Rongeurs

Préparer les études réglementaires à venir est la fonction déclarée de ce projet cadre, qui prévoit jusqu'à cinquante études par espèce sur cinq ans, avec trente rats ou cinquante souris par étude. 2 500 souris et 1 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 1 000 d'entre eux étant réutilisés ensuite dans d'autres projets, à des fins de formation ou pour constituer des bibliothèques de tissus, les autres étant tués. Un même animal peut subir une vingtaine d'interventions par semaine, dont douze prélèvements de sang, jusqu'à seize heures en cage métabolique et autant de mise à jeun. Le porteur ne nomme aucun des tests comportementaux employés, désignés par les seuls domaines explorés, locomotion, sociabilité, communication, sensoriel, et fonde le recours au rongeur sur une exigence réglementaire, la norme ICH M3(R2).

Objectifs

Ce projet ne comporte qu’une seule procédure, au sein de laquelle seront réalisées des études exploratoires multidisciplinaires dans un modèle rongeur. Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'Homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire, etc.) ou de carcinogénicité observée dans des études précédentes, d'établir la pertinence de certains effets observés chez le rongeur en comparaison avec l’Homme (ex : effets sur le système immunitaire, recherche de biomarqueurs, effets sur le comportement), avec pour but d'assurer la santé des patients humains (composés pharmaceutiques) et/ou la sécurité des personnes exposées (produits chimiques). Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. Ces études sont aussi utilisées pour choisir une voie d'administration efficace et adaptée chez le rongeur, ou pour démontrer la validité de nouvelles techniques d'investigations. Il est prévu d'utiliser en moyenne 30 rats, ou 50 souris par étude, et de réaliser jusqu'à 50 études par espèce sur la durée du projet (5 ans).

Bénéfices attendus

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier. De plus ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, et aussi de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires. Ces études permettent d’obtenir une meilleure connaissance du composé et du modèle animal, pour une meilleure conception/design des études réglementaires à suivre, que ce soit du point de vue du choix des doses, mais aussi dans le choix des voies d’administrations, du nombre d’animaux, etc. D’un point de vue éthique, une réduction du nombre d’animaux dans les études futures est potentiellement possible, et la douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables sera minimisée au maximum. L’utilisation de tests neurocomportementaux dans le cadre de ce projet permet une approche par des méthodes non invasives, dans le cadre des 3Rs (Raffinement).

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, etc.) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses. La durée des études varie entre 1 jour et 1 an. Des prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) et des recueils d’urines et /ou de feces sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse en cage métabolique, n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h). Pour les tests de comportements, ils sont toujours faits après une administration unique par test, les tests sont non invasifs, avec manipulation et contraintes limitées des animaux et observation par suivi video (domaines explorés : locomotion, sociabilité, communication, sensoriel), d’une durée maximale d’une heure ; un seul test est réalisé par jour maximum et dans la limite de 3 dans la même semaine d’examen, sur une durée d’étude de 3 mois maximum. Dans tous les cas où l’hébergement individuel est requis , les animaux restent en contacts visuels, auditifs et olfactifs avec les autres animaux en hébergement individuel ou non.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures (prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle) ; - aux effets systémiques du composé testé (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire). - à l’hébergement individuel (rare) en cas de nécessité absolue

Devenir

Si l’état de santé des animaux le nécessite, l’avis et/ou l’intervention d’un vétérinaire seront requis, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable. Chaque fois que cela sera envisageable (ex : animaux contrôles), les animaux seront réutilisés dans d’autres projets, ou à des fins de formation, ou pour réaliser des bibliothèques de tissus.

Remplacement

Les explorations dans ce projet s'appuient parfois/souvent sur des études vitro préalables, mais ne peuvent pas être menées in vitro. Il n’existe pas toujours de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Il n'existe pas de méthodes alternatives à l'heure actuelle qui permettent de remplacer les tests neurocomportementaux prévus dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude : un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, etc En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel, consommation de nourriture et/ou d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés, etc.), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des techniques de prélèvement sanguin (ex : via veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire, saphène, etc.) sont utilisées selon les bonnes pratiques vétérinaires et procédures internes validées, quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, comme les administrations intramusculaires et intra-articulaire. Les rongeurs sont hébergés en groupe (il doit être évité le plus possible tout hébergement individuel d’individus). Cependant, certaines situations expérimentales exigent l’hébergement individuel et devront être dûment argumentées (comportements antisociaux comme chez la souris mâle, voie d’administration dermale, par exemple). Pour certains produits (exemple : CNS) une période d'habituation aux doses peut être effectuée sur les animaux avant la toute première administration.

Choix des espèces

Au-delà des aspects opérationnels (manipulation), le recours à une espèce rongeur dans le développement préclinique est une exigence réglementaire (ICH M3(R2), CPM/SWP1042). C’est aussi une espèce de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) qui permet le classement de produits chimiques dans de nombreuses classifications de dangers. Le rat est souvent utilisé car il reste d'une taille suffisante pour l'observation des lésions (la souris étant petite et plus sujette à variabilité ou parfois plus sensible à certaines classes de produits) ou car il est le seul modèle validé (exemple perturbateur endocrinien). La souris est parfois préférée au rat pour raison d’homologies avec l’homme (exemple paramètres immunologiques). Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs dont notamment : résultats déjà existants, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique, ou incompatibilité avec une autre espèce animale, par exemple. Les animaux ont en général 5 à 12 semaines d’âge en début de traitement pour assurer une administration pendant la phase de croissance. Dans certains modes d'administration, (voie dermale, souris) les animaux pourront être plus âgés de quelques semaines pour répondre à des conditions expérimentales particulières (ex : pour avoir un poids plus élevé, ou un âge en adéquation avec la maturité sexuelle) ou pour des raisons scientifiques (ex : maturité du système immunitaire). Les animaux ne doivent pas être gravides. Cet âge permet, selon les modes d’administration choisis, de réaliser des analyses avant le premier jour de traitement (prises de sang, pesées corporelles, ophtalmologie, etc.) ainsi que de prévoir une période d’acclimatation suffisante après réception des animaux.

