Rongeurs
Implication du système immunitaire dans la résistance à la castration
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 860 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales destinées à déclencher des tumeurs de la prostate, puis, trois, cinq ou neuf mois plus tard, une ouverture de l'abdomen avec ou sans retrait des testicules, et enfin des injections de traitements stimulant ou bloquant les cellules natural killer jusqu'à quatre fois par semaine. Le porteur qualifie les suites opératoires de "douleurs mineures facilement prévenues" et écrit que l'étude pourra ouvrir de "nouvelles pistes thérapeutiques" contre les cancers résistants à la castration. Il affirme que la complexité des lésions précancéreuses "rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo", tout en indiquant que l'équipe étudie déjà une partie des paramètres sur des organoïdes dérivés des tumeurs.
Objectifs
Afin de mieux comprendre la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate (CaP), ce projet vise à étudier les effets de la castration chirurgicale dans plusieurs modèles murins de cancers prostatiques. En effet, le traitement du cancer de la prostate chez l'homme repose sur la chirurgie et l'utilisation de traitement anti androgénique appelé castration chimique. Malheureusement, après un temps limité de sensibilité aux traitements, 20% des patients développent des résistances à ces traitements et les cancers "résistants à la castration" sont de très mauvais pronostic. Il est donc primordial de mieux comprendre la résistance à la castration. Les études récentes menées au laboratoire mettent en évidence une implication forte du facteur de transcription Hif1a induit par l'hypoxie dans le développement de la résistance à la castration. Ainsi nous voulons étudier le mécanisme moléculaire sous-jacent pour mieux comprendre par quel biais l'inactivation de Hif1a rend ces tumeurs sensibles à la castration. Nos données préliminaires montrent un infiltrat de cellules natural killer majeur dans les souris sensibles à la castration comparé à celles qui présentent des tumeurs résistantes à la castration. L'objectif est donc de conduire une étude dans laquelle les cellules natural killer sont bloqués ou stimulés afin de voir la réponse sur la croissance des tumeurs après castration.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si les cellules natural killer permettent de rendre les tumeurs de prostate sensibles à la castration dans le cancer de la prostate et par quels mécanismes. Si cela s'avère être le cas, cette étude pourra ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate résistant à la castration.
Procédures
Les souris subiront 5 injections intra-péritonéales sur 5 jours pour induire l'apparition des tumeurs (5 minutes par souris), puis une intervention chirurgicale (castration/sham) 3, 5 ou 9 mois plus tard (30 min par souris) et les injections intra-péritonéales de traitement stimulant ou bloquant les cellules natural killer 1 à 4 fois par semaine pendant au plus 4 semaines (jusqu'à 12 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets secondaires post chirurgicaux sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas. En cas de mauvaise ligature des artères, une hémorragie peut avoir lieu. Cette complication est très rare et facilement visible du fait du gonflement important de la zone et d'effets secondaires généraux sur l'animal. Le blocage des cellules natural killer a été déjà éffectué dans de nombreuses études chez la souris et sont administrés en routine par un laboratoire collaborateur sans observation d'effets secondaires. L'activation des cellules natural killer peut engendrer une perte de poids transitoire des souris traitées dans les 48h suivant l'administration, les souris reprennent habituellement leur poids de départ dans la semaine qui suit l'injection. La croissance des tumeurs de prostate est lente et donc les variations de poids liée à leur croissance ou régression sur 2 semaines est négligeable.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les organes et de les analyser.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.Par ailleurs, nous utilisons des organoïdes dérivés des tumeurs pour étudier un certain nombre de paramètres, cependant l'étude du microenvironnement nécessite de se placer en condition in vivo stricte.
Réduction
Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Afin d’obtenir des résultats significatifs avec une bonne puissance, nous aurons besoin de 20 animaux par groupe. Le nombre d’animaux sera de 3860 souris maximum.
Raffinement
On procèdera à l'anesthésie générale des souris par inhalation, et après l'induction, une analgésie en injection intrapéritonéale sera faite. En post-opératoire, une injection en sous cutannée d'ant- inflamamtoire sera faite. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, une analgésie supplémentaire sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Par ailleurs, les animaux castrés (ouverture abdominale avec retrait des tesitcules) et les animaux sham (ouverture abdominale sans retrait des tesitcules) seront séparés: une cage sham versus une cage castré par exemple pour éviter tout risque de domination. En cas de signe de douleur (dos voute, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation), l'animal sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Après les injection-intrapéritonéales, les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter une éventuelle infection sur les sites d'injection, et en cas d'observation de rougeur, de voussure ou de signe de douleur, les animaux seront retirés de l'étude et un avis vétérinaire sera pris. Par ailleurs, pour prévenir une éventuelle perte de poids liée aux traitements, le poids sera pris 1 fois par semaine pendant la durée de l'étude et en fonction de la différence de perte de poids observée, soit de la nourriture enrichie sera administrée aux souris, soit les animaux seront mis à mort et retirés des études.
Choix des espèces
La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le CaP humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes. A l'âge de 8 semaines, nous administrons le Tamoxifène pour induire le développement de tumeurs. Puis, 3, 5 ou 9 mois plus tard, nous débutons les expériences (castration et neutralisation des cellules NK, stimulation de ces cellules) avec les différents groupes expérimentaux et nous euthanasierons les animaux à un temps court et un temps long après les traitements.
Génétique des maladies auto-immunes sur modèle murin (2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
153 850 souris vont être utilisées, chacune recevant une puce électronique sous la peau avant le sevrage et une biopsie d'un fragment de queue dès deux à trois semaines d'âge. 250 d'entre elles reçoivent en plus des injections intrapéritonéales d'un agent chimique mutagène à quatre, cinq et six semaines, qui peut rendre stériles 70 % des mâles, les autres naissant, étant génotypées et maintenues pour l'entretien de la lignée. Toutes seront tuées dès les premiers signes biologiques de la maladie auto-immune, ce que le porteur présente comme un moyen d'éviter toute souffrance. Il annonce un effectif établi sur des études statistiques permettant d'utiliser "le moins d'animaux possible", sans expliquer comment ce calcul aboutit à 153 850 souris.
Objectifs
Ce projet concerne les maladies auto-immunes qui ont une cause génétique et sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs. Le but est de caractériser les gènes impliqués en utilisant la souris comme modèle. Dans ce projet nous induirons des mutations au hasard dans le génome grâce à l’injection d'un agent chimique. Nous identifierons les mutations qui modifient les caractéristiques physiques de la maladie en suivant les descendants des souris traitées. Les mutations qui modifient de manière significative les caractéristiques de la maladie seront ainsi identifiées. Les protéines codées par les gènes identifiés seront des cibles thérapeutiques potentielles chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la maladie. Cette démarche donnera accès à de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie ainsi qu’à de nouveaux marqueurs génétiques et/ou biologiques permettant de dépister la maladie à des stades précoces. Nous prévoyons que de nouveaux gènes modifiant les caractéristiques de la maladie seront découverts.
Procédures
Chez certaines souris une injection unique intrapéritonéale sera pratiquée dans les 3 jours qui suivent la naissance (le geste dure 15 secondes). Le projet comporte l'injection intrapéritonéale de 250 animaux avec un agent chimique 1 fois par semaine pendant 3 semaines (à 4, 5 et 6 semaines d'âge) (chaque geste dure moins de 15 secondes). Chez certaines souris un prélèvement unique de sang sera effectué à 6 semaines sous anesthésie générale (le geste dure 30 secondes). Toutes les interventions citées précédement seront réalisées dans un seul établissement utilisateur. Une puce électronique sera implantée à tous les animaux avant le sevrage par voie sous cutanée et des biopsies d’un fragment de queue seront effectuées à partir de 2-3 semaines d’âge (le geste dure 15 secondes). Ces deux interventions pourront être réalisées dans les deux établissements utilisateurs
Impact sur les animaux
Les injections de l’agent chimique peuvent entraîner une infertilité chez 70% des mâles. L'injection intrapéritonéale peut en soi être à l'origine d'une douleur, les prélèvements de sang sous anesthésie peuvent être associés à une douleur à l'œil au réveil, les biopsies de queue peuvent engendrer une douleur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes biologiques de la maladie afin d'éviter toute souffrance.
Remplacement
Ce projet concerne l'étude de maladies auto-immunes qui sont d’origine génétique. Il n’existe pas de modèles in vitro ou in silico pour aborder le sujet. D’où le besoin d'avoir recours aux modèles de souris dont les caractéristiques récapitulent la maladie humaine. Les expériences proposées nécessitent de comparer des individus qui ne diffèrent pas de façon majeure pour leur fond génétique ou l’environnement. C’est le cas de la souche de souris que nous proposons d’étudier.
Réduction
Pour respecter le principe de la Réduction, le nombre proposé de souris a été établi sur la base d’études statistiques permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables. La méthode utilisée permet de cumuler les individus à des temps différents de suivi en diminuant ainsi de manière très importante le nombre de souris analysées à chaque temps individuel. Pour les expériences impliquant des croisements, le nombre d’individus prévus tient compte de notre expérience dans le domaine. Par ailleurs, le protocole prévoit un nombre limité de croisements (3) pour constituer les groupes d'animaux qui feront l'objet de l'analyse génétique.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour respecter le confort maximum des conditions d’hébergement, faire pratiquer les gestes nécessaires par un personnel formé et ayant de l’expérience des pratiques, réduire le stress et la douleur. Les souris sont hébergées dans des portoirs ventilés. Les cages sont dotées de tunnels d’enrichissement rouges et de cotons de nidification. Pour les prélèvements sanguins et les biopsies une prise en charge de la douleur sera mise en place avec des antalgiques et des anesthésiques. Une observation quotidienne avec une grille de points limites sera effectuée afin qu’en cas de besoin des mesures soient mises en place pour garantir le bien-être de l‘animal. Quand des livraisons d’un établissement à l’autre seront réalisées, les animaux aptes au transport seront livrés via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux (colis comprenant alimentation, gel d'hydratation et enrichissement). Une période d’acclimatation sera appliquée après réception des animaux.
