neurogenèse (création de nouveaux neurones) en condition constitutive et régénérative (sans et avec lésions cérébrales). Pour cela, nous avons pour sous objectifs de comprendre : (1) l'impact de désordres métaboliques (obésité/prédiabète) sur la prolifération des cellules souches neurales, sur la neuroinflammation et l'angiogenèse (création de nouveaux vaisseaux sanguins), (2) par quels mécanismes la surnutrition impacte la régulation des gènes modulant la création de nouveaux neurones), (3) et enfin d'étudier l'impact de la surnutrition sur les mécanismes de réparation cérébrale (mort cellulaire, angiogenèse et neurogenèse régénératives).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre comment un déséquilibre nutritif entrainant une obésité et une dérégulation de la glycémie peut avoir des répercussions sur la plasticité cérébrale et les mécanismes de réparation (mort cellulaire, angiogenèse, neurogenèse). En situation non lésée, nous pourrons mieux comprendre l'impact de la surnutrition sur la prolifération des cellules souches neurales, sur la vascularisation cérébrale et sur la neuroinflammation du tissu. De plus, nous pourrons étudier l'expression de facteurs clés dans les mécanismes de neurogenèse, plasticité et vascularisation cérébrales en situation dite homéostatique (non lésée). En outre, un focus particulier sera fait sur les voies de signalisation Notch, Id1 et des glucocorticoïdes. En situation de lésion, nous pourrons comprendre comment les désordres métaboliques induits impacte les mécanismes de réparation cérébrale impliquant entre autres la mort cellulaire associée à la lésion, le recrutement des cellules microgliales et la création de nouveaux neurones. A termes, cela pourra permettre d'identifier des voies thérapeutiques d'intérêt pour contrecarrer les effets délétères de désordres métaboliques sur le cerveau mais aussi sur les mécanismes de réparation à la suite d'accidents vasculaires cérébraux ou de traumatismes crâniens.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions - lésions du télencéphale (mortalité inférieure 1%) - Injections intrapéritonéales

Impact sur les animaux

Les points limites sont un comportement anormal (mouvements circulaires), une nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), une flottabilité anormale dans la colonne d’eau, et une couleur anormale ou une hyperventilation, indiquant une souffrance ou un stress. Peu voire pas d'effets indésirables sont attendus dans ces modèles. Bien que la surnutrition puisse entrainer des diminutions de plasticité cérébrale et de locomotion, les animaux surnutris dans ces conditions expérimentales ne semblent pas présenter de stress particulier dans de tels temps d'étude De plus, les lésions du télencéphale réalisées sous anesthésie générale sont rapides (moins de 30s) et parfaitement maitrisées. La mortalité associée est quasi nulle . De plus, après lésion cérébrale sous anesthésie, le poisson est remis immédiatement dans l'eau et se réveille en moins de 1 à 2 minutes. Il ne présente visuellement aucun signe de souffrance, de séquelles visibles ou de stress (cités précédemment). Il est presque impossible à l'œil de distinguer un animal qui a subi une lésion d’un non lésé car aucun différence notable et significative de locomotion ou autres paramètres de nage n’est perçu. Pour voir de subtils changements, il est nécessaire de monitorer l'activité avec des équipements comportementaux très fins. Ceci s'explique aussi probablement par le fait que le cerveau n'est pas innervé d'un point de nociceptif. Aussi, les injections de BrdU en intrapéritonéale sont maitrisées et se font sous anesthésies du poisson dans de la tricaine (MS-222). Elles n'induisent pas d'effets indésirables.

Devenir

A l'issue finale du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié. Si jamais les résultats scientifiques sont suffisamment etayés ou si un problème survenait, la segmentation du projet en sous-expérimentations indépendantes nous permettra de réduire le nombre d'animaux et de les utiliser pour d'autres expérimentations.

Remplacement

La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de la surnutrition (obésité/situation prédiabétique) sur les effets du cerveau ne sont pas modélisables in vitro. Des facteurs périphériques et centraux sont modulés et ont un impact sur l'homéostasie cérébrale. De plus, lors de la réparation cérébrale les mécanismes ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de réparation impliquent plusieurs types cellulaires: microglies, oligodendrocytes, macrophages, cellules endothéliales, neurones, et cellules souches neurales. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de la réparation : hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.

