Rongeurs
Tests précliniques sur un modèle de fibrose pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Les souris reçoivent d'abord jusqu'à deux injections intraveineuses destinées à humaniser leur système immunitaire, puis, douze semaines plus tard, une injection intratrachéale de dix minutes sous anesthésie qui déclenche une fibrose pulmonaire. Les expérimentateurs administrent ensuite des candidats médicaments par voie pulmonaire, digestive ou injectable, avec des prises de sang répétées et un score clinique quotidien portant sur le pelage, les mouvements, les muqueuses et la respiration. 1 500 souris vont être utilisées sur cinq ans dans 50 études, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, un score égal ou supérieur à 7 ou une perte de poids de plus de 25 % déclenchant la mise à mort. Aucune réutilisation n'est prévue, la fibrose étant décrite comme progressive et incurable, l'animal ne pouvant plus recouvrer son état de santé.
Objectifs
La fibrose respiratoire est une affection pulmonaire impliquant le système immunitaire qui touche près de 5 millions de personnes dans le monde. Cette pathologie peut être causée par l’inhalation de produits toxiques, par une infection, par des traitements médicamenteux, des suites d’une réaction auto-immune ou de cause inconnue (idiopathique). L’âge (>50 ans) ainsi que des facteurs génétiques et environnementaux jouent également un rôle dans le développement de cette maladie. Cette pathologie est souvent mal diagnostiquée et les traitements disponibles à ce jour sont extrêmement couteux et permettent seulement d'en ralentir la progression. Ainsi, la fibrose pulmonaire dite idiopathique est associée à une survie médiane de seulement 3.8 ans parmi les plus de 65 ans. Par ce projet, nous souhaitons développer un modèle d’étude de la fibrose pulmonaire sur souris au système immunitaire humanisé afin d’en étudier le développement, d’en améliorer son diagnostic et de tester de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier la fibrose pulmonaire et des potentiels traitements pour cette pathologie avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Procédures
Injection par voie intraveineuse : 2 fois maximum. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. 1 injection intratrachéale de maximum 10 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Le suivi de l’état de santé des animaux se fera par score clinique (aspect des poils, mobilité, état corporel, …) ou bien par palpation (ou autre geste technique). Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire d’établissement et figurera dans le protocolé d’étude. Chaque prélèvement aura une durée de 15 à 30 secondes, environ.
Impact sur les animaux
La fibrose pulmonaire se manifeste par une inflammation des poumons menant à l'apparition de fibrose pouvant induire une gêne respiratoire (dyspnée). Des nuisances peuvent être induites par les prélèvements sanguins, l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
La fibrose est une maladie progressive et incurable, l'échelle de score doit permettre une euthanasie avant que l'impact ne soit jugé sévère sur les animaux. Une réutillisation n'est donc pas envisagé puisque l'animal ne pourra pas recouvrir complètement son état de santé en fin d'étude.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec le système respiratoire pour étudier le développement et le traitement de la fibrose pulmonaire. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement de thérapies innovantes permettant de soigner cette pathologie.
Réduction
Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études afin de mettre en place le modèle et de réaliser les premières études précliniques. Chaque étude comprendra un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats fiables malgré la variabilité intrinsèque liée au modèle. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Des morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, l’état de santé sera évalué par une échelle cumulative de scores prenant en compte : l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, la couleur des muqueuses, le score corporel et la respiration. Les souris seront évaluées quotidiennement et l’échelle sera appliquée dès que nécessaire. Une souris avec un score ≥7 sera euthanasiée pour raison éthique. Le poids sera mesuré au moins trois fois par semaine. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Le suivi de l’évolution pondérale pourra être adapté au stade de l’étude. Une perte de poids de plus de 25% par rapport au poids initial sera considérée comme une raison de mise à mort. Toute anormalité non objectivable par l'échelle de score devra immédiatement être rapportée au vétérinaire qui aura pleine autorité pour envisager un traitement ou imposer une euthanasie pour raison éthique. Le vétérinaire est présent sur site tous les jours et joignable les week-ends et jours fériés. L'injection intratrachéale sera réalisée sous anesthésie générale volatile à l'isoflurane ou fixe à l’alfaxolone (dose à déterminer).
Choix des espèces
Le projet vise à étudier le développement de la fibrose pulmonaire en se basant sur un système immunitaire humanisé afin d'obtenir le développement d'une pathologie la plus proche possible de celle qui se développe chez l'Homme. Nous maîtrisons l’humanisation du système immunitaire sur les souris, il est donc essentiel de poursuivre sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de l'age de 16 semaines pour les animaux humanisés, ceci prenant en compte une période d'humansiation de 12 semaines (minimum) qui peut être réalisée à partir de l'age de 3 à 4 semaines. Les animaux non humanisés seront utilisés à partir de l'age de 6 à 8 semaines afin d'utiliser des animaux adultes. Les études seront réalisées sur des groupes d'âges homogènes.
Etude de l’incidence d’un gène sur le développement de la souris EU : 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Toute souris qui montre une posture inhabituelle, le poil hérissé, le dos voûté ou un retrait de ses congénères est sortie de l'étude et tuée immédiatement. 1 320 souris vont être utilisées, 880 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Chaque animal est identifié par l'ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, puis peut subir jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de sa vie, sur animal vigile sous contention. Le porteur indique que les souris produites servent d'abord au maintien des lignées et à la fabrication des cohortes nécessaires aux expériences, pour un gène dont il annonce ne pas connaître précisément le rôle.
Objectifs
L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.
Procédures
Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Les animaux issus des croisements sont identifiés amputation de la première phalange. Cette procédure est réalisée entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Le prélèvement de la biopsie est alors non douloureux. La phalangectomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.
Devenir
Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.
Réduction
Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.
Evaluation de l’effet de traitements dans un modèle de rat rendu diabétique par une administration de streptozotocine
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rendus diabétiques par une administration de streptozotocine, 1 080 rats subissent une hyperglycémie persistante qui peut provoquer maigreur, déshydratation, polyurie, dos voûté, yeux mi-clos, cataracte et cicatrisation difficile. Ces procédures relèvent toutes d'un niveau de souffrance sévère, sur 24 semaines, avec jusqu'à trois traitements par jour, des prélèvements sanguins quotidiens et jusqu'à 56 tests comportementaux par animal. Le porteur écrit pourtant que "le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible", et qu'une éventuelle modification des doses se décidera "en accord avec notre client". Tous les rats sont tués à la fin, une partie pour prélèvements, l'autre parce qu'elle ne peut être ni replacée ni réutilisée après avoir reçu des substances aux effets inconnus à long terme.
Objectifs
Le diabète est une maladie chronique caractérisée par une hyperglycémie (taux élevé de glucose dans le sang) due à une production insuffisante d'insuline par le pancréas ou à une mauvaise utilisation de l'insuline par l'organisme. Elle se manifeste souvent par une dysfonction sensorimotrice périphérique (altérations de la sensibilité sensorielle dans les membres affectés) et des problèmes cognitifs et/ou des troubles d’anxiété liés à la neuropathie centrale. Dans le modèle que nous allons mettre en œuvre, les rats développent une hyperglycémie persistante ce qui permet d'étudier les effets de l'hyperglycémie chronique et d'explorer des interventions thérapeutiques. Ainsi dans ce projet, le modèle sera utilisé pour tester l’effet de composés en cours de développement sur plusieurs facettes de la neuropathie diabétique telle que la neuropathie périphérique, l’anxiété et le dysfonctionnement cognitif.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter le diabète. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de son utilisation chez l’Homme.
Procédures
Les animaux de ce projet seront amenés à subir une induction d’hyperglycémie. Sur les 24 semaines de la procédure, les animaux auront un maximum de 3 traitements par jour. Ce nombre de traitement se rapproche des prises quotidiennes chez l’Homme, notamment lorsque les médicaments ne sont pas disponibles sous forme à libération prolongée ou dans le cas de la prise de plusieurs types de médicaments. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins journaliers (ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire) afin de pouvoir suivre la glycémie et d’autres paramètres plasmatiques. En parallèle les animaux effectueront un maximum de 56 tests de comportements dont le test d’EMG qui est réalisé sous anesthésie alors que les autres le sont sur des animaux vigiles. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée ce temps comprenant systématique une compression finale afin de contrôler l’hémostase.
Impact sur les animaux
Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun cela peut induire un stress chez l’animal. L’hyperglycémie induite peut entrainer les symptômes suivants ; une augmentation de la prise de boisson et de nourriture, une polyurie et des selles plus abondantes d’aspect altéré (molle, couleur claire, …), une maigreur et des signes de déshydratation, une diminution du toilettage, une posture avec un dos vouté et des yeux mi-clos, le développement d’un voile oculaire blanc pouvant aller jusqu’à la cataracte, un abdomen distendu et une cicatrisation difficile.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses comportementales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse des effets d’une hyperglycémie nécessite une observation globale, uniquement possible chez l’animal vivant. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes. Après analyse de puissance statistique, nous envisageons d’utiliser 12 animaux par groupe. Des analyses statistiques finales sont réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 15 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en œuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement du milieu : un tunnel pour leur permettre de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Des que cela est possible, les prélèvements ou les administrations sont effectués sous anesthésie générale de l’animal. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de mise en œuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. En raison de la polyurie, à partir d’une semaine après l’induction le change est effectué quotidiennement. De plus, nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui serait inattendue. Si le traitement par le composé à tester induit des souffrances, nous envisagerons, en accord avec notre client, la modification des doses ou l’arrêt du traitement. Si aucune solution n’est possible, l’animal sera euthanasié. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA (Structure du Bien Être Animal) sera réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques, permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Le diabète pouvant apparaitre à tout âge mais se développant souvent dès l'enfance ou l'adolescence, nous utiliserons des rats de 6-7 semaines lors de l’induction.
L’Evaluation de nouveaux médicaments pour la neuroinflammation oculaire en utilisant les modèles murins
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rats : 796
Deux injections dans le vitré des deux yeux, des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant 14 jours et un examen à la lampe à fente chaque jour à partir du huitième : 796 rats et 720 souris vont être utilisés, tous tués à des moments échelonnés du protocole. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 316 animaux et modéré pour 1 200, avec une uvéite auto-immune déclenchée par immunisation, des dégénérescences rétiniennes provoquées par agents chimiques et une néovascularisation choroïdienne induite au laser. Le porteur annonce détresse, fièvre et perte de poids au pic inflammatoire, une baisse de vision dans tous les modèles, des hémorragies intraoculaires possibles et des lésions de la cornée en cas d'anesthésie prolongée. Il indique n'utiliser les rats que pour l'évaluation thérapeutique parce que leurs yeux sont plus grands, ce qui permet d'injecter une dose précise et de récupérer assez de matériel, argument qu'il présente comme une réduction du nombre d'animaux tués.
Objectifs
Les maladies rétiniennes inflammatoires sont les causes principales de cécité dans les pays industrialisés. Les traitements anti-inflammatoires actuels, tels que les glucocorticoïdes, peuvent entraîner de graves effets secondaires. Il n’existe pas non plus de traitement pour la neuroprotection. Dans ce projet, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de deux molécules candidates : une nouvelle molécule anti-inflammatoire prometteuse et un médicament existant que nous voulons repositionner dans l’œil. Les objectifs du projet sont : 1) d’évaluer les effets thérapeutiques de ces deux molécules en utilisant des modèles expérimentaux d’inflammation oculaire et de neurodégénérescence rétinienne de rat, et 2) d’étudier les mécanismes moléculaires en utilisant des modèles murins transgéniques.
Bénéfices attendus
Une des deux molécules à tester est un nouveau type de médicament anti-inflammatoire, qui a un grand potentiel dans le traitement des maladies oculaires inflammatoires cécitantes chez l’homme. L’autre molécule est un médicament déjà sur le marché aux propriétés pharmaceutiques connues, Il peut être repositionné pour traiter les maladies oculaires grâce à leurs effets anti-inflammatoires. Les résultats de ce projet serviront à déterminer les pathologies pour lesquelles ces traitements seront bénéfiques et à identifier les mécanismes d’action. Ils permettront également de comparer les voies d’administration afin de développer des traitements ciblés optimisés pour les patients souffrant de diverses inflammations oculaires. Ce projet contribuera à approfondir nos connaissances sur la pathogenèse de la neuro-inflammation oculaire et à promouvoir la santé publique à long terme en fournissant de nouveaux traitements fondés sur des preuves.
Procédures
L’induction des modèles pathologiques prend entre 5 à 10 minutes. Les expériences sont réalisées sous anesthésie générale et locale sur tous les animaux. Un analgésique est administré pendant 3 jours après l’induction de l’uvéite autoimmune expérimentale (EAU). Dans cette procédure, l’administration systémique des médicaments est réalisée par injection intrapéritonéale (IP) une fois par jour pendant 14 jours sur les animaux éveillés. Pour tous les modèles pathologiques, l’administration intraoculaire des médicaments est effectuée par injection intravitréenne (IVT) dans les 2 yeux sous anesthésie générale et locale. Cet acte dure quelques secondes. Pour le modèle EAU, deux IVT sont effectuées aux jours 7 et 15 après l’immunisation. Pour les modèles de dégénérescence rétinienne induits par des agents chimiques, une seule IVT est réalisée au jour 0. Tous les animaux sont suivis par des examens morphologiques et fonctionnels. L’observation de l’uvéite avec une lampe à fente, qui prend environ 1 minute, est réalisée quotidiennement à partir du jour 8 jusqu’à la fin de la procédure EAU, sur les animaux éveillés. De différents examens in vivo permettant d’évaluer la morphologique et la fonction de la rétine sont réalisés sous anesthésie générale et locale et durent entre 10 à 30 minutes. L’examen de la morphologie de la rétine est effectué aux jours 7, 15 et 24 après l’immunisation dans le modèle EAU chez le rat ; avant, puis aux jours 3, 7 et 14 après l’injection des agents chimiques dans les modèles de dégénérescence rétinienne chez le rat ; tous les 3 et 4 jours dans le modèle EAU chez la souris ; et avant et 10 jours après le traitement au laser dans le modèle de néovascularisation choroïdienne (CNV) chez la souris. L’examen de la fonction de la rétine est réalisé au jour 15 dans le modèle EAU chez le rat ; au jour 3 ou jours 7 et 14 dans les modèle de dégénérescence rétinienne, et au jour 21 dans le modèle EAU chez la souris. L’angiographie permettant de visualiser des néovaisseaux est effectuée une seule fois dans le modèle CNV. Enfin, un prélèvement sanguin est réalisé au jour 15 après l’immunisation chez les rats traités systématiquement dans le modèle EAU. Cet acte dure une dizaine de secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux incluent : 1) Pendant la manipulation, notamment lors des examens des yeux, les animaux peuvent éprouver du stress. 2) L’anesthésie présente des risques tels que l’hypothermie, la détresse respiratoire et, dans des cas extrêmes, le décès. 3) Dans le cadre du modèle d’uvéite autoimmune expérimentale, les animaux sont susceptibles de souffrir de détresse, de fièvre et de perte de poids pendant la phase de pic inflammatoire. 4) Tous les modèles étudiés pourraient entraîner une baisse de vision. 5) Des complications spécifiques, comme une hémorragie intraoculaire, peuvent survenir lors des injections intravitréennes et des traitements au laser. 6) Enfin, la prolongation de l’anesthésie ou une protection insuffisante de la cornée peuvent causer des lésions cornéennes.
Devenir
Tous les animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à des moments différents, selon les besoins spécifiques des questions scientifiques posées. Les tissus oculaires seront ensuite prélevés pour réaliser des analyses histologique, immunohistochimique, ainsi que des études cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Ce projet concerne 1) d’une part l’évaluation des effets thérapeutiques de deux catégories de médicaments, 2) d’autre part l’identification des mécanismes moléculaire et la cascade de signalisation impliquée dans la régulation du système immunitaire locale et systémique, de la barrière hémato-rétinienne et la neuroprotection. Face à la complexité des systèmes étudiés, aucun système accessible pour le moment in vitro ou ex vivo ne reproduit totalement le modèle intégré dont nous avons besoin. Le but principal reste le transfert des techniques mises en œuvre vers l’évaluation thérapeutique des traitements chez l’homme.
Réduction
Les examens morphologiques et fonctionnels in vivo assurent un suivi du même animal et permettent une réduction du nombre d’animaux euthanasiés. Les mécanismes d’action des médicaments seront évalués secondairement dans des modèles où les traitements sont bénéfiques. Les souris transgéniques sont partagées entre plusieurs équipes qui travaillent sur d’autres sujets de recherche et sur d’autres organes. Le nombre total d’animaux établi pour ce projet est de 1516 grâce à un calcul de puissance. Il sera également nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les procédures utilisées dans le projet pouvant entraîner une souffrance modérée pour les animaux, des mesures de prévention et des points limites précoces sont mis en place pour réduire ou éviter la douleur. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale et locale. Une analgésie sera administrée avant les interventions potentiellement douloureuses et sera renouvelée pendant 3 jours. Afin d'éviter l'hypothermie pendant l'anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Pour protéger la cornée du dessèchement et éviter les lésions cornéennes consécutives, des gouttes de larmes artificielles sont instillés jusqu’au réveil de l’animal. Des points limites précoces sont définis en amont et seront contrôlés tout au long du projet, impliquant des actions pouvant aller jusqu’à l’euthanasie en cas de souffrance trop importante. Le chercheur observe les différents signes permettant d'évaluer une souffrance animale avérée : le comportement, l'activité locomotrice, qualité du poil, la prise alimentaire et la perte de poids. Pour assurer de bonnes conditions de stabulation pour les animaux, les conditions d’hébergements (température, hygrométrie) sont contrôlées conformément aux exigences réglementaires de l’espèce. La litière, l’abreuvement et la nourriture sont changés une fois par semaine et vérifiés quotidiennement. Le milieu est enrichi pour les souris : coton de nidification, tunnels et niches, maison en plastique accrochée à la grille ; et pour les rats : tunnels en cartons ou plastique et/ou maison en plastique au sol. Des recherches régulières dans la littérature et la participation à la formation continue de l’expérimentation animale permettront d’apprendre et mettre en œuvre de nouvelles techniques de raffinement.
Choix des espèces
Les espèces rat et souris ont été choisies car il s'agit des modèles établis pour le développement de différentes pathologies dont des maladies oculaires humaines. Seuls les rats sont utilisés pour tester les effets thérapeutiques des médicaments, car leurs yeux sont plus grands, et une dose précise de médicament peut facilement être injectée dans l’œil. De plus, nous pouvons récupérer suffisamment de matériel pour effectuer les analyses, ce qui réduit le nombre d’animaux euthanasiés. Les souris transgéniques sont utilisées pour étudier les mécanismes, car le génome de souris est similaire à celui de l’homme, et la fonction des gènes dans les maladies humaines peut être analysée à l’aide de ces modèles murins. Dans le cas d’animaux achetés, les rats et souris auront 5-7 semaines à leur livraison, une phase d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée avant que les animaux ne rentrent dans le protocole. Dans le cas où nous élevons les animaux au sein de notre propre établissement, les animaux auront 6-8 semaines. L'âge choisi est en accord avec ce qui est fait dans la littérature pour ce type de modèles expérimentaux. Il s'agit de modèles de pathologie survenant à l'âge adulte.
Effets métaboliques et cognitifs des variations d’apport en tryptophane et des fibres alimentaires dans l’alimentation (Multisite 2/2).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Tués à la fin de l'expérimentation pour prélever contenu intestinal, foie, muscle, tissu adipeux, sang et cerveau, 650 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 450 mères et petits. 200 rats vivent en cage individuelle pendant six semaines pour la mesure de la consommation alimentaire, avec deux heures de regroupement par jour, et passent jusqu'à sept tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, après des jeûnes de 15 heures et des privations d'eau de 6 heures. Quarante rates sont anesthésiées, séparées de leur portée pendant trois heures et traites à la main après injection d'une hormone, l'opération étant répétée une seconde fois. Le porteur justifie le choix de l'espèce par une recommandation de la FAO citant l'être humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines, l'enjeu déclaré étant l'effet de la végétalisation de l'alimentation.
Objectifs
La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.
Bénéfices attendus
Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.
Procédures
Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.
Impact sur les animaux
Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.
Réduction
A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.
Raffinement
Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.
Choix des espèces
Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.
Evaluation de l’effet de composés sur l’hyperactivité induite chez le rat et la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rats : 900
Pour tester si des composés en développement réduisent une hyperactivité motrice provoquée par des agents perturbateurs, 900 souris et 900 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Sur 24 semaines, chaque animal peut recevoir jusqu'à quatre traitements par jour, subir des prélèvements sanguins quotidiens et passer jusqu'à 14 tests comportementaux de 90 minutes sur animal vigile. Le porteur annonce des convulsions ou des apathies possibles, une hyper-locomotion transitoire provoquée par les inducteurs, et un jeûne de moins de 16 heures avant le prélèvement terminal de sang. Il précise que si un composé induit des souffrances, la modification des doses ou l'arrêt du traitement sera envisagé "en accord avec notre sponsor", et qu'à défaut de solution l'animal sera tué.
Objectifs
L’hyperactivité ou l’hyper-locomotion est un symptôme présent dans plusieurs pathologies neurologiques, comme la schizophrénie, la maladie d’Alzheimer, le trouble déficitaire de l’attention (TDAH) ou le trouble bipolaire pour citer les plus connus. Cette composante des pathologies doit être prise en compte dans leur traitement global car l’impact sur la vie du patient est notable. Bien que ces troubles présentent des mécanismes physiopathologiques distincts, ils partagent une origine commune liée au déséquilibre des circuits neuronaux impliqués dans le contrôle moteur et l'attention. Pour simuler ces pathologies, différents agents perturbateurs sont utilisés qui impactent l'activité motrice. Ce projet a pour objectif de tester l’efficacité des composés en cours de développement préclinique à réduire l’hyperactivité induite chez le rat et la souris.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, quand nous testons des produits en cours de développement, nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour traiter l’hyperactivité. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique, nous participons à une meilleure connaissance de la prédictivité de nos modèles c’est-à-dire de leur capacité à reproduire les effets des médicaments dans la situation expérimentale comme lors de son utilisation chez l’Homme.
Procédures
Sur 24 semaines de la procédure, les animaux auront un maximum de 4 traitements par jour. Ce nombre de traitement se rapproche des prises quotidiennes chez l’Homme, notamment lorsque les médicaments ne sont pas disponibles sous forme à libération prolongée ou dans le cas de la prise de plusieurs types de médicaments. Les animaux pourront également être soumis à des prélèvements sanguins journaliers (ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire) afin de pouvoir suivre les paramètres plasmatiques. En parallèle les animaux effectueront un maximum de 14 tests de comportement (90 min chacun) sur animaux vigiles. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée ce temps comprenant systématique une compression finale afin de contrôler l’hémostase.
Impact sur les animaux
Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement (douleur passagère, irritation, inflammation, induration mâchonnement et de fausse route pour la voie per os). Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. De plus les inducteurs utilisés provoquent une hyper-locomotion transitoire. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun (
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mortpour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.
Remplacement
Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, l'analyse de l’hyperactivité nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 animaux. En effet, selon nos données antérieures un effectif de 10 par groupe permet d’obtenir une bonne puissance statistique. Des analyses statistiques finales seront réalisées. Les animaux inclus dans ce projet vont nous permettre de mener 30 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.
Raffinement
Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en œuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement important du milieu. Pour les rats, nous proposons un tunnel en carton afin de leur permettre de se cacher et des boules de bois permettant de jouer et de grignoter. Pour les souris nous proposons un tunnel en carton accroché à la grille de la cage afin d’en augmenter le volume utile, une maisonnette en carton afin de permettre aux animaux de se cacher, et de la frisure pouvant servir de matériel de nidification, de jeu et de matériel à grignoter. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Les administrations et les prélèvements qui peuvent être réaliser sous anesthésie le seront. De plus, nous avons établis des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui serait inattendue. Si le traitement par le composé à tester induit des souffrances, nous envisagerons, en accord avec notre sponsor, la modification des doses ou l’arrêt du traitement. Si aucune solution n’est possible, l’animal sera mis à mort. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA sera réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des rats ou des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques, permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (environ 6 semaines et 200-250g pour le rat et 5 semaines et 25g chez la souris). Nous avons fixé cet âge car les mécanismes de l’hyperactivité que nous induisons ne sont pas dépendants de l’âge et d’après nos études antérieures les animaux de cet âge répondent de façon reproductible et robuste au protocole.
Détermination de l’implication du système sympathique dans la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées pour l'implantation d'un capteur de pression artérielle pour 288 d'entre elles, dont 144 soumises en plus à un exercice de nage, 706 souris vont être utilisées et toutes tuées, 644 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 120 autres nagent avant un prélèvement sanguin et 236 sont maintenues en vieillissement jusqu'à une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Ces souris portent une mutation qui reproduit la sclérose latérale amyotrophique humaine et développent des altérations motrices, le projet cherchant des dérèglements de la pression artérielle avant l'apparition des symptômes. Le porteur justifie le recours à ces animaux par le "manque de connaissance" de la maladie et par l'impossibilité de suivre des paramètres physiologiques hors d'un "organisme entier", tout en annonçant qu'une grande partie du projet se fera ex vivo sur des tissus.
Objectifs
La moelle épinière thoracique contient l'essentiel des neurones à l'origine de la commande nerveuse autonome sympathique, un acteur majeur du maintien de l'homéostasie corporelle, responsable du contrôle d'un grand nombre d'activités automatiques de l'organisme. Les neurones préganglionnaires sympathiques (SPNs), étage de sortie de la commande sympathique, connectent au sein des ganglions sympathiques les neurones postganglionnaires sympathiques qui à leur tour connectent les organes cibles. Les SPNs sont des neurones qui sont moléculairement extrêmement proches des neurones qui commandent les muscles striés : les motoneurones (MNs). La sclérose latérale amyotrophique (SLA), troisième maladie neurodegerative après Alzeihmer et Parkinson est caractérisée par la perte des neurones moteurs corticaux et des MNs spinaux conduisant à une atrophie musculaire, à la paralysie progressive des malades et à leur décès par insuffisance respiratoire. Les causes précises de la dégénérescence des MNs sont à ce jour encore inconnues et nous ignorons encore si cette dégénérescence est initiée directement au niveau des MNs ou au niveau du muscle. Notre hypothèse est que les SPNs sont aussi atteints dans la SLA et participent via un dysfonctionnement du contrôle vasculaire musculaire à la dégénérescence du muscle et des MNs. L’objectif de ce projet est donc de mettre en évidence des altérations précoces (avant l'apparition des symptômes moteurs) de la régulation de la pression artérielle sur un modèle murin de la SLA.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) dont l'issu est aujourd'hui toujours fatale chez l'homme (dans les 3 à 5 ans suivant les premiers symptômes).
Procédures
Certains animaux subiront une chirurgie (n=288) et certains d'entre eux effectuerons un exercice de nage (n=144) . 236 animaux seront aussi maintenu en veillissement d'être perfusés en intracardiaque (sous anesthésie). 62 animaux serviront de mâles reproducteurs mais ne développeront pas la maladie. 120 animaux effectuerons un exercice de nage avant prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices qui seront surveillées de très près par une équipe compétente (50% des animaux de l'étude). Au cours des soins post opératoire et malgré l'administration de l'anti-inflammatoire, les animaux peuvent présenter un signe de douleur. L'exercice de nage peut générer un stress de l'animal.
Devenir
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des prélèvements de tissus seront faits. Cela permettra de faire des études histologiques et immuno-histologiques
Remplacement
Des études préliminaires sur tissus ont été faites afin d'orienter le projet. De plus, une grosse partie du projet se fera ex-vivo grâce à des techniques d'histologie et d'immuno-histologie. Il n'existe pas de modèle mathématique simulant les modifications induites par SLA sur les paramètres cardiovasculaires car les connaissances de cette maladie sont aujourd'hui limitées. De plus, le suivi de paramètres physiologiques au cours de la vie d'un animal n'est pas possible en dehors d'un système intégré comme un organisme entier. Il n'est donc pas possible de faire cela sur des tissus ex-vivo. C'est à cause du manque de connaissance de notre modèle (la SLA) que nous avons recours à l'utilisation d'animaux présentant cette maladie.
Réduction
Afin de déterminer au mieux le nombre d'animaux, nous avons calculé le n à l'aide de tests statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser un système de mesure de la pression artérielle qui sera implanté. Ainsi, chacun des animaux sera enregistré à chaque temps permettant de ne pas multiplier le nombre d'animaux par le nombre de temps d'enregistrement. Une étude pilote sur très peu d'animaux (16) sera faite et conditionnera l'utilisation des autres animaux.
Raffinement
Les individus porteurs de la mutation seront suivi régulierement et l'évaluation des signes moteurs sera faite toutes les semaines, puis 2 fois par semaine, puis tous les 2 jours puis quotidiennement afin de ne jamais laisser un animal en souffrance. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé afin de préserver le caractère grégaire de la souris. Lors de la chirurgie d'implantation, des soins post-opératoires seront faits (analgésie, antibiothérapie si nécéssaire sur avis vétérinaire, tapis chauffant pour le réveil), les conditions d'asepsies seront respectées (autoclavage, stérilisation à froids, matériels à usage unique stérile) et le personnel dédié à la chirurgie sera parfaitement formé (formation réglementaire et spécifique auprès d'un centre de formation dédié).
Choix des espèces
La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. De plus, un modele murin de la sclérose latérale amyotrophique existe. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Enfin le choix de l'espèce est aussi conforme au R de réduire puisque nous avons choisi un modèle mammifère relativement petit. Les animaux de l'étude pilote seront implantés à P75 pour être enregistrés à partir de P90 Les animaux de l'étude complémentaire seront implantés à P30 pour être enregistrés à partir de P40 Les animaux devant être prélévés pour les études post-mortem sont prélevés à partir de P21
Détermination préliminaire de l’exposition d’une entité thérapeutique (chimique ou biologique) chez le rat après pose d’un cathéter
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
9 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun peut recevoir un cathéter jugulaire ou fémoral sous anesthésie, subir jusqu'à huit prélèvements sanguins en 24 heures, des gavages ou injections jusqu'à trois fois par jour, un hébergement individuel jusqu'à dix jours et jusqu'à 48 heures en cage à métabolisme sans enrichissement. La finalité est de mesurer la pharmacocinétique de candidats médicaments, l'effectif étant estimé d'après l'expérience du laboratoire et "le nombre de demandes de nos partenaires". Le porteur reconnaît que les tests in silico et in vitro suffisent à présélectionner les composés, puis conclut que seul un modèle animal permet de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez le rat. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouveaux composés en vue de la première administration chez l’homme, c’est donc une étape clé dans le cycle de vie de tout médicament en développement.
Bénéfices attendus
A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o Par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée : Durée 30 secondes sur animaux vigiles. Unique ou répétée max 2 ou 3 fois par jour selon la voie o Par voie intraveineuse à la veine caudale ou via le cathéter sur animal vigile: Durée 30 secondes. Unique ou répétée max 2 fois par jour • Prélèvements de sang : o Via le cathéter : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via la veine saphène ou caudale en microsampling : Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 8 fois sur 24h. o Via ponction cardiaque en phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. o Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 50 à 150 µL. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place entre les prélèvements. • Procédure chirurgicale de pose de cathéter jugulaire et/ou fémoral : o 1 anesthésie gazeuse de 30 minutes maximum par animal sur la durée de la chirurgie. o Administration par voie sous-cutanée d’analgésique. Durée 30 secondes sur animaux vigiles ou anesthésié. Unique ou répétée max 2 fois. o Administration unique par voie sous-cutanée de NaCl pour l’hydratation des animaux. Durée 30 secondes sur animaux anesthésié. • Hébergement individuel post-chirurgie ou post traitement : o Cage individuelle avec enrichissement complet (litière et matériaux de nidification) avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 10 jours. o Cage individuelle à métabolisme sans enrichissement avec maintien du contact olfactif et visuel. Habituation pendant au moins 3 jours. Durée de l’hébergement individuel maximal de 48h.
Impact sur les animaux
Au cours des études, - la chirurgie de pose de cathéter sous anesthésie/analgésie peut entrainer une nuisance, douleur et durée modérée - Les administrations et prélèvements sanguins vigiles peuvent entrainer une douleur légère de courte durée par acte, mais la nuisance peut être légère à modérée par la répétition des actes sur une étude, - L’hébergement individuel post-opératoire peut entrainer une nuisance légère de durée modérée ; - Sur certaines études, l’hébergement en cage à métabolisme peut entrainer une nuisance légère à modérée selon la durée. Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet. Toutefois dans ces phases précoces de développement, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo- ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points limites anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. Les cathéters implantés ne sont pas perméables au-delà de 10 jours pour une implantation à la veine jugulaire et 14 jours pour la veine fémorale. De plus, les composés sont testés pour déterminer les profils d’élimination mais ces données ne sont disponibles que bien après la fin des phases in-vivo. De ce fait, il n’est pas possible de réutiliser les animaux pour de nouvelles études.
Remplacement
De nombreux tests in silico et in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Ces tests préliminaires ex vivo évitent le recours à l’animal. Pour la suite du développement des nouvelles entités thérapeutiques, il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme.
Réduction
Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée; Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes, et ainsi de réduire le nombre d‘animaux. La forte sensibilité des méthodes analytiques permet la mise en œuvre de techniques de prélèvements sanguins de volumes réduits autorisant la réalisation de prélèvements répétés sur un même animal. Il est ainsi possible d’obtenir une cinétique complète à partir d’un seul animal. Cela augmente aussi la robustesse des données obtenues pouvant mettre en évidence une éventuelle variabilité inter-individuelle. Le nombre minimal d’animaux par cohorte de traitement est réduit au minimum scientifique, c’est-à-dire 3 animaux pour les études de pharmacocinétique. Ce nombre suffit pour avoir des données assez robustes pour présélectionner des candidats pour la phase pré-clinique. L’estimation du nombre de rats utilisés est basée sur l’expérience acquise sur ce modèle et sur le nombre de demandes de nos partenaires. 9000 rats seront prévus sur une période de 5 ans.
Raffinement
Les animaux seront hébergés conformément aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Après réalisation des chirurgies, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages conformes à la réglementation pour permettre une bonne récupération post-chirurgicale et éviter qu’ils ne s’abiment les sorties de cathéters ou les plaies en cicatrisation. Ces cages seront équipées d’enrichissement et matériaux adaptés. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Lors de l’administration de doses croissantes, les animaux seront traités de manière séquentielle afin de s’assurer de l’innocuité d’une dose avant de passer à une dose plus élevée; Cette organisation permet d’éviter l’administration à des doses où les nuisances seraient trop fortes pour les animaux. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur. De plus, les procédures sont fortement améliorées grâce à l’organisation de formations complémentaires pour le personnel en relation directe avec les animaux sur les techniques d’administrations et de prélèvements de liquides biologiques.
Choix des espèces
Le rat est une espèce couramment utilisée dans les stratégies de sélection de candidat, en réalisant des essais de pharmacocinétique préclinique. De nombreuses publications le démontrent. Le choix de l’espèce est dicté par différents impératifs : - Techniques : compatibilité de volume de prélèvement sanguin total chez un même sujet expérimental; - Scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée.
Evaluation de l’effet préventif d’un bloqueur de CCK2R sur la survenue de la neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Choisies pour leur faible variabilité, de même fond génétique, même âge et même poids, 68 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de paclitaxel ou d'oxaliplatine, deux anticancéreux neurotoxiques, une partie subissant en plus un gavage quotidien pendant huit jours et trois prélèvements sanguins par voie intraveineuse sur animal vigile contentionné. Toutes passent trois tests comportementaux nommés, un de sensibilité tactile et deux de sensibilité thermique, tous les trois jours pendant environ quatorze jours. Elles sont ensuite toutes tuées pour prélever peau, nerf et ganglions spinaux, le porteur précisant que les animaux montrant fatigue, troubles moteurs ou signes de souffrance sont retirés du protocole avant l'analyse.
Objectifs
Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent après l’hématotoxicité. Ces dernières sont principalement source de douleurs (à type de brûlures, piqure, fourmillements) altérant fortement la qualité de vie des patients en cours de traitement et/ou survivant à un cancer. Ces douleurs intenses peuvent être à l’origine d’une diminution des doses, d’un espacement des cycles voire d’un arrêt du traitement anticancéreux, et mettre ainsi en péril les chances de survie du patient. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive reconnue. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, on comprend que le développement de stratégies neuroprotectrices contre ces neuropathies induites par la chimiothérapie constitue un enjeu de santé publique. Au cours d’un projet précédent, il a été mis en évidence que le récepteur à la cholécystokinine de type 2 (CCK2R) était exprimé par le système nerveux sensitif périphérique et que son blocage par un antagoniste industriel spécifique de CCK2R, prévenait le dévelopment de la neuropathie induite par la vincristine dans un modèle murin. La vincristine est un agent anticancéreux indiqué notamment dans la prise en charge des cancers hématologiques. L’objectif de ce nouveau projet est d’évaluer l’influence d’un traitement par cette molécule sur la neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine chez des souris. Le paclitaxel est un agent anticancéreux notamment indiqué dans la prise en charge des cancers du sein et des poumons, et l’oxaliplatine dans la prise en charge des cancers colorectaux. La vincristine, le paclitaxel et l’oxaliplatine sont trois agents anticancéreux représentatifs de trois classes de chimiothérapie particulièrement neurotoxiques. Chacune de ces molécules présente un mécanisme d’action cytotoxique différent contre les cellules cancéreuses, ainsi que des mécanismes de neurotoxicité spécifiques. Nous souhaitons vérifier si l’effet préventif de ce bloqueur de CCK2R observé dans le modèle de neuropathie induite par la vincristine, se produit également dans le cadre des neuropathies induites par le paclitaxel et l’oxaliplatine.
Bénéfices attendus
Particulièrement présent dans le système gastro-intestinal et dans le système nerveux central, le récepteur CCK2R est impliqué dans la satiété, l’anxiété et la douleur. Dans un modèle précédant, la vincristine induit une hypersensibilité tactile et une dégénérescence des nerfs sensitifs, deux phénomènes totalement prévenus par l’administration du bloqueur de CCK2R. Nous supposons que cette molécule pourrait également présenter des effets préventifs (analgésique et neuroprotecteur) sur deux autres modèles de neuropathies chimio-induite, le paclitaxel, et l’oxaliplatine. La molécule d'intérêt fait aujourd’hui l’objet de plusieurs essais cliniques et présente un bon profil de sécurité. Ainsi, la mise en évidence d’un effet neuroprotecteur dans nos modèles animaux permettrait de faciliter la translation chez l’Homme, avec la mise en place rapide d’un essai clinique évaluant son effet sur les neuropathies induites par la chimiothérapie.
Procédures
L'ensemble des animaux recevra des injections intrapéritonéales répétées tous les deux jours ou tous les trois jours pendant une période de 6 jours. Une partie d'entre eux recevront également le traitement par voie orale tous les jours pendant 8 jours, par gavage. Une partie des animaux subiront en plus trois prélèvements sanguins en intraveineux chacun à 7 jours d’intervalle, sur animal vigile contentionné. L'ensemble des animaux sera soumis à trois tests comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et deux autres évaluant la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 14 jours environ.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales tous les deux jours ou tous les trois jours pendant 6 jours (maximun 4 injections par animal) induiront une douleur légèreet un stress de courte durée . Au cours de l'administration du traitement par voie orale, les animaux pourront ressentir un stress lié à la préhension, le gavage peut être associé à un risque de fausse route. Les prélèvements sanguins peuvent être source de stress lié à la manipulation et la contention. Le prélèvement induira une douleur légère de courte durée. Le volume sanguin prélevé n'aura pas d'impact sur l'état général et le bien être de l'animal. Au cours des trois tests comportementaux, les animaux seront isolés de leurs congénères sur une période de courte durée ; ces tests produiront un stress le temps de la manipulation. Les tests comportementaux, évaluant la sensibilité tactile ou thermique, génèreront une gêne au moment du stimulus (de l'ordre d'une seconde). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu du paclitaxel ou de l’oxaliplatine ont un comportement similaire aux animaux témoins et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations associées au paclitaxel ou à l'oxaliplatine seront mises en évidence par une analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.
Remplacement
Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi deux modèles qui suivent les protocoles d'injection des agents anticancéreux utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet du traitement sur des neurones sensoriels humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensoriels humains, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par la chimiothérapie ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse.
Réduction
Le nombre de 8 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé avec un logiciel de calcul qui estime un nombre total de 56 animaux (avec 6 mesures de la sensibilité), soit 8 par groupes. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements de tissus nerveux (peau, nerf et ganglions spinaux) seront effectués sur chaque animal mort avant qu'il soit placé dans le congélateur des cadavres. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote pourront être utilisés pour renforcer l'analyse statistique de l'étude principale.
Raffinement
Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet du traitement sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide de tests comportementaux. Si des signes de souffrance et/ou de toxicité sont observés, alors l’étude principale ne sera pas poursuivie. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le traitement présente un effet analgésique et/ou neuroprotecteur sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul des tests d'évitement seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité tactile et thermique, et une valeur limite est établie à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés au traitement et/ou au paclitaxel ou à l’oxaliplatine doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux Ctrl pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.
Choix des espèces
Des modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie chez la souris ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.
Etudes des mécanismes impliqués dans l’immunosurveillance précoce des tumeurs mammaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Sept injections et neuf prélèvements sanguins sous anesthésie par animal, sur des souris chez qui une tumeur mammaire est déclenchée : 166 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. La pousse tumorale peut provoquer une gêne ou une douleur locale, les injections intrapéritonéales, intraveineuses et sous-cutanées une douleur au point d'injection. L'objectif déclaré est d'identifier les cellules immunitaires qui éliminent les cellules en cours de transformation tumorale, que le porteur présente comme une piste de prévention des cancers et des rechutes. Parmi les animaux tués figurent les mâles reproducteurs et les souriceaux au "génotype non relevant car inutilisés", et le point limite est évoqué comme un "volume tumoral trop important" sans que le seuil soit donné.
Objectifs
Le cancer du sein est le premier cancer féminin en terme de fréquence et la première cause de décès par cancer chez les femmes, avec plus de 600 000 décès estimés en 2018 dans le monde. Sans amélioration dans la prise en charge du cancer du sein, le taux de mortalité lié à cette pathologie aura augmenté de 58% en 2040, pouvant atteindre environ 1 million de décès (OMS). L’identification de nouvelles cibles thérapeutiques est donc primordiale pour faire face à ce problème majeur de santé publique. Au cours des dernières années, certaines thérapies ciblant le système immunitaire ont déjà démontré des efficacités thérapeutiques sans précédent dans certains types de cancer (mélanome, cancer du poumon). Cependant, à l’heure actuelle, seulement un faible nombre de patients répondent à ces immunothérapies innovantes. Ainsi, l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques ciblant les cellules du système immunitaire des patientes atteintes de cancer du sein reste primordiale. Notre projet a pour objectif de déterminer, en utilisant un modèle de tumeur spontanée mammaire chez la souris, les acteurs du système immunitaire qui pourraient être impliqués dans l'élimination des cellules qui sont en train de se transformer en cellules tumorales.
Bénéfices attendus
La compréhens ion des mécanismes impliqués dans la détection précoce et l’élimination, par les cellules du système immunitaire, des cellules en transformation tumorale devrait permettre de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques représentant une piste majeure de prévention des cancers et des rechutes.
Procédures
- Pousse tumorale suite à l'induction du phénotype dommageable. - Injections (x7, 2min) ; -Prelèvements de sang, x9, 5min incluant l'anésthésie
Impact sur les animaux
Le développement de la tumeur peut occasionner une gêne, et/ou une douleur locale. Les injections par voies IP, IV et SC peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection. Le prélèvement de sang peut entrainer un stress causé par l’anesthésie générale et une douleur locale.
Devenir
A l'issu des procédure, les animaux seront mis à mort pour les raison suivantes : - Les mâles reproducteurs ainsi que les souriceaux issus des accouplements avec un génotype non relevant car inutilisés; - afin de réaliser des analyses de biologie ex vivo sur les tissus mammaires au cours de la progression tumorale, les animaux seront mis à mort avant prélèvement des tissus pour éviter toute souffrance. - atteinte d'un point limite (par exemple volume tumoral trop important...).
Remplacement
À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules du système immunitaire et leur microenvironnement, ne peuvent actuellement pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables. Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier les interactions cellulaires des étapes précoces de détections des cellules en transformation tumorale par le système immunitaire.
Réduction
Grâce à des données de la littérature, issues d'expériences pilotes sur un faible nombre d'animaux, ou de par notre exeprience, le nombre de souris a été déterminé au minima, notamment grâce à un test de statistique afin d'assurer l'obtention de résultats significatifs avec un minimum d'animaux utilisés. Au final, un total de 166 souris sera utilisé dans ce projet.
Raffinement
Certaines procédures (injections, Prélèvements) peuvent induire une douleur/un stress chez les animaux. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse, via notamment l’anesthésie gazeuse et un anesthésique local. Un suivi adapté des points limites spécifiques au projet, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la souffrance des souris. Le comportement, l’apparition des tumeurs et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. En cas de douleur détectable,un anti-douleur sera administré.
Choix des espèces
Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence de souris transgéniques nous permettant de caractériser l’infiltrat immunitaire au cours du développement tumoral. De plus nous avons pour objectif d’effectuer une analyse détaillée du microenvironnement tumoral ; les outils que nous souhaitons utiliser ne sont disponible que chez la souris.
Identification et genotypage des souris en élevage
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
690 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, au sein d'un élevage de lignées modélisant des malformations cardiaques congénitales. Chaque animal est saisi par la queue une dizaine de secondes, le temps d'une biopsie caudale de cinq secondes destinée à vérifier la transmission du gène modifié. Le porteur indique que ces souris sont maintenues en vie pour une utilisation continue dans d'autres autorisations de projet, l'élevage servant à produire les cohortes des expériences suivantes. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe "aucune alternative" et que le recours à l'animal est "incontournable", cellules in vitro et organoïdes ne rendant pas compte du développement du cœur.
Objectifs
Elevage de souris à des fins de recherches sur les pathologies cardiaques congénitales ( malformations du coeur à la naissance) Nous élevons des souris qui modélisent des pathologies cardiaques congénitales telles que la cardiomyopathie dilatée (dilatation du ventricule gauche ) ou le Syndrome de Cornelia de Lange, une maladie du développement affectant la formation et la fonction de nombreux organes. Ces deux souris modèles nous ont permis de mettre en évidence des pistes thérapeutiques pharmacologiques (identification de médicament utilisés pour la cancérologie) qui feront l' objet de projets cliniques dans un futur proche. Ces souris plus généralement nous permettent également de mieux comprendre la formation du coeur et de chercher l 'origine des malformations qui sont susceptibles de se produire.
Bénéfices attendus
un génotypage (c'est à dire la vérification de la transmission du gène modifié dans le modèle de souris à partir des parents) adéquat très important pour la rigueur de nos recherches
Procédures
les souris seront soumises à une légèrepréhension par la queue pendant 10 secondes pour la biopsie de queue qusi ne dure que 5 secondes ce qui pourrait événtuellement entraîner une légère et courte douleur
Impact sur les animaux
les gestes sont très rapides et n'apportent à la souris qu'une gêne à la préhension
Devenir
Ces souris sont élévées pour une recherche continue sur les malformations cardiaques congénitales apparaissant de novo ou associéees à des maladies rares. Les souris sont maintenus en vie, pour une utilisation continue dans des DAP d'expérimentation. Dans seulement les 5 dernières années, nous avons pu mettte en évidence deux cibles médicamenteuses grace à l utilistion de ces souris. Ceci a permis en collaboration avec nos collègues cliniciens le design actuel de deux essais cliniques chez des patients.
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la regle des 3R. L’étude des pathologies cardiaques congénitales nécessite de recourir a l’animal car il n’existe aucune alternative. Il n’est pas possible d’obtenir ces informations par des cellules in vitro ou des organoides qui ne peuvent rendre compte fidèlement du développement, de la maturation et du fonctionnement du coeur
Réduction
Le recours a l’animal etant incontournable, nous avons reduit le nombre d’animaux au minimum pour le strict maintien de la colonie pour chaque allèle
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid, cartons à ronger)
Choix des espèces
3.4.3. Justifiez la pertinence des espèces animales choisies La souris peut être facilement modifiée génétiquement. Nos modèles murins récapitulent parfaitement le phenotype des patients. Elle est un bon modèle de biologie du développement, un avantage pour les pathologies cardiaques congénitales
Evaluation du rôle de la glycoprotéine VI plaquettaire et de son ciblage en thrombose artérielle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
336 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacune reçoit une injection intrapéritonéale sur animal vigile, puis une ou deux injections intraveineuses après anesthésie, l'un des traitements étant perfusé en continu pendant les trente minutes du modèle de thrombose. Le porteur explique cette absence de réveil par le fait qu'un caillot de grande taille dans un vaisseau n'est pas compatible avec la survie de l'animal, l'objectif étant de tester un anticorps anti-GPVI censé réduire la thrombose sans majorer le risque hémorragique. Il indique par ailleurs que l'efficacité de cette approche a déjà été confirmée in vitro sur du sang humain et de souris, tout en concluant que les modèles in vitro ne suffisent pas.
Objectifs
L’hémostase est le processus qui permet d'arrêter les saignements. Elle implique notamment les plaquettes sanguines qui, lorsqu’un vaisseau est endommagé, s'adhèrent, s'activent et se regroupent pour former un bouchon qui limite le saignement. Un processus similaire se produit lors de la thrombose artérielle, qui se développe dans une artère malade présentant une plaque d’athérosclérose, conduisant à la formation d’un caillot pouvant causer des maladies graves comme l'accident vasculaire cérébral ischémique. Actuellement, les médicaments antiplaquettaires utilisés pour traiter la thrombose artérielle augmentent le risque de saignement. Le but du projet est de démontrer l’importance de la glycoprotéine VI (GPVI) dans la thrombose artérielle et de tester une approche thérapeutique ciblant ce récepteur. L’avantage de cibler la GPVI est qu’elle joue un rôle important dans la thrombose artérielle mais est moins impliquée dans l’arrêt des saignements, réduisant ainsi le risque de saignement.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre le rôle de la GPVI dans la thrombose artérielle. On espère observer une réduction de la thrombose artérielle en absence de GPVI ou lors de son blocage dans nos modèles expérimentaux de souris. Si notre agent anti-GPVI est efficace, cela pourrait mener au développement d’un nouveau médicament antiplaquettaire qui n’augmente pas le risque de saignement, contrairement aux antiplaquettaires actuels.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections dans la cavité abdominale (animal vigile) et intraveineuses (animal anesthésié). Dans chaque procédure l’animal vigile recevra une injection pour l’anesthésie puis il y aura une ou deux injections de quelques secondes sur animal anesthésié avant ou après le début de la thrombose artérielle en fonction des traitements à administrer. Un des traitements sera administré en perfusion continue pendant les 30 min du modèle de thrombose.
Impact sur les animaux
Il existe un risque de saignement au site d’incision pour la pose d’un cathéter et au site d’induction de la thrombose expérimentale.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des procédures car l'induction d'un caillot de grande taille dans un vaisseau n'est pas compatible avec un réveil de l'animal.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle de la GPVI dans la formation de la thrombose artérielle et de tester un nouveau traitement basé sur un anticorps anti-GPVI. La thrombose artérielle est un processus complexe impliquant différents types de cellules et des conditions spécifiques de flux sanguin, rendant nécessaire l’utilisation d’animaux. En effet, les modèles in vitro ne sont pas suffisant. Cependant, l’efficacité de notre approche a déjà été confirmée in vitro avec du sang humain et de souris.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 16 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées. Nous avons ajouté des matériaux tels que des carrés de cellulose, des bâtonnets de coton et des morceaux de papier froissé pour qu'ils puissent organiser leur environnement comme ils le souhaitent. Les animaux sont placés par groupes dans chaque cage. Les conditions de travail ont été raffinées au maximum afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés et maintenus sur plaque chauffante. De plus, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédure afin de soustraire l’animal aux procédures et ainsi de limiter la souffrance et l’inconfort. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entraîné. Les procédures sont sans réveil et l’animal sera anesthésié pendant la totalité des procédures.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’études de thrombose artérielle sont maitrisés et caractérisés. De plus, les techniques de mutation ont permis de générer des souris déficientes pour la GPVI, permettant d’étudier le rôle de la GPVI dans la thrombose artérielle, ainsi que des souris exprimant la GPVI humaine permettant de tester un traitement anti-GPVI humaine. Les souris seront utilisées au stade adule entre 2 et 6 mois, correspondant à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Pour l’une des procédures, les souris sont utilisées à 3 semaines pour limiter la présence de lipides autour des artères.