Choix des espèces
L'espèce animale choisie est une souche de souris qui développe une maladie dont les caractéristiques sont similaires à celles de la maladie humaine correspondante. Les souris sont engagées dans les procédures dès la naissance. La maladie apparait chez les souris adultes après 12 semaines d’âge. Les souris sont suivies une fois par semaine, à partir de 10 semaines d’âge, pour détecter de manière précoce la survenue de la maladie. Les expériences seront toujours interrompues dès les premiers signes biologiques de la maladie avant que celle-ci n’ait donné lieu à des manifestations physiques entraînant une souffrance des animaux.
Cathétérisme Vasculaire chez les rongeurs et administration par voie parentérale. Application à des études d’évaluation d’efficacité de composés innovants dans des modèles d’inflammation aigue, ou de défaillance hépatique aigue ou chroniques (ALF et ACLF)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 4140
Le choc, la détresse cardio-respiratoire et les troubles de la thermorégulation servent ici de critères de point limite, et une partie des animaux les atteindra assez tôt pour être tuée avant terme. 4 440 souris et 4 140 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, 2 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 6 220 un niveau sévère. Un cathéter veineux leur est posé sous anesthésie, puis vient un gavage d'un agent toxique pour le foie deux à trois fois par semaine pendant dix semaines pour installer une cirrhose, avant une injection qui déclenche la défaillance hépatique aiguë. Le porteur écrit vouloir "reproduire une gravité qui sera jugée sévère" tout en maintenant les animaux dans un état qu'il estime acceptable, et renvoie au conditionnel les solutions thérapeutiques qu'il espère proposer aux patients.
Objectifs
La défaillance hépatique aigue ou acute-on-chronic liver failure (ACLF) est un syndrome fulminant qui survient de manière aiguë, chez des patients qui souffrent d'une maladie hépatique chronique qui peut avoir différentes origines (virales,métabolique, ou médicamenteuse). La défaillance aigue généralement en raison d'un événement précipitant, et qui évolue rapidement vers une défaillance de multiples organes Elle survient chez environ 30% des patients hospitalisés atteints de cirrhose et est associée à un taux de mortalité à 28 jours qui varie entre 20% et 70% selon le grade de l’ACLF. L'objectif de ce projet est d'instrumentaliser des voies veineuses chez le rongeur et de les utiliser dans nos modèles pré établis pour évaluer l'efficacité de produits nouveaux. Nous sommes effectivement contraints à effctuer des administrations soit en bolus unique, en admnistration répétées ou perfusions lentes, des composés que nous étudions. Les modèles intrumentés par un cathéter posé en voie veineuse ( dits cathétérisés) seront employés dans des modèles que nous avons déjà développés (modèles d'infammation aigue au LPS, de stress oxydatif à l'acétaminophène ou au pyrazole, ou d'alcoolisation massive produisant une translocation bactérienne ) sur des animaux sains,ou dejà atteints d'une maladie hépatique. dans le traitement des patients qui subissent cet évènement aigu.
Bénéfices attendus
Lors d’épisodes ACLF, il est nécessaire de prendre en charge les patients pour les défaillances multiples le plus précocement possible pour préserver le capital hépatocytaire qui subsiste, et qui peut se révéler être vital lors de la survenue d’un second épisode d’ACLF Aujourd’hui les traitements employés agissent sur les symptômes tels que la pression portale, l’infection, l’hémorragie digestive ou le syndrome hépato-rénal à l’aide de corticoïdes par exemple de manière à préserver les chances d’éligibilité à la transplantation. Les solutions thérapeutiques que nous espérons proposer visent à agir simultanément sur les différentes voies qui sont à l’origine des défaillances multiples donc sur les mécanismes à l’origine des effets fulminants observés. (Infection, inflammation, immunité et métabolisme). A ces bénéfices attendus lors du déroulement de nos projets, nous avons ajouté la voie veineuse d’administration des composé étudiés qui reflète davantage la situation majoritairement vécue en clinique humaine
Procédures
Selon les procédures concernées, les gestes techniques pratiqués pourront être un peu différents : • Pour les opérations chirurgicales de pose du cathéter, les animaux seront anesthésiés au masque (anesthésie volatile au gaz) et ils recevront successivement : • 1 injection unique avant l’opération d’un médicament anti-douleur (=analgésique) • 1 injection de solution physiologique qui prévient la déshydratation fréquente lors de la chirurgie • 1 aspersion locale de médicament anti-douleur à l’emplacement de l’incision. • 3 injections par jour d’un médicament anti-douleur au cours des 3 jours qui suivent l’opération. • Pour les phases d’induction de la cirrhose hépatique Les animaux qui recevront par gavages un agent chimique toxique pour le foie (2 fois par semaine à 2mL/kg pour les rats et 3 fois par semaine pour les souris), pendant 10 semaines successives. Chaque manipulation de l’animal dure environ 15 secondes. Les animaux subiront un prélèvement sanguin sous anesthésie volatile (prélèvement intermédiaire et final ; la durée totale de chaque prélèvement dure environ 2 minutes. • Pour la phase de déclenchement de la défaillance hépatique Les animaux recevront une injection intrapéritonéale à 5mL/kg pour les rats et 10mL/kg pour les souris. Durée du geste y compris contention est de15 secondes • Pour les études pharmacocinétiques Les animaux subiront des micro-prélèvements intermédiaires au niveau du cathéter sans introduction d’aiguille en conditions vigiles au nombre de 6 pour les rats et 3 pour les souris. Durée y compris la contention de l’animal 15 secondes Les animaux subiront des prélèvements terminaux sous anesthésie gazeuse. Durée y compris l’anesthésie : 2 minutes
Impact sur les animaux
La défaillance hépatique aigue du patient cirrhotique représente un évènement grave, sa survie est engagée. Le modèle d’étude développé chez la souris ou le rat présente manifestement des signes cliniques d’inconfort. On s’attend à observer des animaux en état de choc et de détresse cardio-respiratoire, avec des épisodes de troubles de la régulation de la température corporelle. Les effets cités sont observés de manière plus ou moins prononcée, ces signes constituent les critères d’atteinte des points limites. Certains animaux présenteront ces symptômes à des stades qui nécessiteront un point d’arrêt anticipé. Pour évaluer les effets de nos composés, nous nous fixons comme objectif de reproduire une gravité qui sera jugée sévère mais qui permette de maintenir des animaux dans un état acceptable du point de vue éthique et conservant toute pertinence scientifique.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort car il est indispensable de recueillir les organes en vue d'analyses d'expression de gènes ( transcriptomique) , ou de proteine ( histologie)
Remplacement
La possibilité de disposer d’un modèle animal qui permet d’évaluer les effets des nouveaux composés sur tous les aspects d'une pathologie présente chez l’homme constitue une étape clé dans la lutte contre ces maladies et font de nos modèles des outils translationnels très pertinents. Bien qu'une première phase de sélection des meilleurs composés soit effectuée sur des modèles acellulaires ou cellulaires, contribuant ainsi à l’utilisation de méthodes alternatives visant à remplacer partiellement l’utilisation des animaux comme nous le rappelle la règle des 3R’s, l’évaluation finale du potentiel thérapeutique des produits dans des modèles animaux reste cependant nécessaire. Le recours à l'emploi d’un animal vivant permet d’évaluer la réelle efficacité des composés dans un système biologique complexe et «global », capable de métaboliser les pricipes actifs donc de déceler les effets secondaires, capable d'activer toutes les voies de signalisation qui participent à la caractérisation de ce modèle. Son remplacement à ce stade du projet scientifique (phase pré clinique) n'est pas envisageable dans une système biologique isolé ou cellulaire qui quelque soit sa nature ne pourra apporter tous les enseignements issus de l'expérimentation in vivo.
Réduction
La stratégie de réduction consiste à ne réaliser que les essais avec les composés les plus prometteurs ayant satisfait aux étapes de sélection préliminaires in vitro. La réduction du nombre d'animaux est motivée par la longueur/lourdeur des procédures expérimentales, cela nous a conduit lors d'essais pilotes ou préliminaires de cibler le juste nombre d'individus nécessaires à l'obtention de résultats pertinents. Les paramètres que nous étudions in vivo (bio marqueurs, induction/répression de gènes, effets histologiques etc) doivent être pertinents. Nous écartons les paramètres peu représentatifs et peu discriminants statistiquement qui nécessiteraient des effectifs trop importants. Nous disposons de données expérimentales ou publiées dans la littérature sur les paramètres biologiques ou biomarqueurs les plus pertinents et "robustes". Des approches statistiques permettent d'affiner les effectifs et donc de réduire les nombres d'animaux.
Raffinement
Les rats sont hébergés par paires ou trios, les souris peuvent être gardées en groupes sociaux plus importants (5 ou 6 par cage). L’enrichissement du milieu est systématisé par l’apport de dispositifs permettant aux animaux de ronger (blocs ou billes des bois), un apport de coton compressé permet de maintenir l’instinct de création du nid, des tunnels en polycarbonate transparent teintés en rouge sont placés dans les cages pour apporter un espace simulant la dissimulation et favorisant le maintien de l’instinct grégaire des rats. Nous avons opté pour la pose de cathéters qui offrent un accès à l’aide d’un bouton métallique bouché par un obturateur aimanté qui présente l’avantage de pouvoir faire cohabiter les animaux dans une même cage sans crainte d’arrachage du cathéter par les congénères, cela constitue une amélioration significative du bien-être des animaux. L'établissement de points limites dans ce modèle expérimental de défaillance hépatique nous permet d'écarter tout individu susceptible de subir un inconfort trop important ou de la douleur. Bien conscient que nous développons dans ce projet des modèles sévères, nous nous efforçons d'avoir recours à des moyens analgésiques adaptés et non confondants. La pathologie et les mécanismes qui la déclenchent sont en partie connus, l'emballement inflammatoire en est une composante, le recours à des moyens de lutte contre la douleur peut introduire un biais expérimental ; une étape de validation s’impose pour chaque situation.