Réduction

Chaque expérimentation sera scindée en des expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le deuxième groupe d'animaux. A noter que chaque expérimentation sera menée sur des groupes de 20 poissons par condition (4 x 20 poissons nourris normalement et 4 x 20 poissons surnutris). Cette segmentation de l'expérimentation en 4 expérimentations indépendantes permettra de stopper l'expérimentation en cas d'une souffrance insoupçonnée ou de données scientifiques suffisamment étayées.

Raffinement

Les poissons seront maintenus dans des conditions optimales. La procédure invasive sera réalisée sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Les points limites sont un comportement anormal (mouvements circulaires), une nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), une flottabilité anormale dans la colonne d’eau, une couleur anormale et/ou une hyperventilation, indiquant une souffrance ou un stress. Chaque situation d'animal montrant des signes de souffrances sera rapportée au vétérinaire responsable de l'animalerie (ou responsables du bien-être animal) pour conseils ou directives de traitement approprié, en général sédation profonde et euthanasie.

Choix des espèces

Le poisson zèbre partage de 70 à 85 pour cent de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement . C’est également un modèle de réparation cérébrale reconnu avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères Mâles et femelles : à part égale afin d'avoir une meilleure appréciation des effets observées chez les mâles et femelles et étudier d'éventuels dimorphismes sexuels. Les animaux auront le même âge au sein d'un groupe contrôle et traité.

60 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. On leur prélève un fragment de nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, puis on les soumet à deux séries de test d'effort en couloir de nage forcée à courants croissants, à deux âges différents, pour relier une hypertrophie cardiaque d'origine génétique à leurs capacités de nage. Le porteur qualifie de modéré le stress lié à ces épreuves de nage. Il affirme que l'étude dynamique du cœur à l'effort n'a de sens qu'à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les hormones thyroïdiennes contrôlent un grand nombre de processus biologiques en régulant l’expression de nombreux gènes. Des perturbations de ces hormones sont à l’origine de diverses pathologies qui peuvent se manifester tout au long de la vie et donc constituent des problèmes majeurs de santé publique. L’étude des régulations physiologiques par les hormones thyroïdiennes constitue donc un axe de recherche important, notamment pour l’étude de la fonction cardiaque. Nous avons montré dans différents travaux que ces hormones jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la régénération du tissu cardiaque. Afin d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu pendant la régénération cardiaque lorsque les hormones thyroïdiennes sont perturbées, nous avons étudié les effets de l’inactivation d’un gène clé contrôlant ces hormones, le gène dio2, en utilisant une lignée de poisson zèbre mutante pour ce gène. Ainsi, l’inactivation du gène dio2 entraine une hypothyroïdie des animaux. Lors de nos analyses, nous avons observé que chez les poissons mutants pour le gène dio2 la région cardiaque était différente comparés à celle des poissons non mutants et que ces poissons mutants présentaient les signes d’une hypertrophie cardiaque, confirmée par des analyses morphologique et moléculaire des cœurs chez ces poissons mutants. Dans le but de relier ces observations à un test comportemental, nous voulons réaliser une analyse des performances de nage en soumettant les poissons mutants à un test d’effort en couloir de nage forcée dans l’objectif de compléter l’étude de cette lignée de poisson zèbre présentant une hypertrophie cardiaque quand le gène dio2 est inactif.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à étudier l’effet d’une hypothyroïdie congénitale induite par une mutation d’un gène clé impliqué dans la signalisation thyroïdienne sur les performances de nage et la résistance à l’effort chez un poisson adulte.

Procédures

Deux types d’interventions sont utilisées dans ce projet : 1) Le génotypage des poissons se fait par prélèvement d’un fragment de 5 mm2 à l’extrémité de la nageoire caudale sur les poissons âgés de 2-3 mois (l’acte se fait sous anesthésie et dure moins de 10 secondes ; il concerne 60 poissons utilisés dans l’étude ; il est à noter que le bout de nageoire régénère rapidement) ; 2) Les 60 poissons sont soumis individuellement ou en groupe à deux séries de test d’effort en couloir de nage forcée, en appliquant des courants de vitesses croissantes (3 vitesses pour les tests de nage individuelle ; 5 vitesses pour les tests de nage en groupe) et en observant leur capacité de nage pendant des durée de 20-30 secondes (pour les tests de nage individuelle) et 10 secondes (pour les tests de nage en groupe) : un test fait sur les poissons âgés de 6-8 mois, puis un deuxième test fait sur les mêmes poissons âgés de 1,5-2 ans (permettra de voir si il y a une évolution des effets de l’hypertrophie cardiaque sur la capacité de nage des poissons en fonction de l’âge).

