Rongeurs
Imagerie cérébrale comme nouvel outil d’étude des troubles du spectre autistique chez le rat (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les neuf rates gestantes sont tuées au sevrage de leurs petits, à 21 jours, et les ratons en surnombre, au-delà de dix par portée, sont placés dans d'autres portées ou tués. Au total, 111 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et tous ceux nés dans l'étude sont tués à leur tour, seuls 12 rats adultes utilisés pour un test de sociabilité étant gardés en vie pour d'autres projets ou une retraite. Les mères reçoivent par gavage, chaque jour pendant 42 jours de gestation et de lactation, un retardateur de flamme ou une huile neutre, et au 12e jour de gestation une injection de VPA, le médicament de référence, ou d'eau stérile. Les 90 jeunes passent quatre tests comportementaux, sensibilité sensorielle, activité et anxiété, interactions sociales et comportements répétitifs, pour vérifier qu'ils présentent le "phénotype autistique recherché", puis une partie d'entre eux passe des séances d'imagerie cérébrale sous anesthésie. Le porteur qualifie d'"essentielle" l'expérimentation sur des animaux non-humains pour reproduire la complexité des troubles du spectre autistique.
Objectifs
Les Troubles du Spectre Autistique se caractérisent par des difficultés de communication et des comportements répétitifs. La génétique n'explique que 25 % des cas, ce qui suggère que des facteurs environnementaux, comme les polluants chimiques, jouent un rôle important. Les retardateurs de flamme sont identifiées comme substances préoccupantes en raison de leurs effets toxiques pour le cerveau. Des recherches précédentes ont montré que l'exposition à ce polluant pendant la gestation et la lactation provoque des comportements autistiques et des altérations cérébrales chez les jeunes rats, comparables à ceux observés dans un modèle autistique médicamenteux de référence. Ces dommages comprennent une inflammation du cerveau et des changements dans la façon dont les cellules nerveuses communiquent entre elles, observés après la mort des animaux. Pour étudier plus en détail ces effets, ce projet validera une technique d'imagerie chez des jeunes rats exposés à ce polluant. Deux traceurs seront utilisés pour mesurer l'activité métabolique du cerveau et son inflammation afin de mieux comprendre les mécanismes cérébraux associés à ces troubles. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Pour la première fois, ce projet utilisera l'imagerie cérébrale pour étudier comment le métabolisme et l'inflammation du cerveau sont affectés par un polluant chimique de l'environnement, en lien avec les Troubles du Spectre Autistique. Il aidera à définir et valider les paramètres de la méthode d’imagerie (comme l’anesthésie et la durée du protocole d’imagerie) pour voir, à l’échelle du cerveau entier, où et comment les dommages se produisent et à établir un lien potentiel entre ces dommages.
Procédures
Femelles gestantes : Administration unique par gavage avec le polluant ou le véhicule (huile neutre) quotidiennement pendant 42 jours, couvrant les périodes de gestation et de lactation, injection avec le médicament de référence ou le véhicule (eau stérile) une seule fois au 12ème jour de gestation et suivi régulier du poids. Jeunes rats : suivi régulier du poids et tests comportementaux après sevrage. Chaque jeune rat passera 4 tests comportementaux (sensibilité sensorielle, niveaux d’activité et d’anxiété, interactions sociales, comportements répétitifs) pour sélectionner ceux qui présentent des signes d’autisme, en vue des études d’imagerie. Imagerie cérébrale : À partir de 60 jours, certains rats passeront des séances d'imagerie cérébrale (4 fois en tout sur 2 semaines) sous anesthésie (6 fois), pour mesurer l’activité métabolique cérébrale et pour détecter l’inflammation. La durée de chaque session (1 à 2 h) sera définie pendant cette phase de mise au point.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables attendus sont les suivants : Pour les femelles gestantes : Pour les femelles gestantes : - La piqure d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale de VPA entraine un stress physique mineur et une douleur légère de courte durée (1 fois). - L’administration du polluant par gavage (42 fois) entraine un stress physique mineur de courte durée. Pour les descendants : - L’existence d’un phénotype comportemental de type autistique entraine notamment un risque d’anxiété accru. - La réalisation des tests comportementaux (4) entraine un stress physique mineur de courte de durée.
Devenir
Neuf femelles gestantes seront réparties en trois groupes. Elles seront maintenues en vie jusqu'au sevrage de leurs petits à 21 jours, puis euthanasiées. Le sang et les tissus seront utilisés notamment pour l’analyse des hormones. En cas de portées trop importantes (supérieures à 10 ratons), la portée sera réduite par placement des ratons surnuméraires dans d’autres portées plus faibles ou euthanasie. Dans ce cas, les tissus seront prélevés pour des analyses. L’ensemble des ratons (10 par portée soit 90) réaliseront 4 tests comportementaux afin de s’assurer qu’ils présentent le phénotype autistique recherché et de pouvoir en sélectionner pour les études in vivo par imagerie (dix-huit mâles et femelles maximum). A l’âge adulte, l’imagerie sera réalisée sur 3 rats par groupe et par sexe. Si nécessité de renforcer les résultats, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté à chaque groupe pour augmenter la taille de l’échantillon. L’ensemble des rats nés dans cette étude sera euthanasié pour des analyses en histologie et biologie moléculaire ou des ajustements de techniques en vue de la phase 2 du protocole qui fera l’objet d’une future demande d’autorisation. Enfin les 12 rats (6 femelles et 6 mâles) ayant participé aux tests de sociabilité seront maintenus en vie et pourront être réaffectés à d’autres projets ou placés en retraite.
Remplacement
L'utilisation d'animaux est essentielle pour reproduire la complexité des Troubles du Spectre Autistique observés chez l'Homme. Les modèles autistiques utilisés dans ce projet, reconnus et validés chez les rongeurs, permettent de créer des troubles comportementaux et cérébraux similaires à ceux de l'Homme. Ils permettront d’utiliser l'imagerie cérébrale pour étudier les effets d'un polluant et comprendre le lien avec le développement de l’autisme. Cette imagerie nécessite l'étude de l'activité cérébrale d'animaux vivants.
Réduction
Chaque portée sera considérée comme une unité statistique. Dans chaque portée, un raton mâle et un raton femelle seront sélectionnés pour réaliser des analyses par imagerie in vivo. Comme il y a peu de données sur l'utilisation des deux radiotraceurs de l’étude, cette première phase vise à tester la faisabilité de l'imagerie sur un échantillon de 3 ratons par groupe et par sexe, pour 3 groupes. Si besoin, un deuxième raton de chaque sexe et de chaque portée sera ajouté pour augmenter la taille de l'échantillon. Ainsi, cette phase exploratoire inclura un total de 9 rates gestantes, 90 jeunes et 12 autres rats adultes pour un test de sociabilité. Au total, 111 animaux seront impliqués dans cette étude, avec un minimum de 9 rats mâles et 9 rats femelles (jusqu'à un maximum de 18 de chaque sexe) utilisés en imagerie.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans l’EU1 dans des conditions standards, respectant les réglementations en vigueur. Les femelles gestantes et allaitantes seront hébergées avec leurs petits jusqu'à 21 jours après la naissance. Ensuite, les jeunes rats resteront ensemble sans leur mère entre 21 et 28 jours pour maintenir leurs liens sociaux. À 28 jours, les rats seront séparés par sexe et placés par deux dans des cages ventilées, avec des buchettes de bois et de la frisure de papier Kraft pour enrichir leur environnement. Les tests comportementaux seront effectués durant la nuit, période d'activité naturelle des rats. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être, et manipulés par le même personnel entraîné pour réduire le stress. À 50 jours, les rats seront transportés dans des cages prévues à cet effet vers l'animalerie de la plateforme d'imagerie EU2, avec des conditions similaires à leur habitat précédent (cycle lumineux, nourriture, enrichissements environnementaux) pour minimiser les perturbations. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale, en suivant des protocoles rigoureux adaptés à chaque animal. Les radiotraceurs seront injectés par du personnel qualifié, avec des doses précises. Pendant l’imagerie, l'anesthésie sera surveillée en temps réel pour assurer la sécurité des animaux. Après la procédure, les rats seront surveillés attentivement dans un environnement calme pour une récupération rapide et sans complications.
Choix des espèces
Les modèles de Troubles du Spectre Autistique médicamenteux ou après exposition des mères au polluant ont été développés et sont reconnus chez le rat dont le comportement social est proche de celui des humains, ce qui en fait un bon choix pour étudier ces troubles. Les femelles adultes utilisées pour la reproduction auront entre 12 et 13 semaines, comme dans les études précédentes, pour assurer la comparabilité des résultats. Les petits seront étudiés de la naissance jusqu'à 80 jours pour suivre leur croissance, évaluer leur comportement (entre 36 et 43 jours) et analyser les modifications métaboliques et inflammatoires par imagerie (entre 60 et 80 jours). Cette période permettra de définir les protocoles d'imagerie.