Choix des espèces
La littérature scientifique, est riche sur la cirrhose du foie, les espèces employées à ce stade de la recherche sont les rongeurs qui sont de bons répondeurs aux stimuli métaboliques, et constituent modèles et des moyens vivants de valider l’efficacité d’une nouvelle molécule dans le traitement de la pathologie étudiée. Les méthodes chirurgicales de pose de cathéters chez les souris et rats sont parfaitement décrites et idéalement adaptées à l'utilisation de ces espèces dans ce projet. Les rats sont de jeunes adultes de 6 à 7 semaines d’âge, les souris sont-elles âgées de 8 à 10 semaines , elle ont alors un poids qui permettent une manipulation plus aisée ( environ 25gr)
Etude des interactions hôtes-pathogènes et de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le contexte de tuberculose
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Infectées par Mycobacterium tuberculosis par voie intranasale ou intraveineuse, puis gavées ou injectées cinq à sept jours par semaine pendant trois à huit semaines, ces souris peuvent aussi recevoir un second agent pathogène. 6 704 souris vont être utilisées, 5 028 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 676 un niveau sévère. Le porteur affirme que la surveillance biquotidienne permet "l'arrêt total des souffrances de l'animal par sa mise à mort", tout en jugeant "indispensable" d'observer chez les souris infectées par Plasmodium au moins deux signes de neuropaludisme, ataxie, hémiplégie ou tétraplégie, spasmes, coma. Toutes sont tuées par dislocation cervicale en fin d'expérience, pour le prélèvement d'organes.
Objectifs
Le projet présente trois objectifs distincts: - étudier l'effet de composés (médicaments, substances chimiques ou produits biologiques) à visée thérapeutique contre la tuberculose. - évaluer la pathogénicité de différentes souches bactériennes de Mycobacterium tuberculosis sauvages ou mutantes, ainsi que la contribution de l'hôte à la pathogénicité des mycobactéries in vivo chez la souris. - étudier l'évolution de la co-infection (par un agent pathogène secondaire) dans un modèle de souris infectée de manière latente par M. tuberculosis.
Bénéfices attendus
Selon les estimations de l’Organisation Mondiale de la Santé, 9,9 millions de personnes ont développé la tuberculose dans le monde, et 1,3 million de personnes sont mortes de la tuberculose en 2023 (dont 214 000 présentaient également une infection à VIH). À l’échelle mondiale, la tuberculose est la 13e cause de mortalité et la deuxième due à une maladie infectieuse, derrière la COVID-19. Cette évolution est principalement liée à la recrudescence de la tuberculose chez des patients immunodéprimés, ainsi qu'à l’émergence des souches résistantes aux antibiotiques. Dans ce contexte, nos projets visent à identifier de nouveaux composés à visée thérapeutique efficaces sur les souches multiresistantes et à comprendre les mécanismes fondamentaux de l'interaction de l'hôte avec les mycobactéries, afin de comprendre tous les mécanismes responsables de l’infection, mais également de caractériser et étudier l'impact d'une co-infection chez la souris atteinte d'une tuberculose latente.
Procédures
Selon leur formulation, les composés peuvent être administrés quotidiennement (5 à 7 jours par semaine) par gavage (durée d'intervention : 1 minute) ou voie intrapéritonéale (durée d'intervention : 30 secondes) ou une fois par semaine par voie intraveineuse (dans la veine caudale - durée d'intervention : 2 minute) aux souris non-anesthésiées, pendant 3 à 8 semaines. L’administration par voie endotrachéale (durée d'intervention : 3 minute) ou intranasale (durée d'intervention : 1 minute) peut également être utilisée 3 à 5 fois par semaine et pendant 1 à 3 semaines sur souris préalablement anesthésiées. L'infection des souris avec les différents agents pathogènes est réalisée par voie intranasale (durée d'intervention : 1 minute) sous anesthésie ou par voie intraveineuse (durée d'intervention : 2 minute), intrapéritonéale (durée d'intervention : 30 secondes) ou sous cutanée (durée d'intervention : 1 minute) sur animaux vigiles. Dans le cadre des expériences de co-infections, les animaux seront infectés à deux reprises, (i) avec Mycobacterium tuberculosis (ou BCG) (durée d'intervention : 1 minute), puis (ii) un des autres pathogènes étudiés (durée d'intervention : 1 minute).
Impact sur les animaux
Lors des expériences de surinfection, des signes cliniques graves pourraient etre observés. Des points limites basés sur l’apparence et le comportement des souris sont observés quotidiennement, afin de détecter le plus tôt possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques est utilisée et le « score de douleur » permet de déterminer le niveau de souffrance de l’animal. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables (score supérieur à 5) sont euthanasiés. Dans cette procédure, la perte de poids constitue le point limite majeur pris en compte. L’évolution du poids est suivie au minimum 2 fois par semaine. Une perte de poids > 20%, seule, entraine l’euthanasie de la souris. La prostration est également un des indicateurs de douleur pertinent dans le cas d’infection de certaines souris transgéniques. Lors de l'infection par Plasmodium, la mise à mort fait suite à l'observation de deux symptômes caractéristiques du neuropaludisme : ataxie, hémi ou tétraplégie, spasmes, coma pour les souris infectées par Plasmodium berghei ANKA. Aussi, il est indispensable pour l'étude du neuropaludisme d'observer au moins ces deux signes cliniques, la pathologie étant cérébrale et ne pouvant être diagnostiquée que par ces signes. Néanmoins, l'apparition de ces signes cliniques étant dans une fenêtre connue (6 à 10 jours après infection), les animaux seront surveillés toutes les demi-journées, permettant l'arrêt total des souffrances de l'animal par sa mise à mort.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux sont euthanasiés par dislocation cervicale en fin d'expérience pour effectuer le prélèvement de différents organes pour analyse.
Remplacement
Aucun modèle expérimental in vitro ne permet d'englober tous les aspects de l'interaction hôte-pathogène qui aboutissent à la tuberculose pulmonaire évolutive, ni de reproduire la physiopathologie de l’infection respiratoire, ni d’étudier les mécanismes de défense contre l’infection. Seules les études in vivo permettent de déterminer l'efficacité de composés face à une épreuve virulente de M. tuberculosis. Et l’efficacité chez la souris constitue un pré-requis avant toute phase clinique sur l'homme. De nombreux aspects de la pathogénicité étant comparables entre l’homme et la souris, il est ainsi admis que la souris constitue un modèle incontournable pour le suivi de la réplication du bacille tuberculeux in vivo et l’étude de l’interaction entre l’hôte et les mycobactéries. Les différentes stratégies innovantes de vaccination contre les mycobactéries pathogènes peuvent être évaluées et validées chez la souris qui, infectée efficacement par des souches de M. tuberculosis pathogènes humaines, développe une tuberculose pulmonaire.
Réduction
Les expériences sont répétées en triplicate sur 4 animaux par groupe expérimental. Les résultats sont analysés statistiquement avec le test de Student. Afin de réduire le nombre d'animaux, une partie des organes est également utilisée et analysée par histologie ou par FACS, afin de visualiser la localisation des bactéries dans différents types cellulaires.
Raffinement
De façon à réduire le stress, l'inconfort et la douleur, les souris sont anesthésiées au moment des différentes administrations invasives. De plus, la surveillance sera accrue, 2 à 3 fois par semaine ou quotidienne, selon les procédures. L'apparence physique, l'alimentation et le comportement des animaux seront surveillés, afin de détecter le plus tot possible une éventuelle morbidité. Une grille de signes cliniques a été établie et est utilisée pour évaluer un "score" de douleur et permet d'évaluer le niveau de souffrance des animaux. Les animaux présentant des signes cliniques défavorables (score supérieur à 5) seront euthanasiées. Les souris seront euthanasiées au maximum 10 semaines post-infection, i.e. avant l'apparition des signes de morbidité, sur la base des connaissances de la souche de M.tuberculosis de type sauvage qui est la plus pathogène parmi les mycobactéries que nous étudions. Si des signes de morbidité étaient observés, les points de cinétiques serons revus et réajustés, les individus seront euthanasiés et les analyses prévues réalisées plus précocément par rapport à celles initialement prévues. Le cas échéant les souris sont préalablement anesthésiées: - à l’aide d’une solution d’isoflurane (2%) par la voie aérosol. Les souris sont placées par série de 4 dans une boite d'induction étanche en plexiglas avec joint (L21,8*l12,8*H12,9 (3,6 l)) pendant environ 5 à 10 minutes où elles respirent les vapeurs d’isoflurane. La durée d'anesthésie est d'environ 1 minute. - par injection intrapéritonéale d'une solution contenant 1 mg/ml de Xylazine (Rompun®) ou Diazépam et 10 mg/ml de Kétamine (Clorketam 1000-Vétoquinol®), préparée en PBS. 50 à 100 μl de ce mélange est administré pour 10 g de souris (soit 5 à 10 mg/kg de Xylazine et 80 à 100 mg/kg de Kétamine). La durée d'anesthésie est d'environ 20 minutes.
Choix des espèces
1)La possibilité d’induction d’une tuberculose chronique chez la souris par des souches de M. tuberculosis pathogènes pour l’homme et la pertinence de ce modèle expérimental en ce qui concerne l’évolution de la maladie, 2)L’existence de nombreuses similitudes de l’immunité anti-mycobactérienne entre l’homme et la souris, 3)Les nombreuses connaissances disponibles pour cette espèce, font de ce modèle expérimental un système de choix qui permet d’éviter le recours aux espèces plus sensibles. Les animaux utilisés sont âgés de 6 à 10 semaines au moment de l'infection par M. tuberculosis. Cet intervalle d’âge permet d’avoir un système immunitaire optimal.