Impact sur les animaux

- Dans le cadre de la lignée dio2 utilisée, une hypothyroïdie des poissons mutants a été diagnostiquée. Cependant, les poissons mutants ne présentent pas de handicaps majeurs, excepté une taille plus petite et une certaine infertilité qui rend la production d’animaux plus difficile que chez les poissons non mutants (les femelles mutantes ont une période de reproduction plus courte et plus de difficulté à pondre). - Les challenges (test d’effort en couloir de nage forcée) sont susceptibles d’entrainer un stress ponctuel des animaux, mais ces variations étant contenues dans des gammes proches de celles pouvant être rencontrées dans le milieu naturel (nage en eau courante/nage à contre-courant), les stress induits devraient être modérés.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans la procédure seront euthanasiés en fin de procédure ; ces animaux seront utilisés pour réaliser des analyses histologique, moléculaire ou anatomique, en particulier concernant leur cœur.

Remplacement

L’étude dynamique du processus cardiaque n’a de sens qu’à l’échelle de l’organisme entier, d’autant plus dans le cadre d’un test d’effort qui fait appel à la locomotion de l’animal. Notre étude nécessite donc de recourir à des organismes modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux qui seront testés (10 poissons mâles et 10 poissons femelles pour chacun des 3 génotypes : Dio2 mutant (-/-) ; Dio2 sauvage (+/+) ; Dio2 hétérozygote (+/-) ; donc en tout 60 poissons) s’appuie sur l’expérience passée de l’équipe collaboratrice qui a déjà mis en œuvre ce type d’expérimentation. Néanmoins, les expériences seront conduites par lots successifs de façon à pouvoir être arrêtées dès que les résultats obtenus seront concluants.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Dans le cadre du test d’effort en nage forcée, les animaux font l’objet d’un suivi particulier pendant toute la durée de l’expérience, afin de surveiller l’éventuelle apparition d’un trouble locomoteur ou comportemental (point limite) qui imposerait l’interruption du challenge. Ce suivi sera maintenu de manière particulièrement attentive par le personnel formé pendant les 2 à 3 jours suivant chaque expérience pour s’assurer que les poissons conservent un comportement normal.

Choix des espèces

Le projet vise à étudier l’effet d’une hypothyroïdie congénitale induite par une mutation d’un gène clé impliqué dans la signalisation thyroïdienne sur les performances de nage et la résistance à l’effort chez un poisson adulte. Le poisson-zèbre, par sa facilité d'élevage, par sa croissance rapide et par les possibilités qu'il offre pour la réalisation d’études du comportement natatoire, est un excellent modèle pour notre projet. Les animaux des 3 génotypes (dio2+/+, dio2+/- et dio2-/-) seront utilisés à 2 âges différents : une mesure de leur capacité à nager à contre-courant sera évalué au stade jeunes adultes (6-8 mois), puis une deuxième mesure sera faite sur ces mêmes poissons à un âge plus avancé (1,5-2 ans). Le but est de voir l’effet de la mutation du gène dio2 sur la capacité de nage du poisson zèbre, et de voir l’effet de l’âge sur cette capacité.

