Poissons

Les poissons zèbres utilisés portent une modification génétique qui rend fluorescent un gène du métabolisme intestinal, ce qui permet de lire à l'œil ce qu'une substance fait dans leur intestin. 700 d'entre eux vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés à des perturbateurs endocriniens entre 72 et 120 heures après la fécondation, ils passent ensuite cinq séances d'imagerie sans anesthésie jusqu'à l'âge de trois mois, chacune d'une dizaine de secondes. Ils sont tués pour prélever leurs intestins et mesurer l'expression du gène, et le porteur présente la lignée transgénique comme un moyen de réduire le nombre de poissons employés dans les tests réglementaires.

Objectifs

Dans le cadre de l’étude des perturbateurs endocriniens en lien avec les pathologies métaboliques telles que l’obésité, le diabète ou la stéatose, nous développons une lignée transgénique de poisson zèbre apte à rendre compte d’effets de substances au niveau du métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme. La quantification de la fluorescence dans cette lignée transgénique permet de suivre l'expression de notre gène d'intérêt et est réalisée après exposition d’embryons issus de cette lignée à des substances pendant 48h, de 72 heures post-fécondation (hpf) à 120hpf. Afin d’étudier la réversibilité de la réponse de ce modèle nous souhaitons poursuivre les mesures de fluorescence au microscope au-delà de 120hpf, jusqu’à 3 mois. Les animaux ne seront donc pas exposés aux substances passé 120hpf. L’utilisation de la lignée transgénique apportera des informations complémentaires sur les mécanismes d’action des substances sans augmenter le nombre de poissons nécessaires à la réalisation des essais pour l’identification des perturbateurs endocriniens. A terme, le modèle que nous développons permettra d’évaluer l’impact de perturbateurs endocriniens en ayant recours à des embryons âgés de moins de 120hpf et les données générées au cours de ce projet permettront le développement/l’amélioration de voies de toxicité impactant le métabolisme qui pourront être utilisées pour une meilleure évaluation des dangers et des risques des perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire.

Bénéfices attendus

L’étude la réversibilité de la réponse après exposition des embryons de poissons zèbres aux substances de 72hpf à 120hpf permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes régulant cette réponse. Nous pourrons ainsi analyser si l’expression de la fluorescence, induite ou inhibée à la suite de l’exposition aux substances, persiste ou au contraire revient à la normale alors que les poissons n’y sont plus exposés. Ainsi, la fluorescence étant relative à l’expression de notre gène d'intérêt, acteur clé du métabolisme intestinal chez le poisson zèbre, cette expérimentation permettra d’étudier les effets au long terme (jusqu’à 3 mois) sur ce métabolisme à la suite d’une exposition courte (48h) aux substances inductrices ou inhibitrices de de ce gène. Dans le cadre du développement d’un modèle de poisson zèbre apte à rendre compte des impacts des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme, l’étude de la réversibilité de la réponse aux substances a toute son importance. Ces données participeront à la caractérisation du modèle et de fait à l’élaboration d’un outil d’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme chez l’Homme, au cœur des objectifs du projet européen dans lequel s’inscrivent ces travaux.

Procédures

Les poissons zèbres seront soumis à des prises d'image en microscopie à fluorescence. Les animaux (5, 7, 10, 15 et 20 jours post fécondation) ne seront pas anesthésiés mais resteront dans de l'eau tout le temps de l'imagerie qui ne durera que 10 secondes environ. Chaque animal sera soumis à 5 imageries au cours de l'expérimentation.

Impact sur les animaux

L’exposition aux substances réalisée en début d’expérimentation (de 72hpf à 120hpf) aura un effet sur l'expression de notre gène d'intérêt (et probablement d'autres qui ne seront pas mesurés) sur le court terme et peut être le long-terme mais aucun effet toxique ou développemental n'est attendu aux concentrations sélectionnées. Les manipulations répétées tout au long de l’expérimentation (la prise d'image au microscope à fluorescence) pourraient entrainer un stress chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les intestins pour réaliser des mesures d'expression du gène d'intérêt à l'aide de techniques de biologie moléculaire.

Remplacement

L’étude de la réversibilité de la réponse dans le modèle poisson zèbre que nous développons ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. En effet, cette expérimentation est essentielle à la caractérisation de ce modèle biologique, permettant de renseigner de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme à l’échelle de l’organisme entier, une problématique encore peu investiguée. Les modèles cellulaires ne permettent pas cette approche. Quant aux modèles mathématiques, s’agissant d’une problématique émergente, la modélisation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme est encore balbutiante. A terme, l’expérimentation menée ici permettra d’établir un modèle de poisson zèbre pertinent pour l’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme.