Humanisation du foie de souris et modélisation de pathologies hépatiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Une humanisation du foie qui ne réussit qu'environ une fois sur deux, et un effectif calé sur le plan commercial d'une entreprise : 7850 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour tester la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments contre des infections virales, un cancer ou une insuffisance du foie, elles reçoivent une ou deux injections d'un composé qui tue leurs propres cellules hépatiques et une greffe de cellules hépatiques humaines, avec, par la veine porte, une chirurgie qui déplace les viscères. Les candidats médicaments sont administrés par voie pulmonaire, tumorale, cutanée, digestive ou par injection. Les souris au foie humanisé peuvent être reprises dans d'autres projets ou dans une formation interne aux gestes techniques, 200 étant déclarées réutilisables, et le porteur indique que les autres sont tuées parce qu'elles ne recouvreront pas leur état de santé. Il présente la souris comme une espèce "facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains".
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d'insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Les cellules hépatiques humaines pourront ensuite par exemple être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de recréer, dans la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. De plus les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente pourront également être exploitées pour l’étude de l'insuffisance hépatique.
Procédures
1 ou 2 injections(s) de composé induisant la mort des hépatocytes. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection SC d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, tumorale, dermique, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire et figurera dans le protocolé d’étude.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant la chirurgie via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le MESRI dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.
Remplacement
Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.
Réduction
Un total de 7850 souris seront utilisées, couvrant une période 5 ans et permettant de réaliser par exemple 80 études précliniques de 50 souris sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées par l’entreprise. De plus, 50 souris seront utilisées dans le cadre de l’implantation du patch correspondant à une étude pilote de 5 souris et une première étude de 45 souris pour l’évaluation de l’efficacité du patch. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe, autour de 50% via l’injection splénique d’hépatocytes et donc l’utilisation de moins d’animaux.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, les fréquences sont limitées et définies dans le protocole d’étude. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. De plus, la souche immunodéficiente présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.
Quinobiote, échange de quinones au sein du microbiote intestinal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
12 souris vont être utilisées pour un unique gavage de trente secondes, et toutes seront tuées ensuite pour le prélèvement de leurs organes et de leurs tissus. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger, l'inconfort déclaré se limitant au gavage. Ces souris portent une flore intestinale simplifiée à douze espèces bactériennes, construite en laboratoire, ce qui permet de chercher si l'une de ces bactéries fabrique sa quinone à partir d'un précurseur fourni par une autre. Le porteur écrit qu'"à terme, il pourrait être envisageable" de moduler le microbiote intestinal humain grâce à cet apport de précurseurs, un bénéfice reporté au conditionnel là où le gavage et la mise à mort sont, eux, programmés.
Objectifs
Les troubles intestinaux sont fréquents chez l'Homme et résultent souvent d’un déséquilibre de la flore intestinale. Une meilleure compréhension des facteurs régissant l’équilibre des communautés bactériennes qui colonisent l’intestin pourrait permettre de proposer des approches pour traiter ces troubles. Un des facteurs de stabilité de la flore intestinal est l’échange de molécules entre bactéries, mais peu de cas ont été caractérisés dans l’intestin à ce jour. L’objectif du projet est de caractériser un nouvel échange de molécule, un précurseur de la ménaquinone (MK) qui joue un rôle clé dans la bioénergétique des bactéries et pourrait donc fortement impacter l’équilibre du microbiote. Les résultats de nos analyses bioinformatiques démontrent que de nombreuses espèces du microbiote intestinale (dont Bifidobacterium animalis, un probiotique commensal reconnu) possèdent uniquement les gènes de la fin de la voie de biosynthèse de la MK, ce qui suggère que ces espèces dépendent d’autres bactéries dites « donneuses » pour obtenir un précurseur afin de synthétiser leur MK. Des expériences nous ont permis de prouver que B. animalis est capable de synthétiser sa MK uniquement lorsqu’un précurseur (le DHNA) est ajouté au milieu de culture ou lorsque B. animalis est co-cultivé avec une espèce donneuse (Enterococcus faecalis). L’objectif du projet est maintenant de valider dans un contexte physiologique in vivo que B. animalis est capable de synthétiser sa MK à partir du précurseur fournit par le microbiote intestinal. Pour cela, nous proposons d’utiliser une souris (nommée oligoMM12) porteuse d’une flore intestinale simplifiée (composée de 12 espèces bactériennes dont B. animalis et E. faecalis). La détection de la MK de B. animalis dans les échantillons du microbiote intestinal d’oMM12 nous permettra de confirmer que l’échange de précurseur de quinones est effectif au sein du microbiote intestinal. Ce résultat servira de base à des études ultérieures visant à définir si l’échange de précurseurs de quinones est un facteur important de l’équilibre du microbiote intestinal, notamment pour les espèces bactériennes possédant une voie partielle de synthèse de MK.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des facteurs qui régissent l’équilibre des communautés bactériennes qui colonisent notre intestin pourrait permettre de proposer des approches pour traiter certains troubles intestinaux et les maladies liées. En utilisant une souris porteuse d’une flore intestinale simplifiée, nous pouvons identifier les quinones synthétisées par chaque espèce bactérienne présente et ainsi mettre en évidence la synthèse d’une quinone par Bifidobacterium animalis grâce à un échange de précurseur (DHNA) avec des espèces donneuses du microbiote intestinal. Ce résultat permettra de confirmer que l’échange de précurseur de quinones est effectif au sein du microbiote intestinal et posera les bases d’études ultérieures visant à établir l’importance de ces échanges de précurseurs de quinones pour l’équilibre du microbiote intestinal. A terme, il pourrait être envisageable de concevoir une modulation du microbiote intestinal grâce à l’apport de précurseurs de quinones.
Procédures
Chaque souris sera soumise à un unique gavage oral sous contention durant maximum 30 secondes.
Impact sur les animaux
Au cours de nos expériences les animaux pourront subir un inconfort suite au gavage. Ces effets indésirables sont de sévérité légère et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de réaliser les prélèvements d’organes et de tissus nécessaires aux analyses requises pour atteindre les objectifs fixés.
Remplacement
Des premiers résultats en culture cellulaire ont permis d’identifier un composé bactérien qui concoure au maintien de la bactérie d’intérêt. Les analyses sur fèces et intestins isolés permettent de déterminer les conditions optimales de multiplication des bactéries probiotiques. Nous voulons maintenant vérifier si ce composé est présent au sein du microbiote intestinal et s’il est mobilisable par la bactérie d’intérêt, B. animalis. A ce stade de la recherche, aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés. La colonisation bactérienne de l'intestin ne peut être obtenue et analysable que dans un organisme entier. Pour atteindre les objectifs, nous devons travailler avec un système digestif complet et vivant ; la souris est un modèle approprié et bien validé puisque nous disposons de souris avec une flore intestinale simplifiée et contrôlée, adaptée à nos objectifs.
Réduction
En analysant les prélèvements provenant de 3 souris adultes mâles et 3 femelles, nous avons pu obtenir les données de référence nécessaires pour ce modèle. Ces données montrent la présence des quinones synthétisées par les espèces de la communauté à l’exception d’une quinone. Nous testerons donc nos conditions expérimentales sur des groupes de même effectif et sexe ratio : 1 groupe contrôle et un groupe traité. En outre, le projet scientifique global utilise des produits biologiques fournis de façon mutualisée pour différents projets de recherche (organes, tissus).
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. Les gestes expérimentaux (gavage oral, prélèvement de fèces) sont réalisés règlementairement et dans un cadre optimal pour limiter au maximum les risques. Les gavages seront réalisés à l’aide d’une sonde flexible non irritante pour l’œsophage. Le projet est mis en œuvre dans l’animalerie qui maîtrise parfaitement les conditions d’hébergement spécifique à la population de souris : hébergement sous confinement sanitaire approprié en séparant les souris traitées des contrôles non traités.
Choix des espèces
Afin de confirmer l’échange de précurseurs de quinones entre espèces bactériennes du microbiote intestinal, nous devons utiliser un mammifère vivant possédant une flore intestinale simplifiée contenant notre bactérie d’intérêt. Ce modèle n’existe que chez la souris et est adapté à nos objectifs. La souris nous permettra d’obtenir des résultats comparables aux données de référence préalablement obtenues. Nous retenons des souris adultes d’au moins 8 semaines, avec un système digestif mature et une flore intestinale stabilisée pour éviter toute interférence avec un autre phénomène de maturation ou d’adaptation microbiologique en cours. Les données de référence ont été obtenus sur des prélèvements provenant de cette catégorie de souris.
