Rongeurs
Etude des facteurs influençant la dynamique de colonisation et de clairance digestive lors d’une infection à Clostridioides difficile
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Toutes tuées en fin de procédure pour que soient prélevés les segments de leur tube digestif, 280 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont suivies pendant près de six semaines, reçoivent jusqu'à vingt gavages oro-gastriques pour être infectées par Clostridioides difficile puis réinfectées et traitées aux antibiotiques deux fois par jour pendant huit jours, subissent deux injections dans l'abdomen et deux prélèvements de sang par la joue sous anesthésie. L'infection provoque des diarrhées et une perte de poids que le porteur qualifie de légère à modérée et spontanément résolutive en deux à trois jours. Le recours exclusif à des femelles est justifié non par la biologie de l'infection mais par la "nécessité" de cohérence avec les essais antérieurs de l'équipe.
Objectifs
Clostridioides difficile est une bactérie capable de coloniser le microbiote digestif après sa perturbation par des antibiotiques (ATB). Une fois implanté dans le tube digestif, cette bactérie va provoquer une diarrhée sous l’action des toxines qu’elle produit. Les infections à C. difficile (ICD) sont caractérisées par un taux important de récidive (25% des cas), parfois multiples et particulièrement invalidantes pour les patients malgré un traitement antibiotique bien conduit. A ce jour, les déterminants conduisant à la récidive sont encore mal connus. Plusieurs hypothèses non exclusives ont été avancées pour expliquer leur survenue notamment 1) la persistance de la perturbation du microbiote induite initialement par les antibiotiques, voire la perturbation additionnelle induite par les antibiotiques utilisés dans le traitement des ICD ; 2) une réponse immune non efficace pour neutraliser l’action des toxines produites par la bactérie ; 3) la persistance de la bactérie sous sa forme sporulée (forme de résistance non sensible à l’action des antibiotiques) ou sa survie dans des niches écologiques digestives non accessibles aux antibiotiques. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet a pour objectif de mieux comprendre le processus de colonisation digestive et les déterminants favorisant une disparaition complète de la bactérie du tube digestif ou au contraire la récidive et notamment la rechute à partir de bactéries persistantes dans le tractus digestif sous une forme ou dans une niche écologique particulière à identifier
Bénéfices attendus
Les données qui seront obtenues au cours de ce projet permettront de mieux comprendre le mode de survie de C. difficile au sein du tractus digestif (forme et localisation) permettant la récidive de l'infection et d'identifier des espèces bactériennes associées à la colonisation et à la décolonisation digestive de C. difficile. Elle permettra également de préciser la cinétique de mise en place d'une réponse immune efficace avec la prodcution d'anticorps neutralisant l'action des toxines et son rôle dans le processus de protection de l'hôte contre l'action des toxines produites par la bactérie. Ces données sont essentielles pour identifier et construire les bases de nouvelles stratégies de prévention de traitement des ICD complémentaires aux antibiotiques et limiter le risque de récidive que ce soit par l'utilisation de probiotiques de nouvelles génération et/ou de stratégies d'immunisation notamment la vaccination.
Procédures
Les animaux seront suivis tous les jours longitudinalement pendant près de 6 semaines. Au cours de cette période, ils seront soumis à 2 injections intrapéritonéales sous anesthésie locale du point d’injection (durée de l'IP 30 secondes à 1 minute), à des gavages oro-gastriques (de 1 à 20 selon les procédures) pour l’infection et la réinfection et l'administration biquotidienne des traitements antibiotiques pendant 8 jours (durée du gavage 30 secondes à 1 minute). Il sera également réalisé des prélèvements quotidiens de selles, à 2 prélèvements de sang par voie submandibulaire sous anesthésie générale (durée 2 à 3 minutes).
Impact sur les animaux
Le poinçonnage aux oreilles peut provoquer une douleur légère de courte durée. Les piqures d’aiguille pour les injections intrapéritonéales peuvent provoquer une douleur légère de courte durée. Les gavages orogastriques des animaux pour d’une part pour provoquer une infection digestive et d’autre part pour l’administration par voie orale des antibiotiques du traitement de l’infection peuvent provoquer un stress durant le geste dont la durée est courte. L’infection digestive par C. difficile peut provoquer chez les animaux infectés des signes digestifs de type diarrhée, avec perte de poids légère à modérée liée à une déshydratation légère. Ces signes seront spontanément résolutifs après 2 à 3 jours et l’infection dans ce modèle n’est ni sévère, ni mortelle. Au cours de l’infection, les animaux seront suivis quotidiennement : observation clinique, pesée, recueil des selles et changement de litières. Cette surveillance quotidienne n’occasionne aucune douleur mais peut également provoquer une angoisse légère dans la mesure où elle nécessite de manipuler l’animal. Au cours de ces essais, un prélèvement de sang sera réalisé par voie sous mandibulaire susceptible de provoquer une douleur légère et de courte durée liée à l’incision et un stress du à la manipulation de l’animal mais minimisée par l’anesthésie préalable des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure expérimentale car le prélèvement de différents segments du tube digestif permettra d’identifier le site de persistance de la bactérie dans le tube digestif potentiellement à l’origine des récidives des ICD.
Remplacement
Le recours à l'animal est indispensable pour étudier les différents facteurs impliqués dans le processus de colonisation et décolonisation digestive de C. difficile. Aucun modèle in vitro, ex vivo ou in silico n'est capable de reproduire la complexité du processus infectieux dans son intégralité (réponse immune et perturbation du microbiote digestif). Pour les études portant sur le microbiote, les essais de colonisation chez l'animal restent une étape incontournable pour étudier son rôle, car même les expériences sur modèles cellulaires en trois dimensions ou en biofermenteurs modélisant le tube digestif ne permettent pas de reproduire idéalement le processus infectieux global.
Réduction
La méthodologie de ce projet a été construite sur la base des données déjà collectées au sein de notre équipe et celles de la littérature. Cette expérience acquise nous a ainsi permis de nous focaliser sur les points d’intérêt importants de suivi des animaux et de ne pas démultiplier inutilement les temps de suivi. De plus, une planification statistique rigoureuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 280, tout en préservant la validité statistique des résultats de l'étude. L’étude de la rechute, à distance du premier épisode, est intégrée dans l’essai de suivi cinétique de la colonisation et de disparaition digestive lors de ce premier épisode afin de limiter le nombre d’essai et d’animaux nécessaires. Enfin, les groupes contrôles des animaux ont été mutualisés aussi souvent que possible.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 4 par cage avec un tunnel de carton et du papier pour construction de nids comme enrichissement. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer qu'ils subissent le minimum de stress possible. Les litières seront changées quotidiennement pendant la période d’infection et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. Du gel hydrique sera mis dans les cages afin de faciliter la réhydratation des animaux pendant toute la période des signes cliniques de diarrhées. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée avec une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables.
Choix des espèces
Le modèle d’infection chez la souris est maintenant établi et classiquement utilisé dans les protocoles d’étude de la colonisation et d’infection digestive par C. difficile par toutes les équipes de recherche travaillant sur ce sujet. Ce modèle se rapproche de l'histoire naturelle de l’ICD non compliquée observée chez l'Homme. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 8 semaines. Ce choix est motivé par la nécessité de travailler à la fois sur des animaux ayant atteint l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation et d'infection par C. difficile déjà décrit par notre équipe et d’autres équipes. Enfin, le choix d’animaux femelles est également motivé par la nécessité de cohérence et d'homogénéité avec nos essais précédents sur la même thématique.
Impact des fongicides sur les fonctions de l’unité gliovasculaire au cours du développement cérébral (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injection intraveineuse de billes magnétiques, injection d'un produit de contraste dans les enveloppes du cerveau, incision de la peau : 420 souris subissent ces interventions sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Les femelles reproductrices reçoivent des fongicides avant l'accouplement, pendant la gestation et pendant l'allaitement, et leur descendance est suivie jusqu'au stade adulte pour observer les vaisseaux du cerveau. Les séances d'imagerie durent jusqu'à une heure par jour, sur deux jours. Les doses administrées sont celles autorisées dans l'eau potable par l'Union européenne et présentées comme non nuisibles pour la santé, alors que l'objet déclaré du projet est de déterminer les effets nocifs qui peuvent en découler.
Objectifs
De récentes études épidémiologiques suggèrent que l’exposition aux pesticides est associée à des troubles neurodéveloppementaux. La majorité de ces études se focalisent sur les neurones et les cellules gliales, cependant une composante reste encore largement inexplorée : la composante vasculaire. Ce projet est divisé en deux parties : - Partie 1 du projet dans l'Etablissement utilisatuer 1 : administrations de fongicides aux animaux géniterus, afin d'étudier les fonctions vasculaires des animaux issus de femelles traitées avant l'accouplement, pendant la gestation et lactation puis après leur sevrage. - Partie 2 du projet dans l'Etablissement utilisateur 2 : étude de l'action des fongicides sur le développement cérébral, plus particulièrement la composante vasculaire, avec deux techniques d'imagerie fonctionnelle peu invasives, pour observer l'inflammation vasculaire, les flux liquidiens dans le cerveau ainsi que le couplage neurovasculaire. Nous réaliserons cette étude dans des modèles murins "sains" et prédisposés génétiquement aux troubles du spectre autitiques, et ce chez les deux sexes. Pour cette étude nous utiliserons un nombre total de 420 animaux.
Bénéfices attendus
Notre étude permettra de mieux comprendre le mode d’action des fongicides sur le développement cérébral d’animaux sains et prédisposés génétiquement aux troubles du spectre autistique, dans l’espoir d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter au plus tôt contre les malformations cérébrales induites par les pesticides, même à faibles doses.
Procédures
Certains lots de souris subiront des interventions (dans l'Etablissement Utilisateur 2) de type : injection intraveineuse de billes magnétiques, injection intra-cisternale de produit de contraste ou une incision de la peau. Toutes ces interventions seront réalisées sur un animal anesthésié et analgésié. La durée de la procédure 2 sera de 40 minutes environ (injection + imagerie). La procédure 3 sera séparée en 2 jours, l'imagerie durera 1h chaque jour. La procédure 4 durera environ 20 minutes.