Réduction

L'utilisation d'animaux transgéniques pour le suivi des effets dans le temps des substances permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en réutilisant les mêmes individus à chaque temps d'étude. Les effectifs ont été calculé en tenant compte de la variabilité de l'expression de notre gène d'intérêt et de la mortalité normale au cours du développement afin de pouvoir mettre en évidence des effets des substances de plus de 50% (test statistique).

Raffinement

Les animaux sont conservés dans un environnement controlé connus pour engendrer un minimum de stress (aquariums teintés en bleu si possible avec un fond en décors graviers, paramètres physico-chimiques de l'eau et photopériode contrôlés). Ils sont hébergés en groupe afin de respecter leur comportement grégaire et limiter l’anxiété que pourrait entrainer l’isolement, en gardant des populations faibles afin d’éviter les comportements agressifs. Les poissons sont également nourris en partie avec des artémies vivantes, leur permettant ainsi d’enrichir l’éventail de leurs comportements sociaux, notamment celui de la chasse. Tout au long des expérimentations, les animaux seront suivi avec une grille de bien-être adaptée à chaque stade de développement. L'ensemble de ces procédures est réalisé par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est une des espèces recommandées pour la réalisation de tests réglementaires sur les perturbations endocriniennes. Sa petite taille permet des expositions dans de faibles volumes d’eau d’où une faible consommation de substances toxiques et une quantité de déchets générés moindre. Ces dernières années un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées et se sont avérées être des outils pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens tout en réduisant le nombre d'animaux.

Sortis de l'eau à l'épuisette puis amputés d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie, 36 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet veut établir si une analgésie doit compléter l'anesthésie lors de ce prélèvement de génotypage, ce qui suppose qu'un tiers des poissons le subisse sans analgésique. Après l'acte, ils passent moins de vingt-quatre heures seuls dans un bac sans circulation d'eau ni nourriture, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress, et leur locomotion est filmée dix minutes. Ils sont ensuite gardés vivants et réutilisés pour la reproduction, puis tués au bout de dix-huit mois.

Objectifs

L’élevage et le maintien de lignées transgéniques sont nécessaires à de nombreux projets scientifiques qui mènent leurs travaux de recherche sur le poisson zèbre au stade embryonnaire. Pour que les animaux soient des reproducteurs intéressants nous devons les choisir en connaissant leur patrimoine génétique. Pour ce faire nous devons avoir accès à leur ADN en faisant un prélèvement. Ce geste consiste à faire une biopsie de petite taille de la nageoire caudale des poissons de plus de 3 mois de manière à récupérer l’ADN qui se trouve dans ce tissu. L’objectif de ce projet sera de statuer sur la nécessité de mettre en place une analgésie péri-opératoire en plus de l’anesthésie générale lors de ce prélèvement. Ceci sera appuyé par une étude comportementale et une évaluation du bien-être des poissons à l’aide d’une grille de score en post-intervention sur la période de récupération. Une recommandation pourra alors être rédigée à l’issue de cette étude.

Bénéfices attendus

Le prélèvement de nageoire est une pratique très courante et est aujourd’hui la méthode de référence pour connaître le patrimoine génétique d’un poisson zèbre. Cette étude permettra d’apporter à la communauté scientifique les connaissances aujourd’hui manquantes de l’intérêt ou non de l’utilisation d’un analgésique lors d’un prélèvement de nageoire caudale chez le poisson zèbre. Ce projet pourrait permettre de partager par le biais d’une publication scientifique un protocole de prélèvement chez le poisson zèbre qui réponde aux exigences réglementaires, environnementales, de bien-être animal tout en étant prouvé dans sa mise en œuvre grâce à ce travail pour l’expérimentateur.

Procédures

Suivant le groupe auquel appartient l’animal, il est soumis ou non à un analgésique durant 30 minutes avant et après le prélèvement. Ce prélèvement est effectué sous anesthésie générale et ce une seule fois par animal. L’étude comportementale effectuée nous permet d’évaluer la locomotion du poisson ainsi que l’utilisation de la colonne d’eau durant 10 minutes. Au bout de 18 mois, les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les poissons sont sortis de l'eau avec une épuisette provoquant un stress et un frottement sur le corps de l’animal. Un prélèvement cutané de petite taille est fait au niveau de la nageoire caudale provoquant un léger traumatisme pouvant générer un inconfort et une gêne de courte durée pour l’animal. Le risque lié à l’anesthésie, comme l’arrêt respiratoire, est présent mais reste limité car l’anesthésie n’est pas une anesthésie très profonde ni très longue. Après le prélèvement, les aquariums ne sont pas remis en circulation et les poissons ne sont pas alimentés et ce durant moins de 24 heures. Restant seuls durant ce laps de temps, ils peuvent montrer des signes de stress.