Prévention du sepsis par intervention pharmacologique dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
Pour tester si l'inhibition de modulateurs de l'autophagie prévient le sepsis, 2 430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 810 d'entre elles et sévère pour 1 620. Chaque animal subit une ligature et ponction du cæcum, une chirurgie d'environ vingt minutes qui déclenche une infection généralisée, puis reçoit quatre ou cinq injections, une mesure de pression artérielle et une échocardiographie sous anesthésie. Le porteur énumère les atteintes attendues du sepsis, dysfonction d'organes, hypotension, altération de la coagulation et de la thermorégulation, et prévoit une chirurgie terminale pour une partie des souris. Il annonce un score de sepsis murin pour fixer les points limites avant que l'animal ne se retrouve en sepsis sévère, alors que 1 620 souris sont déjà déclarées en souffrance sévère.
Objectifs
La septicémie est la complication la plus grave des infections. Elle peut survenir de manière imprévisible lors de n'importe quelle infection bactérienne ou virale. Le sepsis se développe en raison d'une dysrégulation des défenses de l'organisme contre l'infection, entrainant le plus souvent un excès d'inflammation qui, à son tour, perturbe le fonctionnement des différents organes (https solidaires-sante.gouv.fr). Nous avons démontré, in vitro et in vivo, que des modulateurs de l'autophagie (processus naturel que les cellules de notre corps utilisent pour nettoyer et recycler leurs composants endommages ou inutiles), libérés par les cellules et les organes, sont impliqués dans un réflexe primitif de la faim, stimulant le comportement alimentaire par des mécanismes périphériques. L'inhibition de ces modulateurs, chez la souris, induit la perte de poids et réduit l'apport alimentaire. Nous avons également démontré que la neutralisation de ces modulateurs induit l'activation du flux autophagique dans des modèles de toxicité chronique du foie. Sur la base de ces observations, l'objectif de ce projet est de déterminer si l'inhibition de ces modulateurs de l'autophagie peut prévenir la septicémie chez un modèle murin approprie, la ligature et ponction du caecum (CLP).
Bénéfices attendus
Chaque année, le sepsis frappe près de 50 millions de personnes à travers le monde, affectant plus de 40% d'entre elles qui sont des enfants de moins de 5 ans. Bien que le sepsis impacte de manière significative les nations pauvres et émergentes, il demeure également l'une des principales causes de décès dans les pays développés. Globalement, le sepsis est responsable de plus de 11 millions de décès annuels, avec la particularité que la majorité de ces tragédies pourrait être évitée. En Europe, le sepsis est estimé causer près de 700 000 décès chaque année, dont environ 57 000 en France. Ce projet revêt une importance cruciale, car il vise à valider une nouvelle stratégie thérapeutique contre le sepsis dans un modèle préclinique exhaustif, reproduisant fidèlement l'évolution clinique de la maladie. En parallèle, il offrira une opportunité précieuse pour approfondir notre compréhension des mécanismes physiopathologiques liés au sepsis, qui demeurent insuffisamment caractérisés jusqu'à présent.
Procédures
Tous les animaux du projet seront soumis une seule fois à une chirurgie induisant le sepsis, via la ligature et ponction du cæcum (CLP; durée environ 20 minutes/souris). L’acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie et analgésie. Tous les animaux recevront des injections sous-cutanées (quelques secondes). Tous les traitements seront administrés par voie intra-péritonéale, sous cutanée ou intra-veineuse. Selon les procédures chaque animal recevra soit 5 ou 4 injections (quelques secondes). L'injection intraveineuse sera effectuée en plaçant l'animal dans un dispositif de contention et la procédure durera moins d'une minute. L'examen non invasif de la pression artérielle sera effectué sans anesthésie et durera environ 15 minutes. L'échocardiographie nécessite une anesthésie légère et dure environ 15 minutes. Les trois dernières techniques décrites sont des procédures « légères » au cours desquelles les animaux sont soumis à un stress minimal de courte durée. Une partie des animaux subira une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie d’une durée de 20 minutes et seront euthanasiés sans réveil. Les prélèvements seront effectués après l’euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Des infections pourraient se produire au niveau des sites des injections. Les souris qui seront soumises aux injections subiront un stress lié à la contention de courte durée. Tous les animaux du projet seront soumis à une chirurgie induisant le sepsis, via la ligature et ponction du cæcum (CLP) qui sera effectuée sous anesthésie et analgésie. Les nuisances/effets indésirables induits par le sepsis peuvent être : Inflammation systémique, dysfonction d'organes, altération de la coagulation, hypotension, altération de la barrière intestinale ; dysfonction immunitaire et l’altération de la thermorégulation. Les sites des injections ou le site d'incision chirurgicale pourraient s’infecter. Il pourrait y avoir une mauvaise cicatrisation de la plaie chirurgicale. Une dessiccation des tissus et un inconfort pourraient être observés. L'anesthésie peut entraîner différents effets indésirables comme une dépression respiratoire, une hypothermie, et des troubles du réveil.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
Le sepsis est le résultat d'une réponse immunitaire incontrolée à une infection. Cette situation découle d'une série d'événements complexes, comprenant l'activation des cellules immunitaires et la libération de cytokines, l'activation des voies de coagulation, ainsi qu'un dysfonctionnement endothélial, qui ensemble contribuent à la défaillance d'organes. Actuellement, il est impossible de reproduire de manière fidèle en laboratoire la complexité et les conséquences du sepsis. C'est pourquoi l'utilisation d'animaux vivants demeure impérative pour étudier cette pathologie.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2430 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront réalisés afin d’avoir une interprétation fiable des résultats. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés régulièrement afin de respecter leur bien-être. Le comportement général des animaux sera suivi. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces, seront appliqués afin de limiter la douleur des animaux à leur minimum. Le MSS ou score de sepsis murin sera utilisé pour évaluer l'état clinique des souris atteintes d'un sepsis. Nous nous baserons sur ce score pour définir nos point limites avant que l’animal se retrouve dans un état de sepsis sévère. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Nous utiliserons des souris immunocompétentes. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Evaluation des effets anti-allodyniques/hyperalgésiques d’une ou plusieurs molécules injectée(s) en intrathécale ou intraveineux à l’aide d’un cathéter dans différents tests de douleur chez le rat .
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Trois cents rats sont réutilisés pour entraîner du personnel à des gestes techniques, les autres tués dès la fin de la phase expérimentale parce que les composés testés ont pu modifier leurs structures et leur immunité. 2 750 rats juvéniles à adolescents vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour tester des candidats médicaments contre la douleur. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter intrathécal ou intraveineux, jusqu'à six stimulations mécaniques ou thermiques par jour répétées sur plusieurs jours, des administrations par une dizaine de voies différentes, des prélèvements sanguins et jusqu'à vingt-quatre heures de mise à jeun. Le porteur affirme que la douleur, "expérience sensorielle et émotionnelle", ne peut pas être étudiée in vitro et que l'évaluation chez l'animal vigile "reste la seule option" avant le passage chez l'être humain.
Objectifs
La douleur est encore dans les principales causes d’arrêt maladie. Très mal soignée ou avec de nombreux effets secondaires, il est important de continuer la recherche pour développer de nouvelles pharmacologies de références. D’une part, le but de ce projet est d’offrir la possibilité de tester des candidats-médicaments dans différents modèles de douleur et tests comportementaux et pour différents types de douleur (mécanique, thermique). D’autre part, certains tests visent à évaluer les effets secondaires de composés pharmacologiques issus de différentes classes. En effet, une utilisation abusive s’est développée ces dernières années dans l’utilisation des opiacés mettant à jour une crise appelée « crise des opioïdes ». De plus, les Gabapentinoides provoquent généralement une forte sédation, une somnolence et ont donc un impact sur la démarche et la coordination motrice. C’est pourquoi il est nécessaire de développer de nouvelles molécules antalgiques de référence tout en limitant les effets secondaires. L’implantation de cathéter permettra l’évaluation de composés administrés en perfusion ou de manière répétée. Ces tests sont couramment décrit dans la littérature et sont réalisés dans le laboratoire depuis plusieurs années.
Bénéfices attendus
Les molécules de référence dans le traitement de la douleur sont soit peu efficaces, soit avec de nombreux effets secondaires (Opiacés : Impact sur le transit, tolérance…). Le but de ce projet est de tester de nouveaux candidats médicaments dans des tests de douleur reconnus. Ils seront comparés aux molécules de références testées en cliniques. Le bénéfice à long terme de ce projet est donc la mise au point de nouveaux composés antalgiques efficaces et avec peu d’effets secondaires destinés à l’évaluation en étude clinique puis à la mise à disposition des patients mais aussi à destination du domaine de la santé animale. A plus court terme, la publication de posters/articles scientifiques pour mettre en évidence certains résultats encourageants sera envisagée.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie pour l’implantation de cathéters. Lors des tests ils pourront être exposés à une stimulation mécanique ou thermique d’une durée inférieure à 1 min par stimulation. La stimulation est stoppée dès réaction de l’animal. Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limite de 6 points de mesure par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. Les animaux seront également soumis à la contention ou isolés dans des compartiments le temps des tests. Les animaux recevront des traitements de composés (voie intrapéritonéale, orale, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, intra-rectale, intra-colonique, intraveineuse, intrathécale, intra-articulaire). Ces actes durent quelques secondes. Ils pourront être réalisés une seule fois, ou plusieurs fois par jour espacé de 0min (simultanément) à plusieurs heures (2-4-6-8-12) ou même de plusieurs jours (une fois par semaine, un jour sur deux) Ceci est dépendant de la pharmacocinétique du composé testé. Les animaux seront soumis à un anesthésiant gazeux durant quelques minutes pour l'implantation du cathéter qui nécessite une micro-chirurgie (10minutes). De plus, les animaux pourront subir des prélèvements de sang en répétés ou en prélèvement unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé testé. Les prélèvements de sang durent maximum 3 minutes et les animaux peuvent être sous anesthésie pendant 5minutes. Les prélèvements sont limités à un maximum par jour selon les recommandations en vigueur.