Impact sur les animaux
Certains lots de souris subiront des interventions (injection intraveineuse) qui peuvent entraîner des effets modérés (irritation au site d'injection). Les lots d'animaux traités avec les fongicides seront exposés à des doses retrouvées dans l'eau potable, autorisées par l'Union Européenne (directive 2020/2184) et considérées comme non nuisibles pour la santé. Le but de notre étude est de déterminer les effets nocifs qui peuvent découler de cette exposition.
Devenir
Les animaux utilisés pour la procédure 2 seront mis à mort afin de prélever les cerveaux et de faire nos analyses. Les autres animaux seront également mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux par expérimentation : 10) a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront coadministrés pour limiter toute souffrance à l’animal. En plus de l'anesthésie, une analgésie sera réalisée pour tout animal subissant une thoracotomie. Le personnel est formé sur l’ensemble de la prise en charge des animaux (gestion optimale de l’élevage, actes de chirurgie ou d’injection intrapéritonéale, gestion de l’anesthésie/analgésie, analyse des points limites). Les animaux sont transportés en groupe de 5 et de l'hydrogel sera placé dans les boîtes de transport afin que les animaux puissent s'hydrater pendant le trajet.
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'Homme. Cette étude sera sur le stade adulte et nous permettra de voir les effets à long terme d’une exposition prénatale sur le développement et les répercussions au stade adulte.
Impact d’une exposition alimentaire aux pesticides sur un modèle murin génétiquement prédisposé à la colite, une inflammation chronique du colon.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Privées du gène de l'interleukine 10, elles développent spontanément une colite et reçoivent pendant dix semaines une alimentation contenant du glyphosate à deux doses réglementaires, avec collecte hebdomadaire de fèces puis prélèvement de sang sous sédation profonde juste avant la mise à mort. L'inflammation peut provoquer des diarrhées sévères, une déshydratation et une perte de poids atteignant 20 % en quelques jours, seuil qui déclenche alors la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit le dialogue entre microbiote, intestin et foie, et présente l'usage d'un animal de laboratoire "entier" comme "nécessaire".
Objectifs
Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI) sont des pathologies complexes qui résultent de la combinaison de plusieurs facteurs de risques : génétiques et environnementaux. Dans ces facteurs environnementaux, un déséquilibre du microbiote intestinal, ensemble des bactéries colonisant les intestins, favorise l’apparition de ces pathologies. D’autre part, les contaminants présents dans notre alimentation, tel que le glyphosate, pourraient jouer un rôle dans ces pathologies, notamment chez des individus génétiquement prédisposés. Le glyphosate est le pesticide le plus utilisé dans le monde, et les consommateurs sont principalement exposés via leur alimentation. Chez les plantes, il agit en inhibant une protéine indispensable à la survie de la plante, mais cette protéine est aussi présente dans certaines bactéries du microbiote intestinal. Ainsi, nos résultats préliminaires montrent que l’exposition au glyphosate impacte la composition du microbiote intestinal. Cependant il n’est pas connu si ces changements du microbiote, induits par glyphosate, peuvent favoriser l’apparition de MICI. L’interleukine 10 (IL-10), une molécule du système immunitaire impliquée dans la réponse anti-inflammatoire, est la principale protéine anti-inflammatoire intestinale. Des souris dont l’interleukine 10 a été supprimée (IL-10-/-) développent spontanément une inflammation de l’intestin en vieillissant. De plus, le microbiote intestinal joue un rôle majeur dans le développement de cette pathologie chez ces souris IL-10-/-. Ce modèle de souris est donc approprié pour étudier l’impact de facteurs environnementaux sur le développement des MICI. Dans ce projet nous souhaitons donc étudier l’impact d’une exposition alimentaire au glyphosate sur le développement de l’inflammation intestinale, en utilisant des souris mâles et femelles dont l’interleukine 10 a été invalidée.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire au glyphosate dans le contexte d’une prédisposition génétique au développement de pathologie intestinale telle que la colite. Nous évaluerons ainsi les effets de l’exposition aux pesticides sur le microbiote intestinal, et leur impact sur la progression de la colite.
Procédures
Les souris seront nourries avec un régime contenant ou non du glyphosate, à deux doses différentes : la DJA (dose journalière admissible) et la NOAEL (dose sans effet nocif observable), pendant 10 semaines. Les fèces des souris seront collectées sur animaux éveillés de façon non invasive : les souris seront gardées dans des boîtes en plastique (désinfectées et non hermétiques), dans un endroit bien ventilé, de manière à pouvoir faire leurs besoins sans contrainte ni manipulation inutile pendant 2 heures. Ces prélèvements auront lieu chaque semaine. A la fin des expérimentations, les souris seront mises sous sédation profonde afin de prélever le sang (geste effectué en 30 secondes). Suite à la collection, l’animal sera euthanasié. L’ensemble des autres prélèvements sera réalisé post-mortem.
Impact sur les animaux
Les souris de ce modèle, peuvent, pour certaines, développer, à partir de 8 semaines, une colite qui peut engendrer une déshydratation suite à des diarrhées sévères, et une perte de poids pouvant atteindre 20% de leur poids initial en quelques jours, ce qui constitue un point limite mettant fin à l’expérimentation pour ces souris. Selon nos résultats préalables la survie globale de cette cohorte est estimée à 85% pour les femelles et 90% pour les mâles âgés de 14 semaines. Aucune perte de poids ni de signe de toxicité n’ont en effet été observé dans la précédente cohorte de souris de type sauvage exposées aux mêmes doses de glyphosate dans le laboratoire.
Devenir
A l'issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever le sang et différents organes pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire entier est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (microbiote intestinal, intestin grêle, gros intestin, foie) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. De plus, afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation, le microbiote intestinal et le génome de l’hôte, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec notamment la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires).
Réduction
Nous avons conçu l’expérience pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance et basé sur nos résultats préliminaires. Les résultats de notre étude de pouvoir statistique (calcul permettant d’évaluer le nombre nécessaire d’individus pour confirmer ou non notre hypothèse de recherche) basée sur des résultats préliminaires mesurant un marqueur non invasif d’inflammation intestinale nous a permis de définir le nombre d’animaux nécessaires par groupe expérimental. Nos données préliminaires montrent également que les effets du glyphosate peuvent être dépendants du sexe, nous étudierons donc séparément une cohorte de souris femelles et une cohorte de souris mâles afin de comparer les effets du glyphosate dans les 2 sexes.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement pendant toute la durée du protocole par du personnel compétent. Les mesures nécessaires à la prise en charge de la douleur potentielle des souris avec colite seront adaptées en fonction de l’état des animaux (analgésie et suivi des signes de mieux/mal être avant et après le traitement). Les effets du traitement seront contrôlés par une surveillance selon un score standardisé. Ce score (prenant en compte la variation du poids de l’animal, son apparence externe, les signes cliniques mesurables et le changement de comportement) correspond à une grille d’évaluation clinique permettant de prendre des mesures progressives (points limites) en fonction de l’élévation du score (augmentation de la fréquence des observations, administration de solution saline pour lutter contre la déshydratation, administration d'antalgiques pouvant être renouvelé toutes les 12h, euthanasie précoce). Ainsi, le protocole expérimental pourra être atténué voire suspendu en cas de mauvaise tolérance ou de souffrance des animaux. L’environnement des animaux sera enrichi afin de leur permettre d’avoir un comportement le plus naturel possible (cotons, maisons, cycle jour/nuit).
Choix des espèces
Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche sur les MICI car c’est un modèle permettant notamment l’étude des interactions entre l’alimentation, les polluants de l’alimentation (tels que le glyphosate), le microbiote intestinal et l’intestin. De plus, nous utiliserons un modèle de souris déficient pour l’interleukine 10 (souris IL10-/-) permettant de modéliser l’apparition d’une colite similaire à la colite hémorragique chez l’Homme. Ce modèle génétique de colite existe uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris de 4 semaines et les exposerons aux différents régimes pendant 10 semaines. En effet, nous souhaitons étudier un éventuel effet potentialisateur du glyphosate sur l’inflammation intestinale. Or, les souris IL10-/- développent spontanément une colite qui peut évoluer rapidement vers des stades sévères à partir de 12 semaines d’âge. Ainsi, afin d’être capable d’observer un éventuel effet du glyphosate, nous devons donc utiliser ces souris assez jeunes, juste après le sevrage.
Neuroénergétique du nouveau-né et spécificités genre-dépendantes : vers de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les neuropathies pédiatriques. (BabyBrain)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérés du cerveau le jour de leur naissance, soumis à sept jours de vie à une nouvelle chirurgie puis à deux heures d'hypoxie, gavés ou injectés les trois jours suivants, 576 ratons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils passent ensuite des IRM sous anesthésie à 7, 30 et 45 jours, dont une de deux heures, et des tests de réflexes à 8, 10 et 12 jours. À 55 jours, une privation de nourriture de 72 heures précède un test censé mesurer un état dépressif. Tous sont tués pour prélèvement d'organes, et ni ce test de dépression ni le test de mémoire employé à 45 jours ne sont nommés.
Objectifs
Une meilleure compréhension du métabolisme énergétique cérébral chez le nouveau-né, en prenant en compte les différences liées au sexuel, pourrait permettre de définir de nouvelles pistes thérapeutiques dans un contexte de pathologies cérébrales pédiatriques caractérisées par un déficit énergétique. Les objectifs seront les suivants : - Décrypter les spécificités du métabolisme énergétique cérébral du nouveau-né en bonne santé, en fonction du sexe. - Mettre en évidence les spécificités sexo-dépendantes des altérations métaboliques périnatales dans le contexte de l’hypoxie-ischémie néonatale. - Développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le contexte d’un déficit énergétique cérébral, en fonction du sexe.
