Rongeurs

1 908 souris et 297 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de vecteur viral dans la veine de l'œil ou dans la veine de la queue, des prélèvements de sang hebdomadaires, des mesures répétées de force et de fatigue musculaires sous anesthésie, et des évaluations cardiaques précédées d'une épilation du thorax. Le projet sert à fixer la dose qui figurera dans le dossier réglementaire déposé pour obtenir l'autorisation d'essai clinique, après des cas de toxicité graves allant jusqu'au décès de patients traités à forte dose. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut reproduire la perte de locomotion ni les réactions immunitaires déclenchées par un vecteur d'origine virale.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont des maladies génétiques invalidantes affectant le muscle squelettique et sans traitement à l’heure actuelle. Elles sont dues à des mutations de gènes. Une option thérapeutique possible pour ces pathologies est la thérapie génique qui consiste à transférer une copie normale du gène déficient à l’aide d’un transporteur, un virus modifié capable d’amener le gène thérapeutique dans la cellule sans entrainer d’effets nocifs. Ces virus modifiés sont appelés des vecteurs. Le muscle squelettique représente environ 40% de la masse corporelle, ce qui nécessite d’utiliser des doses élevées de vecteur pour toucher l’ensemble de la musculature. Cependant, ces doses élevées de virus modifié peuvent entrainer des effets secondaires graves. Par conséquent, il y a un besoin de développer des produits efficaces à plus faible dose. Des études préliminaires ont permis d’obtenir des vecteurs efficaces à plus faible dose pour transférer un gène dans le muscle (jusqu’à 10 fois plus efficace). La meilleure dose efficace n’est pas connue. L’objectif de ce projet est donc de déterminer in vivo la meilleure dose efficace de ces nouveaux produits sur des modèles rongeurs de maladies musculaires. Les traitements seront administrés à 2 âges afin de mimer 2 stades différents des maladies humaines. Les analyses réalisées permettront de définir la dose conduisant à un effet thérapeutique, ce qui servira à déterminer la dose qui sera utilisée chez l’homme lors d’essais cliniques. Les études seront incluses dans le dossier réglementaire à déposer aux agences dans le but d’obtenir l’autorisation d’essai clinique.

Bénéfices attendus

Les produits de thérapie génique en cours de développement clinique utilisent des doses élevées de vecteurs, qui se sont parfois assorties d’effets toxiques importants, conduisant dans le pire des cas au décès du patient. Ce projet a pour but d’identifier des produits de thérapie génique de seconde génération efficace à plus faible dose, ce qui permettra de résoudre les problèmes de toxicité, tout en conservant une bonne efficacité thérapeutique.

Procédures

Le traitement par transfert de gène se fait par injection intraveineuse en une seule fois, soit sur animaux anesthésiés pour l’injection à la veine de l’œil soit sur animaux non anesthésiés pour l’injection dans la veine caudale. Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. Afin d’évaluer le bénéfice du traitement, des explorations de la fonction musculaire seront réalisées sur les animaux en début et au cours du protocole. Leur durée moyenne est de 10 minutes. La fatigue musculaire sera également évaluée plusieurs fois au cours du protocole avec un maximum de trois à cinq fois selon la durée post-injection. Les animaux sont anesthésiés, l’examen dure environ 20 minutes. Les animaux sont soumis à une évaluation de la fonction cardiaque au début et en fin de protocole. Les animaux sont anesthésiés et maintenus dans cet état tout au long de l’examen d’une durée de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont les suivantes: → Les animaux seront maintenus en contention pour les injections intraveineuses, ce qui pourrait entrainer un stress. → Certains actes mesurant la force du muscle seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui pourrait entrainer une confusion de l’animal au réveil. → Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment de l’injection intraveineuse du produit thérapeutique, des injections intra-péritonéales d’anesthésique ou de dobutamine, des injections sous-cutanées d’analgésique, ainsi qu’un moment des prélèvements de sang. → Des lésions locales de type inflammatoire ou des irritations accompagnées de douleurs localisées pourraient être causées par l’épilation nécessaire pour pratiquer les mesures de la fonction cardiaque, par la pose d’électrodes au moment de la mesure de l’activité électrique du muscle ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire réalisés sur animal éveillé. Une sécheresse oculaire peut également être observée au cours des anesthésies. → Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte légère ou modérée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes et des muscles pour l’analyse des tissus et des niveaux de produits thérapeutiques reçus afin de vérifier l’efficacité thérapeutique et l’absence de toxicité.