Devenir

A l’issue de la procédure les poissons sont gardés en vie pour une éventuelle réutilisation comme de la reproduction.

Remplacement

Pour comprendre certaines maladies qui touchent l’être humain, les chercheurs ont besoin d’un modèle animal qui puisse se rapprocher le plus possible du génome humain. Il a été montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes semblables aux gènes humains dont 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. Il présente l’avantage d’être facile à élever et d’avoir des embryons uniformes et transparents qui se développent en dehors de la femelle. De plus, il est possible de le rendre transparent à l’âge adulte grâce à une mutation génétique. Ainsi, inutile de procéder à une dissection ou à des méthodes invasives destinées à observer des effets dans le corps du poisson. Son élevage et le maintien de lignées transgéniques sont nécessaires à de nombreux projets scientifiques. Il nous faut donc connaître leur patrimoine génétique. Notre objectif portant sur la méthode de prélèvement pour connaître le patrimoine génétique des poissons et sur la prise en charge de la douleur associée, il n’est pas possible d’envisager un remplacement.

Réduction

Pour cette étude notre effectif a été défini à l’aide d’un test statistique. Nous testons un anesthésique avec ou sans 2 analgésiques, ce qui donne 3 groupes. 12 animaux sont testés par groupe, c’est pourquoi nous utilisons 36 animaux au total. Nous étudions la locomotion et l’occupation de la colonne d’eau grâce à des vidéos ainsi que la cicatrisation de la nageoire caudale grâce à des photos. Chaque expérience est faite une seule fois par poisson. Les résultats sont analysés avec un test statistique.

Raffinement

Les poissons sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les poissons sont mis à jeun le matin de l’expérience afin de préserver la qualité de l’eau. Durant l’expérience, ils sont transférés délicatement à l’aide d’une épuisette entre chaque bac. Ils sont mis en acclimatation individuellement afin de limiter leur stress. Pour les groupes traités, on ajoute au goutte à goutte de l’analgésique de la manière la plus homogène possible sur la totalité de la surface de l’aquarium pour permettre au poisson de s’habituer. Le bain contenant l’anesthésiant est tamponné pour limiter le comportement anxiogène du poisson. Ce dernier est sorti de l’eau à l’aide d’une cuillère en plastique percée atraumatique et déposé sur une surface plane en plastique afin de réaliser le prélèvement. La taille de celui-ci est réduite au maximum. Tout au long de l’expérience des vidéos sont réalisées pour observer le poisson sans le perturber et minimiser son stress. Le poisson reste moins de 24 heures dans le bain sans circulation d’eau ni nourrissage sur une étagère sans lumière directe. Un suivi est effectué avec une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, rétraction des pigments. Cela nous permet d’attribuer un score et de mener les actions nécessaires afin de réduire le stress ou la douleur après prélèvement. Suivant le score attribué au poisson, il sera euthanasié. Nous formons à la suite de l’isolement des couples mâle – femelle qui vont nous permettre d’identifier chaque individu et de poursuivre le suivi. Ces couples sont transférés dans des aquariums puis remis en circulation.

Choix des espèces

Pour comprendre certaines maladies qui touchent l’être humain, les chercheurs ont besoin d’un modèle animal qui se rapproche le plus possible du génome humain. Le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes semblables aux gènes humains dont 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, ce qui en fait un très bon candidat. Il présente l’avantage d’avoir des embryons uniformes et transparents qui se développent en dehors de la femelle. Il est également possible de le rendre transparent à l’âge adulte grâce à une mutation génétique. L’élevage et le maintien de lignées mutées sont donc indispensables pour de nombreux projets scientifiques. L’objectif de notre projet étant de récolter des données pour la mise en place de meilleures conditions de prise en charge lors de la réalisation du prélèvement, il est donc pertinent de travailler directement sur cette espèce. Les animaux seront prélevés entre 3 et 6 mois de vie. Cet âge assure une gestion plus facile de l’anesthésie par rapport aux stades plus jeunes et assure une meilleure récupération. Cela permet aussi d’avoir un pourcentage de prélèvement de tissu suffisamment faible par rapport à la taille totale du poisson.

Chaque truite passe trente minutes seule dans un bac, puis vingt minutes en groupe. 120 truites fario juvéniles sont ainsi testées, sur 200 individus capturés à la pêche électrique et utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objectif déclaré est de savoir si le bruit d'écoulement produit par un barrage ou une passe à poissons modifie le comportement des poissons dans leur habitat, et le porteur affirme qu'aucune substitution n'est possible, ni par organoïdes ni in silico, parce qu'il faut des "organismes entiers" dotés de toute leur intégrité sensorielle. Aucune truite n'est remise à l'eau, ni les 120 testées ni les 80 surnuméraires, toutes étant tuées pour prélever leurs organes sensoriels internes, dans un projet rattaché aussi à la préservation des espèces.