2 247 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les receveuses recevant à elles seules 9,5 grays d'irradiation corporelle totale en une journée, fractionnés en deux séances espacées de six heures. Les donneuses reçoivent une injection quotidienne de substance inflammatoire pendant un mois, une injection sublétale endommageant les cellules, ou 2 grays d'irradiation, avant d'être tuées pour prélever leurs cellules souches du sang. Chez les receveuses dont le greffon ne parvient pas à reconstituer le système sanguin détruit, le porteur décrit une détresse modérée cinq jours après la transplantation, et fixe des points limites qui vont de l'incapacité à se redresser à la peau ulcérée. L'espoir déclaré est de trouver comment lutter contre le vieillissement du sang, quand la destruction du système sanguin de plusieurs centaines de souris est, elle, le point de départ du protocole.

Objectifs

Les principaux objectifs de ce projet sont de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le vieillissement du sang (capacité réduite à se régénérer, à se différencier et à produire un répertoire complet de cellules sanguines et immunitaires matures). En impactant la fonction des cellules souches hématopoïétiques (CSH) (qui peuvent se transformer en tous les types de cellules sanguines), le vieillissement et les facteurs environnementaux tels que l'exposition à l'irradiation, la chimiothérapie ou l'inflammation chronique qui déclenchent un vieillissement prématuré, sont fortement associés à un risque accru de développer de nombreux troubles de santé liés à l'âge tels que les cancers et les maladies cardiaques, par le biais d'une baisse de l'immunité et d'une augmentation des infections et de l'inflammation.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous testerons si l'activation de certains gènes sauteurs de notre génome, connus sous le nom d'éléments transposables, entraîne des changements fonctionnels dans les CSH et leur production de cellules myéloïdes avec l'âge et après un stress tel que la chimiothérapie, l'irradiation ou le stress inflammatoire, et si les éléments transposables sont impliqués dans les propriétés inflammatoires des CSH âgées, des progéniteurs myéloïdes et des cellules matures. Cela nous permettra d'identifier un mécanisme de vieillissement et pourrait donc offrir des moyens de lutter contre le vieillissement du système sanguin et les maladies du sang liées à l'âge.

Procédures

Les souris donneuses sont injectées par voie intrapéritonéale avec une substance qui induit une inflammation (6μg/souris/jour pendant un mois, et l'injection peut être réalisée en 3 secondes), injectées par voie intraveineuse avec une substance qui peut causer du stress et des dommages cellulaires (dose unique sublétale, la procédure d'immobilisation des souris et d'injection de la substance peut être réalisée en 25 minutes), irradiation corporelle totale (2Gy une fois chez les souris, la durée de l'irradiation est de 3 minutes), ou subissent un vieillissement naturel. Après chaque traitement, les souris sont euthanasiées et les CSH sont collectées, triées et examinées en vue d'une coculture puis d'une transplantation dans des souris receveuses. Les souris receveuses seront irradiées pendant 11 minutes dans un irradiateur à rayons X, où la dose de 9,5 Gy sera divisée en deux : 5 Gy le matin, et 6 heures plus tard, une autre dose de 4,5 Gy. Les souris receveuses subiront des injections intravasculaires (une par souris receveuse, l'injection de cellules dure environ 15 secondes) et des prélèvements sanguins (le prélèvement dure environ 15 secondes, 3 prélèvements sanguins par souris à 4, 8 et 12 semaines après la transplantation).

Impact sur les animaux

La piqûre de l'aiguille pour l'injection intraveineuse pendant les traitements des procédures, ou pendant les procédures de transplantation, provoque une légère douleur de courte durée. L'incapacité des greffons à restaurer le système sanguin (éliminé par l'irradiation) entraîne une détresse modérée chez l'animal 5 jours après la transplantation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin d'isoler et d'étudier les cellules souches sanguines (qui peuvent se transformer en tous les types de cellules sanguines).

Remplacement

Ce protocole étudie l'interaction entre différentes cellules, telles que les cellules souches sanguines (qui peuvent se développer en tous types de cellules sanguines), et les cellules de leur micro-environnement, telles que les cellules myéloïdes. Aujourd'hui, il n'existe pas de système in vitro adapté à l'étude du processus de production des cellules sanguines qui soit comparable au corps des mammifères et qui établisse un micro-environnement dans lequel les CSH peuvent rester à l'état de sommeil. Seules certaines expériences peuvent être réalisées in vitro, comme les essais de formation de colonies, et ce sont celles qui seront utilisées. Il est donc indispensable de réaliser des expériences in vivo sur des souris.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre minimum nécessaire pour la quantité de matériel nécessaire à l'expérience et pour obtenir des résultats statistiquement pertinents. Nous effectuerons 3 répétitions pour vérifier si la variation est significative. Si les deux premières expériences donnent le même résultat, la troisième expérience sera annulée afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Pendant toute la durée des expériences, les souris seront surveillées par nous-mêmes et par les zootechniciens, et les critères de finalité humaine (arrêt/euthanasie des animaux) seront appliqués si l'un des critères suivants est observé: (1) Portage/mouvement : déficience grave (immobile lors d'un réveil prolongé (>15 minutes); ne bouge pas lorsqu'on le pousse ou fait de faibles tentatives de mouvement; s'effondre et est incapable de se redresser; agitation continue (>1 minute). (2) Posture: gravement altérée. (3) Pelage: gravement altéré / perte de poils (piloérection généralisée, c'est-à-dire pelage très rêche sur la majeure partie de la surface du corps). (4) Peau: Ulcérée. (5) Poids corporel : Perte >20 %.

Choix des espèces

La souris est le système idéal pour étudier le processus de production des cellules sanguines, car le système sanguin est très bien conservé entre les souris et les humains. En outre, le vieillissement du système sanguin est bien défini et l'approximation des âges pertinents entre l'homme et la souris est connue. Les animaux utilisés pour les expériences seront âgés de 2 à 4 mois, mâles et femelles. Chez ces jeunes souris, le pool de CSH est faible, mais la capacité à reconstituer le système sanguin est élevée.