Etude de la fonction d’un gène candidat de myopie dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Un casque est implanté sur le crâne de certaines souris sous anesthésie, avec une lentille ou un cache-œil porté ensuite de façon prolongée, et jusqu'à treize anesthésies gazeuses en trois semaines s'enchaînent pour nettoyer les lentilles et passer les scanners. 330 souris vont être utilisées ainsi, 210 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 120 au niveau modéré, toutes tuées à l'issue parce que, génétiquement modifiées, elles ne peuvent être ni réutilisées ni mises à la reproduction. L'objet déclaré est de comprendre le rôle d'un gène associé à la forte myopie, dans un modèle où la myopie est provoquée artificiellement. Le porteur annonce des tests comportementaux au cours desquels des animaux sont placés une heure sur une plateforme, sans préciser lesquels, et signale par ailleurs un risque d'arrêt cardiaque sous anesthésie et une cataracte temporaire possible.
Objectifs
La cécité nocturne congénitale stationnaire (CNCS) est un groupe de pathologies rétiniennes d'origine génétique. La plupart des personnes atteintes ont une acuité visuelle basse, associée à des difficultés d’orientation en condition de faible luminosité. De nombreux patients présentent également d’autres anomalies oculaires telles qu’une forte myopie. Dans des études précédentes, des gènes responsables de l'apparition de la CNCS ont été identifiés. De plus les modèles animaux mimant la CNCS ont été très étudiés et d’autres gènes altérés ont été découverts dans toutes les différentes formes de CNCS. Le rôle précis de ces gènes dans la rétine et leur impact sur la CNCS et la myopie sont encore mal connus. Nous allons, au cours de ce projet, étudier l'un de ces gènes qui a notamment été associé à la forte myopie. Pour se faire, nous allons utiliser un modèle de souris génétiquement modifié dans lequel ledit gène a été inactivé.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet incluront une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires menant à la myopie et à la Cécité Nocturne Congénitale Stationnaire (CNCS). La myopie étant l’affection oculaire handicapante la plus courante actuellement et avec une incidence en constante augmentation (les prédictions nous disent que la moitié de la population mondiale sera myope d’ici 2050, et 10 pourcent sera atteint d’une forte myopie). La CNCS est une maladie visuelle handicapante provoquant des symptômes variés pour laquelle aucun traitement n’existe à ce jour. Une meilleure compréhension des mécanismes induisant ces pathologies permettrait de proposer des traitements plus précoces, plus efficaces et moins invasifs que ceux déjà existant.
Procédures
Pour induire et étudier la myopie, une technique chirurgicale, effectuée sous anesthésie et analgésie, se résumant par l’implantation d’un casque sur le crâne de certains animaux est nécessaire. Pour mesurer la myopie : contention manuelle régulière et répétée de certains animaux: une fois par animal et par semaine pendant 6 semaines au total, 10 minutes par animal maximum à chaque fois. Anesthésies gazeuses répétées: Une anesthésie le jour de la chirurgie (durant 45 minutes maximum) + 3 anesthésies maximum par semaine pour le nettoyage des lentilles et des yeux des animaux (10 minutes maximum/animal) + Anesthésies le jour des scanners (3 fois, 15 minutes par animal maximum) soit 13 anesthésies maximum sur 3 semaines. Anesthésie par injection le jour de l’électrorétinographie (une fois/animal, pendant une heure). Modification de l’environnement lumineux de certains animaux : abaissement de la luminosité pendant 4h à un niveau dit « de lumière basse). Les animaux seront répartis en 3 groupes distincts : le premier groupe se verra induire et mesurée la myopie, le deuxième groupe se verra analysé par électrorétinographie, le troisième groupe verra son environnement lumineux changé.
Impact sur les animaux
Certains des animaux seront soumis à des chirurgies : Les techniques chirurgicales peuvent mener à des pertes de poids, des infections, douleurs post-opératoire, perte de sang. Ces mêmes animaux subiront des anesthésies gazeuses répétées pouvant causer un risque léger d’hypothermie, d’insuffisance respiratoire et arrêt cardiaque. Port du cadre à lunette: qu’il s’agisse du cache-oeil ou d’une lentille, le port prolongé de l’appareil peut induire une gêne et un assèchement oculaire. Certains animaux seront placés en hébergement individuel, ce qui peut entraîner des détresses sociales. Durant les tests comportementaux, certains animaux seront placés sur une plateforme durant une heure. L’arrivée dans un milieu inconnu peut stresser l’animal. Une partie des animaux seront utilisés dans le cadre de différents tests fonctionnels afin de caractériser le modèle qui implique soit une immobilisation manuelle pouvant induire un stress soit une anesthésie par injection d’anesthésiques pouvant induire un stress thermique ou des risques cardio-respiratoires. L’un de ces tests peut entrainer une cataracte temporaire. Enfin, certains animaux seront placés en illumination contrôlée sont dans une ambiance lumineuse différente de celle de leur hébergement. L’enrichissement sera réduit pendant cette procédure, ce qui peut induire un stress.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés à la fin des expériences car il s'agit d'animaux OGM et que nous ne pourrons les réutiliser pour des accouplements ou d'autres projets. L'euthanasie sera effectuée selon la méthode réglementaire. Les yeux des animaux seront ensuite prélevés pour études histologiques et de biologie moléculaire.
Remplacement
L’induction et l’étude de la myopie ainsi que la caractérisation phénotypique nécessite un œil complet, en 3D, avec sa rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, crystallin, iris, humeur aqueuse). Aucune méthode alternative ne permet d’obtenir un oeil en 3D.
Réduction
Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour le projet en nous basant sur les données de la littérature scientifique. Aucune étude n’a montré d’influence claire du sexe sur la Cécité Nocturne Congénitale Stationnaire et la myopie. Nous allons utiliser les animaux mâles et femelles indistinctement. Nous utiliserons comme témoins des animaux contrôles non modifiés, possédant donc le gène étudié sur leurs 2 chromosomes. Nous comparerons aussi les résultats avec des animaux contrôles dits « hétérozygotes » possédant le gène étudié sur un seul de leur chromosome, afin de renseigner le potentiel impact de la perte du gène sur un chromosome. Le nombre d’animaux indiqué dans chaque procédure a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe et en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe), des contraintes techniques (Taux de réussite des expériences), des contraintes de contrôles. Nombre total d’animaux nécessaires: 330 animaux
Raffinement
Les animaux utilisés naîtront et seront hébergés en animalerie extérieure jusqu’à expérimentation. Ils seront alors hébergés dans notre animalerie où ils observeront une période d’acclimatation de 5 jours avant toute manipulation. Pour les accouplements, les parents seront placé un mâle avec deux femelles. Les nouveaux-nés seront sevré à 21 jours après la naissance. Les animaux adultes seront placés à 5 au maximum par cage (hors accouplement), possèderont une maison et des morceaux de cellulose ainsi que des morceaux de bois. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les paramètres environnementaux contrôlés des animaleries seront conformes aux normes réglementaires. De l’hydrogel nutritif sera mis à disposition si nécessaire. Seul le personnel qualifié en zootechnie sera habilité à gérer l’hébergement des animaux. Seul le personnel compétent dans la manipulation des animaux sera autorisé à manipuler les animaux. Seul du personnel formé aux techniques chirurgicales du petit animal sera autorisé à procéder aux techniques chirurgicales. Le personnel de zootechnie change les cages chaque semaine et sera en charge de la surveillance de la santé des animaux. Une communication rapide entre les chercheurs et les membres de la zootechnie est assurée par la proximité géographique entre l’animalerie et le laboratoire et permettra une prise de décision rapide en cas de problème de santé des animaux. Les procédures nécessitant une anesthésie et/ou l’application d’analgésiques seront effectuées par du personnel habilité. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées sur un site web commun. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs permettant de limiter toute douleur inutile aux animaux ont été mis en place
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car nous avons besoin d’un modèle génétique particulier qui n’existe que dans cette espèce. Certaines expériences visent à étudier le développement naturel de l'oeil. Le développement de l'oeil se mesure par réfractométrie. Les mesures de réfractométrie ne commencent à être fiables qu’à partir de 3 semaines d’âge, lorsque l’animal est sevré. Avant cela, l’oeil est trop petit. En général, le développement de l'oeil des souris se termine autour de 6 semaines d’âge. Pour nous assurer d’avoir dépassé la période critique du développement, nous poursuivrons la mesure du développement jusqu’à 9 semaines d’âge. Certaines expériences nécessitent d'induire la myopie. L’induction de la myopie est plus efficace si elle débute entre 3 et 4 semaines d'âge car l’oeil y est encore en phase de croissance critique. Certaines expériences consistent en la mesure post-mortem des taux de dopamine rétiniens. Pour éviter tout impact de la croissance de l'animal sur la mesure de Dopamine, nous effectuerons l’expérience à l’âge adulte. Dans un souci de cohérence, nous nous fixons sur 80 jours après la naissance car il s’agit de l’âge auquel nous avons fait des analyses similaires lors de projets précédents. Certaines expériences consistent en la caractérisation phenotypique (ie les symptômes)des animaux, nous travaillerons sur des animaux sur 2 stades adultes différents (6 semaines, 6 mois) pour documenter un possible phénotype progressif.