Objectifs

Bien moins évidente et étudiée que d'autres types de perturbations, la pollution sonore d'un écosystème a récemment reçu un sursaut d'intérêt, avec la démultiplication des études montrant comment elle peut affecter la communication, la reproduction, la migration et la recherche de nourriture chez de nombreuses espèces. Le milieu aquatique n'y fait pas exception avec la propagation des sons pouvant s'effectuer sur de longues distances. Si l'effet de productions sonores actives intenses (e.x. forage, transport motorisé, centrale) dans le domaine côtier a largement été étudié, des effets peuvent également se faire ressentir en milieu dulçaquicole et modifier l'ambiance sonore en réaction à des sources plus diffuses, notamment celles des infrastructures construites dans les cours d'eau, tels que les barrages. Il ne s’agit donc pas tant ici de la production de sons que de la modification des profils d’écoulement de l’eau en relation avec la présence d’aménagements artificiels. Les éventuelles perturbations sensorielles/comportementales occasionnées chez les poissons sont largement méconnues, tout comme la détermination du rayon d'influence acoustique d'une infrastructure dans un cours d'eau. Ce projet doit permettre de déterminer si une modification de l’ambiance sonore par une infrastructure hydraulique passive (non motorisée) de type barrage, canalisation ou passe-piège est susceptible de localement modifier le comportement des poissons dans leur habitat naturel.

Bénéfices attendus

Étant donné le grand nombre d'ouvrages dans les cours d'eau français (la France métropolitaine disposant de l’un des plus grands parcs hydroélectriques en Europe, sans mentionner la multitude d’infrastructures de moindre incidence : seuils, enrochements, pilier de soutènement routier, pompage pour irrigation des champs … ) et la proximité de certaines frayères avec ces sources sonores liées aux activités humaines, il serait bénéfique en terme de gestion de considérer l'impact de cette pollution sonore sur les organismes qui y vivent, notamment les poissons. Que cela soit au niveau d'un barrage, d'une passe à poisson, d'une infrastructure routière (pied de soutènement), d'une centrale hydroélectrique ou tout simplement d'habitations, les émissions sonores associées pourraient altérer le choix d'habitat, le comportement sexuel ou les interactions inter-individuelles. Au-delà de cette prise de conscience et de l'estimation de la zone d'influence de ces infrastructures, les données pourraient à terme conduire à des recommandations d'atténuation/aménagement limitant leur emprise sonore. Les barrages et les passes pièges pourraient ainsi améliorer leur attractivité (ou diminuer leur répulsivité), favorisant leur franchissabilité et assurant une meilleure continuité écologique dans nos cours d’eau (méthode d’Information sur la Continuité Ecologique, ICE). La zone d’impact d’une pollution sonore anthropogénique pourrait également être prise en compte lors d’aménagements territoriaux (proximité d’implantation d’installations industrielles et de zones protégées/sensibles).

Procédures

- Prélèvement par pêche (1fois par individu, 200 individus). - Maintien des individus dans des bacs d'aquaculture dont l'ambiance sonore reproduit celle rencontrées en milieu naturel (120 individus, 30 minutes individuellement + 20 minutes collectivement).

Impact sur les animaux

Les nuisances pourraient être de deux types. i) D’une par concernent la capture au moyen d’une pêche. Les individus se remettent généralement très rapidement de cette pêche ii) D’autre part, les individus seront temporairement placés ex situ dans des conditions expérimentales (bacs d’aquaculture), seuls puis en groupe, présentant des ambiances sonores reproduisant celles préalablement enregistrées en milieu naturel. Ces changements d’ambiances pourraient entrainer un stress temporaire chez les individus même si nous nous attendons à de très légères modifications comportementales.

Devenir

Il n’est pas possible de remettre en liberté les individus, ni ceux ayant servi aux tests comportementaux, ni les éventuels surnuméraires. Tous seront ainsi anesthésiés/euthanasiés afin de réaliser les prélèvements nécessaires au phénotypage/analyses génétiques/prélèvement organes sensoriels internes.

Remplacement

Ce projet s’intéresse aux interactions sensorielles entre des individus vivants (reposant principalement sur l’oreille interne, mais également sur les mécanorécepteurs de la ligne latérale) et la composante acoustique de leur environnement, ainsi que leurs effets comportementaux (intégration multisensorielle et traitement par le système nerveux central). Afin d’extrapoler nos résultats au milieu naturel, il est indispensable de travailler sur des organismes entiers présentant toute leur intégrité sensorielle et cognitive. Dans ce contexte, aucune substitution n’est possible ni en utilisant des organoïdes, ni en utilisant une approche in silico.