Bénéfices attendus
Il est attendu de ce projet de combler une lacune dans le domaine de la neuroénergétique. Ce projet offrira une compréhension des mécanismes moléculaires et de la coopération cellulaire qui sous-tendent les différences entre le cerveau des nouveau-nés masculins et féminins, ainsi que des différences dans la manière dont le cerveau masculin et féminin peuvent être capables de répondre aux agressions neuronales et aux stratégies neuroprotectrices.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie afin de diminuer l'expression de certains transporteurs de substrats énergétiques cérébraux (1 fois, à la naissance, durée 15 min). Pour l'induction de l'hypoxie-ischémie, les animaux subiront une chirurgie (1 fois, à l’âge de 7 jours, durée inférieure à 10 min) puis une hypoxie (1 fois, 30 min après la chirurgie, durée 2 h). Pour l'un des groupes, trois injection de substrat énergétique seront réalisées (juste après l'hypoxie-ischémie et sur les deux jours suivants, âge : 7, 8 et 9 jours de vie, durée : 2 s). Pour un des groupes, les ratons seront gavés avec des substrats énergétiques (gavage juste après l'hypoxie-ischémie et sur les deux jours suivants, âge : 7, 8 et 9 jours de vie, durée : 2 min). Les animaux effectueront des examens par résonance magnétique nucléaire de diffusion sous anesthésie gazeuse ; technique non-invasive pour les animaux (à l'âge de 7 et 30 jours ; durée : 30 - 45 min). Ils effectueront aussi des examens par résonance magnétique nucléaire fonctionnelle sous anesthésie (1 fois, à 45 jours d'âge, durée : 2 h). La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements de réflexes précoces (réalisés à 8, 10 et 12 jours ; durée : 5 min) et de mémoire (évaluée à 45 jours ; durée 10 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (réalisé à 55 jours ; durée de la restriction : 72 h ; durée du test : 10 min).
Impact sur les animaux
Les modèles de répression de transporteurs utilisés dans ce projet sont bien connus des membres de l’équipe. La modification génétique n’entraîne pas de modifications au niveau pondéral, qualité du poil, appétit des animaux, activité et mobilité. Cependant, l'induction du modèle nécessite une chirurgie sous anesthésie générale par hypothermie maintenue tout le long de l’acte. Suite à l'opération, la plaie suturée peut s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser. La chirurgie nécessaire à l’induction de l’hypoxie-ischémie pourrait entraîner une perte de poids, une plaie et des douleurs postopératoires. L’administration de lactate sera réalisée par une injection intrapéritonéale, ce qui constitue une nuisance. La réponse à l'hypoxie-ischémie est variable d'un individu à l'autre. Dans de rares cas, des lésions cérébrales supérieures à 50 % pourraient subvenir. Elles représenteront un point limite. Le test de restriction alimentaire pourrait entraîner chez certains animaux un stress.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 576). La répression de l'expression des différents transporteurs ainsi que l'induction de lésions cérébrales par hypoxie-ischémie ne permettra pas d'utiliser les animaux pour un autre projet.
Remplacement
Des modèles d’organoïdes ainsi que des modèles d’hypoxie cellulaires existent, cependant, ces modèles s’affranchissent de la (patho)physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative, prenant entre autre la dimension sexuée. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de comprendre le métabolisme cérébral en fonction du sexe et tester l'effet neuroprotecteur des molécules afin de pouvoir envisager une application rapide chez l’Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.
Réduction
Une réduction du nombre d’animaux est rendue possible par le fait que l'IRM est une technique d'investigation non-invasive qui permet un suivi des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les différences inter-groupes seront mises en évidence par des tests statistiques. Le nombre d'animaux considéré pour ce projet a été déterminé en prennant en concidération nos projets précédents et en utilisant un calculateur de taille d'échantillon.
Raffinement
Lors des chirurgies, avant anesthésie un antalgique sera administré. Le réveil des ratons et la récupération de la température corporelle s’effectueront dans un caisson ventilé. Les ratons seront surveillés plusieurs fois par jour pendant 3 j puis de manière hebdomadaire. La mise en place d’une grille de scorage et l’utilisation de points limites adaptés permettront la délivrance d’un antalgique si une douleur est constatée. La cicatrisation sera contrôlée ; en cas d’infection de la plaie un désinfectant et un antalgique seront administrés. Les IRM seront réalisées sous anesthésie générale. Une modification de rythme cardiaque ou du rythme respiratoire par rapport aux normes physiologiques, mise en évidence par un capteur placé sous l'animal entraînera l'arrêt de l'expérimentation. Du gel ophtalmique sera utilisé, pour éviter la sécheresse oculaire. Pour le gavage, une canule à bout rond en plastique à usage unique sera utilisée afin de limiter les risques de blessure pour l'animal. Le volume administré, à température ambiante prendra en considération la corpulence de l'animal. En l'absence de détresse respiratoire et de reflux, l'animal sera remis à sa cage et surveillé régulièrement pendant 1 heure. Pour le test de dépression, nécessitant une privation de nourriture ponctuelle, la prostration de l'animal représentera un point limite. Au niveau de l'hébergement, les animaux seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton.
Choix des espèces
Le rat Wistar est plus gros que des modèles souris, ce qui est un atout pour les examens non-invasif par IRM. La taille de son cerveau facilitera aussi les chirurgies. Cette espèce est utilisée depuis plusieurs années dans le modèle d'hypoxie-ischémie, ainsi de nombreux groupes témoins dans la littérature permettent de faire des comparaisons et limitent le nombre de témoins. Les animaux recevront une injection cérébrale à la naissance (P0) afin de diminuer l'expression des différents transporteurs. Pour certains, une hypoxie-ischémie sera réalisée à 7 jours de vie. Ils seront ensuite suivis par IRM à 7, 30 et 45 jours de vie et par des tests de comportement, de 8 à 55 jours de vie, afin de pouvoir comprendre les différences du métabolisme énergétique cérébrale du nouveau-né mâle et femelle et évaluer les effets protecteurs des substitutions thérapeutiques à court et à long terme. Les tests de reflexes seront réalisés à 8, 10 et 12 jours de vie. Un test permettant de mettre en évidence les défaillances neurologiques sera réalisé à 24 jours de vie. L'anxiété sera évaluée à 28 jours de vie. Un test de mémoire sera réalisé à 45 jours de vie et l'état dépressif des animaux sera évalué à 55 jours de vie.
ONCO cerveau-chirurgie : mise en place d’une nouvelle méthode de traitement dans un modèle de tumeur cérébrale orthotopique permettant, après résection tumorale, l’administration « in situ », unique ou répétée, de composés thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour tester des candidats médicaments administrés directement dans le cerveau après retrait d'une tumeur, 1 426 rats vont être utilisés, dont 1 411 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacun reçoit une irradiation, une greffe de gliome dans le cerveau d'environ une heure, puis une résection de la tumeur avec pose éventuelle d'une canule, ouvrant la voie à un maximum de douze traitements intracérébraux. Le porteur annonce des douleurs sévères liées aux chirurgies, des troubles neurologiques, des saignements et des infections possibles autour du dispositif implanté. Quinze rats sont utilisés sans réveil pour entraîner les techniciens à la pose de canule, après un premier apprentissage sur des cadavres, et tous les animaux sont tués à l'issue.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Les cancers du cerveau représentent toujours un enjeu de santé publique majeur. Par exemple, les gliomes de haut grade restent à ce jour un cancer pour lequel la prise en charge a peu évolué depuis 20 ans, avec une survie médiane après traitement de 24 mois environ. Le développement de nouvelles thérapies est de ce fait critique afin d’améliorer la survie et la rémission des patients. L’objectif de ce projet est d’utiliser un modèle orthotopique de cancer du cerveau chez les rongeurs reflétant la pathologie humaine afin d’évaluer de nouveaux candidats médicaments administrés de façon unique ou répétée (à l’aide d’une seringue ou d’un dispositif implantable) après résection de la tumeur. Ce modèle permet donc d’évaluer spécifiquement l’efficacité thérapeutique de composés d’intérêt dans le contexte de la présence de cellules cancéreuses résiduelles suite à une chirurgie de résection de tumeur du cerveau, chez l’homme (partie du traitement standard). La toxicité, la pharmacocinétique et de la biodistribution des candidats médicaments pourront aussi être étudiées dans ce modèle.
Bénéfices attendus
Pour certaines applications thérapeutiques, de nouveaux modèles précliniques plus prédictifs doivent être établis afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. L’animal représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettant d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Irradiation après un court transport. Les animaux restent dans leur cage de stabulation. Durée totale < 30 minutes, hors transport (réalisé une fois). - Procédures chirurgicales, réalisées sous anesthésie et analgésie pré-, per et post-opératoire : o Greffe tumorale intra cérébrale (x1), durée = ± 1h o Résection de la tumeur +/- implantation de la canule (1x). La durée de la résection sera max. 1h. L’implantation de la canula peut rallonger la procédure de 30 minutes. - Pour quelques animaux le traitement avec la canule sera réalisé sous anesthésie (10 – 15 minutes/traitement, max 12 traitements) - Les animaux vigiles et sous contention pourront recevoir des traitements par voies intra-péritonéale (IP), intra-veineuse (IV), sous-cutanée (SC), (1 minute), - Des prélèvements sanguins pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. - Si un suivi par une technique d’imagerie est envisagé, il sera réalisé sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure. - Au moment de l’euthanasie, lorsque le prélèvement des organes nécessitera un flush préalable par perfusion afin d’obtenir des organes avec des vaisseaux sanguins ne contenant pas de sang, les animaux seront profondément anesthésiés et analgésiés.