Une dizaine de séances d'imagerie sous anesthésie et une injection quotidienne dans le péritoine ou par gavage attendent chaque animal, sur quarante jours de traitement. 3 264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever la tumeur, le foie, la rate et les poumons. Elles reçoivent des cellules tumorales sous la peau puis dans le sang pour former des métastases pulmonaires, le porteur listant parmi les effets attendus l'irritation et l'infection des points d'injection, l'absence de toilettage, et pour le gavage la suffocation, le saignement et une salivation excessive. L'effectif s'appuie sur des groupes de douze animaux, sans que le RNT indique combien de groupes ni combien de molécules aboutissent à 3 264 souris.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de traitements anticancéreux sur différents cancers solides et l'apparition des méstatases (mélanome, cancers gastriques, pancréas et côlon) en utilisant des petites molécules dérivées d'antidiabétiques, seules ou en combinaison avec les thérapies actuelles qui stimule le système immunitaire. Nous allons étudier la potentialité de ces molécules à induire une mort immunogénique (=les cellules cancéreuses sécrétent des facteurs qui permettent l'activation du système immunitaire qui va les éliminer). Ceci permettra de proposer de nouvelles solutions aux patients en échec thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ces dernières années des résultats encourageants ont été obtenus un inhibiteur d'une protéine majoritairement altérée dans les mélanomes. Cependant, ces réponses restent transitoires. De nouvelles thérapies, qui réactivent la réponse immunitaire chez les patients, ont aussi été développées. Mais, seul 10 à 30% des patients répondent positivement. Il est donc important de développer de nouvelles molécules pour la mise en place de thérapies ciblées et de combiner ces nouvelles molécules avec les thérapies qui stimulent le système immunitaire, déjà utilisées chez les patients afin de voir si nos dérivés sont capables de potentialiser leurs effets. Grâce à cette étude, nous allons voir les effets de nos composés d’une part sur les tumeurs primitives (mélanome, cancer du pancréas, côlon et gastrique) et d’autre part sur les métastases pulmonaires. Et la mise en place d’une immunité anti tumorale permettra de proposer un nouveau moyen d’éliminer les cellules cancéreuses.

Procédures

Les animaux subiront : - 1 injection sous cutanée de cellules tumorales (5 secondes) - 1 injection/ jour dans le péritoine avec nos molécules ou 1 traitement oral/ jour avec nos molécules (5 secondes) pendant la durée du traitement. - 1 injection en intra veineuse de cellules tumorales (10 secondes) - 1 injection/ jour dans le péritoine avec nos molécules ou 1 traitement oral/ jour avec nos molécules (5 secondes) pendant la durée du traitement L’imagerie des animaux se fera le jour de l’injection des cellules, le lendemain puis tous les 4 jours pendant la durée du traitement. Les souris seront endormies (par inhalation) pendant environ 15 min et subiront une injection dans le péritoine (5 secondes) pour chaque imagerie. Les animaux subiront environ 10 imageries (pour un traitement de 40 jours) - 2 injections en sous cutané des cellules tumorales (5 secondes/ injection) 7 ou 8 injections dans le péritoine (5 secondes/ injection) Aucun prélèvement ne sera effectué sur les souris vigiles.

Impact sur les animaux

Lors des injections des cellules tumorales en sous-cutané, il peut y avoir un risque d’irritation et de gonflement aux zones d’injection. Pour les traitements en injection dans le péritoine, il peut y avoir un risque d’irritation, gonflement, infection aux zones d’injection et absence de toilettage. Pour les traitements oraux, les risques sont la suffocation, saignement et salivation excessive. Pour l’étude des métastases, lors de l’injection intra-veineuse, il peut y avoir gonflement, irritation et infection à la zone d’injection, et absence de toilettage. Lors de l’anesthésie gazeuse pour imager les souris, il peut y avoir hypothermie et prostration au réveil.

Devenir

A la fin de chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort. Nous prélèverons la tumeur et les organes (foie, rate, poumons) afin de réaliser les études qui nous apporterons le plus de renseignements possibles sur le fonctionnement de nos nouvelles molécules thérapeutiques.

Remplacement

Nous avons tout d’abord caractérisé et testé nos composés in vitro et sélectionné les plus efficaces sur les cellules tumorales et l’innocuité sur les cellules normales. Il est maintenant nécessaire de passer chez le rongeur afin d’avoir une approche plus physiologique. Nous pourrons ainsi déterminer lesquels de ces traitements sont les plus efficaces avec les modèles cancéreux utilisés (mélanome, cancer du côlon, gastrique et pancréas) sur les tumeurs primaires, les métastases et la mise en place d’une immunité antitumorale. Le passage chez l’animal est crucial avant le développement potentiel de ces molécules chez l’homme, ce qui permettrait une alternative à l’échec thérapeutique des traitements actuels.

Réduction

Avant le début de l’étude, il est important de faire des statistiques prédictives. Il s’agit de trouver le nombre d’animaux minimum à utiliser pour avoir des résultats significatifs. Pour notre étude, des groupes de 12 animaux seront adaptés à ces exigences.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo, tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid). Elles seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris par cage. Le suivi quotidien qui est réalisé permet de prévenir toute souffrance ou mal être. L’intervention se fait immédiatement. De plus, lors ce suivi, nous mesurons les tumeurs ainsi que le poids des souris, 3 fois / semaine. Pour la procédure qui nécessite une anesthésie gazeuse : les animaux seront mis sur un tapis chauffant le temps de leur réveil, afin d’éviter l’hypothermie.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes génétiques avec l'homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi, ainsi qu'une faible taille, ce qui permet d'avoir des conditions d'hébergement plus faciles. Par ailleurs la souris est un modèle reconnu et déjà validé pour l'étude du développement tumoral et de la mise en place d'une immunité antitumorale. Dans notre étude, les souris sont utilisées à 6 semaines. Elles sont commandées à 5 semaines et acclimatées pendant 1 semaine dans notre animalerie. La croissance tumorale est optimale chez les souris de cet âge et ceci est cohérent avec les expériences déjà effectuées au laboratoire ainsi qu’avec les données de la littérature.