Amélioration de l’humanisation chez des rats immunodéficients humanisés
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rendus immunodéficients par construction, puis greffés de cellules souches et d'un fragment de thymus humains, 120 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La greffe de thymus est placée sous la peau ou sous la capsule rénale, suivie d'injections d'anticorps dans le ventre aux jours 0, 7 et 14, puis de prélèvements de sang derrière l'œil aux semaines 12, 18 et 24. Le porteur mentionne parmi les atteintes possibles la séparation de la mère, le risque qu'elle rejette ses petits, et une réaction du greffon contre l'hôte, sans en décrire les manifestations. Tous sont tués à l'issue pour prélever sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus.
Objectifs
A l'heure actuelle, l'étude de nouveaux médicaments permettant d'agir sur le système immunitaire ne peut pas être effectuer sans réaliser des expériences in vivo. Afin de pouvoir répondre à ce type de problèmatique, l'utilisation de modèle de souris dites "humanisés" permet de pallier la complexité de la réponse immunitaire en mimant de manière plus spécifique la physiologie humaine. Et cela tous en permettant d'extrapoler les effets qu'ils pourront avoir avec d'avantage de sécurité. Suite à l'émergence de nouvelles procédures thérapeutiques, la mise à disposition d'un nouveau modèle d'animaux humanisés : le rat humanisé représentera une alternative intéressante aux souris humanisées. Ce projet expose donc la procédure visant à améliorer l'humanisation de rats immunodéficients qui recevront une greffe de cellules souches et une greffe de thymus.
Bénéfices attendus
Sur le court terme, ce projet pourra montrer une meilleure compréhension du système immunitaire humain grâce à sa modélisation dans les rats humanisés par une greffe de cellules souches et une greffe de thymus. Ces animaux pourront montrer un système immunitaire semblable au système immunitaire humain.
Procédures
Les différentes interventions sur les animaux sont : l'injection de cellules souches, la greffe de thymus soit en sous-cutanée soit sous la capsule rénale (durée entre 10-20 min). Les injections d'anticorps LoCD2b en intra-péritonéale à J0, J7 et J14. Ainsi que des prélèvements se déroulant à semaine 12, 18 et 24 post-injection d'une petite quantité de sang lors d'un prélèvement retro-orbitaire (10 min de procédure de l'endormissement au réveil). Toutes ces procédures expérimentales sont maitrisées.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendues sont : le stress dû à la séparation de la mère pouvant également induire un risque de rejet des petits par celle-ci, de la douleur pouvant être générés par les différentes procédures expérimentales (placement biopsie thymique en sous cutanée ou sous la capsule rénale, l'injection en ip, des prélèvements de sang ou de la contention des animaux, GVHD...). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l'étude grâce à une échelle de point limites. Toute atteinte des points limites préétablis pourra entrainer une euthanasie pour raison éthique.
Devenir
A l'issue de cette procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvements (sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus) ainsi qu’une analyse immunologique par cytométrie en flux afin de pouvoir documenter l'effet des différents traitements étudiés sur le système immunitaire.
Remplacement
Il n'est à l'heure actuelle pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et d'étudier l'effet sur celui-ci d'anticorps et/ou médicament. Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'études pré-clinique réalisée chez l'animal. Le rat ayant un système immunitaire humain constituera donc un modèle scientifiquement robuste et fiable pour reproduire les mécanismes d'action susceptibles d'être mise en œuvre chez l'homme.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet est le minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entres les groupes.
Raffinement
Nous cherchons à raffiner au maximum nos protocoles pour limiter le stress du à l'expérimentation. Les rats seront hébergées en cages ventilées par groupe de 2 à 5 individus dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (igloo en PVC...). La nourriture et l'eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et par les responsables des procédures. Par ailleurs, nous maitrisons les gestes expérimentaux. L'état de santé des animaux seront surveillés par une échelle de point limites. Toute atteinte des points limites préétablis pourra entrainer une euthanasie pour raison éthique.
Choix des espèces
Le choix du rat repose sur le fait que ces animaux présentent de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l'homme que la souris. Les études fonctionnelles seront plus faciles à réaliser. Il est également à prendre en compte que certains modèles de greffes vasculaires ou autres modèles (ex : implantation d'organoïdes humains) seront plus simples à effectuer chez le rat humanisé par rapport aux modèles de souris humanisés.
Evaluation préclinique de nouveaux traitements visant à lutter contre le syndrome d’ischémie-reperfusion générée au cours d’une transplantation rénale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
2 052 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie d'ischémie-reperfusion du rein gauche de quarante-cinq minutes à une heure, l'ablation complète du rein droit la veille de sa mise à mort, jusqu'à sept semaines d'administration quotidienne des composés testés, des micro-prélèvements de sang et des échographies. Le porteur décrit les suites possibles de l'opération, hémorragie lors de la pose du clamp, douleurs, atteinte partielle de la fonction rénale, sang dans les urines, perte de poids. Les molécules ainsi évaluées viennent de la recherche de ses clients et ont déjà montré leur efficacité sur des cellules rénales humaines en culture, un résultat que le projet propose de confirmer sur deux mille souris opérées.
Objectifs
La greffe de rein est un traitement de choix de certaines maladies rénales chroniques (MRCs) arrivées à un stade ultime. Toutefois, il s’accompagne d’un phénomène incontournable : le syndrome d’ischémie-reperfusion (IR) rénal. L’ischémie correspond à la phase où l’organe du donneur est isolé de la circulation sanguine et subit un manque d’apport temporaire en nutriments et en oxygène. La reperfusion de l’organe chez le receveur se traduit quant à elle par une reprise de la circulation sanguine. Cette reperfusion est brutale ce qui génère énormément d’inflammation au niveau du greffon. À court terme, les conséquences délétères du syndrome d'IR se traduisent principalement par une reprise différée de la fonction rénale survenant post-transplantation, elle correspond à une insuffisance rénale aiguë (IRA). À plus long terme, l’IRA peut évoluer soit vers (1) une MRC dans laquelle on peut observer l’apparition progressive de lésions microvasculaires et d’une fibrose rénale, soit vers (2) une insuffisance rénale terminale qui mène au retour du patient sur liste d’attente pour une nouvelle greffe de rein exacerbant ainsi le besoin continu d’organes. Malgré les progrès réalisés dans la prise en charge de ces patients, l’IRA d'origine ischémique demeure une complication fréquente et grave, associée à un risque accru de morbidité et de mortalité. Actuellement, les traitements les plus courants reposent sur l’administration d’immunosuppresseurs et l’utilisation d’une fluidothérapie. En revanche, ils n’ont que pour but principal une prévention du rejet de la greffe et un maintien de la volémie du patient, respectivement. D’autres stratégies sont en cours de développement et impliquent entre autres des molécules additives aux solutions de conservation, des modalités de perfusion du greffon ou encore des molécules administrées directement chez le receveur. Ces approches n’étant pas validées, il apparaît comme étant primordial de renforcer les recherches dans cette indication. L’objectif du projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés issus de la Recherche de nos clients dans un modèle d’IR rénale chez la souris afin de prévenir et de traiter le syndrome d’IR chez l’Homme. Ces composés ayant par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur des cellules rénales humaines de patients.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels consistent en l’administration d’immunosuppresseurs et l’utilisation d’une fluidothérapie, mais ne présentent pas d’activité majeure sur l’IR générée au cours de la transplantation rénale, ni même sur la transition d’une IRA vers une MRC qui en découle. De plus, les immunosuppresseurs sont associés à de nombreux effets secondaires. L’identification d’un ou plusieurs candidat(s) médicament(s) agissant plus spécifiquement au niveau du greffon permettra d’augmenter l’efficacité du traitement tout en diminuant les effets secondaires et participera activement à réduire le nombre de patients en attente d’une nouvelle de greffe de rein.