Impact sur les animaux
Stress léger et de durée intermédiaire (moins de 4 heures) induit par : - Le transport (pour irradiation avant greffe des tumeurs). - La manipulation pour les suivis de poids (le stress lié pouvant très probablement diminuer avec l’habituation). Stress modéré (durant quelques heures, mais pas plus de 48 heures) : - Réorganisation des groupes sociaux au moment de la randomisation. Pertes de poids : - En lien avec le développement de la tumeur. - Suite aux procédures chirurgicales (implantation et résection de la tumeur). Douleur légère à sévère : - En lien avec le développement de la tumeur. - Liée à la présence du dispositif implantable. - En lien l’injection de solutions directement dans le cerveau. Douleur sévère : - Procédures chirurgicales (implantation et résection de la tumeur, mise en place du dispositif implantable). Troubles neurologiques : - Procédures chirurgicales (implantation et résection de la tumeur). - En lien avec le développement de la tumeur. - En lien avec l’injection de solutions directement dans le cerveau. Saignement et/ou infection : - Procédures chirurgicales (implantation et résection de la tumeur). - Liée à la présence du dispositif implantable.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes. Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Le nombre minimal d’animaux surnuméraires sera utilisé afin de plus facilement constituer des groupes homogènes au moment de l’initiation de l’étude. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.
Raffinement
Tout d’abord, les techniciens s’entraineront pour la pose de canule sur des cadavres de rongeurs, avec évaluation macroscopique des lésions générées sur le cerveau. Une fois que la pose de canule sera réalisée sans causer de lésions au niveau de la zone d’implantation, un entrainement sera fait sur animaux vivant (dans le cadre d’une procédure sans réveil). Les coordonnées de l’induction tumorale dans le cerveau seront déterminées au moyen d’un atlas pour limiter le risque de déficit neurologique. Les animaux sont placés sur un cadre de stéréotaxie pour les procédures chirurgicales. Toutes les procédures chirurgicales (implantation et exérèse de la tumeur, puis mise en place du dispositif implantable) seront réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées (selon doses et voie d’administrations validées par la structure pour le bien-être des animaux de notre société et le vétérinaire). Les traitements intracérébraux seront faits sous anesthésie. Les animaux bénéficieront de soins pré- et post opératoires (tels qu’hydratation, utilisation d’un plan thermostaté pour maintien de la température corporelle). Les expérimentateurs sont formés pour évaluer spécifiquement l’état de souffrance des animaux. Une grille d’évaluation est utilisée pour apprécier finement l’état de santé des animaux et guider la réponse à apporter en cas de détresse (soins spécifiques ou euthanasie). De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages.
Choix des espèces
Les rats, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Ils présentent aussi l’avantage de pouvoir développer des cancers, et notamment des cancers du cerveau (par exemple des gliomes), après implantation de cellules tumorales issues d’un cancer s’étant préalablement développé chez un rat de la même souche. De plus, diverses souches de rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Les animaux seront utilisés après sevrage à l’âge de jeunes adultes (7 semaines minimum). L’utilisation d’animaux adultes garantit la reproductibilité l’injection des cellules tumorales, c’est-à-dire que cette injection est toujours réalisée au niveau des coordonnées souhaités. Cela garantit également que la vitesse de croissance des tumeurs sera similaire d’une expérience à l’autre. L’utilisation d’animaux plus jeunes ne permet pas de garantir que l’injection des cellules est réalisée au niveau des coordonnées souhaitées, ceci pouvant donc induire des effets neurologiques néfastes.
Validation d’un mécanisme impliqué dans la résistance des cellules de mélanome aux cellules immunitaires NK
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une perte de poids supérieure à 10 % par rapport au maximum enregistré déclenche la mise à mort de l'animal. 629 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 448 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau du flanc sans anesthésie, une injection de cellules immunitaires dans la veine de la queue pouvant provoquer des métastases pulmonaires et un essoufflement, et pour certaines 48 injections dans l'abdomen étalées sur seize semaines, afin de vérifier si une protéine resensibilise les cellules tumorales aux cellules Natural Killer. Les tumeurs sont mesurées au pied à coulisse jusqu'à ce qu'une nécrose, un suintement, un dos voûté ou des yeux mi-clos entraînent la mise à mort.
Objectifs
Le mélanome cutané (15 500 nouveaux cas par an en France) est un cancer issu des mélanocytes, cellules responsables de la pigmentation de la peau. Le pronostic de ce cancer diagnostiqué précocement est favorable, mais au stade métastatique celui-ci reste très mauvais. Malgré les progrès dans le traitement des patients atteints de mélanome cutané métastatique avec les thérapies ciblées et les immunothérapies, plus de la moitié de ces patients développent des résistances. Notre équipe a montré que les cellules de mélanome sont capables de s’adapter et d’échapper au système immunitaire et aux thérapies ciblées. De nouvelles approches thérapeutiques sont alors nécessaires afin de resensibiliser les mélanomes au système immunitaire et aux thérapies ciblées. Nous avons étudié le rôle d'une protéine sur la sensibilité des cellules de mélanome au système immunitaire et sur les résistances des cellules aux thérapies ciblées. In vitro, nos résultats montrent que la diminution d’expression de cette protéine diminue la sensibilité des cellules de mélanome au système immunitaire et que cette protéine est perdue dans les résistances aux thérapies ciblées. Les cellules Natural Killer sont des cellules appartenant au système immunitaire inné et qui ont un rôle dans la destruction immédiate des cellules cancéreuses. Nous avons montré que les cellules qui expriment notre protéine sont sensibles à la mort induite par les NK. L'objectif de ce projet est de confirmer et de valider in vivo la resensibilisation des cellules de mélanome à la mort induite par les cellules NK en modulant l'expression notre protéine, mais aussi de valider les cellules Natural Killer comme une thérapie potentielle dans le traitement des mélanomes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une validation in vivo des observations faites in vitro, montrant que l’expression de notre protéine par les cellules tumorales est capable de les sensibiliser à la mort induite par les cellules immunitaires NK. Ce projet permettra également de valider l'approche et l'intérêt thérapeutique d'utiliser les cellules Natural Killer pour éliminer les cellules tumorales du mélanome. Ces validations sont indispensables pour envisager, in fine, un développement clinique de nouvelles approches thérapeutiques ciblant ce récepteur.
Procédures
Les souris seront soumises à une injection de cellules en sous-cutanée au niveau du flanc gauche (les souris sont non anesthésiées.) ainsi qu’une injection intraveineuse de cellules immunitaires dans la veine caudale (veine située au niveau de la queue). Dans certains cas, des souris pourront recevoir une drogue pour les sensibiliser au NK par injection intra-péritonéale 3 fois par semaine pendant 16 semaines au maximum (48 injections).
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Les souris subiront une injection sous-cutanée de cellules qui peut entraîner des rougeurs (lésions) au site d'injection. Les souris peuvent être gênées par la croissance de la tumeur (perte de poids (malnutrition et/ou déshydratation), mobilité réduite) et peuvent également présenter des altérations visibles de la peau (lésions, nécroses…). Chaque animal sera soumis à une injection intraveineuse au niveau de la veine caudale, ce qui peut entraîner des métastases dans les poumons et un essoufflement possible de la souris peut être observé. Certains animaux pourront également être soumis à une injection intra-péritonéale 3 fois par semaine pendant 16 semaines au maximum (48 injections), pouvant entraîner une rougeur (inflammation) ou une infection au site d'injection.
Devenir
À l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons, ...) présentant des métastases afin de réaliser des analyses in vitro.
Remplacement
Compte tenu de la complexité du processus impliqué dans la formation des mélanomes, résoudre ce problème uniquement par l’analyse in vitro n’est pas suffisant et l’utilisation de modèles animaux est essentielle. Par conséquent, pour l’instant, aucune méthode alternative ne permet de remplacer complètement le modèle murin dans notre étude.
Réduction
En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide du logiciel GPower, et d'un test de puissance statistique. Il faudra donc 16 souris par groupe. Également, une analyse statistique sera réalisée pour valider les effets sur la croissance de la tumeur. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs/métastases et organes (tels que le foie, la rate, les poumons, sang) pour des analyses histologiques, biochimiques et cytométriques. Dans le meilleur respect du bien-être animal et dans le but de réduire, nous utiliserons des souris mâles et femelles provenant de notre élevage.
Raffinement
En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi et seront observées deux ou trois fois par semaine selon la procédure par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. De plus, nous avons établi une liste de points limites et de critères d'arrêt des souffrances. Par exemple, une perte de poids supérieure à 10 % de la pesée la plus élevée de toutes les pesées (depuis le début de l’expérimentation) entraînera une mise à mort des souris. Si une observation est faite au niveau de l'apparence physique des souris (absence de toilettage, dommages corporels importants, prostration, yeux mi-clos), le comportement des souris (dos voûté, essoufflement suite à l'injection en veine caudale) et/ou l'apparence des tumeurs (tumeur nécrosée, suintement, volume), les souris seront mises à mort. Les manipulateurs sont en possession du niveau opérateur ou concepteur qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est fait par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous cutanées au pied à coulisse, pesée des animaux régulières). En ce qui concerne les souris immunodéficientes, ces dernières seront manipulées sous une hotte de type PSM dans des conditions d'hébergement stérile (igloo, nourriture, changement de cage en condition stérile). Ces conditions d'hébergement permettent donc le maintien d'un statut sanitaire exempt d'organisme pathogène spécifique.
Choix des espèces
Nous utiliserons un modèle de souris immunodéficientes. L’utilisation de ces souris immunodéficientes (absence de cellules B, T et NK) nous permettra une bonne prise tumorale des cellules humaines utilisées et de valider spécifiquement l’impact des NK dans la prise tumorale en fonction de l'expression du récepteur d'intérêt. Pour les procédures expérimentales, les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Nous utiliserons des animaux jeunes adultes dans l’ensemble des procédures, de façon à étudier des organismes stables, qui ne sont ni en développement ni en sénescence. De plus, les données de la littérature ainsi que nos données précédentes montrent une meilleure homogénéité dans la prise tumorale entre les animaux de cet âge.
Visualisation et modulation des cellules cérébrales individuelles afin de comprendre et traiter les problèmes mnésiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 514 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent jusqu'à trois craniotomies sous anesthésie avec injection d'un vecteur viral ou implantation d'un dispositif dans le cerveau, un conditionnement aversif douloureux, jusqu'à cinq jours de restriction alimentaire, et pour certaines une injection d'acide kaïnique déclenchant des crises d'épilepsie. Celles qui portent des implants d'électrophysiologie restent isolées jusqu'à deux mois, ce que le porteur décrit comme un stress "modéré à fort". Il retient la souris plutôt que le rat parce que la littérature est plus riche et que son équipe y est déjà formée, ce qui éviterait de tuer des animaux supplémentaires pour adapter les chirurgies.