424 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'analyse de leurs tissus. Sevrés à un mois, ils reçoivent jusqu'à deux injections sous la rétine sous anesthésie générale, subissent jusqu'à six examens du fond d'œil et trois électrorétinogrammes, et jusqu'à quatre prélèvements de sang à la jugulaire portant chacun sur 10 à 15 % de leur volume sanguin. Le projet teste des outils de thérapie génique contre la maladie de Stargardt et sert aussi, selon les finalités déclarées, à la formation professionnelle. Le porteur justifie le choix du rat par la taille de l'œil, cinq fois plus gros que celui de la souris, qui facilite l'injection et permet, écrit-il, de récolter suffisamment de matériel après la mort de l'animal.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie génétique rare qui touche les yeux, et plus particulièrement la rétine, une partie essentielle pour voir. Elle affecte surtout une zone appelée la macula, qui nous permet de voir les détails et de bien voir en plein jour. Environ 1 personne sur 8 000 à 10 000 est concernée par cette maladie. Dans la rétine, il y a des cellules qui réagissent à la lumière, appelées photorécepteurs, qui utilisent de la vitamine A. Mais quand ces cellules captent de la lumière, elles produisent des déchets toxiques. Normalement, une protéine, la ABCA4, aide à se débarrasser de ces déchets. Cependant, quand il y a un problème dans le gène ABCA4, les déchets s'accumulent et détruisent ces cellules, ainsi que d'autres cellules importantes dans l’œil. Pour l’instant, il n’y a pas de traitement pour cette maladie. Des chercheurs essaient d’utiliser une technique appelée thérapie génique pour corriger le gène ABCA4. Ils envisagent d’utiliser CRISPR/Cas9, un outil pour modifier les gènes. Le problème, c’est que le gène ABCA4 est trop grand pour être inséré facilement dans les cellules avec les méthodes actuelles, comme avec des vecteurs viraux (des virus modifiés qui servent de transporteurs). Les scientifiques cherchent donc à améliorer ces vecteurs et à essayer d’autres solutions, comme utiliser des mini-versions du gène ou des "nanoblades", sortes de petites "lames" moléculaires, avec des lentivirus (autres types de transporteurs). Les nanoblades ont déjà été testées dans d’autres parties du corps, mais pas encore dans l’œil. Enfin, un autre souci avec les vecteurs viraux est qu’ils peuvent déclencher une réaction du système immunitaire ou que leur effet ne dure pas assez longtemps. Les chercheurs doivent donc bien évaluer ces nouvelles approches pour trouver la meilleure solution pour traiter la maladie de Stargardt.

Bénéfices attendus

En thérapie génique, plusieurs facteurs peuvent provoquer une réaction du système immunitaire, comme la quantité de vecteur utilisé, le type de gène ajouté, ou la façon dont le traitement est administré. Pour la maladie de Stargardt, le gène ABCA4 est très grand, ce qui complique son insertion dans les vecteurs viraux habituels, comme les AAV (Virus Adéno-Associés). Cette étude vise à trouver la meilleure manière de corriger le gène ABCA4 et s’assurer qu’il n’y a pas de réponse immunitaire après l'insertion du gène dans l’œil. La technique CRISPR/Cas9 (outil moléculaire qui permet de couper des parties ciblées de l'ADN), déjà testée pour une autre maladie des yeux, offre de l’espoir pour traiter la perte de vision due à la maladie de Stargardt. L’utilisation d’un minigène permettrait de réparer plusieurs parties du gène ABCA4 en même temps, ce qui pourrait aider de nombreux patients avec des mutations différentes. En combinant les lentivirus et les nanoblades, les chercheurs espèrent améliorer l’efficacité du traitement, cibler précisément les cellules touchées, réduire la quantité de vecteur viral nécessaire et rendre l’intégration du gène plus sûre dans les cellules. Si cette approche fonctionne, elle pourrait non seulement soigner la maladie de Stargardt, mais aussi d’autres maladies liées à des gènes similaires

Procédures

(i) Injection sous-rétinienne (ISR) : Geste réalisé sous anesthésie générale avec anesthésie locale, durée de la chirurgie 30 minutes maximum. Pour l’évaluation de certaines stratégies, jusqu’à deux ISR seront réalisées, espacées de 3 semaines. (ii) Imagerie rétinienne (FO-OCT : Fond d’œil – Tomographie en Cohérence Optique) : Geste réalisé sous anesthésie générale avec anesthésie locale, durée de l’examen 30 minutes maximum. Si les animaux sont gardés 3 mois (temps maximum post injection), ils auront au maximum 6 FO-OCT. (iii) Imagerie rétinienne (ERG : Electro-Rétinogramme) : Geste réalisé sous anesthésie générale avec anesthésie locale, durée de l’examen 30 minutes maximum. Si les animaux sont gardés 3 mois (temps maximum post injection), ils auront au maximum 3 ERG. (iv) Prélèvements sanguins : Geste réalisé sous anesthésie générale, un volume sanguin correspondant à 10-15% maximum du volume sanguin circulant de l'animal sera prélevé au niveau de la veine jugulaire après anesthésie gazeuse de l'animal. Durée de l’anesthésie 10 minutes maximum. Si les animaux sont gardés 3 mois (temps maximum post injection), ils auront au maximum 4 prélèvements sanguins qui seront espacés d’au moins 2 semaines. Toutes les anesthésies seront espacées d’au moins une semaine pour laisser un temps de récupération à l’animal.

Impact sur les animaux

A ce jour, l’administration sous rétinienne de vecteurs chez le rat n’a pas d’effet délétère notable sur la morphologie et la fonction rétinienne ni sur l’état de santé général de l’animal. Nous nous attendons donc à une douleur minime liée à l’injection. Le modèle rat est un modèle qui tolère bien des injections de fortes doses de vecteur en sous rétinien. Cette douleur ne devrait pas dépasser les 12 heures post chirurgical. Les anesthésies répétées peuvent stresser les animaux mais celles-ci seront espacées d’au moins une semaine et les animaux seront surveillés au moins une heure après leur réveil par l’expérimentateur, la récupération devrait être rapide car les animaux seront soit sous anesthésie gazeuse ou recevront un réversif (en cas d’anesthésie fixe) pour accélérer le réveil et la récupération de l’animal.

Devenir

L'euthanasie des animaux est nécessaire pour obtenir les échantillons de tissus sur lesquels s'appuieront les analyses moléculaires, biochimiques, immunologiques et histologiques réalisées.

