Rongeurs
Elevage et maintien de la lignée murine modèle de la maladie de Pelizaeus Merzbacher, avec prélèvement invasif pour génotypage
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les souris homozygotes de cette lignée sont conçues pour démyéliniser: dysfonction mitochondriale, dégénérescence du cervelet, convulsions et mort précoce vers l'âge de trois mois. 2 250 souris au maximum vont être produites sur cinq ans, dans un projet d'élevage classé en souffrance légère au titre de la seule procédure déclarée, un prélèvement de l'extrémité de la queue sur des souriceaux de sept à dix jours. Les porteuses des génotypes utiles partent vers d'autres projets à vingt-et-un jours, les reproductrices sont gardées jusqu'à huit mois, et les souris non porteuses sont tuées parce que leur modification génétique interdit tout replacement. Le RNT ne dit pas combien de souris homozygotes seront produites ni combien exprimeront le phénotype dommageable, alors que c'est là que se concentre la souffrance de la lignée.
Objectifs
La maladie de Pelizaeus-Merzbacher est une maladie génétique rare de la famille des leucodystrophies. Elle fait partie des leucodystrophies hypomyélinisantes caractérisées par un déficit permanent de myéline (une substance qui sert à isoler, à protéger les axones des neurones comme une gaine isolante autour de fils électriques et qui joue un rôle important dans la propagation rapide de message nerveux d’un neurone à l’autre) au niveau du cerveau. Cette maladie touche surtout les enfants avec des retards de développement important qui impactent à la fois les fonctions motrices et cognitives. La mise au point d’un traitement est un point crucial pour les patients atteints de cette maladie génétique rare, qui ne bénéficient actuellement d’aucune solution thérapeutique. L’objectif du projet est d’élever une lignée de souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie de Pelizaeus Merzbacher afin de générer nos lots expérimentaux qui permettront d’évaluer l’effet thérapeutique de différentes approches thérapeutiques par la suite.
Bénéfices attendus
La maladie de Pelizaeus-Merzbacher (ou PMD) est une maladie génétique rare de la famille des leucodystrophies. Sa fréquence est de 1 pour 100 000 naissances. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour cette pathologie. Le bénéfice du projet sera de maintenir notre lignée modèle de cette pathologie afin de générer des lots expérimentaux pour différents projets de recherche pour l’évaluation de nouvelles stratégies thérapeutiques qui nous l’espérons, contribueront à améliorer la vie des patients. A plus long terme ce projet pourrait donc permettre d’améliorer les connaissances sur la PMD et contribuer à l’amélioration de la prise en charge des patients.
Procédures
Un prélèvement de l’extrémité de la queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera effectué une fois sur animal vigile de 7 à 10 jours et durera moins d’une minute par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage. La lignée présentera un phénotype dommageable chez les animaux homozygotes generé se traduisant par une démyélinisation des axones, une dysfonction mitochondriale aggravant la dégénérescence du cervelet, suivie d’une mort précoce des animaux à l’âge de 3 mois en lien avec des crises de convulsions, cependant les reproducteurs heterozygotes ne developpent pas de phenotype dommageable et les animaux générés seront transférés en procédure dans d'autres DAP à 21jours. Enfin, les animaux pourront ressentir un stress lors des manipulations.
Devenir
En fonction de leur patrimoine génétique, une partie des animaux sera dirigée vers d’autres projets de recherche, en utilisation continue. Les animaux d’élevage et les animaux non porteurs des génotypes d’intérêt seront euthanasiés par une methode réglementaire car ils ne pourront pas être réutilisés dans d’autres projets ou replacés du fait de leur modification génétique.
Remplacement
Le projet vise à maintenir une lignée de souris génétiquement modifiées modèle de la maladie de Pelizaeus Merzbacher, afin de générer des lots expérimentaux pour l’étude d’approches thérapeutique de cette pathologie . Les modèles in vitro (lignées immortalisées/cultures de neurones primaires) nous permettront au préalable de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de nos approches thérapeutiques mais il restera toujours indispensable de valider les résultats obtenus dans un contexte physiologique de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de recourir à des études pré-clinique chez l’animal. La souris représente un modèle pertinent dans notre cas puisqu’un modèle de la maladie de Pelizaeus Merzbacher associé à la mutation génétique que nous voulons cibler a été créé chez cette espèce.
Réduction
Du fait de la nature du projet (élevage), il n’y aura pas de tests statistiques. Nous piloterons notre élevage afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour correspondre à nos besoins stricts pour les projets de recherche et le maintien de notre lignée. Nous prévoyons donc de produire au cours du projet un nombre total maximal de 2250 souris afin de constituer nos cohortes d’étude. Nous contrôlerons les accouplements pour générer uniquement les animaux nécessaires, ainsi, en fonction de nos besoins expérimentaux au cours des 5 années du projet il est possible que nous produisions finalement moins que ce nombre maximal. Les animaux produits seront en utilisation continue dans des projets d’évaluation de thérapies dans lesquels les effectifs par groupe auront été définis à l’aide de tests de puissance statistique afin d’inclure uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. De plus nous inclurons dans ces groupes les mâles et les femelles générées, en effet nous pouvons utiliser les 2 sexes dans ce modèle murin préclinique car la mutation d’intérêt n’est pas liée au sexe comme chez l’Homme, ce qui limitera le nombre d’animaux à produire.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, la procédure a été mise en œuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux seront hébergés en groupe avec un enrichissement, et un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. En cours de procédure une attention particulière est portée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne par la zootechnie et la mise en place de points limites et de soins adaptés. Le prélèvement pour le génotypage est très petit et réalisé sur un jeune animal (moins de sensibilité à le douleur et cicatrisation rapide), c’est un geste rapide et maitrisé qui est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Les reproducteurs seront conservés jusqu'à l'âge de 8 mois pour conserver des capacités de reproduction optimales. Dès que les animaux homozygotes exprimeront le phénotype dommageable, c’est-à-dire à 12 jours environ, nous les surveillerons et mettrons à leur disposition un soutien alimentaire directement dans la cage afin de favoriser leur alimentation. Nous choisirons un schéma d'accouplement entre hétérozygotes afin de limiter l'expression du phénotype dommageable aux animaux nécessaires pour les évaluations thérapeutiques uniquement.
Choix des espèces
Pour notre projet, nous avons besoin d’un modèle de la pathologie afin d’étudier les effets de nos approches thérapeutique de la maladie de Pelizaeus Merzbacher. De nombreux modèles de souris génétiquement modifiés ont déjà été mis au point, et il existe chez la souris un modèle particulièrement pertinent pour cette pathologie que nous avons donc sélectionné pour notre projet. Les animaux reproducteurs seront utilisés de l’âge de 2 mois environ jusqu’à 8 mois. Les petits produits seront prélevés d’un fragment de queue à l’âge de 7 à 10 jours pour connaitre leur patrimoine génétique. Les animaux porteurs des patrimoines génétiques d’intérêt pour nos projets de recherche seront transférés dans ces projets (utilisation continue) à l’âge de 21 jours.
De nouveaux régulateurs impliqués dans l’établissement de la tolérance immunitaire dans le thymus
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
La paralysie part de la queue et remonte le long de la moelle épinière, et le porteur limite la procédure à trente jours pour cette raison. 660 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 570 en sévère, toutes tuées pour analyse. Elles reçoivent des injections sous-cutanées et intraveineuses sous anesthésie gazeuse pour induire une sclérose en plaques, ou des cellules tumorales injectées sur chaque flanc suivies de quatre injections de traitement, avec une mesure quotidienne des tumeurs et une mise à mort au vingt-et-unième jour parce que le modèle devient létal au-delà de trente jours. L'objectif déclaré est d'identifier deux régulateurs de l'éducation des lymphocytes T, avec un bénéfice renvoyé au conditionnel face à une immunothérapie qui, selon le porteur, n'est efficace que chez 20 % des patients.
Objectifs
Les lymphocytes T sont un sous-type de globules blancs qui combattent les virus, les bactéries ou encore les cancers. Ces lymphocytes sont éduqués à ne pas reconnaître nos propres tissus comme des éléments étrangers dans un organe du système immunitaire appelé le thymus. Des dérégulations dans leur éducation peuvent conduire à des maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques ou le diabète de type 1, mais également impacter l’efficacité de la réponse antitumorale. Dans le thymus, les cellules épithéliales médullaires thymiques, appelées mTEC, sont critiques à l’éducation des lymphocytes T. L’identification de régulateurs de l'éducation des lymphocytes T constitue un défi majeur pour améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la protection contre les maladies auto-immunes et les cancers. Dans ce contexte, notre équipe a identifié deux nouveaux régulateurs associés au développement de la sclérose en plaques. Nous avons alors émis l’hypothèse que ces facteurs pourraient contribuer à l’éducation des lymphocytes T. Notre projet visera à 1) caractériser le rôle de ces facteurs dans la protection contre des pathologies auto immunes à l’aide d’un modèle murin de sclérose en plaques ; 2) analyser l’impact de ces facteurs sur l'éducation des lymphocytes T et 3) déterminer l’impact de la déficience de ces facteurs sur la réponse antitumorale. En résumé, l’ensemble de ces travaux de recherche permettra de mettre en évidence la fonction de ces nouveaux facteurs clé dans la protection contre des maladies auto-immunes et l’éradication des tumeurs.