Procédures
1/ Chirurgie ischémie-reperfusion du rein gauche sous anesthésie gazeuse (environ 45 minutes-1 heure), une fois dans l’étude 2/ Chirurgie néphrectomie sous anesthésie gazeuse (ablation complète du rein droit, environ 20 minutes), une fois dans l’étude et la veille de la mise à mort de l’animal 3/ Injection sous-cutanée d’un analgésique sur animal vigile, deux fois le jour de la chirurgie (quatre fois au cours d’une étude) 4/ Administration des composés à tester ou de leur solvant soit par gavage oral, soit par injection en sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineux, une à deux fois/jour pour la voie orale ou sous-cutanée, une fois/jour pour la voie intrapéritonéale, trois fois/semaine à raison d’une fois/jour pour la voie intraveineuse pendant un maximum de 7 semaines 5/ Micro-prélèvements de sang réalisés en quelques secondes sur souris vigiles, une session d’1 à 3 ponction(s) sur 24 heures, une semaine minimum de récupération (trois sessions maximum) 6/ Échographies effectuées sous anesthésie gazeuse au maximum deux fois dans une étude (environ 20 minutes/examen) 7/ Anesthésie gazeuse pour les prélèvements sanguin et urinaire puis la mise à mort, une fois dans l’étude
Impact sur les animaux
Les effets indésirables associés à la chirurgie sont : - pendant la chirurgie : stress lié à l’anesthésie, risque d’hémorragie lié à la pose et/ou retrait du clamp sur les vaisseaux et également lors de la néphrectomie - post-chirurgie : douleurs, atteinte partielle de la fonction rénale, mobilité réduite, perte de poids dans les 24 à 48hrs post-chirurgie, sang dans les urines (non systématique) Les différents traitements administrés soit par gavage oral, soit par injection en sous-cutanée, intrapéritonéale ou intraveineuse sont susceptibles de créer de l’inconfort voire de la toxicité. Les différents prélèvements de sang réalisés au cours de l’étude peuvent également générer de l’inconfort.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale, des analyses sur les reins étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.
Remplacement
À ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement l’ensemble des caractéristiques associées au syndrome d’ischémie-reperfusion, l’insuffisance rénale aiguë et sa transition vers une maladie rénale chronique qui en découlent, ni même la cinétique d’absorption et d’élimination d’une molécule. Cette complexité rend ainsi nécessaire le recours à des expériences in vivo pour comprendre ce phénomène pathologique et évaluer de potentiels candidats médicaments.
Réduction
Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter le nombre d’animaux lors de la phase de mise au point. Le nombre de souris par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. L’imagerie par ultrasons (échographe), méthode non invasive, sera employée pour un suivi longitudinal des lésions microvasculaires et, par conséquent participera à diminuer le nombre d’animaux par groupe. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés au préalable sur la base de leurs efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant toute manipulation. Hébergement : Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d’acclimatation (enrichissement : igloo, sizzle pad, aspen). Chirurgie (ischémie-reperfusion et néphrectomie) : Afin de palier l'inconfort lié aux gestes chirurgicaux, un programme d'anesthésie sera effectué. Un anti-douleur sera administrée en sous cutanée 30 minutes avant et 4 heures après la chirurgie suivi d’un apport dans l’eau de boisson pendant 48 heures. Un antiseptique puis un anesthésique local seront appliqués sur la peau au niveau de la zone d’incision. Pour éviter l’assèchement des yeux, une goutte de gel ophtalmique sera déposée sur chaque œil au début et en fin de procédure. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Une sonde rectale sera placée afin de mesurer la température corporelle, le tapis régulera alors sa température pour maintenir le corps à 37°C. En fin de procédure, les animaux seront replacés dans leur cage sur tapis chauffant jusqu’à leur réveil. Afin de faciliter la prise de nourriture, quelques croquettes humidifiées seront placées dans la cage. Un enrichissement adapté (igloo en carton) sera utilisé afin d’éviter tout accroc avec la cicatrice. La litière sera également remplacée par une litière plus douce et plus absorbante en fibre de cellulose pour éviter toute irritation de la cicatrice. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse pouvant être infligées aux animaux, une surveillance journalière ainsi que des points limites précoces et spécifiques à ce modèle ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou à la mise à mort anticipée de l’animal. Lors de la mise à mort, les animaux seront placés sous anesthésie gazeuse profonde.
Choix des espèces
L’espèce choisie sera la souris, espèce majoritairement utilisée dans la littérature pour notre modèle de transition IRA-MRC. Les souris utilisées dans ce projet seront à un stade adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.
Mise en place d’un modèle murin de xénogreffe orthotopique de glioblastome 1/3
- Recherche appliquée
- Cancers
Opérées du crâne pendant trente minutes pour qu'une tumeur humaine de glioblastome soit implantée dans leur cerveau, puis transportées en voiture entre trois établissements, 307 souris passent ensuite en imagerie sous anesthésie une fois par semaine pendant quatre semaines, jusqu'à deux heures par séance. Les procédures vont du niveau de souffrance modéré pour 188 d'entre elles au niveau sévère pour 59, et 60 sont opérées puis tuées sans réveil. Le porteur indique que la croissance de la tumeur peut entraîner une perte de poids excessive et des effets neurologiques, et que les anesthésies répétées sont une source de stress. Toutes sont tuées quand les points limites sont atteints ou à la fin du projet, sauf une centaine d'entre elles, gardées pour la formation et le maintien des compétences du personnel.
Objectifs
Le glioblastome multiforme est la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. La médiane de survie globale varie de 15 à 18 mois et le taux de survie à 5 ans n’excède pas 5%. Le traitement de référence consiste en la chirurgie la plus complète possible suivie de l’association d’une radiothérapie et d’une chimiothérapie par le témozolomide. Malgré ce protocole thérapeutique, la majorité des patients rechute dans un délai médian de 8-9 mois. Il est donc aujourd’hui indispensable d’améliorer ce protocole. Dans cette démarche, il est connu que les glioblastomes sont caractérisés comme des tumeurs résistantes à l’irradiation. Cette résistance repose en partie sur le manque d’oxygène (hypoxie) au cœur de la tumeur et il a été démontré dans de nombreuses études que l’oxygénation des tissus représente un facteur prédictif de réponse à l’irradiation. Dans ce contexte, ce projet aura comme objectif la mise au point d’un modèle orthotopique de glioblastome, c’est-à-dire l’induction d’une tumeur au sein même de la cavité crânienne chez la souris afin d’évaluer la réoxygénation cellulaire et la radiosensibilisation et ainsi d’améliorer la survie des patients atteints de glioblastome. Ce projet se déroulera dans 2 établissement utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait contribuer à optimiser le traitement actuel des patients atteints de glioblastome en sensibilisant les tumeurs aux effets de la radiothérapie pour améliorer la survie de ces patients.
Procédures
A) Dans l’Etablissement Utilisateur (EU) 1/3 nous ferons une Chirurgie 1 : une injection analgésique d’une minute sur animal vigile, puis une anesthésie générale gazeuse, suivie d’une chirurgie de 30 minutes avec une injection d’une minute et suture sous anesthésie générale et locale. B) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 1 : une injection d’une minute sur animal vigile, puis imagerie de 30 minutes sous anesthésie générale pour l’observation de la croissance tumorale. Puis, une injection sur animal sur animal vigile, suivi 24h après d'une imagerie de 15 minutes sous anesthésie générale. Cette procédure sera réalisée à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. C) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Imagerie 2 : Imagerie sous anesthésie générale de 2 heures pour l’observation de la croissance tumorale et de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. D) Dans l’EU 2/3 nous ferons une Chirurgie 2 : une injection d’une minute d’un anesthésique général sur animal vigile, puis des injections d’une minute d’un anesthésique local et d'un analgésique, puis une chirurgie de 2 minutes, suivi d’une perfusion de 5 minutes. E) Dans l’EU 3/3 nous ferons une Imagerie 3 : Imagerie sous anesthésie générale de 90 minutes pour l’observation de l’hypoxie à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines. F) Dans l'EU 2/3 un groupe subira les procédures A et F. Un autre subira les procédures A, puis B, suivi D puis F. Un autre subira les procédures A, puis C, suivi D puis F. Un autre subira les procédures : A, puis C, D et E puis F. G) Dans l’EU 1/3 et 2/3 nous ferons injection d’une minute sur animal vigile à raison d’une fois par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
La mise en place des modèles pourra induire des douleurs/infections suite à la chirurgie associée à une potentielle perte de poids transitoire et une déshydratation. Le transport des animaux entre les trois EU pourra induire un stress. Les injections nécessaires à l’imagerie pourront entrainer un stress chez l’animal se traduisant par des problèmes respiratoires. Les suivis par imagerie pourront induire du stress suite aux anesthésies répétées. La croissance des tumeurs pourra entrainer une perte de poids excessive et des effets neurologiques.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort lorsque les points limites sont atteints ou à la fin du projet, sauf les animaux utilisés pour la formation ou le maintien des compétences du personnel.
Remplacement
Les études préliminaires réalisés sur cellules cancéreuses ont permis de valider 2 types de cellules pour notre modèle de glioblastome chez la souris. Ce modèle chez l’animal permet de mimer au plus proche la complexité d'un environnement tumoral chez l'individu (vascularisation, inflammation…).