Remplacement

Des premiers tests ont été réalisés sur des cellules en laboratoire pour évaluer l'efficacité de différents systèmes de thérapie génique. Cependant, ces modèles en laboratoire ne peuvent pas reproduire toute la complexité des interactions biologiques présentes dans un organisme vivant. Cela rend difficile la reproduction de ces résultats dans un corps vivant. En laboratoire, il est aussi impossible de vérifier la répartition du traitement dans le corps ou son efficacité thérapeutique complète. La rétine de l'œil, qui est une structure complexe faite de plusieurs couches de neurones et de cellules nourricières, ne peut pas être recréée parfaitement en laboratoire. Même avec des méthodes utilisant des cellules souches, il est difficile de tester les interactions complexes du cycle visuel. C'est pourquoi l'utilisation de modèles animaux est essentielle pour étudier comment les gènes se comportent dans la rétine avant de commencer les essais cliniques sur l'homme. Les rats sont préférés aux souris pour ces études car leurs yeux sont cinq fois plus gros, ce qui facilite l'injection et assure une meilleure répartition du traitement. De plus, la taille de leurs yeux permet de récolter suffisamment de matériel pour les analyses après leur mort.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux nécessaire pour nos expériences. Ce nombre est basé sur des tests similaires que nous avons déjà effectués. En examinant les études publiées et notre propre expérience en laboratoire, nous avons déterminé que 8 animaux par groupe sont suffisants pour obtenir des résultats fiables. Après l’expérience, nous nous attendons à obtenir des variables (liées à nos données) ordinales. Nous ne pouvons pas raisonnablement supposer que les données seront normalement distribuées, par conséquent, nous pensons essentiellement utiliser des tests statistiques pour analyser les données générées par l’expérience.

Raffinement

Toutes les interventions sur les animaux seront réalisées sous anesthésie générale et locale pour minimiser la douleur. Si nécessaire, des analgésiques et anti-inflammatoires seront ajoutés. Les animaux seront surveillés chaque jour et le vétérinaire sera informé dès que des signes de détresse apparaîtront pour adapter les soins. Pour leur bien-être, les animaux seront hébergés par paire dans des cages enrichies avec du papier froissé, des bûchettes de bois et des tunnels. Si un animal doit être hébergé seul, nous augmenterons les éléments d'enrichissement pour lui. Ils auront toujours accès à la nourriture et à l'eau en permanence. Nous appliquerons des critères d'arrêt stricts pour intervenir rapidement en cas de souffrance, en fournissant des traitements pour la douleur ou en prenant la décision d'une euthanasie si nécessaire.

Choix des espèces

Nous utilisons des rats Long Evans, qui ne sont pas albinos, car leur vision est moins affectée par l'âge, ce qui est important pour analyser l'effet des traitements sur la structure de la rétine. Pour tester l'efficacité, nous utilisons des rats génétiquement modifiés pour avoir la maladie de Stargardt. Ces rats, provenant de la lignée Sprague Dawley, ont été créés avec la technologie CRISPR/Cas9, qui nous a permis de produire des rats n’exprimant plus le gène ABCA4 (ABCA-/-). Nous avons confirmé que ce modèle présente les caractéristiques attendues de la maladie, avec des problèmes métaboliques dans la rétine similaire à ceux observés chez les patients. Les rats seront des jeunes sevrés (à l’âge d’un mois) pour que leur manipulation soit plus aisée et que l’injection soit plus simple. Plus l’âge augmente plus la taille de l’œil est importante et plus le maintien de l’œil pour l’injection est complexe. Si l’injection est simplifiée, elle prendra moins de temps, l’anesthésie sera de plus courte durée et les résultats seront plus reproductibles.

Commandées à sept semaines chez un fournisseur agréé, ou nées de lignées génétiquement modifiées comparées à leurs contrôles de portée, 1 940 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever peau, cerveau, moelle épinière, rate et ganglions rachidiens. Le dos est dépilé puis exposé vingt minutes aux ultraviolets sous anesthésie, et la sensibilité mécanique de la zone brûlée est mesurée dix minutes par jour sur animal éveillé. Une partie subit l'ablation des glandes surrénales sous anesthésie profonde à l'âge de quatre semaines, d'autres reçoivent du LPS pour déclencher une inflammation aiguë, de la toxine diphtérique ou du tamoxifène jusqu'à trois fois par semaine. Le porteur affirme que ces interactions entre système nerveux et système immunitaire ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico, tout en annonçant l'emploi de cocultures de neurones et de cellules immunitaires déjà maîtrisées au laboratoire.

Objectifs

Lors d’un coup de soleil, les cellules immunitaires orchestrent la réparation cutanée. La peau est aussi densément innervée par des neurones sensoriels qui communiquent avec les cellules immunitaires pour optimiser la cicatrisation, puis transmettent les informations vers le cerveau. Nous avons récemment observé qu’une zone particulière du cerveau appelée hypothalamus était sollicité suite aux coups de soleils et induisait la libération de neurohormones, les glucocorticoïdes, aux propriétés anti-inflammatoires. Notre objectif dans ce nouveau projet est de caractériser comment la peau et le cerveau dialoguent pour assurer un processus de cicatrisation optimal. Notre modèle de lésion cutanée aux ultraviolets est idéal pour étudier les échanges entre le système nerveux et le système immunitaire. En effet, il permet de suivre à la fois le processus de cicatrisation et la transmission nerveuse des messages de toucher et de douleur vers la moelle épinière jusqu’au cortex cérébral. Notre équipe a déjà démontré l’importance des neurones sensoriels au cours de la réparation de la peau, cependant, comment le cerveau perçoit les lésions cutanés et y réponds, reste encore mal compris. Ainsi, le projet a pour but de répondre aux objectifs suivants : (1) identifier les étapes clés de la réparation cutanée après lésion chez des souris de type sauvage, et sa perception par le système nerveux périphérique et central. (2) Déterminer les rôles respectifs des neurones sensoriels et de l’hypothalamus dans la réparation cutanée. (3) Déterminer les mécanismes moléculaires, médiés par le cerveau, qui orchestrent la réponse immunitaires de réparation cutanée. Comprendre ces mécanismes nous permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter les pathologies inflammatoires, prévenir les douleurs chroniques et favoriser la régénération tissulaire.