Impact sur les animaux
Les nuisances liées aux tests sont dues à l’application d’un stimulus douloureux ou non (mécanique ou thermique) qui sera stoppé suite à la réaction de l’animal (nuisance légère < 1 min). Les tests sont pratiqués sur animal en contention manuelle (légère < 1 min) ou dans une boîte en plexiglass avec une mobilité possible mais réduite (nuisance légère, 4h maximum). Les tests peuvent être répétés plusieurs fois sur une même journée dans la limité de 6 points de cinétique par jour. Ils peuvent être réalisés sur plusieurs jours. De plus, l’ensemble des animaux pourra subir des nuisances liées à l’administration unique ou répétée de composés (lésion superficielle :, nuisance légère < 1 min, administration répétée : nuisance modérée). Le port d'un adaptateur au système de de perfusion dans la nuque peut etre une nuisance légère (légère gène,) Les composés administrés peuvent induire des effets secondaires listés dans les points limites (posture anormale, sédation). Enfin, les animaux peuvent subir des prélèvements de sang en répétés ou unique afin de suivre la pharmacocinétique du composé (nuisance légère < 3 min). Certains animaux subiront les nuisances liées à la mise à jeun (modérée maximum 24h). Les nuisances liées à la pose du cathéter et du système de perfusion sont : le risque d’infection, l’apparition de tissu cicatriciel et l’anesthésie. La nuisance liée aux perfusions est l’anesthésie gazeuse qui peut-être répétée.
Devenir
Le test de composé pharmacologique en développement ne permet pas la réutilisation des animaux pour tester de nouveaux composés car un impact des composés pharmacologique sur les structures, l’immunité, etc… n’est pas exclu. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont euthanasiés par le personnel habilité. Néanmoins, dans le cas des procédures n'impliquant pas la mise à mort immédiate des animaux, les animaux ne présentant pas de signe de souffrance pourront être réutilisés pour de la formation à des gestes techniques (traitements, tests par exemple).
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Ces tests sont couramment mis en place au sein du laboratoire. De nombreuses données ont été générées afin de calculer au mieux le nombre d’animaux minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques à postériori. Un système de surveillance de l’état général des animaux (grille de scoring) associé à des points limites est mis en place au laboratoire.Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les données disponibles. Il est attendu que le nombre d’animaux effectivement nécessaire soit inférieur aux prévisions de cette demande d’autorisation de projet. Classiquement une étude est composée de 5 à 6 groupes. Elle comporte différent groupe d’animaux contrôles positif et négatif qui peuvent être exclus ou limités à un seul en fonction des tests. Ici nous avons pris en compte l’ensemble des contrôles mais dans le cadre de ce projet ils pourront être revus à la baisse si certains groupes contrôles ne sont pas nécessaires. En fonction du design de chaque étude de tests statistiques appropriés seront effectués.
Raffinement
Les animaux ont accès dès leur arrivée dans l’animalerie à de l’enrichissement (tunnel en polycarbonate rouge transparent, briquettes en bois) et sont habitués à la salle d’expérimentation et aux tests (contention, enceinte…) afin de limiter leur stress. Lors des tests, des valeurs dites de cut-off sont fixées et correspondent à la stimulation maximale que peut subir l’animal. Ceci permet d’éviter les lésions dues au test ou les stimuli plus douloureux que nécessaire. Dans le cadre de certains tests, le choix des températures ou de la gamme de filaments est fait afin de limiter la douleur et de mesurer une allodynie (c’est-à-dire la réponse à un stimulus non douloureux chez l’animal sain). Une anesthésie est appliquée avant chaque acte le nécessitant et le permettant : prélèvements, traitements particuliers, … Une surveillance accrue des animaux est mise en place au vu de la thématique de la recherche. Des points limites sont clairement établis et des mesures sont mise en place suite aux inductions des modèles : aliments placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir, injection sous cutanée de solution hydratante en cas de déshydratation. Un système de fiche de scoring est également mis en place afin de donner une vision objective des paramètres à suivre. La pose d’un système de perfusion est un raffinement en soi car il permet d’éviter les injections répétées en intraveineux et réduit les temps d’anesthésie pour injection.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par d’autres espèces est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur est récente et les modèles in vitro d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. Le rat a été sélectionné pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés pour l’ensemble des procédures sont des animaux juvéniles à adolescents (4-7semaines). Ce stade a été choisi car ilpermet un suivi sur plusieurs semaines des animaux, évitant d’avoir des animaux âgés pour lesquels des pathologies liées à l’âge pourraient interférer avec nos résultats. Ce stade de développement permet aussi d’avoir des animaux dans une gamme de poids adaptée aux tests réalisés ce qui limite le stress engendré par la contention.
Rôle d’une protéine dans la résistance aux chimiothérapies dans un modèle de xénogreffe murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
390 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe de cellules cancéreuses humaines dans le flanc, jusqu'à quarante gavages et six injections intraveineuses, et une immobilisation trois fois par semaine pendant huit semaines pour mesurer sa tumeur au pied à coulisse. Le porteur indique que le gavage peut provoquer une inflammation de l'œsophage et que la chimiothérapie entraîne une fatigue généralisée. L'objectif est de vérifier si le blocage d'une protéine restaure la sensibilité des tumeurs à la chimiothérapie, ce qui permettrait selon lui d'en abaisser les doses. Les souris qui ne développent pas de tumeur sont tuées elles aussi, le porteur écrivant qu'elles "ne peuvent pas être considérées comme naïves".
Objectifs
La protéine que nous étudions est impliquée dans la chimiorésistance. Quand nous retirons cette protéine des cellules cancéreuses, elles deviennent de nouveau sensibles aux chimiothérapies. Sachant que 90% des morts par cancers sont la conséquence de chimiorésistances, nous voulons voir dans des modèles de souris si quand on enlève notre protéine de la tumeur, nous sommes capables de contrer ce phénomène de chimiorésistance. Si c’est le cas, nous pourrons diminuer la dose de chimiothérapie et donc les effets secondaires et également proposer un nouveau traitement pour des patients qui ne répondent plus à la chimiothérapie et son donc dans une impasse thérapeutique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mettre en évidence le rôle de notre nouveau traitement en combinaison avec une chimiothérapie. Nous pouvons imaginer pouvoir baisser la dose des chimiothérapies car elles seraient plus efficaces en combinaison avec notre traitement, ce qui permettrait de diminuer les effets secondaires de ces chimiothérapies. Aussi, 90% des morts par cancer font suite à une chimiorésistance, il y a donc une urgence pour contrecarrer ce phénomène.
Procédures
Les animaux recevront une injection de cellules tumorales dans le flanc (1x, 40sec). A la suite de cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine pendant 8 semaines, l’animal est maintenu immobile environ 30 sec. Les composés sont administrés par injection intraveineuse (3x par semaine de traitement pendant 2 semaines, 1min dont 3sec d’injection) et par gavage (5x par semaine pendant 8 semaines, 1min dont 5sec de gavage) sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Un stress peut être observé lors de la contention des animaux (greffe, administration de composés, et pesées). Les traitements avec chimiothérapie peuvent induire une fatigue généralisée. Le gavage peut provoquer une inflammation de l’œsophage.
Devenir
Les souris sont mises à mort pour le prélèvement des tumeurs en vue d’analyses des tissus. Les souris qui n’auront pas développées de tumeurs seront mises à mort, car elles ne peuvent pas être considérées comme naïves.
Remplacement
Les travaux menés in vitro montrent que la stratégie de blocage de la protéine X induit la mort des cellules cancéreuses. Mais ces tests ne bénéficient pas d’un microenvironnement tumoral et d’un environnement hôte complexes. Aussi il est nécessaire d’avoir recours à l’in vivo pour étudier la capacité du nouvel outil thérapeutique à atteindre la tumeur, pour analyser son comportement dans cet environnement complexe, évaluer son efficacité et pouvoir valider cet outil. Ces méthodes sont complémentaires d’expérimentations sur des cellules en culture qui sont largement utilisées en parallèle pour cette étude.
Réduction
Le nombre de souris a été calculée en fonction de l’importance de l’effet attendu afin d’observer une différence entre les groupes à l'aide d'un test statistique.
Raffinement
Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur formé à cette technique. Il est important de noter qu’une surveillance adaptée (3 fois par semaine) permettra la détection et notation des signes de souffrance grâce à une feuille de scoring contenant des points d'arrêt objectifs, reproductible et standardisés et qui conduiront à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux si nécessaire. En cas de souffrance n’allant pas jusqu’à un point limite, l’injection d’analgésique pourra être envisagé pour réduire la douleur. Les analyses de croissance des tumeurs seront non invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d’injection d’anesthésiant. En revanche, les souris seront anesthésiées lors de l’injection sous-cutanée des cellules.
Choix des espèces
La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules, tout en permettant de faire des suivis de croissance tumoral dans le cadre d’essais de nouveaux traitements. Par ailleurs les schémas d’administration des chimiothérapies sont bien standardisés (voie, doses, posologies...) contrairement à d’autres modèles tels que le Zebrafish. Les expérimentations seront effectuées sur des femelles de 6 à 7 semaines, âge où la prise de greffe est la plus efficace et la plus homogène.
Mesure du pH tumoral à l’aide de nouveaux agents de contraste: application aux modèles murins MDA-MB231 et 4T1 de cancer du sein 2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Deux heures d'IRM sous anesthésie générale et jusqu'à deux injections d'agents de contraste radiomarqués à vingt-quatre heures d'intervalle: 920 souris femelles immunodéficientes vont être utilisées, dont 100 tuées sans reprendre conscience et 790 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une injection de cellules cancéreuses dans la mamelle pour induire une tumeur du sein triple négatif, puis passe d'un établissement à l'autre en véhicule climatisé entre l'imagerie et les études de biodistribution. Le porteur écrit que les acquisitions IRM sont indolores et atraumatiques et qu'aucun antalgique n'est utilisé pour les injections d'agents de contraste, les nuisances déclarées se limitant au développement des tumeurs. Toutes sont tuées sous anesthésie, par ponction cardiaque pour certaines, afin de récupérer la tumeur et de mesurer la radioactivité retenue par chaque organe.