Objectifs
L'étude de la mémoire et de ses bases neuronales est essentielle pour comprendre ses mécanismes et pouvoir, à partir de ces analyses, traiter les troubles qui y sont liés, comme la maladie d'Alzheimer, le syndrome de stress post- traumatique et d'autres types d'amnésie. Dans ce projet, nous proposons d'utiliser un modèle animal pour étudier comment la mémoire est stockée et rappelée à court et long terme. Cela nous permettra de comprendre les modalités d’activation des régions impliquées, et, en visualisant et en modifiant leur activité, de comprendre dans quelle mesure ces régions influencent le maintien de souvenirs spécifiques. En particulier, nous utiliserons une tâche de conditionnement classique pour former et étudier des souvenirs émotionnels, positifs et négatifs. Par ce projet, nous souhaitons répondre à quatre questions principales : quels sont les changements d'activité observés au niveau des cellules individuelles (1) ou du cerveau entier (2) lorsqu'un animal apprend et se souvient d'un événement passé ? La manipulation artificielle de ces régions identifiées peut-elle influencer le comportement de l'animal (3) et l'activité des régions cérébrales qui leur sont liées (4) ?
Bénéfices attendus
Le modèle souris est un excellent modèle translationnel, qui nous permet d’étudier la complexité des fonctions cognitives telles que la mémoire. Il nous permet, grâce à des techniques invasives, de tester par la manipulation et la visualisation in vivo les dynamiques neuronales qui sous-tendent la formation et le rappel de la mémoire, et ce à différentes échelles. A court terme, le projet permettra d’élucider le fonctionnement de la formation et du rappel des souvenirs à court et long termes, chez la souris mais également de façon translationnelle chez l’Humain. A plus long terme, ces connaissances pourront conduire à la découverte et au développement de thérapies plus ciblées et efficaces pour lutter contre divers troubles de la mémoire, et donc avoir un impact clinique concret. Nous utilisons le modèle souris en particulier car la reproduction est rapide et mène à un grand nombre d’animaux dans chaque portée, ce qui facilite l’obtention rapide de résultats statistiquement significatifs. Par ailleurs, l’ensemble de l’équipe est formé sur ce modèle, ce qui permet la réduction maximale du nombre d’animaux utilisés, et la littérature sur la mémoire est très riche pour cette espèce (par comparaison, par exemple, au modèle rat).
Procédures
Au cours de chaque phase de ce projet, les animaux peuvent passer par : - Un régime alimentaire de maximum 5 jours (et de maximum 2 fois par animal, à plusieurs semaines d'intervalle) pendant lequel l'animal reçoit une quantité restreinte de nourriture. Chaque jour, les animaux sont surveillés et si leur poids diminue trop, les quantités de nourriture mises à disposition sont modifiées en conséquence ; - Des tests comportementaux pour étudier leur mémoire et leur niveau de stress. Ces tests sont très courts et durent entre 5 et 10 minutes. - Des opérations chirurgicales sous anesthésie générale qui durent entre 30 et 50 minutes. Si un animal subit plusieurs interventions chirurgicales (dans tous les cas, 3 au maximum par animal), celles-ci sont espacées d'au moins 1 semaine. - Dans certains cas spécifiques, les animaux seront maintenus en isolement depuis l'intervention chirurgicale jusqu'à la fin des expériences comportementales, qui dureront au maximum deux mois à compter de la date de l'opération. Certains animaux recevront une injection d'acide kainique afin de déclencher des crises épileptiques.
Impact sur les animaux
Pour ces études, la technologie de pointe utilisée nécessite des procédures d'implantation invasives à l'intérieur du cerveau de l'animal. Les animaux subiront donc une ou deux craniotomies, suivies d’une injection d’un vecteur viral ou d’une implantation. Cette procédure, douloureuse, sera donc effectuée sous anesthésie générale et durera un peu moins d’une heure. Les implants n'affectent toutefois pas le comportement normal et le bien-être de l'animal une fois implantés. Certains animaux devront subir une privation de nourriture partielle, procédure indispensable à leur motivation pour certaines tâches comportementales. La quantité de nourriture qu'ils ingèrent chaque jour sera limitée, mais de manière à ne pas dépasser une perte supérieure à 10% de leur poids normal afin d’éviter tout stress superflu ou malnutrition, ce qui serait non seulement préjudiciable à l'animal mais aussi contre-productif pour nos expériences, qui exigent que l'animal soit en parfaite santé et non stressé ou même malade, car cela fausserait les résultats de nos recherches. Pour les expériences employant l’électrophysiologie, la fragilité des implants ne permet pas de replacer les souris dans la même cage que leurs congénères, et ceci cause un stress émotionnel modéré à fort. Néanmoins, cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisé, en réduisant au maximum les risques que l’implant ne tienne pas dans la durée. Par ailleurs, cet isolement n’est pas le cas pour tous les autres implants utilisés. Par ailleurs, ce projet étudiant les souvenirs émotionnels, certains animaux devront subir un conditionnement aversif, induisant une douleur moyenne brève, ainsi qu’un stress passager d’intensité modérée. Pour les expériences employant l'acide kainique, l'injection induira des crises épileptiques, occasionnant un stress d'intensité forte mais passager (retournant à la normale après 4 heures en moyenne).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Celle-ci interviendra alors que l’animal sera profondément anesthésié. Ceci est absolument nécessaire pour les études histologiques et immunohistochimiques.
Remplacement
Du fait des approches intégratives de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants reste incontournable. En effet, à l’heure actuelle, il n'existe pas de méthodes substitutives in vitro, ex vivo ou in silico pour obtenir des données sur ces processus cognitifs, bien trop complexes pour envisager toute simulation informatique. Par ailleurs, de par la nature de nos expérimentations (chirurgie, conditionnement aversif, analyse par immunohistochimie), il nous est impossible d’employer directement des sujets humains. Le modèle souris se révèle alors être idéal du fait de la proximité fonctionnelle entre son système nerveux central et celui de l’humain quant à ses capacités à créer des souvenirs émotionnels simples (auxquels nous nous intéressons, type conditionnement pavlovien) et de sa petite taille. Ceci explique également l’impossibilité d’utiliser des modèles animaux invertébrés, trop éloignés de l’humain pour raisonnablement étudier une réponse émotionnelle à un souvenir ainsi que trop éloignés dans la configuration du système nerveux central, critique à notre étude inter-régions.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au nombre minimal permettant de faire des études statistiquement significatives, nombre choisi sur la base d'expériences présentées dans des articles montrant des analyses similaires. Nous utilisons également les tissus après les expériences, maximisant ainsi l’utilisation de chaque animal.
Raffinement
Afin d’améliorer les conditions de vie des animaux, réduire la douleur, le stress et l’anxiété causés lors des différentes procédures, un certain nombre de mesures sont mises en place : - Les cages seront enrichies d’un tube en carton qui permettra de manipuler les souris sans les soulever par la queue. - Les animaux seront habitués plusieurs jours avant les expériences aux branchements et débranchements de leurs implants afin de réduire leur stress. - Nous avons amélioré la technique d’implantation des optrodes et des plaques de base du miniscope afin de ne plus avoir à isoler les animaux après implantation. - En plus de l’utilisation d'anesthésiques adaptés et d’anti-inflammatoire, nous appliquons également un anesthésique local ainsi qu’un analgésique lors de la chirurgie et après la chirurgie en cas de signes de douleurs. Nous appliquerons également des points limites spécifiques aux chirurgies (saignement trop important pendant la chirurgie, perte de poids trop importante ou signes de douleur ne s'améliorant pas malgré l'administration d'analgésiques en postchirurgie, etc.) et aux procédures expérimentales (en particulier, le non retour à la normale des animaux de la procédure 5 suite à l'épilépsie induite) employées, au delà desquels les animaux seront euthanasiés (cf. partie 4.2., où les points limites sont détaillés pour chaque procédure.
Choix des espèces
Les comportements que nous souhaitons étudier sont trop complexes pour justifier de l’utilisation d’espèces non-mammifères (drosophile, poisson-zèbre, etc.). De même, les méthodes in silico et in vitro ne sont pas assez développées pour modéliser ni la mémoire, ni le fonctionnement du cerveau à si grande échelle. Par ailleurs, eu égard au nombre d’animaux requis, les rongeurs (et plus particulièrement les souris) s’imposent de par la facilité et la stabilité de leur élevage. La souris a également été préférée au rat pour deux principales raisons: - La littérature relative à la mémoire, incluant tous nos précédents travaux, est bien plus riche chez la souris que chez le rat. - Notre équipe est déjà formée sur la souris, notamment pour la réalisation des chirurgies. Ne pas changer de modèle nous permettra de conserver ce savoir-faire, et ainsi de ne pas euthanasier d’animaux supplémentaires pour adapter les chirurgies à un nouveau modèle animal. Les souris étudiées seront adultes (plus de 7 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.
Implantation de sondes télémetriques ECG et pression artérielle au niveau de la carotide chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
L'opération vise à former quatre personnes à la pose d'un capteur de pression artérielle sur la carotide. 20 souris de 5 à 6 semaines vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Chacune reçoit deux injections d'analgésique, une anesthésie de trente minutes maximum, puis l'implantation d'une sonde sur la carotide gauche et d'un transmetteur sous la peau du flanc, avec un risque d'hémorragie. Le porteur compte une souris par personne et par demi-journée sur deux jours de formation, sans autre justification de ce total de vingt animaux.