Bénéfices attendus

L’orchestration du processus de régénération tissulaire après lésion, par le système nerveux périphérique et central, reste encore très inexplorée. L’un des avantages majeurs de la neuro-immunologie est d’identifier des cibles pharmacologiques qui pourraient simultanément soigner les pathologies inflammatoires, et prévenir les douleurs qui y sont associées. Outre son aspect fondamental, la compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents, permettrait d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter l’inflammation et favoriser la réparation tissulaire tout en traitant les douleurs associées. Cette approche est particulièrement intéressante pour des personnes souffrant de défaut de cicatrisation telles que les personnes âgées ou bien atteintes de diabète. Nous proposons d’étendre nos résultats précédents à l’étude des interactions bidirectionnelles entre la peau et le cerveau. La douleur et le stress associé à une blessure (invalidité, chirurgie) constituent un problème majeur de santé public. Mieux comprendre comment ces deux processus modulent le système immunitaire au cours de la cicatrisation est primordial pour améliorer à terme le confort des patients, prévenir l’escalade de la douleur vers un stade chronique et approfondir notre compréhension de son mécanisme d’action. A terme, cette étude permettra de développer de nouveaux médicaments pour traiter la douleur inflammatoire tout en minimisant les potentiels effets secondaires.

Procédures

Toutes les souris subiront une anesthésie générale afin de subir une dépilation sur la peau du dos puis une exposition aux ultraviolets pendant 20 minutes de la zone dépilée, toujours sous anesthésie. Nous réaliserons ensuite des études de comportement pour tester l’évolution de la perception de la douleur (mesure de sensibilité mécanique ; 10 min/jour) suite à l’exposition aux ultraviolets sur animaux vigiles. Plusieurs des injections à réaliser (1 min) sont faites en intrapéritonéal, en sous cutané, ou en intradermique, sur animaux vigiles. Des prélèvements sanguins seront faits sur la veine sous-mandibulaire (2 min). Certaines procédures nécessiteront une chirurgie (ablation des glandes surrénales ; 10 min) sous anesthésie profonde (45 min), après laquelle la plaie sera suturée et les souris suivies quotidiennement et traités avec des analgésiques, crème cicatrisante et anti-inflammatoires.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à subir une irradiation aux ultraviolets (20 minutes) sur une petite zone de la peau du dos qui pourraient induire une perte de poids (sur 2 jours), des modifications de comportement en plus de l’inflammation cutanée. La procédure pourra aussi provoquer une sensibilité mécanique ainsi qu’un potentiel prurit (démangeaisons) au niveau de la peau irradiée. Les mesures de sensibilité mécanique (5 min.) peuvent engendrer du stress. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en œuvre pour minimiser la nuisance provoquée. Les injections, en intrapéritonéale ou sous cutanée, réalisées sur animaux vigiles peuvent générer un stress de courte durée (5 min.). Les modèles génétiques utilisés ne présentent pas de phénotypes dommageables. L’effet principal des déplétions génétiques que nous réalisons est une diminution de la sensibilité à la douleur chez ces animaux (perte de sensibilité à la chaleur, ou aux stimulations mécaniques). Le suivi de certaines souris impliquera une anesthésie légère à l’isoflurane (5 min.) jusqu’à 3 fois par semaine, ce qui induira du stress à l’animal. De même, certaines méthodes de traçage génétique nécessiteront une injection de tamoxifène jusqu’à 3 fois par semaine. La déplétion de certaines cellules immunitaires nécessitera une injection intrapéritonéale unique de toxine diphtérique. Pour notre approche pharmacologique, les traitements (injection ou application topicale) seront effectués journalièrement pendant 4 jours sous isoflurane et pourront engendrer du stress. La procédure (No3) chirurgicale visant à enlever les glandes adrénales (20 min/souris) nécessitera un traitement pré- et post-opératoire analgésique pour minimiser la douleur et le stress des animaux avant, pendant et après la chirurgie. Les souris traitées au LPS subissent une inflammation aigue pour une période de temps très courte (6 heures) au bout de laquelle les souris seront sacrifiées et analysées. La dose utilisée (100ng/10g) n’induit pas de choc septique. Cependant, il se peut que ces souris subissent une baisse transitoires (45 min.) de leur température corporelle. Nous utiliserons un tapis chauffant (37C) ainsi qu’un milieu enrichi pour prévenir cette hypothermie avant analyse.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures et les organes d'intérêts (peau, DRG, cerveau, moelle épinière, rate, ganglion lymphatique) seront prélevés post mortem pour analyse. Les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des différents tissus est indispensable pour étudier le recrutement cellulaire de la réponse inflammatoire au niveau des tissus étudiés.

Remplacement

Le modèle animal (in vivo) est indispensable pour étudier les interactions entre système immunitaire et système nerveux sensoriel. En effet, ce sont des événements progressifs et multifactoriels qui dépendent des interactions tissulaires, cellulaires et moléculaires, localement sur le site inflammatoire mais également à distance dans les ganglions rachidiens de la racine dorsale (DRG) qui innervent la peau. Ces interactions ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico, en particulier l’étude de l’innervation dans un tissu donné. Cependant, pour la recherche de mécanismes d’interaction neurone/cellule immunitaire ou des neuropeptides produits par ces neurones sensoriels, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maîtrisées au laboratoire, telles que la coculture de neurones et de cellules immunitaires.