Réduction
Les études préliminaires sur cellules ont également permis de réduire le nombre de lignées à 2 afin de réduire le nombre de groupe utilisant des animaux. La mise en place du modèle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisées dans de futurs projets étudiant l’amélioration de la radiothérapie sur un modèle de glioblastome. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé avec suffisamment d’animaux pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente par les 2 méthodes d’imagerie décrites. Ce projet utilise des méthodes d’imagerie non-invasives permettant de suivre un même animal au cours du temps réduisant le nombre d’animaux
Raffinement
Chaque protocole expérimental prend en compte un potentiel impact sur la souffrance animale et différents critères ont été établis pour justifier un arrêt de l'expérience en cours. Les animaux seront hébergés à 5-8 souris par cage (souris issues de différents groupes de traitement), dans des cages à couvercle filtrant avec de la litière, des frisures de papier kraft, des tubes de coton (nidification), des bâtons et des tunnels. Les procédures expérimentales seront réalisées par des manipulateurs expérimentés. Les animaux seront acclimatés à leur hébergement deux semaines avant de démarrer les procédures. Des anesthésies et des analgésies sont appliquées dès que possible pour éviter tout risque de stress et de souffrance. Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale et seront évalués 3 fois par semaine. Si une souris présentait des signes d’effet(s) secondaire(s) ou de symptômes révélant un inconfort ou l’apparition de douleur, le vétérinaire désigné sera contacté pour venir voir les animaux, poser un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées. Les méthodes d’imagerie utilisées sont reconnues non-invasives et non-irradiantes. Les animaux seront transportés en voiture entre les trois Etablissements Utilisateur (temps maximum de 10 minutes entre les EU1 et EU2 et de 30 minutes entre les EU2 et EU3). Pour cela, les animaux seront mis dans des boites de transport avec un filtre sanitaire, de la nourriture, de l’eau gélifiée, des frisures de papier et du matériel de nidification avec ajout de chaufferettes sous les boites.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus utilisée en expérimentation en oncologie. La raison la plus importante du choix de la souris pour notre étude est sa similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Le modèle de souris choisi permettra l’implantation de lignées cancéreuses humaines et le développement des tumeurs orthotopiques. Les animaux utilisés seront adultes c’est-à-dire à partir de 6/8 semaines car ils possèdent un poids et un développement optimales pour les actes subit (chirurgie, injections…).
Evaluation de l’efficacité de l’ORFADIN pour le traitement du cancer pancréatique avec des métastases
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Greffées de cellules tumorales dans la rate au cours d'une chirurgie de vingt-cinq minutes, puis suivies par imagerie sous anesthésie, 191 souris vont être utilisées, dont 161 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie reçoit trois injections de chimiothérapie par semaine pendant deux semaines. L'objet est d'évaluer un médicament commercialisé depuis 2001 pour une maladie héréditaire du foie, l'ORFADIN, contre le cancer du pancréas métastatique, les résultats devant être intégrés à un brevet protégeant cette nouvelle indication. Le porteur indique que l'usage d'anti-inflammatoires et de morphiniques est "proscrit" dans ce protocole parce qu'ils modifient le métabolisme tumoral, la seule réponse prévue à la douleur étant alors la mise à mort de l'animal, par dislocation cervicale.
Objectifs
L'ORFADIN est un médicament utilisé en clinique depuis 2001 pour le traitement d’une maladie héréditaire du foie engendrée par la dégradation incomplète de la tyrosine, un acide aminé apporté par les protéines alimentaires. Des travaux de l’équipe montrent que la voie de dégradation de la tyrosine par les cellules métastatiques est exacerbée et qu’elle est essentielle à leur survie et à leur expansion (in vitro). Le but de ce projet est d’évaluer l’efficacité de l’inhibition de la dégradation de la tyrosine par l’ORFADIN et/ou de l’apport de tyrosine par l’alimentation (i.e. régime déficient en tyrosine) dans le traitement du cancer du pancréas avec des métastases. Ce projet comportera 3 objectifs : Obj. 1 : Evaluer l’efficacité de l'ORFADIN associé ou non à la chimiothérapie, le FOLFIRINOX (abréviation FFX utilisée dans la suite de la saisine) dans le traitement des métastases du foie : - administré seul l’ORFADIN prolonge-t-il l’effet de la chimiothérapie sur les métastases, - combiné à la chimiothérapie est-il plus efficace que la chimiothérapie, - si ce schéma thérapeutique est poursuivi par l’administration d’ORFADIN, maintient-on l'effet anti-métastatique du traitement combiné ? - combiné à un régime sans tyrosine, le traitement combiné ORFADIN+chimiothérapie est-il plus efficace ? Obj. 2 : Evaluer l’efficacité de l'ORFADIN associé ou non au FFX dans le traitement des tumeurs primaires pancréatiques. Les 3 questions posées dans l’objectif 1 seront adressées afin d’évaluer l'efficacité des différents schémas thérapeutiques sur la progression/régression de la tumeur pancréatique. Obj. 3 : Etude de la toxicité de l'ORFADIN. Les modèles expérimentaux utilisés seront des souris développant des métastases du foie (Obj.1 et 3) et des souris développant des tumeurs pancréatiques (Obj. 2 et 3).
Bénéfices attendus
Cette étude pré-clinique a pour but de confirmer l’efficacité de l'ORFADIN associé ou non au FFX dans le traitement des cancers pancréatiques avec des métastases et d’évaluer la toxicité de ce traitement combiné. Les résultats obtenus permettront seront inclus dans le brevet visant à protéger l’utilisation de l’ORFADIN pour le traitement du cancer pancréatique avec des métastases. Elle permettra également de proposer un essai clinique aux patients atteints de cancer pancréatique avec des métastases, qui sont actuellement inéligibles à la chirurgie, seul traitement curatif disponible en clinique.
Procédures
Les souris de la procédure 1 seront soumises à une procédure chirurgicale de greffes de cellules tumorales dans la rate, une seule procédure chirurgicale par souris sera effectuée. Cette procédure chirurgicale durera 25 min max. (temps d'endormissement, chirurgie et réveil de l'animal). Les souris traitées au FOLFIRINOX recevront 3 injections par semaine de cette combinaison de chimiothérapie et ce pendant 2 semaines. La durée de ce geste est de 1-2 min. Le suivi de l’évolution des métastases du foie par de l’imagerie en bioluminescence a une durée estimée par animal de 15 min (temps d'endormissement, imagerie et réveil de l'animal).
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont pour la procédure 1 : avant l’acte chirurgical : contention et injections sous-cutanées d’antalgique et d’anesthésique local qui peuvent générer un léger stress ; au cours de l’acte chirurgical : l’anesthésie gazeuse peut engendrer une hypothermie et une détresse respiratoire si elle est mal contrôlée ; en post-chirurgie : des complications post-opératoires (rupture des points de sutures, infection de la plaie) peuvent survenir et engendrer de la douleur qui doit être rapidement prise en charge ; les animaux devront être isolés de leurs congénères ce qui génère un stress. Pour les procédures 1 et 2, les nuisances au cours du développement de la tumeur primaire et des métastases sont les suivantes : douleur, perte de poids, mobilité réduite, apparences et/ou comportements anormaux, celles-ci sont grâce à notre expertise du modèle rapidement détectées et en fonction du score déterminé, la procédure adaptée sera mise en œuvre.
Devenir
Afin d'évaluer la prise métastatique au sein du foie et la régression de la tumeur primaire en fonction des traitements administrés aux animaux, ceux ci seront euthanasiés par dislocation cervicale et autopsiés.
Remplacement
Le recours à des animaux est absolument indispensable pour mener à bien ce projet qui vise à inhiber le dialogue entre les cellules cancéreuses des métastases de foie et les cellules du foie avoisinantes. Ceci, en utilisant un médicament déjà sur le marché pour une autre indication thérapeutique que le cancer du pancréas, et à évaluer son effet anti-cancéreux sur la tumeur du pancréas et sur les métastases du foie, et sa toxicité sur les organes sains. Ce projet fait suite à des expériences de culture de cellules de métastases de foie cultivées avec des cellules de foie validant la pertinence d’inhiber le dialogue entre ces deux types cellulaires pour limiter l’expansion des métastases. Ainsi, il est à présent nécessaire de démontrer au sein d’un hôte vigile, porteur de métastases et avec des fonctions du foie non-altérées, qu’un médicament associé ou non à un régime alimentaire spécifique, combiné à la chimiothérapie de référence des patients, permettrait de réduire la progression des métastases sans entrainer d’importants effets secondaires, qui ne peuvent être appréhendés que sur des modèles animaux de cancer pancréatique avec des métastases.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à l’obtention d’un effet anti-tumoral significatif de chaque traitement par rapport aux animaux non-traités a été défini en utilisant le test statistique d’analyse de la variance suivi de comparaisons multiples. La diminution attendue de l’incidence/taille des tumeurs primaires/métastases et les différences inter-individuelles ont été estimées sur la base de données bibliographiques et de résultats antérieurs de l’équipe. Ainsi, pour la procédure 1, le nombre d’animaux nécessaire est de 13/groupe alors que pour la procédure 2, il est de 10/groupe.