Objectifs
Malgré les avancées dans le dépistage et le développement de thérapies, le cancer du sein reste un problème de santé public majeur. Il s’agit du cancer le plus fréquent chez la femme. L’incidence du cancer du sein est en constante augmentation dans la plupart des pays malgré les efforts fournis pour la prévention de cette maladie. Une caractérisation tissulaire du cancer du sein est indispensable pour une détection plus précoce, ce qui permettra d’augmenter les chances de réussite du traitement, mais aussi de minimiser les séquelles. Il Il est connu que le pH extracellulaire des tumeurs est plus acide que celui du tissu sain . Ceci est dû à une augmentation de la production d’acide lactique. Nos collaborateurs ont développé des agents de contraste détectables en IRM sensibles au pH. L’objectif de ce projet est dans un 1er temps d’étudier l’efficacité de nouveaux agents de contraste pour mesurer les variations du pH tumoral au cours du développement de la tumeur. Une fois injectés par voie intraveineuse, l’intensité du signal de la tumeur sur l’image IRM va varier en fonction de la valeur de son pH. Ceci permet de calculer le pH tumoral et d’étudier sa variation tout au long du développement de la tumeur mammaire. Néanmoins, la technique d'IRM ne permet pas une quantification absolue de l'agent de contraste dans un organe d'intérêt du fait que le signal dépend à la fois de la concentration locale d’agent mais aussi de son environnement. L’utilisation d’un analogue radioactif permet l’accès à la distribution relative de l’agent dans l’organisme (biodistribution) car l’activité qui est retenue par chaque organe dépend exclusivement de la concentration locale en agent. Dans un 2nd temps, nous allons étudier la biodistribution ex vivo (prélèvements d'organes post mortem à des temps précis) de ces même agents de contraste, sur souris saines et souris modèle de cancer du sein triple négatif à l'aide des analogues marqués soit à l'111In soit avec un autre radiométal. Ils ne sont donc pas éligibles aux traitements ciblant ces trois types de marqueurs et donc plus difficile à soigner. Ce projet se fera donc sur 2 EU
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité de nouveaux agents de contraste sensibles au pH pour mesurer les variations du pH tumoral au cours du développement de la tumeur et de quantifier la biodistribution de ces agents de contraste dans les différents organes. Ce projet devrait permettre d'améliorer la connaissance sur le développement du cancer triple négatif puisque le pH est directement lié à l’agressivité tumorale et au développement de métastases.
Procédures
Dans l'EU1 (IRM), certaines souris vont recevoir une injection intra mammaire unique pour l’induction des tumeurs (durée moins de 2 minutes). Tous les animaux vont recevoir 1 injection intraveineuse ou intrapéritonéale pour l’injection des agents de contraste à étudier en imagerie par résonnance magnétique (IRM). Dans l'EU2, tous les animaux vont recevoir 1 injection intraveineuse ou intrapéritonéale pour l’injection des agents de contraste à étudier en biodistribution. Certaines souris venant de l'EU1 serviront pour les études de biodistribution dans l'EU2 et recevront au maximum 2 injections à 24h d'intervalle. Le temps d'injection est de 5 secondes environs. L’induction tumorale et les examens d’imagerie seront effectués sous anesthésie générale. Le temps total d'examen d'imagerie est de 2 heures maximum. Certaines souris vont avoir un prélèvement de sang qui se fera juste avant la mise à mort de l’animal sous anesthésie générale (Dans l'EU1 ou l'EU2).
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles sont liées au développement des tumeurs mammaires. Si des signes de souffrance apparaissent, ils feront l'objet de points limites. L’injection IV de agents de contraste ne provoque pas de douleur, juste celle équivalent à une piqure d’aiguille. Notre expérience de l’injection d’agents de contraste fait que nous n’utilisons pas d’antalgiques pour ce geste. Les acquisitions IRM sont totalement indolores et atraumatiques. De plus les souris sont sous anesthésie gazeuse pendant toute la durée des acquisitions IRM et durant la ponction cardiaque. Les souris immunodéficientes utilisées présentent un phénotype dommageable dû à leur immunodéficience.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les souris anesthésiées à l'isoflurane seront mises à mort pour pouvoir récupérer la tumeur et les organes d'intérêt.
Remplacement
Le modèle animal souris est fondamental dans notre cas, puisque à notre connaissance il n'existe pas de modélisation capable de représenter la complexité des tumeurs et la distribution des agents de contrastes in vivo. Pour ces raisons, l’étude préclinique de biodistribution des agents de contraste et l’induction de tumeurs mammaires ne peuvent se faire que sur un organisme vivant entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. L’IRM (imagerie par résonance magnétique) pour le suivi du développement des tumeurs mammaires ainsi que la SRM (spectroscopie par résonance magnétique) permettent aussi de réduire le nombre d’animaux puisque l’intérêt de ces techniques réside dans le fait qu’une même souris peut être observée plusieurs fois dans le temps. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris.
Raffinement
Elles sont manipulées par du personnel formé et entraîné. Les animaux sont observés quotidiennement afin de déceler toute souffrance. Des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance au cours de l’expérimentation. Toutes les tumeurs seront induites dans l'établissement 1. Après l'imagerie RM, les souris seront transportées à l'établissement 2 (situé sur le même campus) dans un véhicule climatisé. Les animaux sont transportés dans des cages à couvercle filtrant et des procédures strictes sont appliquées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…) évitant la contamination des animaux durant les séances d'imagerie.
Choix des espèces
Ce modèle animal nous donne la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisés. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses humaines et murines. On utilisera des souris femelles adultes de 8 à 10 semaines; âge auquel tous les organes sont arrivés à maturation, ce qui est important pour l’élimination des agents de contraste (en particulier les reins).
Formation à la physiologie de la nutrition par la recherche : Effet des boissons sucrées sur l’induction de la lipogenèse et le comportement.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rats : 60
Former des étudiants ingénieurs et de master à la physiologie de la nutrition: 60 souris et 60 rats reçoivent une boisson sucrée à 20 % de saccharose pendant quatre semaines et sont tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chaque animal passe deux tests de comportement de dix minutes, dont le RNT ne dit pas la nature. Les mises à mort sont échelonnées pour que les encadrants corrigent les gestes des étudiants pendant les prélèvements, l'enseignante ouvrant l'abdomen avant que les binômes ne prélèvent le foie et les tissus adipeux. Le porteur écrit que comprendre ces mécanismes est "indispensable" à la formation, et justifie le choix indifférencié du rat ou de la souris par la réutilisation possible de rongeurs venant d'autres protocoles.
Objectifs
Notre école forme des ingénieurs et des étudiants en master en recherche et développement capables d’intégrer la nutrition dans les bénéfices santé de l’alimentation et de comprendre les effets sur l’apparition de dysfonctions métaboliques. Acquérir les connaissances concernant le lien alimentation / santé, les besoins nutritionnels, le comportement alimentaire au travers d’enseignement par la recherche est un objectif majeur de nos formations. Un problème majeur en nutrition, qui est un sujet d’actualité dans le cadre de la pandémie mondiale d’obésité, est la prise de poids et l’augmentation de la masse grasse, qui en retour induit des dysfonctions métaboliques (diabète, maladies cardiovasculaires, accumulation de lipides dans le foie, hypertension).Comprendre les mécanismes par lesquels le poids et l’adiposité augmentent est indispensable pour la formation des ingénieurs et des étudiants en master de nutrition. Ces connaissances, en plus de la formation théorique sur les voies métaboliques , nécessitent d’appréhender la complexité du problème par une approche par la recherche, pour évaluer l’effet de l’alimentation sur le comportement des animaux et sur l’interaction entre les organes et les molécules de signalisation associées, afin de comprendre la mise en place de ces dysfonctions métaboliques. L’objectif de ce projet est de former les étudiants à la physiologie de la nutrition en étudiant les effets de l’ingestion de boissons sucrées (saccharose à 20% dans l’eau) sur l’augmentation de la masse grasse. Les effets des boissons sucrées sont complexes et font intervenir une non compensation énergétique lorsque l’apport énergétique est sous forme liquide et une augmentation de la glycémie et en conséquence de l’insulinémie. En effet, la consommation de sucres, notamment sous la forme de boisson, induit une augmentation de l’ingéré énergétique qui s’ajoute à la consommation de l’énergie quotidienne. De plus, le glucose, le fructose et l’insuline vont stimuler directement la synthèse des lipides dans le foie qui vont être ensuite exportés et stockés dans les graisses.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de former les étudiants à la nutrition, au comportement et à l’analyse statistique des données obtenues ainsi qu’à l’anatomie. Il porte sur l’effet des boissons sucrées sur le comportement et la prise de de graisses. Comprendre les mécanismes responsables de l’effet de la consommation de boisson sucrées sur la prise de poids et les conséquences sur le surpoids et l’obésité est un enjeu majeur en santé publique.
Procédures
Administration de boisson sucrée donnée dans l’eau de boisson (pour 120 animaux sur une durée de 4 semaines) et tests de comportement pour 120 animaux (2 tests de 10 minutes chacun). A la fin de l’expérimentation, tous les animaux (n=120) seront anesthésiés par injection en quelques secondes à l’animalerie 15 minutes avant la mise à mort. Les animaux anesthésiés seront ensuite mis à mort par injection léthale en quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les tests de comportement pourraient induire un stress léger dû à la nouveauté de l’environnement qui fait partie du principe de ces tests. L’injection sur animal vigile est susceptible d’induire de la douleur et un stress modéré mais de courte durée. Le stress induit par l’injection lors de la mise à mort sera atténué par l’injection préalable d’anesthésique.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’étudier sur les organes et tissus l’activation de la synthèse de graisse et l’augmentation de la masse grasse.