Remplacement

Le projet consiste à déterminer l’effet thérapeutique de nouveaux produits de thérapie génique au niveau des muscles squelettiques et du coeur. Cette évaluation ne peut pas être réalisée dans des modèles cellulaires car 1) il est impossible de mimer les symptômes de la maladie dans ces modèles (type perte de la locomotion ou atteinte des paramètres cardiaques) ; 2) Il est impossible de cibler différents tissus simultanément dans ces modèles et d’étudier la répartition du produit thérapeutique entre les différents organes ; 3) Il est impossible de recréer en laboratoire les réactions immunitaires complexes qui peuvent se développer après l’injection de vecteurs d’origine virale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats significatifs sans utiliser d’animaux surnuméraires. Nous utiliserons les mêmes animaux témoins pour des expériences différentes chaque fois que possible. Un maximum d’analyses sera réalisé sur chaque organe prélevé. Un nombre plus important de doses sera testé sur les jeunes animaux, et selon les résultats obtenus, un nombre réduit de doses sera testé sur des animaux plus âgés, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés en tout.

Raffinement

Pour les animaux non issus de l’élevage, une phase d’adaptation sera respectée avant la réalisation des procédures. L’ensemble des animaux est observé quotidiennement au niveau de la cage. Afin de limiter le stress et la douleur induite par les prélèvements de sang, ces derniers seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Dans le cas des prélèvements de sang réalisés sous anesthésie gazeuse, des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telle l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus. Un point de compression est systématiquement réalisé pour favoriser la coagulation. La survenue de signes hémorragiques, gonflements ou rougeurs sera surveillée après le prélèvement. Un test de course sera réalisé : une phase d’entrainement sera réalisée pendant 4 à 7 jours avant le test. Lors des tests de mesure de la force des muscles, il y a un risque exceptionnel de blessure. Dans ce cas, un traitement à la bétadine sera prodigué jusqu’à la cicatrisation. La mesure de l’activité électrique du muscle sera réalisée après un traitement anti-douleur préalable réalisée 30 minutes avant le test. Le test sera réalisé sur une plaque chauffante sous anesthésie aérienne. Lors des mesures de l’activité du cœur, une épilation du thorax est réalisée : une application locale de crème anti-irritation sera réalisée à l’endroit de l’épilation. Lors des anesthésies, les animaux sont placés sur plaque chauffante.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons les espèces souris et rat car ces modèles reproduisent les caractéristiques principales des maladies étudiées. Dans le cas des modèles de la maladie de Duchenne, le modèle de rat présente des atteintes cardiaques plus représentatives de la pathologie humaine, tandis que le modèle de souris est un meilleur modèle de la pathologie du muscle. Dans certains modèles, le modèle de rats présente des cellules immunitaires spécifiques de la pathologie humaine, mais seule la souris présente une réduction de la force des muscles. L’utilisation de deux modèles de rats ou de souris est donc nécessaire, selon la question scientifique posée. D’autre part, les espèces de souris et de rats sont faciles à manipuler, héberger, et se reproduisent facilement et rapidement. Les approches de thérapie génique ont des efficacités variables selon l’état du muscle: elles sont généralement plus efficaces à des stades précoces, notamment parce que le tissu est en meilleur « état ». Pour cette raison, la dose efficace d’un même produit peut être différente selon l’état d’avancement de la pathologie Dans ce projet, dans le but de traiter des patients ayant des avancées différentes des maladies, il sera nécessaire d’utiliser des animaux adultes jeunes et des animaux plus âgés afin de reproduire les stades précoces et tardifs des pathologies.

Opérées du crâne dans les deux premiers jours de leur vie, des souris nouveau-nées reçoivent une greffe de cellules nerveuses assemblées en trois dimensions par lévitation acoustique. 312 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur indique que la séparation d'avec la mère peut conduire celle-ci à rejeter définitivement ses petits, et qu'un échec de la greffe peut diminuer la capacité de préhension de la patte avant gauche. L'étude pilote annoncée porte sur 120 animaux au maximum, sans que le reste de l'effectif demandé soit détaillé.