Réduction

Dans notre dispositif, il nous faudra analyser le comportement de 120 poissons. Sachant que la mortalité des alevins à un stade précoce peut être assez importante (compétition chez cette espèce territoriale), allant jusqu’à environ 60% (néanmoins inférieure à celle observée en conditions naturelles), nous souhaiterions ainsi pouvoir travailler avec un total de 200 individus (mis en croissance), dont seulement 120 seront utilisés pour les tests comportementaux. Cet effectif correspond à un strict minimum permettant de répondre aux attentes scientifiques tout en accommodant des contraintes techniques.

Raffinement

La première phase de croissance se tiendra dans des conditions semi-naturelles tout spécifiquement dédiées à la croissance des salmonidés. Dérivant partiellement l’eau de la rivière avoisinante où l’espèce est naturellement présente, les conditions seront les mêmes que dans le milieu naturel (substrat, débit, proies/alimentation, présence de refuges, température, oxygénation). La capture par pêche électrique sera réalisée par une équipe expérimentée et habilitée avec un matériel et un champ électrique adapté aux juvéniles de salmonidés. Si plusieurs passages de pêche sont nécessaires pour capturer les poissons, ils seront espacés d’une demi-journée afin de ne pas créer des stress répétitifs proches dans le temps. Dans ces conditions, les individus pêchés ne présentent généralement aucune séquelle ni effet indésirable notable. La seconde phase de la procédure en milieu contrôlé sera réalisée dans des bacs alimentés directement par de l’eau du chenal où la croissance est réalisée, avec la même qualité physico-chimique. Les principaux paramètres physico-chimiques seront cependant régulièrement suivis (au moins une fois par jour) pour s’assurer de cela et l’eau sera oxygénée à l’aide de bulleurs. L’eau de chaque bac expérimental sera partiellement renouvelée entre le passage de chaque poisson. Contrairement à beaucoup d’études s’intéressant à des sons d’intensité importante (fracturation hydraulique, forage, motorisation de bateau, turbines hydroélectriques, etc.) nous nous intéressons ici à des infrastructures hydrauliques passives (non motorisées) ayant pour conséquence de moduler localement l’ambiance sonore (composition spectrale de l’environnement sonore) générée par l’écoulement de l’eau, le transport de sédiments, le clapotis de surface, la réverbération des sons par des surfaces artificielles, etc. Dans ce contexte, les ambiances sonores qui seront reproduites le seront avec une intensité modérée, n’excédant jamais celles quantifiées/rencontrées en conditions naturelles par les poissons. Dans tous les cas, les intensités sonores reproduites resteront toujours très en deçà du seuil de douleur/lésion. Une grille précise et quantitative des points limites a été définie et sera appliquée.

Choix des espèces

Le projet porte exclusivement sur des alevins (en fin de résorption vitelline)/juvéniles (taille généralement comprise entre 4 et 10 cm) de truite fario qui est une espèce commune et emblématique de nos cours d’eau (tant d’un point de vue culturel qu’économique) dont la continuité écologique est à plusieurs reprises entravée au cours de son cycle de vie par la présence d’infrastructures hydrauliques dans les rivières. Afin de minimiser l'impact sur les populations naturelles, les poissons utilisés seront tous issus d'une pisciculture produisant en grande quantité des alevins à partir de géniteurs sauvages. Des alevins sont exclusivement utilisés car leur survie en milieu naturelle est la plus à même d'être affectée par l'activités sonore anthropique (sensibilité, faible dispersion).

Tous relâchés en milieu naturel à l'issue de l'expérience, 60 jeunes anguilles et 60 larves de lamproie marine vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont d'abord capturés par pêche à l'électricité ou par tamisage du sable, marqués sous anesthésie par une injection sous-cutanée d'élastomère coloré, puis placés dans un aquarium dont le niveau d'eau baisse de deux centimètres par jour pendant vingt-cinq jours jusqu'à l'assèchement d'une partie du sable. Aucun abri ne leur est fourni, pour que les caméras gardent la vue sur eux. Le porteur indique que la marque colorée pourrait augmenter le risque qu'un prédateur les repère après leur remise à l'eau, et que le comportement d'enfouissement étudié ne peut s'observer que sur des individus vivants.