Remplacement
Cette étude permettra de former les étudiants à la nutrition en étudiant sur des modèles animaux les effets de l’alimentation sur les différents organes, au comportement et à l’analyse des données obtenues, ainsi qu’à l’anatomie sur les animaux morts. Le projet de recherche proposé dans le cadre de ces travaux pratiques requière la mesure des conséquences de l'ingestion des boissons sucrées sur le comportement et la prise de poids et de masse grasse, ce qui empêche le remplacement de l'expérimentation animale par des modèles cellulaires ou moléculaires. Ainsi, les objectifs de ce projet de recherche ne peuvent être atteints sans avoir recours à l’animal.
Réduction
Nous avons estimé l'effectif minimal requis pour observer un effet des boissons sucrées à 10 animaux par sexe et groupe. Les données seront mutualisées dans 4 unités d’enseignement sur une durée de 2 ans. Pour chaque année, trois groupes de TP de 15 étudiants au maximum participeront aux prélèvements des organes sur 20 animaux pour chaque groupe de TP et 48 étudiants organisés en 4 groupes de TP de 12 étudiants mesureront le comportement de 4 animaux par groupe de TP, soit 16 animaux pour les 48 étudiants. Les résultats obtenus seront également utilisés pour former 30 étudiants par an aux tests statistiques, en utilisant soit ceux obtenus par leur promotion, soit ceux obtenus par les promotions antérieures (étude de la reproductibilité).
Raffinement
Le projet n’imposant pas un suivi de la prise alimentaire, les animaux sont mis en cage collective de trois à quatre animaux. Les cages seront enrichies avec des tunnels transparents. L’expérimentateur ou le personnel animalier passera tous les jours pour vérifier l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement, ainsi que la disponibilité de la nourriture et de la boisson de chacune des cages. Les points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures. Au cours des travaux pratiques, les étudiants seront sous la responsabilité des enseignants titulaires du diplôme de niveau 1 et de chirurgie, assistés de l’animalière et d’un assistant ingénieur. Les étudiants seront divisés en 4 groupes de 12 pour l’étude du comportement et de 3 groupes de 15 pour les études physiologiques.Pour ces derniers TP, les animaux seront mis à mort en séquentiel pour permettre aux encadrants du TP de suivre et corriger les gestes des étudiants au cours des prélèvements post mortem. Au début de la séance, l’enseignante procède à une démonstration sur un animal pour deux binômes (4 animaux). Par la suite, l’enseignante vérifie la mort de l’animal, ouvre la cavité abdominale, effectue le prélèvement sanguin au niveau de la veine cave, et ensuite, les étudiants prélèvent le foie et les différents tissus adipeux. Avant les travaux pratiques, les étudiants suivent des enseignements sur l’expérimentation animale (1h30) incluant la présentation de la réglementation dispensés par la responsable de l’animalerie et l'animalière et 3h de cours sur l’éthique dispensé par l’enseignant spécialiste du comportement animal.
Choix des espèces
Comme l’homme, le rat et la souris ont un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie du système digestif du rat et de la souris présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. Ces espèces présentent également une réponse positive à la prise de poids et de masse grasse par l’absorption de boisson sucrée. Le choix indifférencié de la souris ou du rat se justifie par le fait que nous favoriserons la réutilisation d’animaux d’autres protocoles, si cela est possible. Les animaux arriveront à l’âge de jeunes adultes (4-8 semaines), période propice à la prise de masse grasse sous l’effet des sucres.
Mise en place d’un modèle de radio-nécrose chez la souris portant un gliome (1/3)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Cent souris reçoivent des cellules cancéreuses implantées directement dans le cerveau, cinquante autres par voie intraveineuse, puis toutes passent sous radiothérapie ou restent sans traitement comme témoins. 150 souris vont ainsi être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, transportées vers un second établissement pour le suivi par IRM, puis tuées en fin de projet pour confronter les images aux coupes histologiques. Le porteur décrit des titubations, une léthargie, des tremblements, des crises d'épilepsie et une perte de poids suivie jusqu'à 15 %, et affirme que la radionécrose de la tumeur ne devrait pas provoquer de douleur, celle du tissu cérébral sain pouvant en revanche devenir douloureuse. Le RNT laisse la radiothérapie en "session unique ou répétée" et ne précise ni le nombre de séances ni le nombre d'examens IRM par souris, alors que ces répétitions sont l'objet même du projet.
Objectifs
Chaque année, environ 65 000 européens sont diagnostiqués avec une tumeur cérébrale primitive. La radiothérapie est une option thérapeutique établie en association avec une chimiothérapie ou une résection chirurgicale. Même si son efficacité a largement été prouvée, la radiothérapie peut cependant engendrer des phénomènes nécrotiques et inflammatoires intenses, appelés radio-nécrose, 6 mois à 2 ans chez près de 25% des patients. Cette radio-nécrose est un effet secondaire de la radiothérapie et limite la précision de l'évaluation de la réponse tumorale à la thérapie. En effet, ces lésions dues aux radiations peuvent être confondues avec la progression tumorale, d'où le terme parfois utilisé « pseudoprogression ». A ce jour, seule l’analyse d’échantillons extraits par biopsie s’avère être totalement fiable pour différencier ces deux phénomènes. Mais la biopsie reste une intervention chirurgicale pouvant présenter certains risques pour le patient et le résultat peut s’avérer peu informatif étant donnée la petite taille de l’échantillon vis-à-vis du volume et de l’hétérogénéité tumorale. Diagnostiquer précisément le plus tôt possible une radionécrose ou une récidive est essentielle afin d’adapter au mieux le traitement. En effet, la progression tumorale et la radio-nécrose ont des approches thérapeutiques et des pronostics différents : des sessions supplémentaires de radiothérapie peuvent être bénéfiques pour les patients présentant une récidive de la maladie, alors qu'elles sont contre-indiquées lors de présence de radionécrose. Par conséquent, des biomarqueurs spécifiques et sensibles sont nécessaires pour différencier le plus tôt possible les deux effets. Ce projet vise à développer des méthodes avancées d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour permettre l'évaluation in vivo non invasive de la réponse à la radiothérapie. Ainsi, l’objectif de cette demande est de développer un modèle de radionécrose chez la souris portant un gliome.
Bénéfices attendus
Ces modèles sont représentatifs de cas chez l’homme, donc la méthodologie IRM pourra être transférée rapidement. L’IRM devrait permettre de détecter la radionécrose, et de la différencier de la pseudo-progression. Les données recueillies avec la nouvelle méthode IRM fourniront un point de départ solide pour 1) évaluer la possibilité d'éviter les biopsies chirurgicales et 2) évaluer plus précocement l'évolution de la maladie. Ces informations sont cruciales pour mieux orienter le traitement du patient.
Procédures
Un premier groupe de 100 animaux sera soumis à une implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique ou répétée) ou pas. Un deuxième groupe de 50 animaux sera soumis à une injection de cellules cancéreuses en intraveineux (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique ou répétée) ou pas. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Tous les animaux seront soumis à une injection intraveineuse d'un agent de contraste IRM sous anesthésie générale à chaque examen IRM. Ces examens seront séparés d'au minimum 3 jours.
Impact sur les animaux
Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, et des signes neurologiques tels que la tête penchée, tremblements, crises d’épilepsie. La radionécrose tumorale ne devrait pas induire de douleur. En revanche, si une radionécrose du tissu cérébral sain intervient, celle-ci pourrait devenir douloureuse et sera détectée par des modifications du comportement ou de l’apparence physique. De plus, le transport des animaux d’un établissement utilisateur à un autre pourrait induire un stress aux animaux.
Devenir
A l’issue de la radiothérapie (ou pas pour les contrôles), les animaux seront transférés à un autre établissement utilisateur pour les héberger à proximité d’une plateforme d’imagerie pour leur suivi par IRM. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de confirmer les résultats IRM avec des coupes histologiques.
Remplacement
Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic précoce et fiable de la radionécrose. Il n'existe pas de modélisation suffisamment aboutie pour reconstituer un micro-environnement tumoral, une immunité, et une vascularisation tumorale suffisamment intégrée pour reconstituer un modèle proche de l'homme. L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus.
Réduction
Du fait de la non-invasivité de l’imagerie par IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de quatre jours entre chaque examen. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.
Raffinement
Pendant les chirurgies et les examens IRM, l'utilisation d'anesthésies gazeuses, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle visuel de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Au cours du suivi post-opératoire, les souris portant des tumeurs ou métastases cérébrales seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Des points limites ont été instaurés pour surveiller la santé et le bien-être des animaux. Si des signes de souffrance apparaissent, les animaux seront soit euthanasiés soit pris en charge par un analgésique. Les animaux seront observés au réveil pour une recherche de signes cliniques de la douleur. Les animaux sont observés 2 fois par jour pendant les 3 jours suivant les chirurgies puis 1 fois par jour. La fréquence repassera à 2 fois par jours en cas de début de perte de poids (10%).
Choix des espèces
Les souris sont des animaux permettant d'obtenir des modèles oncologiques, proches de ceux rencontrés chez l'homme. De plus, leur variabilité inter-individuelle est faible, permettant d'établir des protocoles IRM reproductibles, avant tout transfert à l'homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car le développement des organes sera terminé.
Oncologie : modèles d’étude précliniques de cachexie
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 600
1 200 souris et 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent des injections de cellules tumorales sous anesthésie, puis des substances administrées jusqu'à quatre fois par jour, des mesures de poids et de tumeur jusqu'à trois fois par semaine, une imagerie hebdomadaire et, le cas échéant, jusqu'à sept séances de radiothérapie par semaine pendant quatre semaines. Le porteur annonce une période maximale de nuisance de un à deux jours et écrit que la distension de la peau par la tumeur n'est associée ni à des douleurs ni à des démangeaisons, dans un projet dont l'ensemble des procédures est classé sévère. L'objet réel est d'induire une cachexie chez ces rongeurs puis d'évaluer sur eux des substances déjà décrites comme anti-cancéreuses ou anti-cachexie, et de produire des modèles pour des études de pharmacologie ultérieures.