Objectifs

Le cortex cérébral est la partie externe du cerveau et est responsable de fonctions complexes telles que la perception sensorielle, la cognition, la génération de commandes motrices volontaires... Il est composé de six couches distinctes, chacune ayant des types spécifiques de neurones et des connexions uniques. Ces couches jouent un rôle crucial dans le traitement de l'information en permettant une organisation et une transmission efficaces des signaux neuronaux à travers différentes régions du cerveau. Le cortex cérébral est souvent affecté en cas de traumatisme crânien en raison de sa position superficielle, cependant les solutions thérapeutiques proposées demeurent limitées. En effet, le cerveau adulte présente une faible capacité d’autoréparation, que ce soit dans la neurogenèse de nouvelles cellules ou de nouvelles connexions projetant sur de longue distance. La transplantation cellulaire offrirait ainsi une stratégie thérapeutique pour les patients en apportant de nouvelles cellules en remplacement de celles perdues suite à une lésion. Différentes technologies sont actuellement utilisées pour procéder à la reconstruction 2D ou 3D de tissus complexes à partir de cellules vivantes. Dans le champ des Neurosciences, de nombreux modèles in vitro sont actuellement en cours de développement. Cependant, l’objectif de ce projet n’est pas d'étudier la thérapie cellulaire par transplantation de cellules fœtales, mais plutôt d’évaluer un éventuel intérêt de la lévitation acoustique comme technique innovante pour améliorer cette thérapie. Des recherches récentes ont montré qu'il est possible, en utilisant la lévitation acoustique, de structurer en 3D des couches de neurones intégrées dans des blocs d’hydrogel. Le but de ce projet est donc de tester la capacité des structures neuronales 3D obtenues par lévitation acoustique à favoriser la restauration des différentes voies neuronales après transplantation dans un modèle murin de traumatisme crânien.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra d'étudier l'intérêt de la technique de lévitation acoustique sur la réparation des réseaux neuronaux après transplantation de cellules chez le rongeur. Cette technique permet un positionnement extrêmement précis des cellules, ce qui est essentiel pour cibler des zones spécifiques du cerveau avec une grande exactitude. La lévitation acoustique offre une méthode innovante et potentiellement supérieure pour la manipulation précise et douce des cellules destinées à la thérapie cellulaire, améliorant la précision, la viabilité et l'efficacité de ces interventions thérapeutiques. A plus long terme, les bénéfices attendus de ce projet sont le développement de thérapie chez l'Homme autour la transplantation cellulaire, afin d’améliorer la qualité et la fiabilité des transplantations et ainsi améliorer la prise en charge des patients souffrants de lésions corticales.

Procédures

Sur nouveau-nés anesthésiés : 1 chirurgie craniale pour transplanter des cellules : 1 fois (5 minutes par animal, 312 animaux). Sur animaux vigiles : au maximum une dizaine de pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (une fois par semaine, sur toute la durée du projet, 312 animaux maximum). Sur animaux anesthésiés (avec antalgie) : 1 chirurgie sans réveil pour le prélèvement du cerveau (5 minutes par animal, 312 animaux).

Impact sur les animaux

La séparation des nouveaux nés avec leur mère, le temps de la chirurgie, peut induire un stress modéré transitoire chez la mère et chez les petits. Cette séparation peut également induire un rejet définitif des petits par la mère. Pendant l’induction de la cryoanesthésie, une sensation de froid transitoire est attendue. Après la chirurgie crânienne, l’effet indésirable attendu est une douleur modérée transitoire atténuée par des antalgiques. Si la greffe est un échec, l’effet potentiellement attendu est une légère diminution de la capacité de préhension de la patte avant gauche. L’acte de pesée sur animal vigile peut induire un léger stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques.

Remplacement

La technique d’impression des cellules par lévitation acoustique utilisée dans cette étude aura été testée au préalable in vitro. La différenciation et la survie des cellules seront vérifiées avant de commencer les tests in vivo. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la possibilité de la réparation du cerveau lésé sur le plan neuroanatomique. De ce fait, la nécessité de modèles animaux apparait essentielle à l’étude de cette pathologie. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. De nos jours, il n’est pas encore possible de modéliser la complexité du cortex cérébral de mammifère in vitro ou in silico, qui nous permettrait d’étudier la reconstruction des noies neuronales.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires en expérimentation tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour avoir une étude interprétable sur le plan statistique. Nous commencerons par réaliser une étude pilote qui consistera à valider les bons paramètres de la technique de lévitation acoustique pour la viabilité du greffon. Nous procéderons avec une démarche pas à pas (par groupe de 6-8 animaux, c’est-à-dire une portée), répétés au maximum 15 fois, soit 120 animaux maximum au total. Si l'étude pilote donne des résultats satisfaisants, une étude comparative utilisant différentes techniques de préparation des neurones à transplanter sera réalisée. Les données de l'étude pilote seront alors exploitées dans cette étude comparative réduisant d'autant le nombre d'animaux utilisés. Si l’étude pilote ne donne pas de résultat satisfaisant, le projet sera arrêté.