Objectifs

L'objectif du projet est de décrire la réaction de larves de lamproies et de jeunes anguilles lors d'une diminution importante du niveau d'eau. L'alternative est 1) la fuite lors de la baisse progressive du niveau d'eau, vers des zones refuges présentant une plus grande hauteur d'eau, ou 2) l'enfouissement temporaire dans le sable humide, en attendant que l'eau revienne à un niveau suffisant pour reprendre l'activité normale. En effet, des données préliminaires laissent penser que les larves de lamproies et les jeunes anguilles pourraient survivre plusieurs semaines enfouies dans le sable humide en absence d'écoulement superficiel d'eau. En revanche, la proportion d'individus optant pour cette stratégie n'est pas quantifiée. Or, cette stratégie, peut-être adaptée pour des assèchements brefs et superficiels, peut éventuellement devenir un piège en cas d'assèchement prolongé ou profond. Pour évaluer la proportion d'individus optant pour chaque stratégie, nous placerons 60 jeunes anguilles et 60 larves de lamproie marine (chaque espèce séparément) dans un aquarium où le niveau d'eau sera progressivement abaissé (2 cm par jour pendant 25 jours) jusqu'à assècher progressivement une surface croissante de sable. Durant l'abaissement du niveau d'eau, les poissons auront le choix de s'enfouir dans le sable ou de nager vers des zones où l'eau superficielle subsistera. L'observation directe et l'enregistrement vidéo permettront d'identifier les individus ayant opté pour chaque stratégie, et de tester si la probabilité d'adopter une ou l'autre stratégie dépend de la taille des individus.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet portent sur la réponse d'espèces patrimoniales (l'anguille européenne et la lamproie marine) aux diminutions importantes du niveau d'eau conduisant à des assèchements progressifs de rivière, et seront intégrés dans des modèles visant à prédire l'évolution des populations naturelles dans des environnements soumis au changement climatique. Les connaissances acquises pourront éclairer les stratégies de gestion visant à limiter l'impact du changement climatique sur les écosystèmes aquatiques.

Procédures

Les individus seront capturés en milieu naturel, par pêche à l'électricité pour les anguilles et par pêche à l'électricité ou tamisage de sable pour les lamproies. Lors de la pêche à l'électricité, les anguilles seront exposées au champ électrique pendant quelques secondes puis placées en bac de stabulation. Le tamisage de sable dure environ 5 minutes, après quoi les lamproies sont placées dans un bac de stabulation où elles peuvent à nouveau s'enfouir. Lors du test comportemental chaque individu sera exposé une fois à une baisse progressive du niveau d'eau jusqu'à l'assèchement partiel de l'aquarium. Chaque individu optant pour la fuite à la nage sera collecté dans un piège de type nasse contenant un abri, d'où il sera retiré dans les 12 heures pour être placé en stabulation. Les individus optant pour l'enfouissement seront tous collectés dans le sable en fin d'expérience. Le marquage est effectué une seule fois sous anesthésie, et consiste à l'injection sous-cutanée d'un très petit volume d'élastomère. L'injection dure quelques secondes, et le délai entre le début de l'anesthésie et le réveil est d'environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels sont liés au stress impliqué par la capture en milieu naturel, l'anesthésie, l'assèchement partiel généré dans l'aquarium et la collecte des individus enfouis dans le sable. Pour limiter l'accumulation de stress, les manipulations (capture et transfert d'un dispositif à l'autre, collecte dans le sable, marquage) seront réalisées minutieusement et rapidement, et seront espacées par des phases d'acclimatation dans l'aquarium et les bacs de stabulation. La présence de la marque colorée pourrait causer une gêne liée au volume injecté et augmenter le risque de détection visuelle par des prédateurs sur les individus, qui seront relâchés en milieu naturel après l'expérience. Ces effets indésirables seront limités par la minimisation du volume d'élastomère injecté, qui ne sera visible que par une inspection minutieuse à la loupe.

Devenir

Tous les individus utilisés seront relâchés en milieu naturel, pour limiter l'effet négatif de notre expérimentation sur les populations dont les individus sont issus.

Remplacement

Le projet porte sur le comportement d'enfouissement de poissons face à un changement de conditions environnementales, et ne peut donc être mené qu'avec des individus vivants appartenant à des espèces capables d'exprimer ce comportement.

Réduction

L'analyse statistique consistera à estimer la probabilité qu'un individu adopte la stratégie de fuite ou d'enfouissement, en fonction de sa longueur corporelle. Un effectif de 60 individus de chaque espèce (donc 120 au total) nous permettra de détecter significativement un lien statistique entre le comportement et la longueur corporelle.