Raffinement
Les personnes compétentes (formations en expérimentation animale + chirurgie) réaliseront les injections d’antalgiques pré et post-opératoires et de l’anesthésique local avant l’incision, l’incision et l’injection des cellules tumorales dans la rate. Ceci afin d’éviter toutes complications post-opératoires et limiter ainsi le nombre d’animaux à opérer. Une grille de points limites sera quotidiennement remplie pour chaque modèle : souris avec une tumeur pancréatique ou des métastases dans le foie, et des mesures adéquates seront prises : euthanasie directe si nécessaire car l’utilisation d’anti-inflammatoires non stéroïdien ou de dérivé morphinique pour limiter la douleur est proscrite dans le cadre de ce protocole. En effet, les données bibliographiques montrent que leur administration altère le métabolisme tumoral, limite la croissance tumorale et/ou potentialise l’action de la chimiothérapie. Un enrichissement matériel de l’environnement des animaux (cocon, nid, maisonnette, etc…) est mis en place dans toutes les cages afin que les souris expriment un répertoire diversifié de comportements normaux.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris, modèle d'étude de référence dans le domaine du cancer pancréatique et dont les caractéristiques morphologiques et génétiques des tumeurs récapitulent fidèlement la maladie chez l’homme. De plus, cette espèce se caractérise par de nombreux avantages, notamment leur développement rapide, une descendance nombreuse et une facilité d’entretien et d’élevage. Les souris développant des tumeurs pancréatiques seront traitées ou non dès l’âge de 6 semaines pour une durée de 4 semaines. Elles seront euthanasiées au stade de jeune adulte (environ 10 semaines après la naissance), stade à partir duquel les tumeurs prélevées sont dites de haut grade, comme la majorité des tumeurs pancréatiques diagnostiquée chez les patients. Ce dernier argument est requis pour notre étude qui vise à améliorer à terme l’efficacité des traitements des tumeurs pancréatiques à fort potentiel métastatique . L'implantation des cellules tumorales dans la rate des souris saines, seront réalisées chez des souris âgées de 5 semaines, puis traitées ou non pendant 4 semaines, la semaine suivant l'implantation. Elles auront un âge similaire aux souris avec tumeur pancréatique lorsque les traitements débuteront, à ce stade, l’impact du métabolisme sur la progression métastatique ne sera pas impacté par une prise de poids ou tout autre facteur lié au vieillissement de l’animal. Elles seront euthanasiées au même âge que les souris avec des tumeurs pancréatiques.
Régulation de la réponse de la microglie aux cytokines et de la clairance des dépôts amyloïdes et des agrégats de tau par le remodelage des glycanes sulfatés
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Environ 80 % des souris porteuses du gène Tau sont mortes à l'âge de 12 mois, et leur faiblesse des pattes évolue vers une paralysie entre 7 et 10 mois, avec une posture voûtée et des difficultés à s'alimenter. 2300 souris, dont des souris porteuses des gènes hAPP ou Tau liés à la maladie d'Alzheimer, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : toutes ont le bout de la queue coupé sous anesthésie pour le génotypage, et 366 sont destinées aux expériences sur cinq ans. Chez les petits de femelles porteuses du gène hAPP, la mortalité atteint environ 15 % sur les six premiers mois. Le porteur écrit pourtant que les lignées utilisées "ne présentent aucun problème physique ou physiologique". Toutes les souris sont tuées à la fin du protocole, après anesthésie et analgésie, sans que le texte précise le rôle des souris génotypées au-delà des 366 destinées aux expériences.
Objectifs
Le projet de recherche vise à comprendre comment les molécules cérébrales appelées glycanes sulfatés régulent l'élimination des substances responsables de la maladie d'Alzheimer par les cellules immunitaires du cerveau dans des modèles de souris. Nous étudierons si un modèle de souris dont le gène d'une enzyme dégradant les glycanes sulfatés est augmenté ou un modèle de souris dont le gène d'une enzyme générant des glycanes sulfatés n'est pas fonctionnel dans les cellules immunitaires du cerveau, serait bénéfique pour l'élimination des substances responsables de la maladie d'Alzheimer in vivo. Des études animales sont nécessaires pour examiner ces possibilités de limiter la progression de la maladie par l'augmentation d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés ou par l'élimination d'une enzyme génératrice ou d'une molécule de protéine présentatrice dans de cerveau de modèles murins de la maladie d'Alzheimer.
Bénéfices attendus
La modification des glycanes sulfatés dans les cellules immunitaires du cerveau in vivo aura un impact sur la recherche en matière de neuroinflammation et de neurodégénérescence. L'analyse des rôles régulateurs des glycanes sulfatés nous permettra de comprendre en détails les mécanismes moléculaires par lesquels les cellules immunitaires cérébrales éliminent les substances responsables dans le cerveau de la maladie d'Alzheimer. Notre analyse des cellules immunitaires du cerveau in vitro est applicable au criblage de composés chimiques susceptibles de potentialiser le traitement thérapeutique des patients affectés par la neurodégénérescence. Les résultats du profilage de l'expression des gènes et de la mise en évidence d'une expression génétique altérée permettraient de découvrir de nouvelles cibles pharmacologiques impliquées dans la cause de la maladie d'Alzheimer. Nos données déjà obtenues montrent que l'augmentation d'une enzyme dégradant les glycanes sulfatés améliore l'élimination des maladies cérébrales responsables de la maladie in vitro, indiquant la faisabilité du projet proposé et ouvrant la voie à de nouvelles approches pour contrôler les causes de la maladie d'Alzheimer. Les concepts innovants concernant la modification des glycanes sulfatés dans le cerveau seront étendus à un autre modèle murin de la maladie d'Alzheimer appelé tauopathie. Dans l'ensemble, notre objectif ultime est de développer une nouvelle stratégie de traitement de la maladie d'Alzheimer, afin de contribuer à l'amélioration de la santé et du bien-être, ainsi qu'au bien-être social et économique. Il s'inscrit dans la priorité nationale « Plan maladies neurodégénératives ».
Procédures
Le bout de la queue (
Impact sur les animaux
Les modèles de souris de la maladie d'Alzheimer, que nous utiliserons dans ce projet, présentent des déficits de la mémoire spatiale et de l'apprentissage. Les petits nés de femelles porteuses du gène responsable de la maladie, appelé hAPP, ont un taux de mortalité d'environ 15 % au cours des six premiers mois de leur vie. Environ 80 % des souris porteuses d'un autre gène responsable de la maladie, appelé Tau, meurent à l'âge de 12 mois, avec la survie médiane d'environ 9 mois. Elles présentent une rétraction des pattes lorsqu'elles sont soulevées par la queue, suivie d'une faiblesse des pattes. Ces déficits moteurs évoluent vers une paralysie à l'âge de 7 à 10 mois, avec une posture voûtée et des difficultés à s'alimenter. Une légère diminution du poids est observée à l'âge de 11 mois. La coupe de la queue pour le génotypage entrainent une douleur légère de courte durée. Les souris seront mises à mort après anesthésie et analgésie.
Devenir
Pendant la durée de la procédure, les animaux sont maintenus en vie. Puis, à la fin du protocole, toutes les souris sont euthanasiées selon la procédure.
Remplacement
Des lignées de cellules immunitaires cérébrales de souris immortalisées et des essais biochimiques et biologiques seront utilisés en parallèle dans le laboratoire. Les objectifs du projet proposé sont d'étudier les effets bénéfiques d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés sur les fonctions des cellules immunitaires cérébrales et d'examiner si l'augmentation d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés pourrait réduire la masse des matériaux responsables de la maladie dans le cerveau des souris modèles de la maladie d'Alzheimer in vivo en facilitant l'activité soutenue des cellules immunitaires cérébrales au fil du temps. Dans cette phase, l'utilisation d'animaux est essentielle.
Réduction
Le nombre de souris est réduit en utilisant chaque hémi-cerveau pour deux expériences différentes. Le nombre de souris par groupe est réduit au minimum afin de garder une analyse statistique fiable. Ce plan expérimental a déjà été publié dans la littérature ce qui permet de réduire au minimum statistique le nombre d'animaux nécessaires à l'étude.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe de cinq dans un milieu enrichi (un bâton, un tunnel ou dôme ou papier craft) dans des cages de taille suffisante et avec un accès libre à l’eau et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera surveillé tous les jours. Les différentes lignées utilisées dans nos procédures ne présentent aucun problème physique ou physiologique. L’ensemble des expérimentations est mené par du personnel qualifié et formé afin d’éviter tout stress ou inconfort de l’animal avec une attention particulière sur la gestion de la douleur. Nous serons attentifs à observer si les animaux souffrent ou présentent un comportement anormal en lien avec le responsable du bien-être animal en observant les paramètres cliniques suivants Les points limites : -Perte de poids rapide 15 à 20% en quelque jours, longue période de perte de poids -Poil hérissé, dos rond, abdomen distendu ou léthargie -Diarrhée -Toux, râles, respiration pénible, écoulements nasaux -Signes d’atteinte du Système nerveux central -Tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté Ce suivi sera réalisé en lien avec le responsable du bien-être animal. Les animaux présentant un de ces critères seront mises à mort.