Raffinement

Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Les mères seront conditionnées aux manipulations et aux odeurs 7 jours avant la procédure pour éviter le rejet des nouveaux-nés. Lors de la chirurgie nous aurons recours à une anesthésie générale avec une analgésie. Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement) et des actions seront mises en place en cas de problème(s) observé(s), avec l’utilisation de points limites adaptés et gradés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée pour les modèles animaux dans le domaine des neurosciences. Les modèles de lésion/transplantation corticale chez le rongeur sont bien référencés et maitrisés. Les animaux seront utilisés au stade postnatal (jusqu'à 2 jours après la naissance). La réalisation de transplantations cérébrales chez les nouveaux-nés de souris présente plusieurs avantages : -Le cerveau des nouveau-nés est beaucoup plus plastique que celui des adultes, ce qui signifie qu'il est plus capable de réorganiser ses circuits neuronaux et d'intégrer les nouvelles cellules -Les nouveau-nés ont souvent une réponse immunitaire moins développée, ce qui réduit le risque de rejet des cellules transplantées par rapport aux adultes dont le système immunitaire est plus mature et réactif -Les cellules souches transplantées chez les nouveau-nés sont plus susceptibles de se différencier en types de cellules appropriés et de former des connexions fonctionnelles beaucoup plus rapidement

Les 960 souris de ce projet seront toutes tuées, au nom de la gestion du risque lié à un agent pathogène de groupe III. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, infectées par le virus respiratoire syncytial ou par une souche de SRAS-CoV-2 adaptée à la souris, inoculée dans le nez sous anesthésie gazeuse. Chacune subit jusqu'à trois prélèvements de sang au sinus rétro-orbital sous anesthésie, avant chaque vaccination puis avant l'épreuve virale. Le porteur décrit des symptômes légers à modérés et une perte de poids qui n'excède pas 15 % chez les jeunes souris, et affirme que l'efficacité vaccinale ne peut être évaluée sans administrer l'agent pathogène à un animal vivant.

Objectifs

Les infections virales respiratoires représentent un défi de santé publique majeur à l’échelle mondiale. Parmi les virus responsables, on trouve notamment le virus respiratoire syncytial (VRS) et le SRAS-CoV-2. La prévention et le contrôle de ces infections virales constituent un enjeu crucial. L’étude des défenses immunitaires a longtemps été limitée aux poumons alors que les voies supérieures dont la muqueuse nasale sont les premiers tissus que rencontrent ces virus comme l'a très bien montré la pandémie de SRAS-CoV-2. Etudier les mécanismes d’infections et de défenses immunitaires dans la cavité nasale est donc indispensable pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques qui permettrons de lutter contre ces virus respiratoires et d'ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. La plateforme vaccinale à adénovirus émerge comme une stratégie prometteuse pour le développement de vaccins contre les infections virales respiratoires. Cette approche exploite la capacité des adénovirus à délivrer des antigènes viraux ciblés dans les cellules hôtes. De plus, l'administration nasale de vaccins à adénovirus vise directement les voies respiratoires, stimulant ainsi les réponses immunitaires locales et conduisant potentiellement à la protection contre ces maladies tout en limitant la transmission des virus. Le présent projet a pour objectifs principaux (i) l’étude de la physiopathologie de l’infection à SRAS-CoV-2 et à VRS au niveau de la cavité nasale chez la souris et (ii) l’évaluation d’approches vaccinales adaptées à l’administration par voie nasale.

Bénéfices attendus

L’étude chez le rongeur des infections à SRAS-CoV-2 et à VRS, et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre les infections respiratoires. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche. Ce projet va permettre d’évaluer les approches vaccinales à l’aide d’adénovirus et de caractériser le rôle des protéines du mucus (mucines) dans les infections virales respiratoires

Procédures

L’inoculation de la souche virale ou du vaccin est réalisée par voie nasale sous anesthésie gazeuse. Le vaccin est administré par injection intramusculaire à l’animal vigile par des manipulateurs expérimentés. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Tous les animaux seront prélevés au plus 3 fois lors de la phase d’immunisation : avant chaque vaccination (au maximum 2) et avant l’administration de la souche virale d’épreuve. Les prélèvements seront réalisés au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié (isoflurane) avec ajout d’un collyre anesthésique.