Objectifs
L'hypertension artérielle est la principale cause des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Malgré les diverses options thérapeutiques disponibles, de nombreux patients hypertendus gardent une tension artérielle non contrôlée. Il a été montré que, dans ces cas d’hypertensions résistantes et/ou réfractaires aux traitements médicamenteux, les mécanismes de régulation de la pression artérielle sont affectés. Ces mécanismes réflexes modulent le diamètre des veines et des artères, ainsi que le rythme et la contractilité cardiaque, afin de contrôler la pression sanguine. La détection de la pression artérielle est initiée par des neurones dont les terminaisons, sensibles à l’étirement des vaisseaux sanguins, se situent dans des structures particulières des grosses artères : les sinus carotidiens (au niveau du cou) et la crosse aortique (à la sortie du cœur). Notre projet vise à caractériser les paramètres modulés par ces mécanismes reflexes chez la souris en conditions physiologiques. Pour cela, nous devons nous former à la pose d'un capteur, en sous cutané, afin de collecter un ensemble de données (température, pression artérielle et rythme cardiaque) sans stress dans un souci du bien-être animal. Les mesures physiologiques peuvent être collectées en continu ou en séquentiel dans différents protocoles, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cette formation nous permettra par le biais d’une nouvelle demande d’autorisation d’étudier ces paramètres chez des souris transgéniques présentant une hypertension artérielle.
Bénéfices attendus
L’ensemble des personnes compétentes impliquées dans le projet sera formé à la pose chez l'animal vigile d'un capteur, en sous cutané, afin de collecter un ensemble de données (température, pression artérielle et rythme cardiaque) sans stress dans un souci du bien-être animal. Cela permettra par la suite d’étudier les paramètres modulés par ces mécanismes reflexes chez la souris dans des conditions physiologiques et pathologiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux injections d'analgésiques en sous cutanée, une anesthésie soit par voie gazeuse ou en intrapéritonéal qui durera 30min maximum, durée de l'intervention chirurgicale qui consistera en la pose d'un capteur au niveau de la carotide et d'un transmetteur au niveau du flanc gauche de l'animal. A la fin de la procédure chirurgicale, les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les risques sont liés à 1) l’anesthésie : stress de la manipulation, déshydratation, détresse respiratoire; 2) à la pose de de la sonde télémétrique au niveau de la carotide gauche : risque d’hémorragie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure ne pouvant être réutilisés.
Remplacement
La pose de capteur en sous-cutanée pour l’étude de la pression artérielle et du rythme cardiaque ne peut se faire que sur des animaux vivants. C’est une méthode validée et utilisée à la fois chez le rat et chez la souris. Il n’y a pas d’alternatives non animales.
Réduction
Ce projet a pour but de former les personnes compétentes à la pose de capteurs en sous-cutanée chez la souris. C’est une technique largement décrite dans la littérature et utilisée couramment pour analyser la pression artérielle, le rythme cardiaque, la température corporelle et l’activité locomotrice chez des animaux vigiles. Le système d'enregistrement que nous utiliserons nous permet d’analyser ces paramètres sur 8 animaux en simultanée. La formation aura lieu sur 2 jours et il y aura 5 participants : 1 formateur et 4 formés. Nous estimons qu'il faudra au maximum 1 souris par demi-journée et par personne, c'est-à-dire, 20 souris au total au maximum.
Raffinement
La pose de capteur se fera sous anesthésie. Pour éviter toute douleur liée à la procédure, nous administrerons un analgésique par voie sous-cutanée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante permettant le suivi des paramètres cardiorespiratoires et de la température. Pour éviter un dessèchement oculaire, nous appliquerons un gel pour les yeux. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de l'examen. Cette procédure sera de classe sans réveil et les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Nous utiliserons le modèle souris car ce modèle est largement décrit dans la littérature et nous pourrons par la suite avoir accès à des modèles de souris transgéniques. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 5 à 6 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Pour une pose optimale du capteur et une bonne transmission du signal, les souris doivent faire un poids minimum de 19g et un poids moyen de 22g.
Création et évaluation du bien-être animal d’une nouvelle lignée à visée de recherche sur le rôle du gène X chez la souris dans le domaine cardiovasculaire.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris de cette nouvelle lignée n'ont jamais été générées, et les effets de leur modification génétique restent inconnus. 90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Chacune subit un prélèvement d'un millimètre au bout de la queue pour identification génétique, en vigile ou sous anesthésie, et une pesée hebdomadaire pendant quatorze semaines. L'évaluation porte sur leur bien-être, de la naissance jusqu'à 48 semaines d'âge, et s'achève par leur mise à mort.
Objectifs
L’objectif est de créer et d’évaluer le bien-être animal d'une nouvelle lignée de souris et d’identifier génétiquement celle-ci via une méthode de génotypage invasif. La production de ces animaux est nécessaire pour nos projets de recherche sur les mécanismes cellulaires et moléculaires de calcifications vasculaires en contexte d'insuffisance rénale chronique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont attendus à la fois dans le domaine de la recherche fondamentale et dans le domaine médical. L’utilisation de cette lignée de souris permettra de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sont à l'origine des symptômes observés en phase tardive de l'insuffisance rénale chronique. Le génotypage permet la caractérisation génétique de la lignée pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour les projets scientifiques.
Procédures
1 prélèvement (1mm) à l'extrémité de la queue - pesée des animaux une fois par semaine - phénotype dommageable possible mais peu probable
Impact sur les animaux
Le stress ressenti par l’animal est limité lors des pesées qui sont rapides et par l’utilisation d’un tunnel pour prendre la souris (1 fois par semaine pendant 14 semaines). Cette lignée n'a jamais été générée, les effets de leur modification génétique ne sont donc pas connus. La biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal.
Devenir
mis à mort à la fin de l'évaluation du bien-être animal
Remplacement
Nos projets de recherche visent à comprendre le rôle d’une protéine connue pour transporter du phosphate du milieu extracellulaire vers l’intérieur de la cellule. La régulation des concentrations de phosphate et de calcium dans le sang et au niveau d’un organe est une composante importante pour notre problématique, ce qui nécessite de travailler sur l’organisme entier. D'autre part, nous nous intéresserons aux réponses de cette lignée de souris dans un contexte d'insuffisance rénale chronique, qui est une maladie impliquant une communication entre plusieurs organes. L’expérimentation sur animal entier est indispensable pour évaluer le rôle des différents organes impliqués dans cette pathologie
Réduction
Les croisements sont élaborés pour obtenir un nombre suffisant d’animaux permettant d’obtenir des résultats robustes et fiables pour l’évaluation du bien-être animal (au moins 14 animaux par génotype selon les recommandations européennes). Leur nombre est adapté aux besoins de l’évaluation du bien-être chez les deux sexes.
Raffinement
Pour la mesure de poids hebdomadaire, les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue. Ce geste limite le stress des animaux. La biopsie de queue est réalisée lors du baguage soit en vigile soit sous anesthésie générale. Cette méthode est approuvée, précise, rapide (quelques secondes), standardisée et réalisée par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur et l’animal.
Choix des espèces
Les souris mutantes générées dans ce projet n’ont jamais été caractérisées. Nous évaluerons le bien-être de ces animaux selon les recommandations européennes, de la naissance jusqu’à l’âge de 48 semaines. L’identification de leur modification génétique sera effectuée à l’âge de 21 jours. Dans ce projet, 6 mâles géniteurs et 12 femelles génitrices seront utilisés pour générer des groupes d’animaux contrôles et mutants nécessaires (au moins 14 animaux par groupe) pour apporter des conclusions robustes sur l’évaluation du bien-être animal.
Etude computationnelle longitudinale du vieillissement physiologie et pathologie de l’aorte de souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
640 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 180 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles ne subissent aucune manipulation avant le jour de leur mise à mort, hormis une échographie sous anesthésie de vingt minutes et un jeûne de quelques heures. Le protocole consiste surtout à les laisser vieillir, jusqu'à 24 mois pour les souris normales et 10 mois pour les souris obèses et diabétiques, avant le prélèvement de l'aorte et son passage au scanner haute résolution. Le porteur affirme que des souris de 24 mois se comportent comme des souris de 2 mois et que la nuisance liée au vieillissement "pourrait ne jamais être atteinte", tout en prévoyant la mise à mort de celles qui perdent plus de 20 % de leur poids.
Objectifs
Le projet vise à analyser ex vivo, l'évolution de très petites structures de la paroi aortique au cours du vieillissement de la souris normale ou obèse par une approche technologique innovante, un scanner à très haute résolution. Notre but est de reconstruire en 3D, grâce à l'outil informatique, l'évolution de l'aorte durant la vie des souris. Cette reconstruction se basera sur les paramètres anatomiques, fonctionnels recueillis chez ces souris à différents âges (souris normales: 2 à 24 mois, souris obèses: 2 à 10 mois). Nous pensons que le suivi du vieillissement de ces animaux permettra de distinguer les altérations associées au vieillissement vasculaire normal de celles liées à un vieillissement altéré pouvant aboutir à des maladies vasculaires majeures, augmentant les risques de décès prématurés. L’objectif de ce projet est double. 1- Pour la clinique humaine, fournir des indices sur le vieillissement aortique qui pourraient guider les cliniciens dans leur choix chirurgicaux et/ou thérapeutiques. 2- Pour la clinique vétérinaire, fournir des indices sur le vieillissement aortique des animaux de laboratoire, de rentes, domestiques, …et de favoriser les décisions thérapeutiques à prendre afin de garantir le bien-être de l’animal et son bien-vieillir. Cependant, avant d'en arriver à une prévention efficace, que ce soit en clinique humaine ou vétérinaire, notre hypothèse doit être testée par des explorations précliniques. Pour des raisons éthiques, l'utilisation d'échantillons humains est impossible tant que nous n'avons pas prouvé que notre hypothèse est solide et peut fournir des informations pertinentes pour la santé humaine.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont de quatre ordres. 1- D’un point de vue scientifique, les données obtenues permettront de contribuer aux connaissances générales sur les mécanismes du vieillissement physiologique et pathologique de la paroi artérielle. L'apport de l'image et notamment sur le remodelage de la paroi artérielle inflammatoire dans l'obésité et leur potentiel résolution thérapeutique. 2- La disponibilité de ces données aidera à identifier les caractéristiques/les marqueurs critiques du vieillissement chez l'homme pour prédire une maladie vasculaire. 3- Ce transfert de la modélisation du vieillissement chez la souris à l'homme peut être également étendu, du point de vue vétérinaire. En effet, les animaux de compagnie et dans une moindre mesure les animaux de rentes, sont confrontés au vieillissement plus ou moins accéléré par des problèmes d'obésité ou de diabète. Le bien vieillir de ces animaux est une préoccupation majeure des propriétaires et des vétérinaires. La prévention des maladies vasculaires est donc primordiale. Par conséquent, le transfert de notre étude de souris aux chats, chiens , ... pourrait ainsi favoriser la prévention et la mise en place précoce de thérapies. 4- Enfin cette étude pourrait servir de bases à des logiciels de simulation qui pourraient etre utilisées en enseignement des sciences biologiques.