9 550 poissons zèbres vont être utilisés, classés en gravité légère, dans un projet de création et de maintien de lignées génétiquement altérées. Chaque animal subit à quatre mois une amputation d'un morceau de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, geste que le porteur présente comme le plus invasif du projet. Les géniteurs et génitrices retenus sont conservés jusqu'à dix-huit mois, tandis que les autres, porteurs de modifications génétiques et jugés non nécessaires, sont mis à mort. Le porteur affirme que seul un organisme vivant complexe permet d'étudier ces syndromes neuro-développementaux et met en avant la transparence des embryons et les pontes nombreuses pour justifier le choix de l'espèce.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de permettre l'étude d’un ensemble de maladies génétiques rares du neuro-développement caractérisés par une microcéphalie et un nanisme. Actuellement, la prise en charge clinique des patients est strictement symptomatique; aucun traitement curatif n’existe à ce jour. Ces syndromes sont dus à des mutations dans un gène spécifique identifié. Le projet de recherche vise à comprendre les mécanismes qui mènent à ces syndromes et pourquoi des mutations distinctes de ce gène conduisent à des pathologies différentes. Afin de mener ces études à bien, le poisson-zèbre a été choisi comme modèle car il permet de reproduire et ainsi de comprendre ces maladies. Le projet proposé ici vise à établir et maintenir des lignées de poissons-zèbre présentant deux mutations emblématiques de ce gène, ainsi qu’une invalidation fonctionnelle totale de ce gène. Ces lignées permettront de mettre en évidence les particularités propres à chaque type de mutation expliquant la variabilité́ des symptômes observés chez les patients, et ce, tout particulièrement sur le développement cérébral.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale permettant de mieux comprendre comment les mutations d'un gène sont impliquées dans la survenue de syndromes présentant des pathologies plus ou moins sévères. A court terme, l’établissement de ces lignées permettra d’établir un modèle de référence de la maladie pour l’étude de ces syndromes. A moyen terme, l’analyse de l’expression des gènes dans les premiers stades de développement du poisson-zèbre aidera à mieux comprendre quels sont les gènes impliqués dans la survenue de retard de croissance et de microcéphalies et de mettre en lumière pourquoi ces symptômes sont plus prégnants pour certaines mutations que pour d’autres. A long terme, ces résultats pourront permettre un éclairage sur les mécanismes cellulaires les plus affectés dans ces syndromes. Ces lignées pourront s’avérer être d’une grande aide dans le test de molécules à visée thérapeutique visant à soulager les patients et à améliorer leur vie.

Procédures

La création de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Aussi, un génotypage des individus s’avère obligatoire. La procédure nécessite le prélèvement d’un morceau de tissu de la nageoire caudale du poisson afin d’en extraire l’ADN. Le choix d’un prélèvement de la nageoire caudale tient au fait que celle-ci se régénère très rapidement. Ce prélèvement sera réalisé une seule fois au cours de la vie de l’animal, à 4 mois. Afin de limiter la douleur liée au prélèvement, celui-ci sera effectué sous anesthésie générale brève de l’animal et à l’aide d’un scalpel dont la lame sera préalablement stérilisée à l’alcool et changée à chaque série de prélèvement. Après le prélèvement, le poisson sera immédiatement transféré dans un bac individuel contenant de l’eau sans anesthésique pour permettre son réveil. Le poisson sera surveillé pendant 10mn pour vérifier son état général. Classiquement, cette technique ne génère pas de mortalité.

Impact sur les animaux

La transmission des syndromes, par le biais de mutations est de type « autosomique récessive » indiquant que les parents sont porteurs sains et asymptomatiques. L’ensemble des progéniteurs de nos lignées seront des poissons porteurs des modifications génétiques, sains et asymptomatiques. De même, il est attendu que la génération de ces lignées poissons-zèbres porteurs des modifications génétiques d’intérêt conduise à des individus sains, libre de se mouvoir et ne présentant aucun signe de mal être. Néanmoins un suivi régulier des poissons-zèbre sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être. Lors de la création de ces lignées, certains poissons zèbres seront amenés à subir un prélèvement d’un morceau de la nageoire caudale afin de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Il s’agit là du geste le plus invasif qu’auront à subir les poissons zèbres dans ce projet.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux d’intérêt (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux, non nécessaires à la conduite de ce projet et porteurs de modifications génétiques, qui ne peuvent pas être replacés.

Remplacement

L’étude du développement neuronal à partir de cellules souches issues de patients et d’un modèle animal, le poisson-zèbre, permet de comprendre les mécanismes de ces maladies. Seul un organisme vivant complexe comme l’animal permet de récapituler l’ensemble des phénomènes physiologiques et de les étudier avec pour objectif une possible application à l’Homme. Le poisson zèbre présente de nombreux avantages, notamment la transparence optique des embryons ce qui permet le suivi, en temps réel, du développement embryonnaire et notamment du système nerveux (deux marqueurs majeurs affectés dans les syndromes étudiés). De précédentes études ont déjà démontré la pertinence du poisson-zèbre comme modèle d’étude car la perte temporaire de la fonction du gène d’intérêt provoque chez cet animal un éventail de symptômes/syndromes spécifiques des maladies humaines, dont une microcéphalie. L’apparition de l’ensemble de ces symptômes/syndromes peut être bloqué par la réexpression de la forme « saine » du gène humain chez le poisson mais pas par les formes « malades », qui portent les mutations identifiées chez l’Homme. Pour poursuivre la caractérisation de ces maladies, l’établissement des lignées poisson-zèbre présentant des mutations stables du gène d’intérêt permettra de disposer de modèles physiologiquement pertinents.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre de poissons de la génération F0 à élever jusque l’âge de 4 mois, une estimation préalable de l’efficacité des systèmes de modification génétique sera réalisée en amont sur des œufs de poisson zèbre de type sauvage à 24-48h heures post fécondation. Le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de la nageoire caudale sera limité au maximum, en réalisant des prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres, afin de ne sélectionner que le nombre minimum de poissons zèbres hétérozygotes nécessaires. Dès lors que le nombre de poissons d’intérêt sera atteint, les prélèvements seront interrompus. Pour le maintien des lignées, seuls les poissons zèbres hétérozygotes nécessaires au maintien de chaque lignée seront conservés, ce qui correspond à une vingtaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Dès lors que le nombre d’animaux d’intérêt sera obtenu, les prélèvements de nageoire caudale pour génotypage seront interrompus. Dans le cas de figure où la génération de poissons-zèbre avec une invalidation totale du gène d’intérêt se révélait trop difficile à obtenir, les autres lignées de poissons-zèbre ne seront pas générés.