Bénéfices attendus
Les maladies auto-immunes touchent 5 à 10% de la population mondiale. Cependant, face à la complexité de ces maladies, il n’existe actuellement aucun traitement permettant de guérir les patients atteints. Par ailleurs, un défaut d’éducation des lymphocytes T peut également impacter l’efficacité de la réponse antitumorale. La stratégie actuelle utilisée pour booster la réponse des lymphocytes T contre la tumeur est basée sur l’utilisation d’anticorps : l’immunothérapie. Cependant, elle n’est efficace que chez seulement 20% des patients. Identifier les régulateurs de l'éducation des lymphocytes T pourrait constituer une nouvelle stratégie pour améliorer l’éradication des tumeurs et la protection contre les maladies auto-immunes. Ce projet pourrait démontrer que ces régulateurs sont critiques dans la lutte contre des maladies auto-immunes comme la sclérose en plaques et à plus long terme pourrait orienter les médecins vers des tests génétiques plus précis pour un meilleur diagnostic. De plus, ces régulateurs pourraient être impliqués dans l’efficacité de la réponse anti tumorale dans des contextes de tumeurs comme le mélanome ou le fibrosarcome. Notre approche de ciblage de ces régulateurs en combinaison avec une immunothérapie basée sur l’utilisation d’anticorps devrait améliorer l’efficacité des agents thérapeutiques pour améliorer la réponse anti tumorale.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous cutanée sous anesthésie gazeuse générale combinée a une injection sous cutanée d’analgésique (3 minutes par animal). Pour le protocole de sclérose en plaque, ces souris recevront en plus deux injections intraveineuse (3 minutes par animal) sous anesthésie gazeuse générale. Pour les deux types de tumeurs, les souris recevront sur chaque flanc des cellules tumorales par injection sous-cutanée sous anesthésie gazeuse générale (2 injections simultanées, pour une intervention d’environ 3 minutes par animal). Les souris recevront également 4 injections intra-péritonéales de traitement anti-tumoral (30 secondes par injection). Les tumeurs seront mesurées tous les jours post-injection sous anesthésie gazeuse générale (2 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Les injections sous-cutanées et intraveineuses seront réalisées sous anesthésie générale légère par anesthésie gazeuse générale minimisant le stress, l'inconfort et la douleur liés à ces injections. Concernant le modèle de sclérose en plaque, la maladie peut générer des nuisances importantes caractérisées par la paralysie progressive de l’animal en commençant par la queue et remontant le long de la moelle épinière. Pour limiter la durée de souffrance des animaux, ces derniers seront suivis quotidiennement et la procédure n’excèdera pas les 30 jours. Concernant le modèle de sclérose en plaques ainsi que l’immunisation, l’injection sous-cutanée peut éventuellement générer une inflammation locale, qui sera surveillée attentivement de manière quotidienne. La probabilité d’apparition de ces nuisances et leur intensité sont susceptibles d’augmenter progressivement au cours de la procédure et devront être contrôlés. Concernant les modèles de cancer, la maladie peut générer des nuisances caractérisées par un inconfort, une douleur prolongée. Ce modèle pouvant être létal au-delà de 30 jours, les souris seront suivies, mises à mort et analysées à un temps de 21 jours dans le cadre de ce projet. Les nuisances possibles sont : un stress lié à la manipulation, une perte de poids, une gêne à la mobilité, une douleur.
Devenir
Les animaux d'intérêt générés seront mis à mort pour l'analyse à la fin des procédures.
Remplacement
A ce jour, aucune alternative non animale ne permet d’étudier la tolérance immunitaire et les cellules épithéliales thymiques. De plus, cette étude prend place dans un contexte pathologique, à savoir les pathologies auto-immunes et le cancer dans notre cas. Notre projet nécessite une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes tissulaires et cellulaires impliquées dans la réponse étudiée.
Réduction
Nous essaierons autant que possible de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Le choix du nombre animaux est réalisé en prenant en considération la variabilité interindividuelle, la variabilité de réponse au traitement antitumoral et la variabilité de prise et de pousse des cellules tumorales afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Ainsi, des cohortes de 4 à 5 animaux par groupe, selon les procédures, seront utilisées avec un total de trois expériences indépendantes. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront randomisés en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Du coton pour confectionner des nids est introduit dans chaque cage. Les animaleries bénéficient d'une température régulée à 21°C, d'une hygrométrie contrôlée, ainsi que d'une photopériode contrôlée. Concernant le stress de manipulation, les animaux seront manipulés par un seul expérimentateur par lignée sauf pour l’étape de randomisation dans les groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésie gazeuse générale avant chaque injection et mesure. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance quotidienne dès le début des procédures expérimentales afin d’identifier tout signe de gêne ou de douleur à l’aide d’une grille d’évaluation, à l’apparition de signes de douleurs des analgésiques seront administrés. En cas de faiblesse pouvant altérer la prise alimentaire ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Dans le cas du modèle de sclérose en plaques, les souris seront suivies quotidiennement et l’avancement de la pathologie sera mesuré à l’aide d’une grille constatant le niveau de paralysie de l’animal pouvant induire une augmentation de la surveillance à deux fois par jour.
Choix des espèces
L’espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés. La génétique de la souris est bien connue et étudiée depuis longtemps. De plus, la souris est le modèle de base pour étudier le système immunitaire et en particulier le thymus. Ce modèle animal couramment utilisé permet grâce à des techniques d’ingénierie génétique de cibler un gène précis dans un type cellulaire spécifique afin d’étudier sa fonction. Les souris seront utilisées entre 6 et 12 semaines, correspondant à un stade développemental de jeune adulte. A ce stade, le thymus des souris est pleinement développé et atteint sa taille et sa fonctionnalité maximale.
Double sélection puis consanguinisation d’un double modèle de crise épileptique pour étudier la létalité dans l’épilepsie (SUDEP) chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un son intense de cinq secondes à une minute déclenche chez ces souris une crise d'épilepsie réflexe, souvent suivie de la mort. 1 760 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, testées deux fois, à un mois puis à trois mois d'âge, celles qui ne répondent pas aux critères de sélection et survivent au test étant tuées le jour même. Le projet consiste à dériver deux lignées d'une souche déjà construite, l'une dont 100 % des individus feraient une crise mortelle, l'autre dont 100 % survivraient à la crise, pour étudier la mort subite dans l'épilepsie. Le porteur résume les effets subis par les souris à "un stress induit par la stimulation auditive" et écrit que la convulsion, qui dure moins de huit secondes dans 99 % des cas, "n'engendre pas de souffrance intrinsèquement".
Objectifs
Le risque de mort subite chez un patient épileptique (SUDEP) est en moyenne trois fois plus élevé que dans la population saine. Aujourd'hui, on n'en connait pas la raison et beaucoup d'énergie est déployée pour mieux comprendre ce phénomène, chez l'Homme comme chez l'animal. Il existe un modèle de SUDEP chez la souris qui correspond à la présentation d'un son intense qui va déclencher une crise réflexe souvent suivie de la mort. Le bénéfice de ce modèle repose sur le fait qu'il n'est pas invasif et qu'il ne repose pas sur une stimulation électrique ou chimique. Seulement, il présente des inconvénients. Effectivement seules quelques lignées de souris y sont sensibles ; de plus, toutes les souris de ces lignées ne sont pas répondeuses. De surcroît, cette sensibilité s’estompe rapidement avec l’âge. C'est pour cette raison que nous avons développé une lignée de souris qui pallie ce problème. 100 % des souris de cette lignée présente une crise d'épilepsie suivies ou non de la mort. Nous souhaitons aller plus loin et, à partir de la lignée déjà construite, reprendre la sélection pour en dériver deux lignées. Une qui présenterait 100 % de crise létale suite à la stimulation sonore. Et l'autre qui présenterait 100 % de crise non létale suite à la stimulation sonore. C'est le sens de ce projet
Bénéfices attendus
Ce modèle de SUDEP permettra 1/ d'évaluer si les anti-épileptiques ont aussi une capacité à empêcher la létalité qui peut survenir après une crise d'épilepsie ; 2/ d'apporter un modèle de SUDEP utile à la recherche fondamentale.
Procédures
Chaque souris issue de la sélection sera soumise deux fois à un test de crise (à 1 mois et 3 mois d'âge) basé sur une stimulation sonore intense d’une durée de 5 sec à 1 minute, qui provoquera un stress.
Impact sur les animaux
Un stress induit par la stimulation auditif.
Devenir
Les animaux répondant aux critères de sélection seront conservés en vue d'une possible sélection en vue d'être croisées pour obtenir la génération suivante. A chaque génération, le nombre de couples formés sera décroissant de 9 à 1 couples. Ceux non sélectionnables et ayant survécu au test seront euthanasiés le jour même.
Remplacement
Les crises d’épilepsie impliquent un grand nombre de modifications biologiques intégrées. L’animal ne peut pas être remplacé pour la compréhension de ses mécanismes biologiques intégrés.
Réduction
Les souris utilisées classiquement ne répondent pas à 100 % au test de la crise audiogène. Ce qui fait qu’il faut tester 2 à 4 fois plus de souris pour la même fiabilité des résultats. Les souris ainsi créées permettront de réduire le nombre de souris testée. Nous souhaitons tester deux portées issues de chaque couple. Cette stratégie est classiquement utilisée dans les sélections directionnelles puisque cela permet de constituer un échantillon d'environ 15 animaux.
Raffinement
Notre protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser toute souffrance des animaux. Ceci se traduit par une durée limitée du stress auditif (max 60 sec), une utilisation d'une cuve circulaire pour éviter les angles dans lesquels la souris pourrait se cogner. Il faut aussi mentionner que la convulsion en elle- même ne dure pas plus de 8 sec dans 99 % des cas et qu'elle n'engendre pas de souffrance intrinsèquement.
Choix des espèces
Seule la souris présente des crises audiogènes létales ; le rat ne présentant que des crises audiogènes non létales. Les animaux seront testés deux fois, à 30 jours et 90 jours d'âge.
Prélèvements de tissus pour la caractérisation de souris génétiquement modifiés en recherche thématique, avec ou sans phénotype dommageable.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des souris hébergées est immunodéprimée, donc fragilisée face aux infections, ce que le porteur qualifie de phénotype dommageable tout en affirmant que leur bien-être n'en est pas affecté tant que l'hébergement reste adapté. 25 960 souris génétiquement modifiées vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. L'acte déclaré tient en un prélèvement de moins de deux millimètres de queue ou d'oreille, réalisé une fois sur des souris vigiles au moment du sevrage, avec un second prélèvement possible entre cinq et douze semaines si le génotypage échoue. Ces souris passent ensuite en utilisation continue dans d'autres projets, et l'effectif déclaré est calé sur les statistiques des années précédentes, avec une marge prévue pour les projets des cinq prochaines années.
Objectifs
Notre établissement utilisateur élève des animaux génétiquement altérés dédiés à la recherche scientifique dans divers domaines tel que la cancérologie, l'immunologie, neurologie, maladies métaboliques etc. Pour cela, nous utilisons une méthode de prélèvement de queue pour la caractérisation génétique. De plus, nous hébergeons des lignées immunodéprimées caractérisées de phénotype dommageable pour certains projets expérimentaux.
Bénéfices attendus
Les lignées immunodéprimées ont pour objectif de répondre à des questions scientifiques dans le domaine de l’immuno-oncologie ou de surveiller le maintien du statut sanitaire SPF dans le cas des sentinelles. Le génotypage permet la caractérisation génétique des lignées génétiquement altérées avec ou sans phénotype dommageable pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour les projets scientifiques des différentes structures travaillant dans notre animalerie (thématiques développées : cancérologie, digestif, cardiaque, osseux...).
Procédures
Prélèvement de queue (
Impact sur les animaux
La biopsie au niveau de la queue ou de l’oreille peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vue immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptées.
Devenir
Les animaux sont prévus pour une utilisation continue dans divers projets scientifiques. La biopsie de queue ou d'oreille permet le génotypage et en fonction des croisement effectués permettra d'identifier les animaux utiles aux études.
Remplacement
Jusqu’à présent la méthode de biopsie de queue était la plus efficace pour identifier génétiquement les animaux. Cependant nous réfléchissons à mettre en place des méthodes alternatives moins invasives tel que le génotypage via prélèvement de poils, de salive ou de fécès. La difficulté d’une méthode non invasive est qu’elle soit applicable pour tous ce qui n'est pas le cas dans toutes les équipes de recherche. Les animaux immunodéprimés sont nécessaires pour des projets de recherche en immunooncologie. Concernant les sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, ce qui nous affranchirai de l’utilisation des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé est basé sur les statistiques des années précédentes et en lien avec les différents besoins en fonction des projets scientifiques. Ce dernier reste suffisamment important pour pouvoir y inclure de futurs projets d’ici les 5 prochaines années. Nous sommes en cours d'expertise pour développer des méthodes de génotypage moins invasives. Concernant les animaux utilisés comme sentinelles, nous sommes en cours de développement d’une méthode alternative aux animaux de prélèvement par buvard directement au niveau des aérations, cela nous affranchirai de l’utilisation des animaux. Lorsqu’une lignée n’a plus d’intérêt scientifique à moyen ou long terme, nous encourageons l'arrêt de l'élevage de cette dernière associé à une méthode de conservation autre (cryopréservation...).
Raffinement
La biopsie de queue ou la biopsie à l’oreille sont réalisées lors du baguage sur des animaux vigiles. Ces méthodes sont éprouvées, précises, rapides (quelques secondes), standardisées et réalisées par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. En cas de signes de stress ou de douleur, du Douxocalm pourra être appliqué. L’immunodépression fragilise les animaux d’un point de vue immunitaire, mais cela n’impacte pas leur bien être tant qu’ils sont maintenus dans des conditions d’hébergement adaptés avec un statut sanitaire stricte et une fréquence de change rapprochée.
Choix des espèces
Nous avons majoritairement des élevages de souris. Ces animaux sont utilisés en fonction des besoins pour les différents projets scientifiques. Les souris sont prélevées au moment de leur sevrage et identification par bague à l'oreille, 3 semaines après la naissance. La réalisation de l'identification et du prélèvement au même moment permet de limiter les effets indésirables du prélèvement (une seule préhension). En cas de problème technique sur le prélèvement (défaut d'extraction de l'ADN par exemple), un deuxième prélèvement pourra être réalisé entre 5 et 12 semaines.
développement d’un modèle d’obstruction de la veine principale du foie par un caillot sanguin chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
495 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées trois ou sept jours après l'intervention pour l'analyse de leurs tissus. Chacune subit une chirurgie d'une heure au plus sous anesthésie, au cours de laquelle la veine principale du foie est partiellement ligaturée pour provoquer un caillot, avec un risque de saignement, d'infection bactérienne et d'hypertension du foie. Une seconde opération, terminale, permet le prélèvement de sang avant la mise à mort. Le projet vise à mettre au point ce modèle de thrombose porte pour l'étude des syndromes myéloprolifératifs, et le porteur affirme que l'étude des types cellulaires en jeu ne peut avoir lieu qu'au sein d'un organisme vivant, ce qui rend selon lui l'utilisation des animaux non-humains "nécessaire".
Objectifs
Les syndromes myéloprolifératifs sont des maladies où la moelle osseuse produit trop de cellules sanguines. Cette surproduction est souvent causée par une mutation génétique. Environ 30 pourcent des personnes atteintes développent des caillots sanguins, qui peuvent être dangereux. Comprendre comment ces caillots se forment est important pour créer de meilleurs traitements. Une étude pense que certaines cellules, comme les plaquettes, jouent un rôle clé dans ce processus. L'objectif est de créer un modèle pour étudier ces caillots et trouver des traitements plus efficaces.
Bénéfices attendus
Ces expérimentations permettront de développer et de normaliser un modèle de formation d'un caillot sanguin de la veine principale du foie chez la souris et de mieux comprendre de quelle façon la mutation génétique identifiée agit sur le développement de la maladie. A plus long terme, cela permettra également de mettre au point des stratégies thérapeutiques plus efficaces que ceux proposées par la médecine actuelle. De plus, il s'agira d'un nouveau modèle expérimental qui pourra être repris par l'ensemble de la communauté scientifique au service de futurs projets.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie d’une durée d’1h maximum qui va permettre un rétrécissement de la veine du foie par le biais d'une ligature partielle (sténose). Les animaux subiront auparavant un prélèvement veineux de quelques secondes sur animal endormi et certains animaux auront un traitement pharmacologique pour diminuer l'apparition des caillots qui sera administré 24h avant la chirurgie par voie intraveineuse en moins de 10 min. Un guide et du fil de suture seront momentanément en contact avec la veine porte. Il s'agit d'autant de gestes à risques pouvant être à l'origine d'une infection bactérienne. A la fin de l'experience, le sang sera prélevé après une deuxième intervention chirurgicale terminale, sous anesthésie et analgésie.
Impact sur les animaux
La chirurgie peut entrainer une douleur et une irritation post-opératoire au niveau de la cicatrice pourra également se faire ressentir. Un risque de saignement peut avoir lieu chez certaines souris. Cette procédure inclue également un prélèvement sanguin sous anesthésie et qui peut être associé à un risque exceptionnel de lésion occulaire. Un guide et du fil de suture seront momentanément en contact avec la veine porte. Il s'agit d'autant de gestes à risques pouvant être à l'origine d'une infection bactérienne. La formation d'un caillot peut entrainer une hypertension au niveau du foie.
Devenir
3, ou 7 jours après la sténose selon le groupe expérimental, les animaux seront systématiquement euthanasiés sous anesthésie, une fois le prélèvement de sang terminé pour pouvoir faire l’analyse des tissus et du plasma.
Remplacement
L'étude du rôle de différents types cellulaires dans l'apparition de maladie du sang associée à la formation d'un caillot ne peut avoir lieu qu'au sein d'un organisme vivant pour des raisons de complexité physiologique. L'utilisation des animaux est donc nécessaire dans la réalisation de ces travaux.
Réduction
Dans un premier temps, nous allons mettre au point la procédure uniquement sur des souris controles afin de déterminer les conditions optimales pour la formation d'un caillot sanguin tout en limitant les souffrances engendrées aux souris. Ces conditions seront alors appliquées sur les souris génétiquement modifiées. Le nombre d'animaux par groupe a été défini pour obtenir des résultats exploitables avec le minimum d'animaux.
Raffinement
Chaque étape de la procédure sera effectuée par du personnel qualifié. La douleur post-opératoire est traitée préventivement par l'administration d'un anti-douleur en plus de l'anesthésie gazeuse. Un tapis chauffant sera utilisé pendant les opérations, et les animaux seront réveillés sous lampe chauffante dans une cage de réveil avec du papier absorbant à la place de la sciure. Pour prévenir la souffrance, les animaux seront soumis à un suivi post-opératoire avec une grille de score, durant lequel ils seront observés et pesés quotidiennement. Si un point limite était atteint, l'animal serait endormi et euthanasié sans délai.
Choix des espèces
La souris possède de nombreuses similitude avec l'Homme, notamment son système vasculaire, immunologique et cellulaire. Ces similarités en font un bon modèle pour grand nombre de pathologies humaines. Les souris utilisées auront entre 8 et 12 semaines . C'est à cet âge que le modèle de souris mutées a été validé.
Effet de l’inhibition spécifique d’Ezh2 sur la calcification valvulaire aortique
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Privés des cinq sixièmes de leurs reins en trente minutes d'opération, contrôlés quatre semaines plus tard par prélèvement sanguin pour vérifier que l'insuffisance rénale s'est bien installée, puis gavés et échographiés cinq fois, 315 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. La néphrectomie concerne 288 d'entre eux et le porteur la classe sévère, avec une perte de poids attendue après l'opération. L'objectif déclaré est de tester si le blocage d'une enzyme, Ezh2, ralentit la calcification de la valve aortique, sur la base de résultats obtenus in vitro et non publiés. Les rats qui perdent 20 % de leur poids ou dont le score de suivi dépasse 5 sont tués par surdose anesthésique, les autres à l'issue du protocole pour le prélèvement de leurs organes.
Objectifs
Le rétrécissement aortique calcifié (RAC) est la valvulopathie la plus fréquente dans les pays occidentaux et sa prévalence augmente avec l’âge. Elle est caractérisée par une calcification progressive des tissus de la valve aortique. Cependant, il n’existe actuellement aucun traitement pharmacologique permettant de stopper le développement de la maladie. La seule issue thérapeutique consiste en une intervention chirurgicale de remplacement de la valve aortique ou en l’implantation d’une prothèse biologique dans la valve aortique par voie percutanée (TAVI). Nos travaux préliminaires sur modèles cellulaires, au laboratoire, ont montré l'intérêt du ciblage thérapeutique d’une enzyme spécifique appelée Ezh2, afin de réduire les phénomènes inflammatoires liés à la formation de calcifications dans la valve aortique. L’objectif central de ce projet est de comprendre le rôle de cette enzyme dans les processus associés à la calcification valvulaire aortique dans le contexte du RAC, en travaillant sur un organisme biologique complet.
Bénéfices attendus
Dans cette étude nous souhaitons démontrer l'intérêt thérapeutique du ciblage de notre enzyme d'intérêt, Ezh2, pour réduire et ralentir le développement des calcifications valvulaires aortique associées au développement du rétrécissement aortique calcifié.
Procédures
1. Pour l’étude cinétique, prélèvement répété (4 fois par rats) de sang, pour effectuer la cinétique des différentes doses de notre traitement administré par gavage, animal vigile mais contentionné, durée du prélèvement par animal = 1minute, classe modérée 2. Néphrectomie des 5/6ème, durée 30 minutes, classée sévère, une fois au cours de l’étude 3. Pour s’assurer de l’induction de l’insuffisance rénale chronique (IRC), un prélèvement sanguin sera réalisé à la 4ème semaine post-néphrectomie afin de mesurer les paramètres plasmatiques de la dysfonction rénale (créatinine, urée) pour n=288 rats, classe modérée 4. Échocardiographie, 30minutes, classée légère, 5 fois au cours de l’étude.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins entraineront de la fatigue et l’administration du traitement par gavage une prostration de l’animal. La procédure de néphrectomie des 5/6ème est classée sévère. Une perte du poids corporel est attendu après la procédure.
Devenir
Mise à mort dans l'objectif de prélever les organes afin d'étudier sur le plan histologique les effets de la maladie et la réponse aux différents agents pharmacologiques utilisés. Cela permettra de mieux comprendre le développement du rétrécissement aortique et les effets des substances utilisés pour lutter contre le processus pathologique de la maladie.
Remplacement
Des résultats non publiés de notre laboratoire ont montré que le ciblage, in vitro, de l’enzyme épigénétique Ezh2 dans les cellules inflammatoires permet de réduire leur potentiel participant au développement de la calcification de la valve aortique. Dans cette étude nous voulons évaluer, in vivo, dans un système biologique entier, l'effet du ciblage spécifique d'Ezh2 sur les processus associés au développement du RAC. De plus, travailler sur modèle animal est une étape indispensable si l’on souhaite développer par la suite un médicament chez l’Homme.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude nous avons mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo durant la procédure et au moment de la mise à mort. Des mesures non-invasives de la fonction cardiaque ainsi que des analyses histologiques seront mises en place. Le choix des inhibiteurs pharmacologiques de Ezh2 est issu d'expériences préalablement réalisées dans des modèles cellulaires de rétrécissement aortique calcifié. A l'aide d’un logiciel qui s'appuie sur la variabilité statistique des résultats obtenus le nombre d'animaux nécessaire est ajusté. Des animaux des deux sexes seront utilisés dans nos procédures afin de s'affranchir d'un effet du genre.
Raffinement
Les animaux sont hébergés aux normes requises et un enrichissement des cages est mis en place. Des points limites adaptés grâce à notre grille de score s’appuyant sur le comportement de l’animal, son apparence, sa perte de poids (≥20%) et des signes cliniques spécifiques associés à une stratégie d’anesthésie, d'analgésie et de réhydratation seront mise en place avec un suivi quotidien du bien-être animal. Si les points limites sont atteints ou si la somme des paramètres de suivi atteint un score supérieur à 5, la méthode mise à mort prévue est la surdose anesthésique. Pour permettre une meilleure récupération après la chirurgie, l’animal sera placé sous lampe chauffante jusqu’à son réveil dans une cage contenant de la nourriture en gel. Par ailleurs les expérimentateurs auront des contacts pluri hebdomadaires avec les animaux afin de tendre à une habituation.
Choix des espèces
Le choix du rat Sprague Dawley se justifie par l’expérience du laboratoire à la fois pour la chirurgie de néphrectomie mais également pour l’étude des fonctions cardiaque par échocardiographie. Par ailleurs, le rapprochement des espèces humaines et des rongeurs sur le plan phylogénétique rend pertinent le choix de cette espèce en garantissant une bonne extrapolation des résultats chez l’homme. Nous allons inclure des rats mâle et femelle (sexe ratio 1/1) de 10 semaines pour l'étude. La taille des rats à cet âge permet une réalisation facilitée des chirurgies et correspond à un âge habituel dans la littérature pour l'induction du modèle.
Développements méthodologiques en IRM chez le rat et la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 150
Prélevés en priorité parmi les animaux surnuméraires d'élevage, ceux dont le génotype ou le phénotype ne correspond à aucun besoin et qui sont de toute façon destinés à la mise à mort, 150 souris et 150 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Ils passent un examen d'IRM de une à trois heures sous narcose ou anesthésie, avec le cas échéant une injection de produit de contraste et des mesures de glycémie. Le porteur reconnaît qu'un réveil en cours d'examen ou un stress thermique ne peuvent pas être exclus, et indique que les souris et les rats sont tués à l'issue de la procédure. La finalité déclarée est l'amélioration de l'"offre de prestations" de la plateforme d'imagerie, et la rubrique consacrée à la réduction se limite à une phrase, sans justifier l'effectif de 300 animaux non-humains.
Objectifs
Notre plateforme de recherche est spécialisée dans l’imagerie préclinique (IRM) et la spectroscopie (SRM) par résonance magnétique. Les projets menés sur cette plateforme concernent des thématiques en biologie et en santé comme par exemple la cancérologie, la nutrition, les maladies neurodégénratives, la compréhension de pathologies ou encore la validation de nouveaux traitements. Pour améliorer son offre de prestations aux équipes de recherche et aux entreprises, la plateforme est amenée à développer en collaboartion avec les équipes support et utilsatrices, de nouvelles méthodes et de nouveaux protocoles d’IRM et de SRM. Ces développements méthodologiques sont toujours réalisés et validés dans un premier temps sur des objets-test spécifiques. Une fois cette étape de validation atteinte, il est néanmoins nécessaire de valider in-vivo cette fois-ci, ces nouvelles méthodes sur un nombre limité d'animaux. L’objectif de la présente demande n’est pas de se substituer au dépôt d’une demande d'autorisation de projet spécifique.
Bénéfices attendus
Proposer des outils d'imagerie opérationnels en utilsant en prioprité des animaux surnuméraires destinés à être mis à mort, en vue d'étdues plus spécifiques.
Procédures
Les animaux feront l'objet d'un examen d'IRM d'une durée comprise entre 1h et 3h. Les interventions prévues sur les animaux concernent la narcose (isofurane), l'anesthesie et le cas échéant, l'injection intraveineuse ou intrapéritonéal d'un produit de contraste, ou encore de solution saline (NaCl) ou de glucose, ainsi que des mesures de glycémie réalisées sous anesthésie ou narcose avec analgésie locale.
Impact sur les animaux
Malgré les efforts de raffinement (cf. 3.3.6.2) on ne peut exclure, (i) un stress thermqiue dû à l'anesthésie et/ou la narcose ou à certaines séquences d'imagerie (ii) le réveil de l'animal en cours d’examen ou (iii) un stress lors de l'installation de l'animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure. Dans le plupart des cas, des organes pourrant être prélevés à l'issu de la procédure.
Remplacement
Dans la plupart des projets menés par la plate-forme, less développements méthodologiques sont réalisés et validés dans un premier temps sur des objets-test spécifiques. Une fois cette étape de validation atteinte, il est néanmoins nécessaire de valider in vivo ces nouvelles méthodes et protocoles sur un nombre limité d'animaux afin d'optimiser ces nouvelles méthodes aux conditions expérimentales réelles (configuration matérielle nécessaire, posiiton de l'animal, suivi physiologique spécfique, synchronisation aux mouvements respiratiores ou cardiaques).
Réduction
Dans le mesure du possible, les animaux utilsés seront des animaux d’élevage destinés à la mise à mort (car génotype ou phénotype non cibles).
Raffinement
Pendant l'examen, une attention particulière est donnée au maintien de la températrue corporelle des animaux. De plus du gel ophtalmique est utilsé systèmatiquement. Les animaux bénéficient d'un enrichissement social et physique dans la zone d'hébergement. Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une recherche systématique de points limites. Tous les gestes invasifs seront réalisés sous anesthésie générale avec une analgésie ad’hoc.
Choix des espèces
L'IRM de la platefrome est conçue principalemant pour l'imagerie pré-clinique. Le rat et la souris sont les espèces préférentielles des utilsateurs. Le stade de développement sera adapté en fonction du besoin méthodologique, ou en fonction des animaux disponibles si le stade de développement n'a pas d'influence sur le besoin méthodologique..
Etude de l’impact physiologique de l’O2L-001
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
Caractériser un candidat médicament développé par une société privée, l'O2L-001, en vue d'un essai clinique annoncé dans deux ans: 160 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'histologie ou pour quantifier les traceurs injectés. Cinquante d'entre eux reçoivent une injection du produit directement dans le cerveau, cinquante autres dans les ventricules cérébraux, soixante subissent la pose d'un cathéter intraveineux et cent passent une IRM de quatre-vingt-dix minutes. Sur les effets subis par les rats, le RNT tient en une ligne, des douleurs, sans autre précision. Le projet relève à la fois de la recherche fondamentale, du contrôle qualité et des tests réglementaires d'efficacité et de tolérance, pour un produit dont l'entrée en clinique est déjà annoncée.
Objectifs
Cette étude cherche à examiner les caractéristiques d'un nouveau médicament appelé O2L-001, développé par la société Op2lysis pour traiter les hématomes qui se forment après des saignements cérébraux. Ce médicament contient un ingrédient actif nommé OptPA, qui est une version améliorée d'une substance utilisée pour dissoudre les caillots sanguins. L'OptPA a été modifié de manière à être moins toxique et à provoquer moins d'effets secondaires que les traitements actuels. Pour le rendre encore plus efficace, il est mélangé avec un matériau spécial appelé Poloxamère 407. Ce matériau se comporte comme un liquide lorsqu'il est injecté, mais se transforme en gel à la température du corps (37°C) pour libérer le médicament lentement dans l'hématome, aidant ainsi à dissoudre le caillot plus efficacement. L'objectif principal de cette recherche est d'en savoir plus sur les propriétés de l'OptPA et de comprendre comment O2L-001 fonctionne dans le corps.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances sur l'O2L-001 et sur son principe actif l'OptPA. L'O2L-001 est une nouvelle génération de thrombolytique qui vise à être testé en clinique d'ici 2 ans pour le traitement et l'évacuation des hématomes formés suite à un AVC hémorragique.
Procédures
1- Pose de cathéter intraveineux pour injection d’OptPA, tPA ou NaCl (30 minutes/animal, n=30 animaux) 2- Pose de cathéter intraveineux pour récupération de sang (30 minutes/animal, n=30 animaux) 3- Injection intracérébral d’O2L-001, de Nacl ou O2L-001+Gadolinium (1h/animal, n=50 animaux. 4- Injection intraventriculaire d’O2L-001, de Nacl ou O2L-001+Gadolinium (1h/animal, n=50 animaux) 5- IRM (90 minutes environ, n=100 animaux) 6- Imageur IVIS® (5 minutes environ, n=20 animaux)
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre chez les animaux seraient des douleurs.
Devenir
Les animaux feront l'objet d'une mise à mort, soit, afin de générer des tissus permettant des observations histologiques, soit, pour quantifier les traceurs injectés.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Le rat est l’une des espèces les plus utilisés dans les études de pharmacocinétique et de pharmacodynamique. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 160 rats seront nécessaires pour réaliser cette étude et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrales et d’étudier la distribution du produit permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux : 160 animaux) a été évalué via un test statistique.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad lithium. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le réveil des animaux à l’issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu’à l’obtention d’un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placé sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour accès plus simple à l’alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d’expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température de la salle d’expérimentation est contrôlée et adaptée au bien être des animaux.
Choix des espèces
Le rat est l’une des espèces animales les plus utilisées pour les études de pharmacodynamique et de pharmacocinétique. L’anatomie du système nerveux ainsi que la physiologie du rat sont également documentés et relativement proches de ceux de l’Homme. C’est donc via l’utilisation d’approches expérimentales fiables et maitrisées, que le rat représente un bon modèle pour ce projet de recherche. En effet, l’ensemble des connaissances dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement adéquate à cette étude. Les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte, ce stade est adapté aux études de pharmacocinétique et pharmacodynamique.
Rôle du thalamus médian dans la synchronisation des aires corticales pendant le sommeil profond chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie de trois à six heures pour implanter dans le crâne des dispositifs d'enregistrement et de stimulation, puis le port d'un implant de trois grammes: 250 souris transgéniques vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles sont ensuite manipulées chaque jour pendant dix à trente jours, environ trente minutes par jour, pour des tâches de mémoire et d'association. Le porteur écrit que ces souris ne présentent pas de phénotype dommageable, ce qui selon lui "suggère qu'elles ne souffrent pas de la présence du transgène", et présente la complexité de ses chirurgies comme un raffinement puisqu'elle produit davantage de données par animal. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Les objectifs de cette étude sont 1- d’élucider les mécanismes qui permettent la synchronisation des activités neuronales entre des aires cérébrales distantes pendant le sommeil profond et 2- de déterminer l’importance de cette synchronisation dans la consolidation de la mémoire.
Bénéfices attendus
Le bénéfice direct de cette étude est l’amélioration des connaissances, dans deux domaines, 1- les mécanismes de base du sommeil profond, et 2- le rôle du sommeil profond dans les processus d’apprentissage et de mémoire. En plus de ce bénéfice direct, les bénéfices indirects de cette recherche fondamentales sont 1- découvrir une nouvelle région cible pour le traitement des troubles du sommeil profond, 2- mettre en évidence l’importance relative des différentes phases du sommeil pour l’apprentissage et la mémoire. 30% de la population européenne est en déficit chronique de sommeil et ceci a de nombreuses conséquences sociales et économiques. Le manque de sommeil est en effet associé à une augmentation des risques d’accidents, mais aussi a un risque accru de souffrir de nombreuses pathologies comme la dépression, l’anxiété, l’obésité, etc. D’autre part la majorité des troubles psychiatriques et des maladies neuro-dégénératives sont associées à des sommeils détériorés qui amplifieraient les symptômes. De plus en plus d’études suggèrent que le sommeil pourrait jouer un rôle important dans l’étiologie de ces pathologies. Il est donc de première importance de comprendre le fonctionnement du sommeil en conditions physiologiques et pathologiques pour ajouter une corde à l’arc thérapeutique.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie consistant en l'implantation d'équipements d'enregisterment et de stimulation miniaturisés. La chirugie d'implantation dure 3-6 heures. Une fois la chirurgie effectuée, les animaux seront hébergés en groupe et libres de leurs mouvements. Les animaux font ensuite des tests comportementaux consistant en des apprentissages de mémoire et d'association stimulus-action nécessitant leur manipulation quotidienne pendant 10 à 30 jours à raison d'environ 30 minutes par jour.
Impact sur les animaux
Cette étude sera effectuée grâce à l’utilisation de souris transgéniques. Le fait de naître transgénique est en soit un potentiel effet indésirable pour les animaux. Néanmoins, les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable, suggérant qu’elles ne souffrent pas de la présence du transgène. Les souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale. Le niveau de douleur de cette procédure est modéré et sera atténué par un analgésique pré-opératoire et des analgésiques pendant les 5 jours post-opératoires. La déshydratation pendant la chirurgie sera prévenue par injection de saline. Après les 5 jours post-opératoires, les animaux seront progressivement habitués à être restreint de leur mouvement pendant une brève période dans la main de l’expérimentateur. Une fois les animaux habitués à la contention, leur implant sera connecté au système d’enregistrement (caméra et/ou préamplificateur). Le poids total de l’implant + équipement est d'environ 3 g. Ce poids peut occasionner une gêne pour l’animal ainsi qu’un stress les premiers jours. Pour limiter cela, les animaux seront habitués sur 2-8 jours au port des équipements pendant des périodes de plus en plus longues 2-5 fois par jour. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés en groupe. Néanmoins, il est possible que le stress induit par la chirurgie ou la contention rende les animaux agressifs entre eux. Une manipulation très progressive sera effectuée afin de limiter au maximum les situations où les animaux devraient être séparés. Néanmoins, en cas d’agression, les animaux seront hébergés dans des cages larges avec une grille séparant deux compartiments qui permettent d’héberger deux animaux dans un environnement contigu tout en empêchant les agressions.
Devenir
A l'issue de ce protocole expérimental, les souris seront euthanasiées. En effet, il est essentiel de prélever leur cerveau afin d'effectuer des analyses complémentaires.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet combine étude du comportement de la souris pendant une tâche d’apprentissage mnésique et enregistrement de la synchronisation des aires corticales. Il est à ce jour impossible de mimer un apprentissage mnésique dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connections entre les différentes aires corticales.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques se basant sur des linear mixed models qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. De plus, chaque animal sera enregistré en situation contrôle et de test afin de pairer les résultats ce qui les rend plus puissants.
Raffinement
Le haut niveau de complexité des chirurgies effectué sur ces animaux permet de générer un grand nombre de données par animal et de maintenir une haute qualité d’enregistrements pendant des mois. Dans ce projet, je combinerai les techniques d’imagerie chez l’animal libre de ses mouvements et les enregistrements électrophysiologiques ce qui permettra de réduire encore le nombre d’animaux et d’obtenir des données encore plus riches puisque combinant deux techniques de pointe sur le même animal. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés. En effet, le stress induit par les contentions et les enregistrements conduit souvent les animaux à devenir agressif et à se battre. Néanmoins, l’isolement est également un stress majeur pour les souris, j’ai donc raffiné les étapes d’habituation et de contention afin de limiter le stress des animaux, et ceci me permet de maintenir les animaux au minimum par deux.
Choix des espèces
Ce projet requiert l’utilisation de souris transgéniques. Il n’existe pas de méthode alternative pour étudier un phénomène physiologique aussi complexe que la synchronisation des oscillations cérébrales. La souris possède une architecture du sommeil très similaire à celle de l’humain avec l’alternance de phases de sommeil profond et paradoxal. Pendant le sommeil profond, on observe des phases de haut niveau de synchronisation très proches de celles observées chez l’humain. La diversité des modèles génétiques existants chez la souris permet tout un panel de manipulation de l’activité neuronal dans des types cellulaires donnés. Mon étude vise à déterminer comment différents types de cellules sont impliqués dans la synchronisation des oscillations. L’utilisation de souris transgéniques spécifiques permettra de répondre à ces questions. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines quand la boîte crânienne a atteint sa taille adulte. Les chirurgie seront effectuées entre 8 et 20 semaines et les enregistrements entre 10 et 35 semaines. En effet, ce projet vise à étudier les oscillations chez des animaux adultes non âgés.
Caractérisation du comportement de tétée chez le nouveau-né de la souris modèle du syndrome de Prader-Willi et rôle de l’ocytocine dans ce comportement.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Des souriceaux nouveau-nés séparés de leur mère jusqu'à quatre heures, stimulés au pinceau puis au laser infrarouge au niveau du tronc cérébral: 708 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, tuées pour des analyses post-mortem. Les mères reçoivent des injections intrapéritonéales d'anesthésique et se voient retirer une partie de leur portée. Le projet cherche à comprendre pourquoi les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi tètent mal et comment l'ocytocine rétablit la tétée, un essai clinique de phase 3 étant déjà en cours chez des bébés. Trente femelles sont réutilisées pour quatre à cinq portées avant d'être tuées, et 312 autres souris sont utilisées pour la reproduction de huit lignées puis tuées vers l'âge de six mois.
Objectifs
Ce projet porte sur la compréhension de mécanismes physiopathologiques impliqués dans la tétée chez des souris modèles d’une maladie rare (le syndrome de Prader-Willi) et le rôle d’une hormone qui restaure une activité de tétée normale. En effet, il a été montré qu’il y a un dysfonctionnement de l’activité de tétée chez les souris modèles d’une maladie rare, tout comme cela a été observé chez les bébés Prader-Willi et que l’administration de l’hormone étudiée rétablie une tétée normale chez ces souriceaux. Ces études précliniques ont engendré des essais cliniques (PhaseI/II) chez des enfants atteints du syndrome de Prader-Willi, il résulte une amélioration (voire normalisation) de l’activité de succion. Toutefois le mécanisme d’action de cette hormone dans l’activité de tétée n’a jamais été investigué Les études associées à ce projet permettront d’identifier les altérations sensorielles ou motrices lors de la tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi, d’étudier comment l’hormone étudiée restaure une tétée normale chez ces souriceaux et quelles régions du cerveau sont activées, et donc d’argumenter l’intérêt d’utiliser cette hormone et définir les conditions optimales pour traiter les bébés Prader-Willi. Ce projet comprend 6 procédures. Au total, 708 souris, dont 678 issues de 164 croisements que nous effectuerons et 30 femelles provenant d'un fournisseur agréé, seront expérimentées.
Bénéfices attendus
Les bébés Prader-Willi présentent dans plus de 95% de cas un déficit de l’activité de tétée qui nécessite une intubation de quelques semaines. Cette intubation peut avoir des conséquences sur le développement et le comportement de ces enfants. Nos études précliniques ont montré que l’administration sous-cutanée d’une hormone (une seule administration à la naissance), permet de restaurer une activité normale de tétée chez les souriceaux modèles du syndrome de Prader-Willi et une amélioration dans le comportement cognitif et social de ces souris plus tardivement. A partir de ces études précliniques, une étude clinique de phase I/II a été mené chez des bébés Prader-Willi montrant une normalisation de la tétée chez ces bébés; une étude clinique en phase 3 est en cours. Il s’agit ici d’un projet qui est focalisé sur la tétée pour comprendre quelles sont les altérations mécaniques ou sensorielles qui empêchent les souriceaux modèles du Syndrome de Prader-Willi de téter normalement et comment une administration de l’hormone étudiée agit sur le plan fonctionnel (sensoriel ou moteur) et sur l’activité neuronale du cerveau pour rétablir une tétée normale chez ces souriceaux. Ce projet amènera : 1) une compréhension des mécanismes fonctionnels et cellulaires du déficit de la tétée dans un modèle du syndrome de Prader-Willi et par extension chez les bébés Prader-Willi ; 2) de mieux comprendre, en général, les mécanismes sous-jacents à l’activité de tétée qui est très peu étudiée ; 3) d’élucider comment l’administration de l’hormone étudiée corrige ce déficit; 4) plus généralement elle nous révèlera le rôle du de tout un système hormonal dans la tétée et cela nous permettra d’envisager d’élargir le traitement à des bébés qui présentent un déficit de tétée à la naissance (soit 10% des nouveau-nés). Les résultats attendus permettront donc de comprendre et de proposer un traitement approprié (en connaissance de cause) du déficit de tétée chez les bébés Prader-Willi mais aussi dans d’autres pathologies qui présentent un déficit de tétée. Cet aspect translationnel est vraiment très important.
Procédures
Sur les mères, les interventions sont : Les injections intra-péritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes. La séparation avec une partie de leurs nouveau-nés pour quelques heures (même si une partie des nouveau-nés restent avec elles). Sur les nouveau-nés, les interventions sont : Les injections sous cutanée sur les nouveau-nés. L’isolement de la portée de souriceaux de leur mère pendant 4 heures maximum. La manipulation des souriceaux pendant le test de saisie de tétine, La stimulation tactile des nouveau-nés à l’aide d’un pinceau. La stimulation externe (au niveau du tronc cérébral) de nouveau-nés à l’aide d’un laser Infra-rouge (peu énergétique) faite sur animaux non contraints Sur les souris génétiquement modifiées lors du maintien de lignée : caudectomie ; tatouage Il n'y a aucune procédure chirurgicale dans cette DAP. Un prélèvement de queue sera effectué sur animaux vigiles dans le cadre du génotypage si le génotypage ne fonctionne pas à partir d’une touffe de poils prélevée sur l’individu (des mises au point sont en cours) mais concernera au grand maximum 312 souris.
Impact sur les animaux
Les injections intra-péritonéales d’anesthésique sur femelles allaitantes peuvent représenter, comme toute injection, une nuisance par leur caractère douloureux. Malgré le temps très court de cette nuisance (
Devenir
Pour l’ensemble des animaux expérimentés en Procédures 1, 2, 4, 5 la mise à mort est justifiée par des analyses post-mortem sur des tissus prélevés. Procédure 3: 30 femelles réutilisées qui, après une première portée, seront utilisées deux fois dans notre étude et pourront aussi être utilisées comme génitrices 2 fois supplémentaires. Après 4 à 5 portées, les femelles seront euthanasiées. Procédure 6: 312 souris seront utilisées comme géniteurs (rices). Il s’agit du maintien de 8 lignées sur 4 ans et d’animaux qui seront géniteurs pour produire les animaux qui seront expérimentés. Ces animaux seront euthanasiés à l’âge adulte vers 6 mois.
Remplacement
Ce projet porte sur la physiologie et physiopathologie de la tétée qui est altérée dans la majorité des maladies neurodéveloppementales et en particulier dans le syndrome de Prader-Willi, qui est notre sujet d’étude. Il n’y a, à ce jour, aucune alternative à l’utilisation de mammifères pour conduire ce type d’étude. La stratégie de l’équipe a consisté en particulier à travailler sur le modèle de souris génétiquement modifié (qui mime ce déficit de tétée) et nous prenons en compte les analyses faites en parallèle sur les bébés Prader-Willi afin d’apporter le maximum de réponses pour comprendre les mécanismes mis en jeu en situation normale et pathologique et, ainsi, mieux traiter les patients.
Réduction
L'utilisation de souris qui sont identiques sur le plan génétique (ici une souche particulière de souris de laboratoire) permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisés. Les tests comportementaux présentent par nature une variabilité interindividuelle importante, encore plus avec les souriceaux à la naissance. Nous utiliserons des femelles qui ont déjà donné naissance à au moins une portée, pour favoriser le comportement maternel et ainsi optimiser le taux de survie des souriceaux. Notre importante expérience pour les tests de comportement depuis plus de 10 ans montre qu’il est généralement nécessaire d’utiliser des effectifs de 15-20 animaux par groupe, dans le test de saisie de tétine, pour valider la démarche statistique. En ce qui concerne les expériences pour étudier l’anatomie du cerveau ou l’activité électrique de neurones, nous utiliserons 6 animaux par condition. Le fait de ne pas distinguer les souriceaux mâles et femelles dans nos analyses (les travaux antérieurs ne montrent pas d’effet sexe sur le comportement de tétée) nous permet de diminuer de moitié le nombre de portées étudiées.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, dépourvu de pathogènes spécifiques. La température et l’hygrométrie sont contrôlées, avec un cycle de lumière de 12h. Les cages enrichies avec du matériel de nidification (dôme et coton) et la présence d'objets (cylindre carton). Les souris sont entre 2 et 4 par cage, mais pas isolées ou exceptionnellement mais moins de 48 heures. La douleur/souffrance des animaux adultes et souriceaux est évalué quotidiennement via l'observation de leur aspect (poil hirsute, position voutée, yeux fermés) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation, ou déplacement la pointe des pattes) en suivant la Grille de Score. Les souriceaux qui réaliseront le test de saisie pourront être isolés de leur mère pendant 20min à 1h. Pendant le temps de séparation de leur mère, les 4 souriceaux seront déposés dans un bac approprié, avec une partie de la litière et du nid de la cage maternelle (pour maintenir les odeurs maternelles) et en posant ce bac sur une plaque chauffante à 38°C pour maintenir le nid à 36°C malgré l’absence de la femelle et ainsi éviter un stress thermique des souriceaux. Sachant que seul 4 petits par portée seront testés, la mère reste dans la cage avec n-4 souriceaux (n étant le nombre de nouveau-nés), ce qui permet de diminuer le stress éventuel de la mère. Lors des injections sur les souriceaux au jour de la naissance et lors du tatouage des animaux de la procédure 6, un analgésique sera appliqué sur la peau pour diminuer la sensation de douleur.
Choix des espèces
L’étude que nous menons, dans le contexte pathologique, sur les déficits de tétée et l’effet de l’ocytocine dans des conditions physiologiques et pathologiques ne peut pas être menée sur des modèles in vitro ou via des modélisations. Cette étude évalue des paramètres de comportement de tétée ainsi que l’anatomie du cerveau. Il est donc nécessaire d’étudier des mammifères, en particulier des modèles de souris de la maladies rare qui nous intéresse mais aussi d’avoir la possibilité de travailler sur des modèles de souris génétiquement modifiés. A ce jour, la souris est donc le modèle le plus adapté à ce type d’étude. Les stades choisis sont le jour de la naissance car le déficit de tétée observé chez les bébés Prader-Willi démarre à la naissance (tout comme dans le modèle souris étudié) et des souris femelles adultes, mères des nouveau-nés étudiés, sont aussi expérimentées.
Etude de l’activité cérébrale par photométrie chez la souris atteinte de douleur chronique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Les 420 souris subissent une chirurgie de 40 minutes pour implanter une fibre optique dans le cerveau, et la douleur chronique est provoquée sous anesthésie par une lésion de nerf (SNI) ou une injection de CFA, avec une douleur modérée et des troubles anxiodépressifs annoncés pendant environ six semaines ou une semaine selon la méthode. Élevées sur place, ces souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à la fin du projet pour prélever leur cerveau et, selon le porteur, "afin de leur éviter toute souffrance inutile". Pendant 4 à 11 semaines, elles passent des séances de photométrie d'environ trois heures et des tests de comportement deux jours par semaine, pour repérer quelles régions du cerveau s'activent sous une stimulation mécanique ou thermique selon que la douleur vient d'un nerf lésé ou d'une inflammation. Le texte ne nomme pas ces tests de douleur, et annonce un prélèvement du cerveau pour analyser "l'expression virale" sans qu'aucune injection de virus figure parmi les procédures.
Objectifs
Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les structures cérébrales activées ? Diffèrent elles selon si l'origine de la douleur apparait suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique? En utilisant de l'imagerie fonctionnelle chez des souris atteint de douleurs neuropathiques ou inflammatoire, nous effectuerons différentes stimulation mécanique ou thermique afin de déterminer les régions cérébrales activées dans ces deux types de douleur chronique selon la nature du stimulus effectué et ainsi déterminer si les circuits cérébraux différent selon l'étiologie de la douleur.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de comprendre les structures cérébrales impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoire selon les modalités sensorielles mobilisées.
Procédures
Tous les animaux (n=420) subieront une procédure chirgicale afin d'implanter dans le cerveau une fibre optique. Cet acte dure environ 40 minutes. Les animaux seront ensuites analysés par photométrie pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 4 à 11 semaines, chaque séance durant environ 3h. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale
Impact sur les animaux
La chirurgie SNI entraine une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 6 semaines. L'injection de CFA entraine une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 1 semaine. L'implantation des canules induit une douleur modérée pendant environ 24h.
Devenir
Les souris douloureuses chroniques seront euthanasiées à la fin de la procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.
Remplacement
Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux génétiquement modifiés permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par photométrie.
Réduction
Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement, en accord avec le décret n° 2011-1177 du 23 septembre 2011 relatif à l'utilisation confinée d'organismes génétiquement modifiés. Les animaux sont stabulés dans des cages individuelles contenant au maximum 4 males ou 5 femelles et situés dans des portoirs ventilés, thermorégulés (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois toutes les 2 semaines. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé (lumière de 19h à 7h). Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.
Choix des espèces
Limplantation de fibres optiques permettant de mesurer l'activité du cerveau est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modéle souris en lien avec les données préliminaire obtenue au laboratoire. Adultes (P21-100) pour comparaison avec les autres données de la littérature
Rôle des voies de réponse aux défauts de l’homéostasie protéique dans la réponse aux traitements de chimiothérapie dans des modèles murins de cancers MSI (Instabilité des MicroSatellites)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Toutes tuées à l'issue, une partie sans même être analysée puisqu'elle ne sert qu'à l'entretien de la lignée, 384 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris transgéniques développent spontanément des lymphomes et des adénocarcinomes intestinaux dans leur première année de vie, avec grossissement de la rate, du thymus et du foie, occlusions intestinales et amaigrissement. Elles reçoivent jusqu'à quarante injections intrapéritonéales sur huit mois, vigiles, et alternent chaque mois deux semaines de régime gras et deux semaines de régime standard, cette alternance servant à faire apparaître plus souvent le type de tumeur étudié. Le porteur affirme qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et conclut qu'il est "nécessaire" de travailler in vivo.
Objectifs
Les cancers MSI (pour microsatellites instables), sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par la perte de l’activité du système de réparation de l’ADN appelée MMR (pour MisMatch Repair). Dans ce type de tumeurs, nous avons rapporté l’effet d’une mutation dans un gène codant pour une protéine dont le rôle est de protéger la cellule d’agressions et stress. La mutation de ce gène présente dans 25 pourcents des tumeurs des patients atteint de cancer MSI, affaiblis la cellule tumorale, tandis que son absence est associée à une résistance des tumeurs aux traitements de chimiothérapie. Avec ce projet nous voulons trouver une nouvelle piste thérapeutique pour les patients atteints de cancer MSI qui présente une mutation dans ce gène et qui donc est résistante à la chimiothérapie. Nous espérons expliquer comment les cellules tumorales utilisent cette protéine pour se défendre des dommages induits par les agents de chimiothérapie. Dans ce projet, nous testerons l'hypothèse selon laquelle la perte de fonction de la protéine influence la sensibilité des cellules tumorales aux chimiothérapies via la modulation de l'activité métabolique de la cellule. D’un point de vue fondamentale ce projet vise à améliorer nos connaissances des mécanismes de résistance à la chimiothérapie de certaines cellules tumorales. D’un point de vue clinique ce projet ouvre à terme des nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de patients atteints de cancers coliques de type MSI.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’élucider dans un point de vue fondamentale et clinique, le rôle du métabolisme dans la réponse à la chimiothérapie des patients atteints de cancers coliques de type MSI (pour Microsatellites instables). Les cancers MSI (pour microsatellites instables), sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par la perte de l’activité du système de réparation de l’ADN appelée MMR (pour MisMatch Repair). Des préliminaires montrent que dans environs 75 pourcents de ces types de tumeurs, le métabolisme et la protéostasie c’est-à-dire la biogenèse, le repliement, le trafic et la dégradation des protéines, seraient associé à une mauvaise réponse au traitement de chimiothérapie et ceci via une protéine spécifique que nous étudions ici. Les résultats que nous obtiendrons ouvriront à terme des nouvelles pistes thérapeutiques pour ce type de cancer
Procédures
Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. Les animaux recevront un régime riche en gras à raison de 2 semaines par mois et retrouveront un régime classique les 2 semaines suivantes tout au long du projet. Les animaux recevront différents traitements par injections intrapéritonéales sur animal vigile à raison de 5 injections par mois pendant maximum 8 mois (soit 40 injections maximum). Dès l’apparition de signes évocateurs du développement d’une tumeur, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements pour répondre à la question scientifique.
Impact sur les animaux
Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. Les effets indésirables sont donc principalement liés à ce développement tumoral. Les principaux symptômes du lymphome sont une augmentation de la taille des organes comme la rate, le thymus et le foie ainsi que dans certains cas des ganglions qui se manifeste généralement par une prise de volume au niveau abdominale/cou. Pour l’adénocarcinome intestinal, il s’agit d’une tumeur qui reste localisé et n’envahi pas les tissus/organes à distance (pas de métastase). Les souris dans ce contexte peuvent faire des occlusions intestinales qui se manifeste généralement par un amaigrissement. L’alternance entre régime standard et régime riche en gras pourra induire un léger stress en raison du changement d’alimentation (néophobie de la souris). L’administration des différents traitements par injection intrapéritonéale pourront induire un stress et une douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille. Les traitements devraient réduire les effets liés au développement tumorale (lymphome et adénocarcinome) avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités.
Devenir
À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires adaptée afin de prélever des tissus pour analyse. Une partie des animaux ne seront pas analysés puisqu’ils seront euthanasiés dans le cadre de l’entretien de la lignée.
Remplacement
La mise en œuvre de ce projet n’est aujourd’hui possible que grâce à l’obtention préalable de données in vitro. A ce stade de nos recherches, il est important tester notre hypothèse sur un modèle in vivo afin d’ouvrir à terme une nouvelle piste thérapeutique. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Dans le cas d’un projet qui vise à étudier l’effet d’une nouvelle molécule et l’implication du métabolisme dans la réponse à la chimiothérapie, il est nécessaire de travailler sur un modèle in vivo car mieux adaptés à l'observation des effets globaux sur un sujet vivant et en particulier pour ce qui concerne l’initiation et la progression tumoral ainsi que les effets autres qui pourraient se manifester sur l’organisme.
Réduction
Le projet impliquera un total de 384 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. En effet, en se basant sur les données de la littérature nous avons choisi de mettre en une étude séquentielle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Dans un premier temps, un premier lot d’animaux sera inclus pour définir la concentration optimale des traitements. Dans un second temps, nous évaluerons l’impact de ces traitements à leur concentration optimale sur nos modèles transgéniques. Cette stratégie permettant de réduire significativement le nombre d’animaux impliqués. De plus, l’utilisation de la stratégie du riche en gras de manière alterné permet d’accroitre la fréquence du développement de l’un des types de tumeur qui nous intéresse, ce qui permet de réduire la taille des groupes à 20 souris. Il apparait nécessaire de mettre en observation 20 souris par groupe pour espérer mettre en évidence un impact significatif du traitement dans le cadre de notre expérience en restant respectueux de la règle des 3R. Nous utiliserons différents tests statistiques pour l’interprétation fiable de nos résultats.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite). Les contraintes induites par le manipulateur dans ce protocole sont faibles (uniquement l’injection des traitements). Elles sont réalisées par du personnel formé et compétent et avec du matériel adapté en condition stérile. Durant les phases de traitement la surveillance sera augmentée afin de mettre en évidence toute intolérance liée au traitement. Un suivi pondéral des animaux sera réalisé afin de mettre en évidence une éventuelle perte/prise de poids. La principale douleur pouvant être subit par les animaux concerne surtout le développement naturel des tumeurs. Ainsi, grâce au suivi et à la très bonne connaissance des modèles murins utilisés, nous pouvons détecter les premiers signes d’un développement tumoral. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : Les souris sont des animaux modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Pour notre projet, l'utilisation des modèles murins est la seule approche permettant d'intégrer le développement tumoral MSI et la complexité de la réponse aux traitements de chimiothérapie. Justification des stades : Les études se feront avec des animaux adultes. Les animaux impliqués dans la mise au point des traitements seront des animaux commerciaux utilisées à partir de 8 semaines de vie. Nous avons choisi cet âge pour tester la toxicité du traitement sur des animaux relativement jeunes afin d’envisager pour la dose un traitement préventif si besoin. Les modèles animaux qui développent des tumeurs spontanément rentreront dans le protocole de traitements à partir d’environs 8-10 semaines. Les souris auront alors atteint un poids et une taille favorable pour pouvoir bien supporter le traitement de chimiothérapie. De plus, grâce à notre expérience de ces modèles, nous savons que l’âge moyenne d’apparition des signes cliniques liés au développement de la pathologie est de 180 jours, ainsi la mise en œuvre d’un traitement à partir de 8-10 semaines nous permettra d’évaluer l’efficacité d’un traitement curatif ainsi que préventif.