Impact sur les animaux

L’infection de souris (> 5 mois) par le VRS ou la souche murinisée de SRAS-CoV-2 entraîne des symptômes légers ou modérés.L’infection par le VRS induit très peu de symptômes chez la souris (perte de poids très rare n’excédant jamais plus de 10%, pas de détresse respiratoire ni de changement de température corporelle, bonne apparence du pelage ni changement de comportement visible). L’infection de souris jeunes par la souche murinisée de SRAS-CoV-2 entraîne une perte de poids modeste, n’excédant pas 15% du poids initial. Le phénotype des lignées transgéniques Muc5b n'est pas dommageable avant l'âge de 6 mois car un problème de clairance mucociliaire peut se développer avec le temps aboutissant à un stress respiratoire. Cependant, les souris seront utilisées avant ce stade.

Devenir

La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition à l’agent pathogène de groupe III utilisé dans ce projet.

Remplacement

L’étude de la physiopathologie de l’infection et de l’efficacité vaccinale ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant.

Réduction

Dans le but de suivre le principe des 3R et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre de souris par groupe a été calculé sur la base de notre expérience acquise précédemment et des données bibliographiques (publications scientifiques). Dans notre expérience, des groupes de 6 animaux permettent d’atteindre une significativité statistique. La comparaison des traitements ou entre lignée de souris s’établit à l’aide de tests non paramétriques.

Raffinement

Pour minimiser le stress induit aux animaux, les souris seront anesthésiées sous isoflurane avant inoculation intra-nasale du virus ou du vaccin. L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et permet d’assurer un réveil rapide en minimisant l’hypothermie. Les animaux feront l'objet d'une surveillance accrue après l’administration des souches virales (mesure du poids quotidien et détection des points limites) afin de déceler rapidement une détresse de l'animal nécessitant une fin de protocole précoce. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. Les souris seront hébergées par 6 dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger.

Choix des espèces

La souris est sensible à l’infection par les souches murinisées du SRAS-CoV-2. Elle présente l’avantage de pouvoir envisager l’emploi de souris génétiquement modifiée pour un gène d’intérêt nécessaire à l’exploration des mécanismes biologiques impliqués dans la susceptibilité ou la défense de l’hôte vis-à-vis de l’infection virale. La souris est le modèle rongeur pour les infections par le VRS, elle développe une infection productive et cette espéce permet d’utiliser des lignées transgéniques nécessaires à la réalisation du projet. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes entre 2 et 5 mois d’âge. Ces souris ont un système immunitaire mature et sont sensibles à l’infection par une souche adaptée à la souris tout en présentant des symptômes modérés.

Cinquante souriceaux âgés de deux à quatre jours vont être gavés ou piqués sous la peau pour que le personnel maîtrise le geste sur des nouveau-nés. 118 souris en tout vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour examiner leurs ganglions lymphatiques au microscope. Chaque animal reçoit trois gavages ou trois injections sous-cutanées sur trois jours consécutifs, avec une contention par la nuque, le gavage pouvant irriter à force de répétition. Le projet valide une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée, et le porteur justifie ses 68 autres animaux par le fait que le génotype reste inconnu à l'âge de l'administration, un quart environ formant les groupes utiles, pour une lecture qualitative de lames sans analyse statistique.

Objectifs

Les ganglions lymphatiques permettent l’initiation de la réponse immunitaire. Leur structure est formée par des cellules stromales qui forment un espace tridimensionnel dans lequel les cellules hématopoïétiques transitent et se regroupent en zones distinctes. Les cellules stromales mésenchymateuses du ganglion lymphatique organisent ainsi l’organe pour son bon fonctionnement. Des modèles de souris sont requises pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires pour la formation de ces cellules organisatrices. Dans ce projet, nous évaluerons une nouvelle souris génétiquement modifiée pour sa capacité de marquer les cellules mésenchymateuses et suivre leur différenciation.