Raffinement

Seul le strict minimum d’animaux nécessaires à la génération et au maintien des lignées subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale. Le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale se fera uniquement sur des animaux anesthésiés et le temps d’isolement des poissons-zèbres pendant cette phase de caractérisation sera limitée au minimum en maintenant les animaux dans des bacs avec des séparateurs transparents afin qu’ils soient au minimum 2 par 2 le temps de la procédure. Les individus d’intérêt seront ensuite regroupés en fonction de leur génotype. Les poissons-zèbres conservés seront tous hétérozygotes et ne présenteront pas de phénotype dommageable (le syndrome étudié étant récessif). Toutefois, une surveillance hebdomadaire pour détecter tout éventuelle anomalie du comportement des animaux sera réalisée. L’observation de blessures sur l’animal ou d’anomalies de comportement (nage anormale, prostration au fond du bac…) conduira à la mise à mort de l’animal afin de limiter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

Avec la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec l’Homme, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier des maladies génétiques dans un contexte physiologique et à l'échelle d’un organisme complexe entier. De plus, ce modèle présente de nombreux avantages avec notamment une fertilisation externe et des pontes supérieures à 100 œufs, permettant ainsi de limiter le nombre de génitrices nécessaires au projet et ainsi de les préserver, tout en obtenant une puissance statistique optimale avec peu de croisements. Enfin, la transparence optique des embryons permet le suivi en temps réel du développement embryonnaire et notamment du système nerveux (deux marqueurs majeurs affectés dans le syndrome étudié). Lors de la création des lignées de poissons-zèbres, les animaux subiront un unique prélèvement de nageoire caudale, à l’âge de 4 mois. Ce prélèvement s’effectue à ce stade car les poissons-zèbres sont suffisamment développés et la quantité de tissu prélevé suffisante pour le génotypage. La cicatrisation et la régénération de la nageoire s’opèrent de manière optimale à ce stade de développement. Par la suite, ces mêmes poissons-zèbres seront les géniteurs et génitrices du projet (à partir de l’âge de 5 à 6 mois).

540 ombles juvéniles vont être utilisés, gardés en vue d'une réutilisation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson est placé seul dans une chambre de respirométrie de 500 millilitres pendant une vingtaine d'heures, après un jeûne de 44 heures, puis soumis à des mesures d'excrétion et de consommation de proies. Le projet compare les populations de deux lacs face au réchauffement et aux pratiques de repeuplement. Le porteur décrit un stress léger lié à l'isolement et juge le modèle poisson "pertinent" pour l'étude.

Objectifs

Les salmonidés lacustres sont emblématiques de l'Amérique du Nord et de l'Europe. Ce sont des espèces qui ont une forte importance économique (pêche professionnelle et amateur), patrimoniale et un fort interêt écologique. Néanmoins, les populations sont en dangers. Les captures de pêche montrent des variations irrégulières, due à plusieurs facteurs comme le réchauffement climatique. Pour pallier à ces déclins, des politiques de repeuplement (lâchés de poissons issus de reproductions assistées) ont lieu. Bien que ces lâchés maintiennent une certaine densité de populations, ils sont débattus car des effets sur les capacités d’adaptation. Les lâchés s’effectuent de peuvent introduire des individus venant de population différente, ce qui peut s’avérer problématique pour la génétique des populations. L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets du repeuplement et du réchauffement climatique sur des traits phénotypiques. Spécifiquement, ce projet testera si différentes populations présentent des phénotypes différents et si la température (4° et 8°) influencent le phénotype des individus. Les observations seront réalisées sur la physiologie (métabolisme et excrétion de nutriments) et le régime alimentaire (taux de consommation).