Réduction

Le plan de nos expériences est construit de manière à limiter le nombre de souris au maximum. Sur la base de nos résultats précédents, pour une différence biologiquement pertinente, nous avons estimé que 10 souris par expérience sont nécessaires : Des groupes de 5 souris seront générés en adéquation avec l’âge, le sexe et le fond génétique contrôle à chaque lignée murine (5 souris dites « test » et 5 souris « contrôles », soit 10 souris par expérience) pour chaque procédure. Chaque expérience sera répétées au moins une fois, soit 20 souris pour chaque condition testée pour répondre aux exigences statistique. Nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles dans nos expériences, pour éviter de produire des animaux sans les utiliser. Tous les paramètres quantifiables seront vérifiés (poids, score d’inflammation, comportement) et tous les organes nécessaires à notre étude seront prélevés (peau, rate, et ganglion rachidien de la racine dorsale, moelle épinière et cerveau) afin d’éviter des expériences inutiles. Nous avons choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de portée respectifs et non avec des souris de type sauvage. Le contrôle des paramètres environnementaux et le statut sanitaire des animaux permettront de limiter la variabilité des résultats expérimentaux, et de réduire le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Nous avons optimisé le modèle UV dans notre Apafis précédent pour minimiser le stress et la souffrance liée à la lésion tissulaire. Seule une zone tres restreinte de la peau du dos des souris sera exposée aux ultraviolets. Les animaux utilisés dans ce projet sont élevés en groupes sociaux, la présence d’objets permet le raffinement de l’environnement dans des cages standards à toit ouvert (couvercle à filtre) avec de la sciure de bois utilisée comme litière et un accès ad libitum à un bidon d’eau et à un régime alimentaire standard. Nous utilisons alternativement des carrés de ouates pour que les animaux puissent faire un nid, des dômes en cellulose ou des tunnels en carton, qui sont changés chaque semaine. Les élevages sont effectués au sein d’un établissement agréé où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé tous les jours. Nous avons recours à l’anesthésie/analgésie lors de l’exposition aux UV. Une planification fine des procédures expérimentales est effectuée (disponibilité des locaux d’expérimentation, du matériel, période d’acclimatation d’une semaine minimum des animaux aux pièces d’expérimentation et l’animalerie) pour diminuer le stress des animaux. Notamment lors du test comportemental par Von Frey les animaux seront acclimatés à l’enceinte 30 minutes avant les mesures pour minimiser le stress. Enfin l’établissement des points limites selon les grilles en annexe sera suivi au quotidien (vérification du poids, de la vivacité et de l’état du pelage des animaux) pour decider de continuer l’expérience ou non en fonction des signes vitaux des animaux. Une souris ayant perdu 20% de son poids sera systématiquement euthanasiée. Ces stratégies seront mises en place dans le but de réduire/supprimer la souffrance animale. Les modèles génétiques, ainsi que les déplétions chimiques ne présentent pas de phénotype dommageable. Les procédures incluant une chirurgie suivront un protocole strict pour réduire la souffrance de l’animal avant, pendant et après la chirurgie. Les souris seront maintenues profondément anesthésiées lors de l’opération et des soins pré-(Buprénorphine), per- (lidocaïne localement) et post-opératoires (Buprénorphine) adéquats sont administrés en plus de creme cicatrisante et nourriture humide pour éviter toute carences hydrique/alimentaires). Un tapis chauffant (37C) est utilisé pour éviter toute hypothermie pendant l'anesthésie.

Choix des espèces

Le niveau de similarité entre la souris et l’homme justifie son utilisation. L’état des connaissances actuelles, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaires et nerveux. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la Souris et l’Homme. De plus, l’existence de modèle murins génétiquement modifiés fait de la souris un modèle animal de choix pour étudier ces phénomènes physiologiques. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires et de développement du système nerveux. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie pendant au moins une semaine. Pour l’adrénalectomie, des souris de 4 semaines sont utilisées pour leur donner une période de rétablissement de 4 semaines avant induction de la lésion cutanée aux UV et étude de la réparation tissulaire.

Implantées dans le crâne après une heure de neurochirurgie, 360 souris reçoivent des stimulations électriques intracérébrales une à deux fois par semaine, sur animal éveillé, pendant des sessions allant jusqu'à quarante minutes. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à dix injections et vingt prélèvements de sang par animal, et sont hébergées derrière un séparateur qui les isole physiquement de leur congénère pour protéger le système d'enregistrement. Le porteur qualifie l'intensité des stimulations de faible et n'attend une réaction comportementale que dans de rares cas, tout en prévoyant l'administration immédiate de kétamine et de diazépam en cas de crise épileptique. Les dispositifs d'enregistrement n'étant pas amovibles, aucune souris ne sort vivante du projet.

Objectifs

L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des candidats médicaments sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Cela signifie d’appréhender cette problématique par une approche consistant à utiliser les données existantes de la recherche clinique pour construire de nouvelles solutions de recherche préclinique et se baser sur des signes de la maladie dans le cerveau et des tests médicaux utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères montrant le fort potentiel de transposition de cette méthode du rongeur à l'Homme, et donc l’application chez le rongeur d’observations faites chez le patient et inversement. Dans ce projet, nous étudierons les activités électriques cérébrales chez des animaux. Les différences mises en évidence pourront alors être utilisées pour différents tests médicamenteux afin d’identifier une molécule efficace pour lutter contre la maladie.

Bénéfices attendus

L’optimisation de nouveaux médicaments nécessite d'identifier des signes de la maladie dans le cerveau et des tests transposables entre les études cliniques et précliniques. Ils doivent permettre d’évaluer de façon fiable et robuste l’efficacité des molécules testées. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des souris et chercherons à mettre en évidence des spécificités de la maladie qui pourront par la suite être applicable à l'Homme et permettre de tester de nouvelles molécules thérapeutiques. L’identification d’un potentiel nouveau traitement de la maladie d’Alzheimer permettrait d’améliorer les conditions de vie de nombreux patients.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux sont hébergés après l’implantation dans des cages à deux contenant un séparateur qui favorise le contact olfactif, visuel et auditif mais qui permet de les isoler afin de préserver l’intégrité du système d’enregistrement. Les animaux seront tous soumis à des stimulations intracérébrales répétées de faible intensité qui seront réalisées sur l’animal éveillé une à deux fois par semaine. Chaque session de stimulation durera entre 3 et 40 minutes au maximum. Au préalable de chacune de ces sessions de stimulations, une molécule pharmacologique pourra être administrée à l'ensemble des animaux (injections aigues durant quelques minutes). Pour ces tests pharmacologiques, un maximum de 10 injections sur une période de 5 à 10 semaines seront réalisées. Des prélèvements sanguins sur animal éveillé pourront également être réalisés (20 maximum au total et 15 minutes maximum par animal), tous les animaux du projet sont susceptibles d'être soumis à ces prélèvements.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagères pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Lors de la stimulation cérébrale, malgré l’intensité faible utilisée, une réaction comportementale (immobilité, sursaut, clignement des yeux) pourra être induite dans de rares cas. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées. Le modèle utilisé présente une stagnation de la prise de poids à partir de 10 mois ainsi qu’une surmortalité très modérée propre au modèle non liée au vieillissement.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électriques du cerveau qui ne sont pas amovibles, les animaux doivent donc être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Ce projet nécessite l'utilisation de modèles animaux car il étudie des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou informatique).