Objectifs
Le cancer est un problème de santé publique majeur et représente la deuxième cause de décès dans le monde. On estime que près de la moitié des patients atteints de cancer développent un syndrome de cachexie, pouvant être associé à de l’anorexie, résultant en une perte progressive de tissu adipeux et de masse musculaire. La cachexie est un syndrome inflammatoire sévère et a un impact conséquent sur la qualité de vie des patients et même leur survie. En effet, on estime à environ 20% la mortalité directe induite par une cachexie chez les patients atteints d'un cancer. De plus, certains traitements anti-cancéreux, comme les chimiothérapies ou d’autres molécules, peuvent elle-même induire un syndrome de cachexie. Cette problématique de santé publique nécessite de mettre en place des modèles d’étude pertinents afin de pouvoir proposer des solutions adaptées d’un point de vue thérapeutique. Les modèles animaux de cancer demeurent des éléments critiques dans la compréhension de la physiopathologie du cancer, l’identification de nouveaux candidats médicaments et la compréhension des mécanismes de résistance. L’objectif est d’induire une cachexie chez des rongeurs par des traitements anticancéreux ou par l’’administration des cellules tumorales afin de pouvoir évaluer des traitements permettant de contrer ces nuisances.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider des substances pharmacologiques décrites comme anti-cancéreuses ou anti-cachexie dans différentes indications tumorales. Ce projet permettra aussi d’évaluer de nouvelles molécules avec un fort potentiel anti-tumoral. En effet, à l'heure actuelle, il n'existe pas de traitements curatifs pour lutter contre la cachexie induite par des tumeurs ou médicamenteuse. De plus, il permettra aussi d'évaluer l'expression de certains biomarqueurs en amont d'une étude de pharmacologie ou de générer des modèles animaux.
Procédures
Les animaux subiront une anesthésie d’environ 5 min pendant laquelle ils subiront une injection rapide (
Impact sur les animaux
La croissance de la tumeur peut dans certains cas s’associer à une perte d'activité normale à travers une diminution de la locomotion, en particulier si la tumeur atteint les points limites. Cependant la période maximale de nuisance sera de 1 à 2 jours. L’évolution du volume tumoral entrainera une distension de la peau, n’étant pas associée à des douleurs ou démangeaisons. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une perte de poids. Les traitements (administration orales, injections, application topique) pourront induire un stress léger. Les mesures de poids et de volume tumoral nécessitent une contention et pourraient entraîner un stress léger, et qui diminue avec l’habituation. Le jour de la randomisation, les animaux seront mis avec de nouveaux congénères pouvant engendrer un stress de 1-2 jours.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude car les animaux présentent des tumeurs ou une cachexie importante non traitable. Cela ne permet pas un maintien des animaux en vie dans de bonnes conditions de santé.
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des méthodes alternatives car l'induction de tumeur ou l’administration de substances s'accompagne de modifications physiopathologiques et micro-environnementales spécifiques ne pouvant actuellement pas être reproduites in-vitro, ces modifications étant nécessaires pour l'étude d'efficacité d'anticancéreux ou de solutions nutritive ou anti-cachexie. De plus, les traitements utilisés subissent toutes les différentes phases incluant administration, distribution, métabolisme et élimination, étapes ne pouvant être reproduites in-vitro.
Réduction
Des analyses in-vitro pourront être réalisées en amont de l'étude permettent de sélectionner des lignées/types de cellules présentant une sensibilité à la substance d'essai afin de limiter le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque test sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet, la comparaison par rapport à une substance de référence, et un effectif suffisant de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des tests. Dans cet objectif, une analyse sera réalisée afin d’estimer le nombre d’animaux nécessaire pour observer une diminution du volume tumoral mesuré d'au moins 50%.
Raffinement
Le raffinement des méthodes expérimentales afin de réduire au maximum la souffrance animale est mis en œuvre grâce à l'utilisation de points limites clairement établis, permettant d'euthanasier tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse. Le programme d’anesthésie, d’analgésie et d'asepsie (incluant oxygène à concentration ajustable et des tapis chauffants) est défini en accord avec un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. Il est aussi mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de jouets, litière, objets de nidification, objets à ronger ou mastiquer, présence de congénères... En cas de doute, une évaluation approfondie sera réalisée quotidiennement jusqu’à normalisation ou jusqu’à atteinte des points limites. Tous les points limites et leur cotation sont décrits dans un formulaire interne. Cette observation inclut une surveillance de l'aspect général, l’aspect du pelage, des yeux, la posture, les réactions de l’animal sous stimulation, la respiration l’appétit, l’état d’hydratation, les tremblements ou convulsions… Une évaluation interne incluant la cellule de bien-être animal pourra permettre de réévaluer et d’adapter à posteriori la catégorie si nécessaire.
Choix des espèces
Les rongeurs rats et souris demeurent essentiel pour étudier les tumeurs in vivo et comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du cancer. En effet, les tumeurs présentent une accumulation de multiples aberrations génétiques qui transforment les cellules, entraînant une croissance anormale, une prolifération et des métastases des cellules. Il n’est pas possible de reproduire ces éléments in vitro car requiert un système complexe comme les modèles animaux. La majorité des animaux seront utilisés à partir de 5 semaines développement que ce soit des rats ou des souris. À ce stade, leur système immunitaire et métabolique est suffisamment développé, ce qui permet d'observer les effets de la cachexie sans interférences dues à une immaturité ou à des modifications métaboliques liées à l'âge. Dans certains cadres, les animaux pourront être utilisés avant sevrage pour des modèles génétiques ou de tumeurs pédiatriques.
Rôle modulateur des agonistes des récepteurs GABAA dans la signalisation hormonale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
700 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune subissant jusqu'à cinq microcoupures de l'extrémité de la queue et cinq injections, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Les hormones administrées, glucocorticoïdes et hormones thyroïdiennes, peuvent selon le porteur induire une obésité, une résistance à l'insuline, une dyslipidémie, une myopathie, une ostéoporose et une hausse de la mortalité cardiovasculaire. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, trouver une molécule limitant les effets secondaires des traitements du syndrome de Cushing. Après avoir énuméré ces atteintes, le porteur écrit que la dose retenue se situe "dans la plage de doses sûres, sans aucun effet secondaire significatif signalé", et que l'injection et le prélèvement "n'entraînent pas de douleur".
Objectifs
Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim. Cette protéine agit comme un stimulateur de production de graisse (lipogenèse) et un stimulateur de l'appétit. Elle a un mode de sécrétion unique, conservé au cours de l’évolution des organismes, notamment les cellules de mammifères. Cette protéine joue un rôle crucial en aidant les cellules et les organismes à s'adapter au stress nutritionnel, par exemple dans le cas de jeûne, nous pouvons observer sa libération rapide dans le milieu extracellulaire, déclenchant ainsi des réponses adaptatives, telles qu'une modification du comportement alimentaire chez la souris. Nous pouvons aussi observer que cette augmentation de niveau est prolongée dans des conditions telles que le vieillissement, l'obésité, les syndromes métaboliques (dont le syndrome de Cushing), l'inflammation chronique et l'insuffisance rénale. Il est donc essentiel d’étudier l’impact (patho)physiologique de ces dérégulations de la sécrétion de cette protéine. Nous avons mené des expériences préliminaires et avons découvert que l'activation de certains récepteurs stimule la libération de cette protéine à partir de cellules en culture et augmente sa concentration plasmatique chez la souris. De plus, la transcription des hormones thyroïdiennes régule à la baisse le niveau de la protéine. Le rôle des récepteurs des hormones thyroïdiennes doit donc être étudié dans le cadre de la thérapie métabolique. Ainsi, ces expériences nous permettront de clarifier les différents mécanismes d'action de deux hormones liées au métabolisme (thyroxine et glucocorticoïdes) avec notre protéine ainsi que de préciser si notre protéine d'intéret peut servir de pont pour participer aux effets synergiques et antagonistes entre ces hormones.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de trouver une molecule capable de limiter les effets secondaires (comme l'obésité) des traitements actuels pour soigner des syndromes métaboliques tel que le syndrome de Cushing
Procédures
Dans les deux premières procédures, les souris recevront une injection (durée moins d’une minute) et auront un prélèvement de sang (durée d’une minute). Dans les quatre autres procédures, les souris auront toutes 5 prélèvements de deux gouttes de sang après une microcoupure de l’extrémité de la queue (durée moins d’une minute) ainsi qu’un prélèvement de sang (durée d’une minute). Cinq injections (durée moins d’une minute), seront administrées en plus à certaines souris.
Impact sur les animaux
Les injections ou prélèvements sous anesthésie locale induisent des nuisances très limitées au site. Ils sont par ailleurs très petits, ce qui evite les risque d'infections. La contention, les prélèvements et les injections peuvent stresser transitoirement les animaux. Les hormones peuvent induire l'obésité, la résistance à l'insuline, la dyslipidémie, la myopathie, l'ostéoporose et une augmentation de la morbidité et de la mortalité thrombotiques cardiovasculaires. La dose de médicament à tester que nous allons utiliser se situe dans la plage de doses sûres, sans aucun effet secondaire significatif signalé.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.
Remplacement
Cette étude ne peut être conduite qu’exclusivement in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs ( in silico, organoïdes, organes sur puce) permettant d’étudier dans son ensemble notre problématique. En effet, il nous faut mesurer la concentration d’une protéine dans le sang et, en même temps, la variation de prise de poids sur un organisme entier selon les effets métaboliques que peuvent avoir certains traitements.
Réduction
Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Il existe des différences entre les sexes dans les réponses hormonales c’est pourquoi ces procédures seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne) et nous utiliserons des petites aiguilles stériles, ce qui évitera les risques d'infection. Le prélèvement sur la queue sera réalisé après une microcupure indolore qui se refermera très rapidement par coagulation. L'injection ou le prelevement n'entrainent pas de douleur mais nous mettrons en place une grille de suivi stricte des points limites qui permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués (l'atteinte d'un des critères entrainent l'euthanasie de l'animal). Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est un animal très utilisé en laboratoire, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé