Rongeurs

650 rats vont être utilisés, chacun logé seul en cage pour que sa consommation alimentaire soit mesurée, quatre jours par semaine pendant six semaines, avec deux heures de retrouvailles quotidiennes ou un week-end en binôme. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue. Jeûne de quinze heures, privation d'eau de six heures, sept passages au maximum dans des tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, jusqu'à cinq prises de sang, quarante-huit heures en cage de collecte d'urines et de fèces, et pour quarante rates deux traites manuelles sous anesthésie après trois heures de séparation de leurs petits. L'enjeu déclaré est d'évaluer les effets de la végétalisation de l'alimentation humaine sur le métabolisme et le comportement, les résultats devant alimenter une collection de données utile aux pouvoirs publics.

Objectifs

La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.

Bénéfices attendus

Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.

Procédures

Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.

Impact sur les animaux

Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.

Remplacement

L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.

Réduction

A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.

Raffinement

Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.

Récupérées parmi les femelles dont d'autres projets n'avaient pas besoin, au lieu d'être tuées au sevrage, 50 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rasage de la face ventrale sous anesthésie, incision au cou pour atteindre la veine jugulaire et l'artère carotide, injection de nanoparticules, dix minutes d'ultrasons appliqués sur le thorax, sutures, imagerie : une trentaine de minutes par animal. Toutes sont ensuite tuées pour que le cœur soit prélevé et analysé. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à un "organisme entier" pour suivre la distribution des molécules injectées, et qualifie d'"indispensable" la preuve de concept chez le petit animal avant tout passage au gros animal puis à la clinique.

Objectifs

Les arythmies cardiaques ventriculaires sont la principale cause de mort subite cardiaque. Chaque année, environ 250 000 personnes sont victimes de mort subite en Europe. De manière générale, les résultats de l’ablation de tachycardie ventriculaire par cathéters (stratégie actuellement utilisée en clinique) sont mauvais avec environ 50% de récidives. Nous souhaitons développer une méthode permettant de réaliser une ablation combinant différentes stratégies. Pour cela, il est envisagé une délivrance de molécules thérapeutiques encapsulées dans des nanoparticules, facilitée par l’ouverture préalable de pores dans la barrière vasculaire grâce à l’utilisation de microbulles et d’ultrasons, pour permettre aux nanoparticules d’atteindre la cible cardiaque avec une forte concentration et d’ainsi augmenter leur efficacité.

Bénéfices attendus

L’intérêt de la démarche est d’améliorer le pronostic des patients souffrant de tachycardie ventriculaire en traitant sélectivement la région cardiaque responsable de l’arythmie, de façon plus efficace et sécuritaire que les techniques actuelles. De manière plus large, ce projet pourra ouvrir des perspectives d'application au-delà du traitement des arythmies cardiaques ventriculaires (traitement de maladies génétiques, protection du cœur après un infarctus).

Procédures

Tous les gestes potentiellement douloureux seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie (2 maximum par animal). Dans ce projet, tous les animaux seront rasés sur la face ventrale sous anesthésie générale pour des raisons d'imagerie (1 par animal, environ 2min). Des incisions sous-cutanées seront réalisées pour l'analgésie (3 maximum par animal) Des incisions seront réalisées au niveau du cou pour accéder aux vaisseaux (veine jugulaire, artère carotide) afin d’injecter les traitements (2 injections maximum par animal). Un appareil générateur d’ultrason sera appliqué sur le thorax de l’animal afin d’envoyer les ultrasons au cœur (1 par animal, environ 10 min). 3 points de sutures par animal seront réalisés pour suturer l'incision réalisée. Les animaux seront imagés sous anesthésie générale (1 par animal,

Impact sur les animaux

Il s’agit d’une approche impliquant une chirurgie légère (pour accéder à la veine jugulaire et à l’artère carotide), une administration intraveineuse de nanosystèmes non toxiques et l’application ciblée (thorax) d’ultrasons non délétères. Le rasage de la face ventrale de l'animal peut occasionner du stress chez l'animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre le prélèvement du cœur et l’analyse (histologie) des tissus afin de confirmer l’efficacité de la thérapeutique étudiée.

Remplacement

Il est nécessaire de recourir à un organisme entier pour étudier le profil de distribution des molécules injectées et évaluer l'efficacité de l'ouverture de la barrière vasculaire cardiaque par les ultrasons. La preuve de concept sur l’efficacité de cette nouvelle approche sur petit animal vivant est indispensable avant d’envisager des études plus approfondies sur plus gros animal, puis un transfert à la clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été estimé au minimum nécessaire pour obtenir des résultats exploitables. Le sexe des animaux n’ayant pas d’importance d’un point de vue scientifique dans ce projet, les femelles non-utilisées d’autres projets (dont le sexe d'intérêt sont les mâles) seront utilisés dans ce projet au lieu d’être mises à mort au sevrage.

Raffinement

Durant toute la durée des protocoles, les animaux seront suivis et tout signe de détresse de douleur et/ou d'inconfort sera noté. Ils seront surveillés quotidiennement, les paramètres suivants seront observés : bien-être général, activité, réactivité, poids, capacité à s'alimenter et posture. Les souris devant être rasées sur la face ventrale, du coton sera placé dans les cages. Une analgésie sera mise en place avant et après l'étape de chirurgie.

Choix des espèces

La souris est un modèle adapté pour les études de diffusion des nanoparticules dans le cœur. De plus, ce modèle est parfaitement compatible avec une approche par ultrasons cardiaque.

600 rates vont être utilisées, toutes tuées et autopsiées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit l'ablation des ovaires sous anesthésie, opération de 30 à 40 minutes, puis des injections sous-cutanées quotidiennes sur animal éveillé sous contention, des prélèvements sanguins à la veine jugulaire jusqu'à une fois par semaine, et un hébergement individuel imposé par le suivi de la prise alimentaire. Le porteur reconnaît qu'un état de mal-être peut découler de cet isolement, et signale des cris ou de l'agitation pendant l'administration des traitements. Il conclut à l'absence de "méthode alternative" et au caractère "indispensable" de l'utilisation d'animaux pour évaluer des peptides censés limiter la perte osseuse après la ménopause.

Objectifs

La ménopause est une période clé pour la santé de la femme car s’accompagne de modifications physiologiques comprenant, notamment, une modification de la composition corporelle et un changement de la répartition des graisses corporelles conduisant notamment à un risque élevé pour la santé cardiaque, ostéo- articulaire et musculaire (perte de densité osseuse, fonte musculaire…). Des traitements thérapeutiques existent déjà pour réduire la perte osseuse, mais présentent des effets secondaires. Des conseils nutritionnels adaptés, associés à des conseils relatifs à l’activité physique, peuvent également s’opposer en partie aux effets de la ménopause d’autant plus que dans notre société l’activité physique est réduite, et la sédentarité croissante. Dans ce contexte, où des facteurs génétiques interviennent également expliquant les différences entre femmes, il devient fondamental de prendre en considération l’impact d’une balance énergétique déséquilibrée en faveur des apports et non des dépenses. L’objectif du projet est donc d’évaluer l'effet de thérapie sur le processus de formation et résorption de l’os dans un contexte combinant ostéoporose et contrôle alimentaire afin de proposer aux professionnels de la santé et aux patients des approches thérapeutiques plus appropriées. Les agents thérapeutiques testés sont des peptides agissant à différents niveaux, il est attendu un effet sur la masse graisseuse et sur le remodelage osseux. Il s’agira d’évaluer l’effet de ces agents thérapeutiques sur la perte osseuse induite par ovariectomie chez le rat (modèle décrit et reconnu par la communauté scientifique) dans un contexte de prise alimentaire monitorée. Ce modèle d’ostéoporose induite par ovariectomie a pour principaux avantages (i) de mimer le développement d’une ostéoporose post-menopausale, avec une reproductibilité élevée pour analyser de manière robuste et efficace les mécanismes mis en jeu dans le développement de la pathologie et dans la réponse induite par les agents thérapeutiques testés (ii) d’accéder à de plus amples informations indispensables au développement de nouvelles approches thérapeutiques (iii) d’être prédictif en clinique de l’activité des agents thérapeutiques testés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent à plusieurs niveaux. Ce projet permettra à court terme d’obtenir des informations sur (i) la tolérance ou la potentielle toxicité des agents thérapeutiques étudiés au niveau systémique et osseux (ii) l’influence d’une alimentation monitorée sur la prise de poids et indirectement sur le développement de l’ostéoporose (iii) les modifications induites par l’administration des agents thérapeutiques étudiés au niveau du corps entier et des os. A plus long terme, ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle des modifications physiologiques ayant lieu après ménopause, d’établir des diagnostics robustes et de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques alliant traitement médicamenteux et suivi alimentaire et limiter les effets secondaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à une opération chirurgicale unique réalisée sous anesthésie générale et avec analgésie pré- et post-opératoire afin de réalisation l’ablation des ovaires. Cette opération dure 30 à 40 minutes par animal. Les traitements sont réalisés par injections sous-cutanées, réalisées quotidiennement, chaque injection dure 1 à 2 min, et est réalisée sur animal éveillé avec contention simple. Des injections sous-cutanées de produits permettant le suivi de la formation osseuse seront réalisées dans les 2 dernières semaine du protocole. Chaque animal recevra 2 injections à 1 semaine d’écart, chacune durant de 1 à 2 min. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine jugulaire pourront également être réalisés, ces prélèvement auront lieu sur animal éveillé, dureront moins de 5 min par animal, et pourront être répétés une fois par semaine tout au long du protocole.

Impact sur les animaux

La réalisation de la chirurgie peut s’accompagner d’une possible réaction inflammatoire transitoire au niveau du site de l’incision. Les effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être un traumatisme exprimé par des cris ou une agitation pendant l’administration des traitements ou le prélèvement de sang, et une inflammation au niveau du site d’injection. Un état de mal-être pourrait également survenir lié à l’hébergement individuel.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes et tissus d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser les agents thérapeutiques, les paramètres et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les agents thérapeutiques que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais la perte osseuse induite par la déficience en œstrogène est un mécanisme complexe faisant intervenir différents types cellulaires du tissu osseux. Les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur des effets sur l’ensemble des organes d’un organisme. Ces mécanismes extrêmement complexes ne pouvant pas être mimés par des modèles simples de culture de cellules in vitro, il n'existe malheureusement pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’efficacité d’agents thérapeutiques sur la perte de densité osseuse. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum afin d’obtenir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une étude complémentaire pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Nous utiliserons notamment des femelles adultes depuis plusieurs semaines ayant dépassé la majorité squelettique dont le squelette n'est plus en phase de croissance. Etant donné la variabilité probable en réponse aux agents thérapeutiques, 10 animaux au maximum par condition testée sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé grâce à nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif pourra être revu après analyse de résultats de protocoles préliminaires, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.

Raffinement

Du fait du suivi alimentaire à réaliser, les animaux seront stabulés individuellement dans des conditions d’hébergement optimisé afin de limiter le stress (ajout d’un enrichissement augmenté tels que tunnel, bâton ou bille de bois). L'état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne et sera spécifiquement axée sur l’apparition (i) de signes de douleur occasionnée par l’acte chirurgical (exemple : inflammation locale, plaie…), (ii) de signes de stress dus aux prélèvements de sang ou liés à l’hébergement individuel, (iii) ou de signes d’inflammation liés aux injections des traitements. Cette observation quotidienne aura pour but de minimiser la douleur et tout facteur agissant sur le bien-être animal. Un protocole analgésique et/ou antalgique sera mis en place le jour dès le jour des chirurgies, avant et après l’opération. Outre la gestion de l'analgésie, l’ablation des ovaires sera pratiquée sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront maintenus un minimum de temps en situation d’inconfort lors de leur manipulation. Enfin, tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible et à l’appui des grilles du bien-être animal) sera humainement euthanasié.

Choix des espèces

Le rat a été choisi pour ce projet car ce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment au niveau osseux, proches de celles observées chez l'homme. Ces rongeurs, étant fréquemment utilisés à des fins de recherche, permettent de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, leur taille permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ces animaux permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux agents thérapeutiques. Les rats femelles et adultes auront dépassé la majorité squelettique (10 semaines). Autrement-dit leur squelette ne sera plus en phase de croissance.

45 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie subissant une seule chirurgie crânienne de dix minutes, l'autre deux opérations de 40 minutes à trois mois d'intervalle. Les chirurgiens posent un implant près du cerveau ou injectent des cellules dans le cerveau, avec un risque d'hémorragie lors de la craniotomie, et des saignements, hématomes ou infections possibles. Ces souris reproduisent une leucodystrophie métachromatique, maladie qui touche environ 150 patients identifiés en France, et le porteur précise qu'elles seront tuées avant l'apparition du phénotype dommageable. La preuve de concept espérée pourrait "permettre de proposer de nouvelles pistes de traitements chez l'Homme", formulation au conditionnel adossée à des craniotomies déjà planifiées.

Objectifs

L’objectif du projet sera d’évaluer la faisabilité puis l’efficacité d’une nouvelle approche thérapeutique dans le cadre d’une maladie présentant une atteinte grave de la gaine de myéline (leucodystrophie métachromatique). Cette approche, basée sur de la thérapie cellulaire, sera évaluée sur le modèle murin de la pathologie.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de concept de la faisabilité et de l’efficacité d’une nouvelle approche de thérapie cellulaire pour le traitement de la leucodystrophie métachromatique. Si les résultats obtenus dans ce projet s’avèrent concluants, cela pourrait permettre de proposer de nouvelles pistes de traitements chez l’Homme et ainsi d’amener à une étude clinique chez des patients souffrants de cette pathologie (fréquence 1/45000 naissances, soit environ 150 patients identifiés en France). A long terme, cela pourrait donc permettre d’améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Pour une partie des animaux, une procédure chirurgicale (sous anesthésie générale et analgésie adaptée) sera réalisée pour la mise en place d’un implant proche du cerveau (une fois par animal, durée 10 minutes). Pour l’autre partie des animaux, deux procédures chirurgicales (sous anesthésie générale et analgésie adaptée) seront réalisées à 3 mois d’intervalle pour réaliser des injections dans le cerveau des animaux (deux fois par animal, durée 40 minutes). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure par une méthode réglementaire. Le phenotype dommageable present chez ce modele se developpe apres l'age d'euthanasie de ce projet.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables possibles sont un stress de l'animal lors des contentions et manipulations nécessaires au cours des procédures. Lors des procédures de chirurgie l’animal pourra ressentir un stress lors de l’induction de l’anesthésie. Cette anesthésie sera associée à une hypothermie et un risque rare de problèmes cardio-respiratoire. Suite à la chirurgie l’animal pourra ressentir une douleur et un inconfort. Des risques rares et inattendus peuvent survenir en lien avec la chirurgie tels que saignements, hématome, ou infection, mais aussi un risque d’hémorragie peu probable lors de l’implantation et la réalisation de la craniotomie. Le phenotype dommageable present chez ce modele se developpe apres l'age d'euthanasie de ce projet.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements de tissus d’intérêts post-mortem et leurs analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires pour évaluer notre approche thérapeutique.

Remplacement

À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier la tolérance et l’efficacité dans l’ensemble de l’organisme de notre approche thérapeutique basée sur la thérapie cellulaire. En effet pour étudier ces aspects il est nécessaire d’utiliser un organisme comparable à la complexité de ce que l’on retrouve chez l’Homme. Il est donc toujours indispensable d’avoir recours à l’animal pour cette évaluation, et notamment un modèle animal de la pathologie pour une meilleure transposition des résultats chez l’homme. Choisir la souris et notamment le modèle murin de la pathologie pour ce projet nous permettra de collecter des données cruciales avant de passer chez l’Homme pour application clinique.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait, nous avons établi qu’un nombre de 3 souris par groupe serait d’abord nécessaire pour valider la faisabilité et la tolérance de notre approche. En fonction des résultats obtenus avec ces premiers groupes réduits nous pourrons évaluer l’intérêt de poursuivre ou non le projet et ainsi utiliser le moins d’animaux possible. Puis nous avons défini que des groupes de 10 souris seraient nécessaires pour l’évaluation de l’efficacité de l’approche sur le modèle pathologique. Ces effectifs permettront de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 45 souris sera utilisé au cours de ce projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, La procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux disposent de nourriture adaptée à leur stade physiologique et d’eau ad libitum. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une observation quotidienne et de soins adaptés. Le change (de la litière, abreuvement,nourriture) est réalisé 1 fois par semaine ou tous les 15 jours en fonction des besoins de la cage. Le milieu est enrichi à l’aide de carré de coton de bâtonnet de bois à ronger et si nécessaire supplémenté de lanières de kraft, et de maison de type celldom. Les animaux d’étude seront hébergés par 3 à 5 souris par cage ventilée au maximum. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée et un maintien de la température de l'animal pendant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir toute hypothermie. Nous utiliserons également un gel ophtalmique afin de prévenir toute sécheresse oculaire au cours de l'anesthésie. En post-opératoire, une surveillance renforcée des animaux sera assurée quotidiennement pendant 5 jours. Au moment de l'euthanasie, un sédatif sera administré à l'animal avant d'injecter le composé euthanasiant. La lignée peut présenter un phénotype dommageable mais nos animaux seront euthanasiés avant sa manifestation.

Choix des espèces

Il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la leucodystrophie métachromatique dans son ensemble, nous avons donc besoin de modèles animaux. Le modèle murin est particulièrement adapté (modification génétique possible, outils moléculaire disponible…) pour reproduire et étudier cette maladie et surtout pour l’évaluation d’un effet thérapeutique. En effet il existe une lignée de souris génétiquement modifiée qui reproduit les caractéristiques de la pathologie présentes chez l’Homme et nous permettra ainsi d’évaluer l’effet thérapeutique de notre approche. Les animaux seront utilisés à 9 semaines d’âge et suivies jusqu’à 19 semaines maximum pour la première étape du projet afin de juger de la faisabilité de l’approche sur un cerveau complètement développé. Pour l’évaluation de l’efficacité de notre approche, les souris seront utilisées à partir de 6 mois et suivies jusqu’à 12 mois. En effet, nous avons besoin d’évaluer notre approche dans un modèle symptomatique de la maladie et de suivre notre traitement sur 6 mois pour évaluer l’effet thérapeutique dans la durée.