Raffinement

Dès leur capture en milieu naturel, les individus seront placés dans des seaux contenant du sable et des abris pour se cacher. Le marquage par injection d'élastomère et la biométrie seront effectués sous anesthésie, par une équipe expérimentée, selon une procédure ne durant pas plus de 5 minutes entre le début de l'anesthésie et le réveil. Lors de la stabulation les individus seront maintenus dans des bacs d'élevages alimentés en eau de rivière et aménagés avec du sable et des abris (pierres, tuiles). Ils seront nourris (sauf dans les 24h précédant l'anesthésie) par distribution de vers de vase (anguilles) ou par le dépôt de litière en décomposition (lamproies). La qualité de l'eau (température, pH, sels nutritifs) sera contrôlée deux fois par jour. Le test comportemental consistant à simuler une diminution importante du niveau d'eau sera effectué dans un aquarium contenant 60 individus pour 10m^2 de sable, une densité comparable à certaines situations en milieu naturel. Aucun abri ne sera fourni, pour ne pas empêcher la visibilité des individus sur les vidéos, mais l'alimentation sera maintenue tant que l'eau libre circulera au-dessus du sable. La qualité de l'eau dans l'aquarium expérimental sera contrôlée deux fois par jour. Lors de la stabulation, et des tests comportementaux, les poissons seront observés directement par les expérimentateurs en journée, et filmés en continu grâce à des caméras haute sensibilité diffusant des vidéos consultables à distance et en direct par les expérimentateurs. En cas d'état sanitaire mettant en péril le bien-être de l'individu (lésions, saprolegniose) ou de comportement altéré (difficulté à s'enfouir, posture déséquilibrée, nage saccadée), l'individu serait retiré du dispositif, placé en observation et éventuellement euthanasié.

Choix des espèces

Les espèces ont été choisies pour leur intérêt patrimonial, justifiant la compréhension de leurs mécanismes d'adaptation aux conditions écologiques défavorables accentuées par le changement global. Les stades utilisés sont le stade larvaire pour les lamproies et le stade juvénile pour les anguilles. La bibliographie mentionne la capacité de ces stades à s'enfouir dans le sable ou à se déplacer dans la rivière lorsqu'elles sont soumises à des diminutions importantes du niveau d'eau conduisant à un assèchement partiel des cours d'eau. Leur style de vie est complémentaire : les larves de lamproies vivent normalement enfouies dans le sable mais peuvent nager en eau libre pour s'enfuir, alors que les jeunes anguilles vivent normalement en eau libre mais peuvent s'enfouir. Les résultats de ce projet alimenteront les stratégies de gestion de ces espèces.

Trois lésions cutanées perforées au trépan à biopsie, puis six prises de sang en vingt-trois jours : 108 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever le tissu cicatriciel, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'objet est de mesurer si le rapport entre deux acides gras d'une huile de microalgues change la vitesse de cicatrisation, question laissée ouverte par un projet précédent. Le porteur décrit un saignement au point de ponction, une réaction inflammatoire et une possible absence de guérison, atteintes qu'il classe pourtant au niveau de souffrance le plus bas. Il justifie les blessures infligées par l'enjeu du bien-être des poissons d'élevage et par les tonnes de poissons sauvages que l'huile de microalgues permettrait d'épargner.

Objectifs

La cicatrisation chez les poissons d’élevage est un enjeu majeur pour l’aquaculture moderne. Les blessures, fréquentes lors des manipulations, du transport ou des interventions sanitaires, favorisent les infections et augmentent la mortalité. Les pertes économiques liées aux maladies en aquaculture sont estimées à 6 milliards USD par an, et peuvent représenter jusqu’à 15 % de la production dans certains pays tels que l’Inde. Une cicatrisation efficace contribue au bien-être animal, limite les pertes, réduit le recours aux antibiotiques et garantit la qualité nutritionnelle des produits. Si le processus de cicatrisation est bien connu chez les mammifères, les recherches chez les poissons sont récentes et montrent l’importance de solutions nutritionnelles sur le processus de cicatrisation cutanée. Les acides gras polyinsaturés, notamment l’EPA (acide eicosapentaénoïque), jouent un rôle clé dans l’intégrité de la barrière cutanée et la cicatrisation des plaies. Cependant, la tendance à remplacer l’huile de poisson par des huiles végétales, plus durables et économiques, réduit la teneur en oméga-3 dans les régimes aquacoles, impactant la santé des poissons et la qualité nutritionnelle des filets. Un précédent projet a montré qu’un régime enrichi en EPA+DHA via une huile de microalgues améliorait la cicatrisation par rapport à un régime standard à base d’huile de poisson. En revanche, l’hypothèse selon laquelle le ratio EPA:DHA influencerait le processus de cicatrisation n’a pas pu être confirmée. En effet, le déroulement de la cicatrisation entre les deux huiles différentes de microalgue testée étaient comparables. L’objectif de cette nouvelle étude est donc d’utiliser le modèle de cicatrisation validé dans un précédent projet pour évaluer l’impact de la teneur en EPA par rapport au DHA sur la cicatrisation des lésions cutanées chez la truite.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans l’amélioration des conditions d’élevage des salmonidés. Il permettra d’évaluer le bénéfice des solutions nutritionnelles sur l’amélioration de la cicatrisation cutanée chez la truite arc en ciel, en étudiant 1) l’impact des taux élevés d’omega-3 dans l’aliment et 2) l’importance du ratio EPA:DHA dans le processus de cicatrisation des lésions cutanées chez la truite arc-en ciel. De plus, l’utilisation de l’huile de microalgues dans la formulation permettra de formuler des régimes plus concentrés et d’utiliser moins d’huile et de poissons. En effet, 1 tonne d’huile de microalgues remplace 60 tonnes de poissons sauvages. Chaque année, son utilisation évite la capture d’environ 1,2 million de tonnes de poissons destinés à la production d’huile et une réduction des émissions de gaz à effet de serre (-5,6 % en 2024 par rapport à 2021). La Stabilité et la sécurité d’approvisionnement en huile de poisson sont soumises à la volatilité des prix et aux aléas climatiques (El Niño) contrairement à l’huile de microlagues qui offre un approvisionnement stable et prévisible, sans dépendance à la pêche.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 23 jours. [[Les poissons seront soumis à trois lésions à l'aide d’un trépan à biopsie (durée 15 secondes) afin d’être plus représentatif de la taille et du nombre de blessure observés dans les élevages industriels]]. Aux jours 0, 3, 7,10,14 et 21 post-lésion des prises de sang seront réalisées. A chaque temps, un volume sanguin nécessaire et suffisant pour l'analyse des paramètres biochimiques sera prélevé sur chaque poisson anesthésié. Pour chaque prise de sang, le temps ne dépassera pas 1 minute. Temps de sortie des poissons hors de l’eau pour les pesées (3 secondes) et pour les identifications (3 secondes).