Bénéfices attendus

Ces expériences permettront de valider le nouveau modèle de souris génétiquement modifiée et de faire avancer la recherche sur la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires. Les cellules mésenchymateuses jouent notamment un rôle clé dans la réponse immunitaire humorale impliquant des anticorps contre des maladies infectieuses, ou dans la formation des structures lymphoïdes retrouvées dans des cancers, ou des organes affectés dans des maladies autoimmunes. Ces résultats apporteront ainsi à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné que des thérapies anti-cancer et anti-maladies autoimmunes visent le système immunitaire, ces résultats auront des retombées sur la thérapie anti-cancer et contre des maladies autoimmunes.

Procédures

Trois gavages ou 3 injections par voie sous-cutanée sont réalisés sur animal vigile sur une période de 3 jours consécutifs (duée de chaque injection ou gavage: 2-3 minutes). Le génotypage sera réalisé sur un surplus de tissu provenant de l'identification des animaux ou sur biopsie de queue réalisée post-mortem.

Impact sur les animaux

Le gavage peut être source d'irritation, du fait de la répétition du geste. Les injections répétées par voie sous-cutanée peuvent induire un certain inconfort. Ces voies d'administration nécessitent une contention au niveau de la nuque, source d’inconfort pour l’animal pendant quelques secondes.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux à l'issue de la procédure et analyse post-mortem des ganglions lymphatiques par microscopie

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la differenciation des cellules mésenchymateuses dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière fiable par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Nous avons identifié des données dans la littérature scientifique, tels que la quantité de tamoxifène à administrer ou le moment choisi dans le développement de l’animal, permettant une meilleure réussite de l’expérience et ainsi de réduire le nombre de souris. Les moyens de l’administration (gavage oral ou injection par voie sous-cutanée) ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Une étude-pilote sera réalisée sur un maximum de 50 souriceaux âgés de 2-4 jours afin de maitriser les gestes techniques chez le nouveau-né, et ainsi minimiser la souffrance qui pourrait être induite lors de la manipulation. La validation de notre modèle sera ensuite réalisée avec un total de 68 animaux, en comparant l’efficacité d’excision suite à l’administration du tamoxifène par voie orale ou par injection sous-cutanée, versus des animaux contrôles qui recevront le véhicule. Ce total de 68 animaux est nécessaire dans la mesure où les produits seront administrés à 2-4 jours d’âge, où le génotype des animaux n’est pas connu. Théoriquement ¼ des animaux constitueront ainsi les cohortes expérimentales, soit environ 22-23 souris (15 animaux expérimentaux + 7-8 contrôles), effectif suffisant pour valider notre hypothèse. Cette validation est notamment basée sur une méthode d’analyse histologique qualitative, et n'implique donc pas d'analyse statistique, mais repose uniquement sur l'observation microscopique des lames.

Raffinement

Les injections sous-cutanées et les gavages sont effectués par un personnel formé et expérimenté. Les souriceaux sont rapidement retournés à la mère après injection ou gavage. Les souriceaux sont observés et surveillés dans les minutes qui suivent le gavage afin de s’assurer qu’il n’y a pas eu de fausse route. Un temps de récupération après les administrations est accordé (24h) aux animaux. Le bien-être de l’animal est évalué par un personnel expérimenté, prenant en compte l’attention accordée aux souriceaux par la mère, le lieu d’injection (sous-cutané au niveau de la nuque) et la croissance des animaux, le poids, l’apparence, le comportement, l'hydratation, la respiration et l’aspect des fèces. Lorsque qu’une anomalie est observée, l’animal bénéficie d’une prise en charge adaptée aux problèmes observés. A l’aggravation, la Structure du Bien-Être Animal est contactée et des mesures conseillées appliquées. Des points limites spécifiques ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les souris seront hébergées par fratrie au sevrage tout en respectant le nombre de souris admis par cage. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. L’hébergement bénéficie d’un enrichissement des cages (matériel de nidification) et un tunnel sera utilisé lors de chaque manipulation et change.

Choix des espèces

La fonction du ganglion lymphatique et sa structuration sont identiques entre l’homme et la souris. Il existe chez la souris des moyens de suivre la différenciation des cellules par marquage génétique (lineage tracing) et d’invalider des gènes dans un type de cellules afin de pouvoir étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant la différenciation des cellules des ganglions lymphatiques à partir des cellules progénitrices. Des nouveaux-nés de 2 à 4 jours seront utilisés, en lien avec le développement du ganglion lymphatique qui commence au stade embryonnaire et se termine environ 5 à 7 jours après la naissance. Des souris adultes (8 semaines) où la différenciation des des cellules des ganglions lymphatiques est complétée, recevront également le tamoxifène et seront utilisées comme contrôles.

Quarante souris atteintes d'une forme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth reçoivent une injection quotidienne pendant quatorze jours, puis passent chaque semaine un test de suspension à une grille inversée et un test de suspension par la queue, avant un déplacement sur tapis roulant à six semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme que ces souris ne présentent aucun signe de douleur, et prévoit dans le même temps que tout animal qui aurait mal soit mis à mort par anticipation, les antidouleurs risquant de perturber les résultats des tests. Les 40 souris sont tuées à six semaines pour prélever les nerfs sciatiques et les muscles de leurs deux pattes.

Objectifs

Ce projet vise à développer une thérapie pour une forme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT). La CMT se manifeste dès l’enfance par une faiblesse musculaire, une perte de sensation et des problèmes de coordination, évoluant vers une difficulté motrice chez les adultes. Notre objectif est d’injecter quotidiennement un composé pharmacologique aux souris modèles de la maladie pour atténuer ces symptômes. Nous souhaitons évaluer le potentiel du composé Bis-T-23, car il a montré, dans le contexte de maladies rénales, son efficacité à augmenter l'activité de la protéine qui est déficiente dans notre forme de CMT. Bien que Bis-T-23 soit encore expérimental, il a déjà été utilisé dans d'autres études, et ses conditions pharmacocinétiques chez les rongeurs sont bien documentées. Repositionner ce composé pourrait réduire les coûts et accélérer le développement d’un traitement pour cette maladie qui en est dépourvue.

Bénéfices attendus

Le succès de ce projet fournira une stratégie thérapeutique pour certaines formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et constitue une étape essentielle vers les essais cliniques. Il s’agit ici de tester un composé médicamenteux, cette approche pharmacologique est plus facilement transposable à l’Homme en cas de succès de l’étude. Ce travail pourrait être bénéfique pour le traitement d’autres formes génétiques de CMT si un lien moléculaire ou mécanistique entre les différentes formes est découvert.

Procédures

Les 40 animaux de l’étude seront injectés quotidiennement (durée d’injection de quelques secondes) pendant 14 jours consécutifs. Le lundi en semaine 3, 4, 5 et 6 les animaux seront pesés puis 2 tests comportementaux seront réalisés : -test de suspension à une grille inversée (durée 3x60secondes) pour évaluer la force musculaire – test de suspension par la queue (durée 5-10secondes) pour évaluer la neurodégénérescence. A 6 semaines, les animaux réaliseront également un déplacement sur tapis roulant (max 60secondes) pour évaluer leur coordination.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées. Le modèle utilisé dans cette étude présente une légère perte de poids, quelques tremblements et des défauts lors du test de hanging ainsi que des défauts histologiques au niveau du nerf à 24 jours. Les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice n’a été notée jusqu’à l’âge de 16 semaines. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 6 semaines après caractérisation comportementale, les tissus affectés seront prélevés pour étude histologique.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible. De plus, nous ne pourrions pas étudier les bénéfices apportés par le médicament sur l’ensemble de l’organisme, notamment sur la force musculaire et la coordination motrice.

Réduction

Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Les 2 pattes seront utilisées (2 nerfs sciatiques et 2 muscles) afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage en zone élevage. Après sevrage ils seront hébergés à plusieurs par cage afin d'éviter l'isolement social. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et la température sera maintenue constante. Des nids seront disposés dans chaque cage, avec un accès illimité à la nourriture/boisson. De la nourriture en gel et enrichie sera placée dans les cages afin de faciliter la nutrition des animaux. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. Les souris sont pesées une fois par semaine afin de surveiller leur état de santé et de s'assurer qu'il n'y a pas de perte de poids significative, qui pourrait entraîner, le cas échéant, l'arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. La zone d’injection sera observée quotidiennement (couleur/gonflement) afin de prévenir l’apparition d’une infection. En cas de douleur au cours de l’étude, les antidouleurs risquant de réagir de manière imprévisible avec le médicament et perturber les résultats aux tests, l’animal sera mis à mort prématurément.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur la force générale et sur la coordination motrice seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et les bénéfices sur les paramètres décrits ci-dessus ne peuvent être mesurés. Pour augmenter l’activité de la protéine déficiente, nous administrerons un composé pharmacologique pendant 14 jours consécutifs aux souris modèles de la maladie. Nous étudierons les effets de ces injections à 6 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts histologiques des tissus et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si le médicament est bénéfique.