Procédures
Dans ce projet, les animaux ne subiront aucune manipulation avant le jour de l'euthanasie. En effet, après une période d'acclimatation, les animaux seront anesthésiés pendant 20 minutes maximum pour l'enregistrement des paramètres hémodynamiques et cardiovasculaires, effectués par échographie, examen non invasif et indolore. Un jeûne de quelques heures est envisagé en amont de l'examen d'échographie et avant l'euthanasie, afin de réaliser une analyse sanguine (prélevement post-mortem) du cholestérol, du glucose et autres molécules, témoignant de l'état de santé de la souris. Ce jeûne de courte durée ne devrait pas induire de nuisance chez les souris.
Impact sur les animaux
Les démarches expérimentales ne comprennent pas de chirurgie ou autre geste invasif susceptible de causer de l'inconfort aux animaux. Un inconfort lors de la locomotion, expliqué par la prise régulière de poids chez la souris diabétique, pourra être observé. A noter, que nous avons priviligié l'échographie, un examen non invasif, sans douleur ni danger pour l'animal, répandu en medecine vétérinaire. Cette technique n'induit aucune nuisance à l'animal. Les nuisances dues au vieillissement, sont extrêmement restreintes puisque les livraisons des animaux sont prévues en fonction de la date de mise à mort, et donc au plus proche de celle-ci. Les nuisances liées à l’âge pourraient se traduire par une diminution progressive du poids, de la mobilité et de l'appétit. A noter que l'expérience des manipulateurs sur ces souris et des partenaires travaillant depuis longue date sur le modèle de rongeurs âgés, fait qu'ils peuvent affirmer que des souris de 24 mois ont un comportement locomoteur, d'anxiété, ou nutrionnel totalement relativement comparable à celui de souris jeunes (2 mois). Cette nuissance dûe au vieillissement pourrait ne jamais être atteinte.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort, afin de pouvoir réaliser les prélèvements tissulaires de chacun des individus et de les analyser par le scanner à très haute résolution.
Remplacement
Préalablement à ce projet, nous avons réalisé des études de mise au point méthodologique sur le scanner à haute résolution. Les tissus aortiques ont été prélevés de souris (normales ou obèses) issues de protocoles APAFIS précédents, avant que celles-ci soient incinérées. Ces analyses préliminaires nous ont permis de démontrer la faisabilité et de découvrir des altérations de la paroi vasculaire qui ne peuvent etre observées par des méthodes d'imagerie conventionnelle. Les approches in vivo ne peuvent être envisagées comme méthode alternative en raison de la complexité cellulaire et extracellulaire. Aujourd'hui, seul les modèles murins permettent de reproduire de manière fidèle les conditions in vivo, offrant ainsi une compréhension plus complète du vieillissement tissulaire et des maladies cardiovasculaires en résultant. La simplification de l'étude en utilisant des systèmes in vitro ou ex vivo, comme les modèles 3D par exemple est actuellement non adaptée. Les modèles murins permettent de prendre en compte cette complexité et d'analyser comment différents organes et tissus interagissent pour déterminer et faire progresser la maladie. Il n'existe actuellement aucune alternative non animale satisfaisante pour répondre à nos questions. Ainsi, les modèles murins restent la meilleure option pour générer des données pertinentes qui pourraient ultérieurement avoir un impact translationnel chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux dans le projet est estimé selon des calculs statistiques considérant la nécessité de réduire l’utilisation d’animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement et statistiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude. La taille de chaque groupe d’animaux est de n = 20 souris. Elle a été calculée en tenant en compte des risque de décès prématurés. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue pour la totalité des animaux. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. L'expérimentation sera réalisée en 4 fois afin que scientifiquement nous ayons 4 expériences indépendantes (soit 5 animaux/âge/ expérimentation). Cette façon de procéder nous permettra de travailler avec des petits effectifs faisant qu'en cas des points limites atteints, d'arrêter la procédure, de la revoir, de discuter avec la structure du bien-être animal... voire de stopper définitivement la procédure. Dans le but de renforcer les données statistiques, l’étude sera randomisée (tirage au sort de l’ordre des groupes pour les injections et clause d’ignorance) et contrôlée. Enfin toujours dans le but de réduire le nombre d'animaux, les tissus issus de nos différents groupes seront prélevés pour être utilisés dans d'autres projets en cours ou futurs.
Raffinement
La litière sera changée 2 fois à 3 fois / semaine selon la quantité d'urine produite par les souris. Au cours des phases de stabulation, plusieurs animaux seront hébergés dans la même cage. En revanche, lors des phases d’expérimentation les animaux seront isolés (1 souris/boîte) afin de limiter la transmission du stress entre individus. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Nous surveillerons régulièrement les souris pour détecter tout signe de douleur ou d'anomalie. Ainsi l'isolement, l’anxiété, la perte d'appétit ou des difficultés de déplacement peuvent indiquer des problèmes de santé. Si une souris perd plus de 20% de son poids maximal ou montre des signes de difficulté à se déplacer ou à manger, nous la retirons de l'étude et sera mise à mort. Nous réalisons également des tests de réflexes pour évaluer la santé des animaux. Si une souris échoue à ces tests, cela peut indiquer un problème de santé grave, et elle est alors retirée de l'étude. En résumé, nous prenons toutes les mesures nécessaires pour garantir le bien-être des souris tout en réalisant nos recherches sur le vieillissement. Les souris diabétiques seront âgés de 2 à 10 mois afin que l'impact négatif sur leur santé et bien-être soit modéré. Au moment du sacrifice, par l'expérience que nous avons de ce modèle, nous estimons que les souris diabétiques ne devraient pas atteindre un poids de 45 g. Si c'est le cas avant la date de mise à mort initialement déterminée, alors nous interromprons l'ensemble du protocole pour la totalité des souris. Ces dernières seront alors sacrifiées pour l'analyse tissulaire. Pour limiter les douleurs des animaux, les procédures ne comprennent ni injection, ni manipulation, avant le jour du sacrifice. 30 - 20 minutes avant la mise à mort des souris, ces dernières seront pesées et la glycémie mesurée puis elles seront anesthésiées afin de réaliser une échographie cardiovasculaire.
Choix des espèces
Les souris ont un génome très proche de celui de l’Homme, et leur système physiologique récapitule assez bien les observations faites chez l’Homme. Aujourd’hui, la souris représente le meilleur modèle pour la compréhension des phénomènes physiologiques comme le vieillissement et les maladies cardiovasculaires sous-ajacentes. Deux type de souris seront nécessaires à l'étude: des souris normales (non diabétiques, non obèses) qui représenteront le vieillissement normal de l'aorte et serviront également de référence par rapport aux souris obèses et diabétiques qui présenteront un vieillissement accéléré de l'aorte et un développement de pathologie comme l'hypertension, l'athéroclérose... en accord avec l'évolution pathologique humaine. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 mois à l’initiation des procédures . Elles seront agées de 24 et 10 mois à la fin dess procédures pour les souris normales et obèses/diabétiques, respectivement.
Impact de la déficience en PRDM16 sur le développement de l’hypertension pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour savoir si la déficience d'une protéine aggrave l'hypertension artérielle pulmonaire, 320 rats Wistar vont être utilisés, dont 192 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une injection sous-cutanée de monocrotaline leur provoque une hypertension pulmonaire, certains subissant en plus une ligature de l'artère pulmonaire droite sous anesthésie, puis dix jours d'injections quotidiennes. La mesure finale passe par un cathétérisme lors d'une chirurgie thoracique sans réveil, et tous sont tués pour prélever les poumons et le cœur. Le porteur qualifie les nuisances de "modérées" alors que 192 rats relèvent d'un niveau de souffrance sévère déclaré.
Objectifs
Le système vasculaire comporte deux boucles : la circulation systémique, qui distribue le sang riche en oxygène à tous les organes, et la circulation pulmonaire, qui réoxygène le sang provenant de ces organes. Ces deux boucles ont des caractéristiques fondamentalement différentes et on ne sait toujours pas si les cellules endothéliales qui tapissent l'intérieur de la circulation pulmonaire ont une réaction unique aux maladies vasculaires. L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) affecte spécifiquement la circulation artérielle pulmonaire ; l'augmentation de la résistance vasculaire entraînant un remodelage et une dysfonction du ventricule cardiaque droit et, en l'absence de traitement, la mort. Des résultats précédents ont révélé que la déficience d'une protéine spécifique compromettait la récupération du flux artériel dans la circulation systémique, mais nous ne savons pas si et comment cette déficience affecte la survenue de l'HTAP. Notre objectif est d'approfondir notre compréhension des implications de la déficience en cette protéine sur le développement et l'évolution de l'HTAP, en utilisant des modèles animaux de la maladie. Nous cherchons à déterminer si cette déficience peut aggraver le remodelage vasculaire pulmonaire initial ou adaptatif responsable de l’HTAP. De plus, nous souhaitons étudier l'effet d'agents thérapeutiques potentiellement bénéfiques, connus pour activer cette protéine.