Bénéfices attendus

Les pratiques de repeuplement des salmonidés sont mises en œuvre dans de nombreux pays. Les résultats de ce projet permettront d’apporter de premiers indices quant aux potentiels effets sur la diversité fonctionnelle des populations et à plus long terme de répondre à la question des effets du repeuplement sur la diversité intraspécifique et les services écosystémiques associés. En plus d’apporter des idées sur les bénéfices et conséquences potentielles de ces approches au niveau local (régulation et production de poisson), ce projet aura un impact plus large en questionnant les stratégies de gestion et conservation des salmonidés en général.

Procédures

Des mesures respirométriques seront effectué dans un récipient hermétique (500ml) pendant 20h environ ce qui limiteras sensiblement leur mouvement (la petite taille des poissons aux stades de développement étudiés, la contrainte physique due à la taille des chambre respirométrique sera limitée). Ces mesures impliqueront un jeun de 44h (mis à jeun pendant 24h avant la mesure + 20h de mesure) qui ne devrait pas impacter le développement des poissons. Un léger stress pourra être ressenti dû à l’isolement des poissons. L’eau y sera renouvelée toutes les 10min pour s’assurer que la qualité de l’eau reste bonne durant le test. Les mesures d’excrétion se feront dans un récipient de 500ml pendant 1h. Le taux de consommation de proie impliquera de laisser les animaux dans un contenant de 500ml pendant 20min en présence de daphnie, proies naturelles de l’espèce étudiées.

Impact sur les animaux

Les procédures de ce projet n’impliquent qu'un léger stress dû à la manipulation des animaux. Les mesures de taux métabolique impliquent de laisser les poissons dans une chambre métabolique de 500ml pendant 20 à 24h. Un léger stress pourra être ressenti dû à l’isolement des poissons, la contrainte physique sera limitée du fait de la petite taille des poissons étudiés (stades larvaires et juvéniles). L’eau y sera renouvelée toutes les 10min pour s’assurer que la qualité de l’eau reste bonne durant le test.

Devenir

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le laboratoire et étant donné que les procédures de ce projet n'impliquent qu'un leger stress aux animaux, ils seront gardés en vue d'une réutilisation.

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre les effets du repeuplement piscicole et du changement climatique sur la diversité des populations de poissons. L'objectif est d'évaluer ces effets dans un contexte de réchauffement climatique en prenant en compte une espèce sujette à l’augmentation de la température. Ces effets sont, de plus, problématiques d’un point de vue économique et écologique. En effet, cette étude permettra de comprendre la sensibilité au changement climatique d'une espèce avec une forte importance économique (pêche professionelle et amateur) et également écologique (prédateur). Les pratiques de repeuplement sont extrêmement développées autour des salmonidés sans que les effets sur les populations ne soient vraiment prises en compte, ainsi le modèle poisson est pertinent pour cette étude.

Réduction

Cette expérimentation prévoit de mesurer les traits dans 2 traitements de température (4.5 et 8.5°C) chez 3 populations avec 10 familles chacune. Les analyses statistiques envisagées sont notamment des analyses de variances (ANOVA) et des modèles linéaires à effets mixtes (GLMM). L’effectif de 18 individus par famille/population (chiffre qui tient compte de la mortalité) de mesure permet d’avoir un effectif de qualité pour avoir la robustesse statistique nécessaire à nos analyses afin de déceler des effets de la température et de la population d’origine tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction).

Raffinement

Les aquariums disposeront d’un couvercle et de cachette (tubes en céramiques) afin de limiter le stress dû à la lumière. Lors des mesures de consommation, des proies vivantes seront placé dans le récipient (et non des aliments inertes), permettant de stimuler les animaux. Lors des mesures métabolique une période d’observation d’une heure sera mise en place afin de vérifier la bonne acclimatation des individus au système expérimental.

Choix des espèces

Nous utiliserons des poissons au stade juvénile. Ce stade de vie devraient présenter des phénotypes différents selon les populations d’origine et les traitements de température de température subit durant le développement embryonnaire.