Réduction

Dans le cas des études de test pharmacologique, chaque animal est son propre contrôle et sera utilisé pour tester différents candidats médicaments, permettant de limiter le nombre d’animaux nécessaire par groupe. Ce type de protocole nous permet d’utiliser des tests statistiques de type appariés. Le nombre d’animaux a ainsi été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées.

Raffinement

Les souris qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Une injection d’analgésique sera faite avant la neurochirurgie et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages d’hébergement avec enrichissement (coton, maison en carton) pour limiter tout stress dû à l’environnement quotidien. Les stimulations seront interrompues au moindre signe d’inconfort de l’animal (évaluation visuelle comportementale). En cas de survenue d’une crise épileptique : un traitement de kétamine/diazépam sera administré alors immédiatement. Dès l’apparition d’un signe clinique d’alerte (poids, comportement...) nous nous réfèrerons à une grille de cotation interne spécifique permettant de prendre les mesures nécessaires en fonction des points limites identifiés afin de préserver le bien-être animal. L’évaluation est réalisée jusqu’à disparition du signe d’alerte. Lors des injections, une surveillance particulière est portée sur les animaux. Un arbre décisionnel peut être consulté en cas d’altération de l’état général de l’animal après l’injection afin de le soulager.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des souris. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques du cerveau. Ces similarités peuvent être utilisées pour le développement de nouveaux médicaments. La sélection de la souris est aussi basée sur des études précédemment réalisées. Les animaux sont âgés de minimum 3,5 mois puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, les circuits électriques du cerveau sont matures. Les animaux seront gardés jusqu’à l’âge de 14 mois maximum car le sujet d’étude concerne la maladie d’Alzheimer qui se développe avec le vieillissement.

Toutes tuées pour que leur système nerveux central soit prélevé, 30 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit quarante gavages oro-gastriques, un par jour, sur animal vigile, avec de la roténone, un insecticide que la Commission européenne a interdit en 2008 pour sa toxicité. Le porteur qualifie la dose de "modérée" et "peu impactante sur la qualité de vie des animaux", et n'attend du gavage qu'une irritation transitoire du système digestif. Il s'agit d'une étude pilote de trois ans, dont la fonction déclarée est de mettre le modèle en place pour permettre de futures expériences.

Objectifs

La roténone est un insecticide d’origine naturelle extrait de racines de plantes tropicales. En raison de sa toxicité, la commission européenne a interdit son utilisation en 2008, avec des dérogations jusqu’en 2011. Le lien étroit entre une exposition à la roténone d'origine professionelle (agriculture) et un risque accru de développer une maladie de Parkinson a été formellement établi en 2011. Les examens post mortem réalisés sur des cerveaux de travailleurs exposés à la roténone dans le cadre de leur activité professionnelle ont révélés des lésions caractéristiques de la maladie de Parkinson : perte des neurones dopaminergiques et accumulation de protéines pathologiques. Ainsi, l’exposition expérimentale à la roténone chez la souris est aujourd’hui utilisée non seulement comme modèle de la maladie de Parkinson, mais aussi pour évaluer ses effets potentiels sur les troubles du développement cérébral chez les fœtus exposés in utero. Il existe en effet de fortes présomptions pour une toxicité des polluants environnementaux (incluant les produits phytosanitaires) sur le cerveau en développement. L’objectif de notre étude pilote est d’implémenter le modèle d’exposition expérimentale à la roténone chez la souris par administration directe dans l'estomac. Cette étude pilote, d'une durée de 3 ans, permettra de préparer de futures études portant sur l’effet de la roténone sur les lésions caractéristiques de la maladie, ainsi que sur les effets toxiques neuro-développementaux de la roténone.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de disposer d’un modèle de référence de maladie de Parkinson provoquée par exposition aux produits phytosanitaires. Sur le plan des connaissances scientifiques, le projet produira des données inédites sur des mesures du comportement des souris dans ce modèle de maladie de Parkinson en complément des données biologiques.

Procédures

Les souris sont exposées à la roténone par voie orale via un gavage oro-gastrique quotidien. Le gavage dure 1 minute et est réalisé sur animal vigil. Chaque souris sera soumise à 40 gavages sur l'ensemble de la période d'expérimentation. En fin de protocole, il sera procédé à une chirurgie terminale sous anesthésie en vue du prélèvement du cerveau.

Impact sur les animaux

Le modèle est bien décrit dans la littérature et la dose modérée utilisée est peu impactante sur la qualité de vie des animaux . La procédure de gavage oral, réalisée par un personnel expérimenté, est susceptible d’engendrer une irritation transitoire du système digestif.

Devenir

L'objectif de ce projet est l'étude de l'effet neurotoxique de la roténone, pour ce faire il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin de disposer du système nerveux central.

Remplacement

A ce jour, le remplacement complet de ce modèle d’étude n’est pas envisageable. Les mécanismes moléculaires et cellulaires, et leurs interactions, impliqués dans le développement de la pathologie spécifique produit par l'administration de roténone ne sont pas réalisables in vitro. L’étude de ces mécanismes nécessitent l'utilisation de modèles animaux.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. Le schéma expérimental utilisé considère chaque animal comme son propre contrôle grâce à la répétition des tests et permet ainsi la réduction du nombre d'animaux.

Raffinement

Conformément aux exigences de raffinement, les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie, et seront hébergés dans un environnement enrichi (igloos, nestlets et petites buchettes de bois). Le suivi individuel consiste en une inspection visuelle du comportement et de l’apparence au quotidien. Le suivi individuel est approfondi lors des pesées bi-hebdomadaires. Les points limites concernent la perte de poids, la présence de piloérection accompagnée du dos vouté et l’absence de réaction à la stimulation. L’administration orale de la roténone évite la répétition d’injections intrapéritonéales.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont des souris conventionnelles qui permettront la comparaison de nos résultats avec les données de la littérature. Le projet prévoit d’utiliser des souris à l'âge de 5 semaines à l'arrivée au laboratoire. Le protocole d’exposition démarrera lorsque les souris auront 8 semaines, ceci nous permettra de comparer les résultats avec les données de la littérature.