Bénéfices attendus
Notre étude vise à élucider le rôle de la déficience en une protéine spécifique dans le remodelage vasculaire pulmonaire et cardiaque, ainsi que ses implications hémodynamiques, en utilisant le rat comme modèle, une espèce pertinente pour l'étude de l'hypertension artérielle pulmonaire. En cas de confirmation de son influence négative sur la pathologie, nous envisageons d'évaluer l'efficacité d'agents thérapeutiques potentiellement bénéfiques,connus pour activer cette protéine. A moyen/long terme, cette approche pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour cette maladie rare et actuellement incurable. L’hypertension artérielle pulmonaire est une cause de handicap, d’insuffisance cardiaque et de mort. Ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades.
Procédures
Exposition à la monocrotaline : injection unique en sous-cutané de la monocrotaline ou de son solvant (sérum physiologique). Ligature de l’artère pulmonaire droite ou incision : opération unique realisée sous anesthésie et analgésie (durée estimée à 20minutes). Mesures des paramètres de la circulation sanguine par mise en place de cathéters pendant chirurgie thoracique sans réveil, sous anesthésie et analgésie (environ 1h). Injections quotidiennes du traitement ou d'un controle (serum physiologique) pendant 10 jours. Les animaux seront surveillés tous les jours et pesés 3 fois par semaine après leur entrée dans le protocole.
Impact sur les animaux
Nuisances classées "modérées": injection en sous-cutané d'un médicament induisant une hypertension artérielle pulmonaire. Risque léger d'irritation suite à l'intubation.Une douleur peut suivre les chirurgies. Les animaux seront surveillés tous les jours et pesés 3 fois par semaine après leur entrée dans le protocole, et des injections seront réalisées, ce qui peut être source de stress.
Devenir
L'ensemble des animaux des 3 procédures seront mis à mort. L'explantation des poumons et du coeur à la fin de l'étude est nécessaire afin d'effectuer des analyses histologiques, immunohistochimiques et de biologie moléculaire des zones pulmonaires et cardiaques.
Remplacement
L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque, la modification des vaisseaux, l'anatomie pulmonaire dans un contexte sain et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une HTAP puis d'une altération cardiaque droite chez l'humain qui est un processus complexe.
Réduction
Lorsque les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation après le cathétérisme pour évaluer leur fonction cardiaque et vasculaire, les tissus prélevés seront stockés pour une utilisation directe mais aussi ultérieure, avec partage possible, afin d’éviter de refaire les expériences. Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Des calculs statistiques ont été effectués afin de réduire au maximum le nombre d'animaux inclus dans l'étude
Raffinement
Une période d'acclimatation de 5 jours minimum sera respectée à l'arrivée des animaux dans l'animalerie. Les animaux seront hébergés en binome par cage dans lesquelles de l'enrichissement sera ajouté (dome, tunnel, lanièresou frisures de papier kraft, buchettes à macher, billes de peuplier naturel). Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel compétent et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress. Toutes les procédures seront pratiquées sous anesthésie et utilisation d'analgésiques avec tapis chauffant et gel de protection oculaire. Des points limites spécifiques ont également été mis en place.
Choix des espèces
Les rats sont couramment utilisés comme modèles pour étudier les maladies cardiovasculaires en raison de leur anatomie vasculaire pulmonaire similaire à celle de l'homme et de leurs caractéristiques hémodynamiques comparables. Un des collaborateur du projet est spécialisé dans les modèles murins d'hypertension artérielle pulmonaire. Il possède l'expertise nécessaire ainsi que le matériel adapté pour mener des recherches avec succès sur des rats. Nous avons choisi d'utiliser des rats de souche Wistar, réputés pour leur sensibilité accrue au développement de l'hypertension artérielle pulmonaire par rapport aux rats Sprague Dawley. Nous utiliserons des rats adultes pour reproduire les caractéristiques démographiques de l’hypertension artérielle pulmonaire chez l'Homme (âge moyen 50 ans). Nous veillerons également à sélectionner des rats ayant un poids adéquat (250-350g), permettant ainsi le cathétérisme et la chirurgie, tout en minimisant les risques de mortalité associés à ces procédures, qui peuvent être plus délicates sur des sujets de petite taille.
Évaluation in vivo de l’efficacité anticancéreuse d’un traitement à base de nanocapsules lipidiques pour le glioblastome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Deux chirurgies crâniennes espacées de quatorze jours, la première pour greffer des cellules de glioblastome dans le cerveau, la seconde pour y injecter des nanocapsules chargées de deux médicaments. 50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec perte de poids liée à la progression tumorale et troubles neurologiques possibles aux stades avancés. Celles qui n'ont atteint aucun point d'arrêt cent vingt jours après la greffe seront "considérées comme guéries" et tuées elles aussi. Le RNT annonce une échelle d'évaluation de la souffrance et des points d'arrêt sans préciser lesquels, et ne nomme pas les deux médicaments associés.
Objectifs
Le glioblastome est une forme très grave de cancer du cerveau, avec un pronostic difficile. Malgré des traitements comme la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie, l'espérance de vie moyenne est d'environ 15 mois. Deux grands obstacles rendent ces traitements moins efficaces : d'abord, une barrière protège le cerveau et empêche les médicaments d’atteindre facilement la tumeur, et ensuite, certaines cellules cancéreuses sont résistantes à la chimiothérapie et continuent de se propager dans le cerveau. Après une chirurgie, la plupart des patients font face à des rechutes agressives près de l'endroit où la tumeur a été retirée. Pour améliorer la survie de patients, il est essentiel d'empêcher ces rechutes. Deux approches prometteuses sont en développement : l'administration directe de médicaments dans le cerveau à l'aide d'implants ou de gels, et l’utilisation de nanomédicaments. La première permet d'amener les traitements directement à la tumeur, en contournant la barrière protectrice du cerveau, tandis que la seconde utilise des particules minuscules pour cibler les cellules cancéreuses, dépasser la résistance du cancer et limiter les effets secondaires. Dans ce projet, des nanoparticules ont été développées pour transporter deux médicaments qui, bien qu'ils n'aient jamais été testés ensemble pour traiter le glioblastome, se sont révélés très efficaces contre les cellules cancéreuses en laboratoire. L’objectif est maintenant de vérifier leur efficacité en les administrant directement dans le cerveau de souris porteuses de tumeurs. Cinquante souris seront utilisées pour évaluer cette nouvelle combinaison de traitements.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de vérifier l’efficacité anticancéreuse d’un nouveaux traitement combinatoire véhiculant des agents chimio-thérapeutiques pour les tumeurs cérébrales très agressives. Les retombées de ce projet pourraient permettre de répondre à un besoin médical non pourvu dans le traitement de ces tumeurs qui n’a pas bénéficié d’innovation thérapeutique depuis 2005.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux chirurgies à 14 jours de distance: 1) greffe tumorale de cellules; 2) administration intratumorale d'un traitement anti-cancéreux. La durée approximative des chirurgies ou tout acte nécessitant une anesthésie de l’animal ne dépassera pas les 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances anticipées dans ce projet concernent la greffe, le traitement intracérébral et les actes chirurgicaux. Les sources de stress potentielles avant/pendant ces actes sont la manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques, l’incision de la peau. La perte de poids reflétant la progression tumorale des tumeurs intracrâniennes est aussi un effet indésirable attendu dans ce projet. Il est également possible, quoique rare, que les animaux développent des troubles neurologiques lors de stades avancés de la pathologie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, lorsque l'un des points d'arrêts est atteint. Si les animaux n'ont pas atteint ces points au jour 120 post-greffe tumorale, ils seront considérés comme guéris et seront mis à mort.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité d'un traitement combiné, administré localement, qui délivre des agents chimiothérapeutiques pour traiter des tumeurs cérébrales très agressives. Les équipes de recherche ont élaboré les différentes étapes de l'expérimentation en s'appuyant sur des résultats obtenus précédemment. La validation de l'efficacité du traitement chez des animaux vivants (in vivo) est une étape cruciale avant d'envisager des essais cliniques chez l'humain. Actuellement, il n'existe aucune autre alternative à l'expérimentation animale pour ce type de recherche.
Réduction
Le nombre total d'animaux requis pour ce projet est de 50. Ce chiffre a été déterminé en se basant sur des protocoles déjà établis : nous avons utilisé une méthode statistique pour calculer le nombre nécessaire d'animaux afin d’obtenir des différences statistiquement significatives entre les groupes étudiés (n = 10 animaux par groupe x 5 groupes expérimentaux = 50 animaux). L'étude de survie durera environ 22 jours pour les animaux témoins et pourra s'étendre jusqu'à 120 jours pour les animaux traités. Les jours de décès après la greffe seront analysés à l'aide d'un logiciel statistique, afin de comparer la survie entre les différents groupes.
Raffinement
Les souris seront hébergées par groupes de 5 par cage, avec des mesures d'enrichissement de leur environnement pour assurer leur bien-être. Cela inclut l'utilisation de litière à base de cellulose, de petits dômes stérilisables, et des morceaux de bois à ronger dans chaque cage. Les animaux seront observés quotidiennement, et des efforts seront faits pour les habituer aux situations potentiellement stressantes afin de minimiser leur inconfort. Une échelle d'évaluation de la souffrance sera utilisée pour mesurer leur niveau de douleur ou de détresse, en tenant compte de critères comme la perte de poids, les changements physiques ou comportementaux, la réaction aux stimuli, et l'apparition de signes cliniques de souffrance. En fonction du score obtenu, des mesures seront prises pour soulager la détresse (comme fournir de l'eau gélifiée, de la nourriture dans la cage ou des enrichissements supplémentaires) et pour gérer la douleur, notamment avec des analgésiques.
Choix des espèces
Le modèle souris (avec le modèle rat) représente le modèle le plus étudié dans le traitement des tumeurs cérébrales. Le modèle de tumeur que nous étudions est un des modèles les plus utilisé dans la littérature pour des études des mécanismes immunitaires et la délivrance des médicaments pour le traitement des tumeurs cérébrales agressives. Les différents travaux scientifiques dans ce domaine ont utilisé très majoritairement des souris de 5 à 8 semaines : afin de pouvoir confronter nos résultats avec la littérature nous avons choisi d’utiliser des souris de 7 semaines.