Impact sur les animaux

Changement du comportement alimentaire, saignement localisé au niveau du site de ponction du tissu. Réaction inflammatoire dans les premiers jours de la cicatrisation, absence de guérison avec rétrécissement de la lésion.

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort à l’issu de la procédure afin de réaliser des prélèvements de tissu cicatriciel au niveau de la blessure.

Remplacement

Au moment de la délivrance de cette autorisation de projet, il n'existe pas de modèle in vitro ou in silico capable de mimer l’intégralité des acteurs cellulaires et acellulaires participant à la complexité des processus de cicatrisation et à la modulation de cette réponse par la nutrition. De plus l’évaluation d’un additif alimentaire, implique de connaitre son mode d’action chez l’animal auquel il est destiné impliquant l'utilisation d'animaux vivants..

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre minimum d'animaux à utiliser pour évaluer ce projet. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d'obtenir une densité adéquate pour favoriser une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux. Des analyses post mortem seront réalisées sur les tissus cicatriciels de chaque animal afin de générer un maximum d'information possible par animal.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux sont définies afin que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux, l'enrichissement des bassins ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et répondent à la législation en vigueur. Aucun animal ne restera isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux. Avant toute manipulation (pesée ou prélèvement) au cours de cette étude, les truites arc en ciel sont anesthésiées. La capture et le stress dus à la sortie des bassins sont réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs lors des pesées, des prises de sang et des mesures. Les conditions expérimentales sont également raffinées par un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’une mousse humide pour faire reposer l’animal sur un support de contention adapté, d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans une procédure interne qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. Un analgésique sera utilisé par voie intramusculaire afin de réduire la douleur après l’introduction du transpondeur et lors de la réalisation des lésions afin de permettre une meilleure récupération et une réduction des effets secondaires comme les frottements de l'animal contre les murs. Un minimum de deux observations quotidiennes des animaux est réalisé afin de détecter prématurément des signes cliniques de dommages corporels et pour vérifier que les poissons s’alimentent correctement. Dès l’observation d’un signe clinique, les animaux sont suivis au moyen d’une grille de score de point limites.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la truite arc-en-ciel, en tant que modèle animal de salmonidé. La truite est un bon modèle pour les salmonidés car elle est taxonomiquement proche du saumon et de physiologie comparable. Les fonctionnalités nutritionnelles sont les mêmes, les deux poissons étant carnivores, les besoins nutritionnels sont les mêmes. Par conséquent, la réponse physiologique de la truite au cours de l'étude sera la même que celle des autres salmonidés, les résultats pourront donc être transposés chez le saumon. La truite est également un animal plus résistant aux conditions d'élevage, aux maladies, avec un taux de croissance plus élevée permettant de rester dans le cadre du développement d’un modèle de cicatrisation subclinique. Au début de l’étude les truites pèseront 85 grammes. Elles seront élevées pendant 4 semaines, puis, à 160 g les poissons seront blessés et un suivi de cicatrisation sera réalisé pendant 23 jours. Le poids final des poissons à la fin de l’étude sera de 200 g.