Choix des espèces
La souris est l'animal classiquement utilisé pour les études sur la maladie d'Alzheimer. Les modèles murins de la maladie d'Alzheimer sont largement utilisés pour les études de recherche fondamentale. De plus, de nombreux outils sont disponibles chez la souris (anticorps, kit et appareil), permettant une exploitation maximale des tissus obtenus. Des souris âgées de 3 mois, 6-9 mois et 15-18 mois seront utilisées. Dans le modèle de souris de la maladie d'Alzheimer, qui surexprime le gène responsable de la maladie, appelé hAPP, les niveaux de matériaux responsables de la maladie dans une région particulière du cerveau, importante pour la mémoire, commencent à augmenter vers l'âge de 6 semaines. Les substances pathogènes deviennent évidentes dans les régions particulières du cerveau nécessaires à la mémoire. Ce phénotype est progressif, avec des pics importants à l'âge de 8-10 mois. Une augmentation significative de l'activation des cellules immunitaires du cerveau a été observée dans ces régions à l'âge de 6-9 mois. Dans le modèle de souris qui exprime l’autre gène responsable de la maladie, appelé Tau, les matériaux responsables de la maladie qui affectent directement les cellules neuronales et provoquent une perte de mémoire commencent à apparaître vers l'âge de 6 mois. Ces phénotypes ont fait l'objet de nombreuses publications dans le monde entier et ont permis d'accumuler des données utiles pour l'étude de la maladie d'Alzheimer.
Etude pilote de validation de protocole d’injections répétées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pour valider les véhicules qui diluent les molécules fournies par des clients, 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Par groupes de 8, à raison de six études par an au plus, chaque souris reçoit un produit témoin jusqu'à deux fois par jour pendant 14 jours, par injection intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse, ou par gavage. Le porteur affirme que ces gestes "n'affectent pas le bien-être des animaux plus d'une heure", et cite pourtant un dos voûté, des yeux plissés, une inflammation du péritoine ou des diarrhées parmi les effets possibles. L'état général des souris, leur toilettage, leur posture, leurs vocalisations et leur poids sont suivis chaque jour pour repérer un point limite. Toutes les souris sont tuées à la fin du protocole, et leurs organes ne sont prélevés que si un effet négatif est observé.
Objectifs
Dans le cadre de l'amélioration continue de nos méthodes de travail, notre objectif est de valider les produits utilisés pour diluer les molécules d'intérêt fournies par nos clients, lorsque ces véhicules n'ont pas encore été testés au préalable. Cette validation est cruciale lors de l'arrivée de nouveaux projets afin de garantir que le produit choisi n'entraîne pas de douleur aiguë ou chronique chez les animaux. L'objectif principal de cette étude est de confirmer les produits injectés aux animaux sont innofensifs. En assurant l'absence de douleur ou de détresse liée à l'administration du produit, nous serons en mesure de procéder aux études de traitement répétées en toute confiance, sans compromettre le bien-être animal et en garantissant l'exactitude des résultats expérimentaux, s'incluant dans le principe de raffinement. Cela nous permet également d'éviter de lancer des accouplements et de créer des cohortes avant d'être entièrement sûrs du protocole de l'étude, s'incluant dans le principe de réduction.Nous avons estimé, sur la base des projets réalisés à l'institut au cours des deux dernières années, que cette étude préliminaire pourrait être nécessaire au maximum six fois par an, en fonction des nouveaux projets nécessitant l'utilisation de produits non encore testés.
Bénéfices attendus
- Évaluation de la sécurité du produit : Assurer que l'administration du produit ne provoque ni douleur aiguë ni douleur chronique chez les animaux. Cela est crucial pour garantir que nos essais ne compromettent pas le bien-être animal. - Fiabilité des études : En validant la non toxicité du produit, nous serons en mesure de mener des études de traitement répété en toute confiance, ce qui nous permettra de fournir des résultats fiables et précis sur les effets des molécules testées.
Procédures
Chaque animal sera soumis à 1 administration d'un produit contrôle au maximum 2 fois par jour pendant 14 jours par voie intrapéritonéale, sous cutanéee, intraveineuse ou par gavage. Ces gestes durent environ 1 minute et n'affectent pas le bien-être des animaux plus d'une heure.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront des injections répétés pouvant conduire de manière aigue à une diminution de la mobilité de l'animal ou a des anomalies posturales (dos vouté, yeux plissés). En chronique les injections peuvent induire une irritation locale ( injection sous-cutanée), une inflammation du péritoine (injection intra-péritonéale), une douleur musculaire (injection intramusculaire) ou des diahrées (gavage oral).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole et les organes seront collectés si un effet négatif du traitement est visualisé.
Remplacement
Tester le produit à injecter avant la réalisation de l'étude expérimentale est une étape essentielle qui contribue à la sécurité, à l'efficacité et à la rigueur scientifique de la recherche. Cette phase permet de garantir que les résultats obtenus sont fiables et que les animaux ne subissent aucune souffrance inutile, répondant ainsi aux exigences éthiques et scientifiques des études expérimentales. Ceci va permettre d'identifier des potentielles réactions indésirables de l'injection ou du composé en lui même mais egalement d'optimiser sa formulation ci necessaire
Réduction
Une étude pilote de 8 animaux sera réalisée pour les études necessitant une administration répétée d'un composé lorsque le client ne l'aura jamais testé par lui même aupréalable (exemple: véhicule repris de la littérature). Tester le véhicule en amont permet d'anticiper et de corriger d'éventuels problèmes avant qu'ils n'affectent l'étude principale, évitant ainsi des répétitioins d'une étude et donc l'utilisation de plus d'animaux. Cela nous permettra également d'éviter de lancer des accouplements et de créer des cohortes avant d'être entièrement sûrs du protocole de l'étude. Suite à nos retours sur les projets précédents et en concordance avec les études statistiques nous avons opté pour 8 animaux par groupe. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 8 animaux constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
La phase de test du produit contribue au raffinement des méthodes expérimentales en minimisant la douleur et la détresse, et en maximisant la qualité des données obtenues. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâton et balles à ronger). Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation ainsi que le poids chaque jour pendant les 14 jours de la procédure. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
La souris est un mammifère permettant une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux pourront être utilisés à partir de l'âge de 1 mois jusqu'à 1 an, en fonction des exigences spécifiques de l'étude principale. Cette flexibilité d'âge nous permet d'adapter les animaux au modèle expérimental en phase avec les problématiques physiologiques pertinentes pour chaque étude.
Tests de molécules à visées thérapeutiques sur un modèle murin de syndrome métabolique (obésité, diabète, fibrose hépatique (NASH)).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Nourries de régimes riches en graisses et en sucre pour développer obésité, diabète et stéatose hépatique, 990 souris, dont certaines au foie ou au système immunitaire humanisé, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude. Elles subissent des prises de sang répétées, dont certaines au sinus rétro-orbital sous anesthésie, et des tests de résistance à l'insuline et au glucose qui, avec la mise à jeun et une injection intrapéritonéale de glucose, durent de 5 h 30 à 13 h 30. Le porteur entend mettre ce protocole "à disposition des chercheurs" et y tester des candidats médicaments, en 33 études de quatre groupes. Pour ce niveau de souffrance déclaré modéré, il liste parmi les signes possibles des accidents vasculaires cérébraux, des crises cardiaques, une encéphalopathie hépatique, une ascite et des vomissements de sang.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer un modèle murin de syndrome métabolique, c'est-à-dire une association d'anomalies mêlant dans ce cas obésité, stéatose hépatique non alcoolique (NASH) qui est une pathologie caractérisée par un excès de graisses dans le foie qui n'est pas due à une consommation élevée d'alcool et le développement de diabète qui est donc une résistance à l’insuline. Ce syndrôme sera reproduit grâce à des régimes riche en graisse et en sucre mimant les régimes occidentaux et permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de cette pathologie et de tester de nouveaux candidats médicaments puisqu'aucune thérapie curative n'est approuvée.
Bénéfices attendus
En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire et/ou un foie humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier un syndrome métabolique (diabète, NASH, obésité) et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Procédures
Prélèvements sanguins : la fréquence et les volumes seront déterminés sur base du poids de la souris. La durée des prélèvements est de 10 à 15 secondes. Test de résistance à l’insuline et test de résistance au glucose comprenant une mise à jeun suivie de prise de sang pour analyse de la glycémie et injection intrapéritonéale d’une solution de glucose. Durée totale du test entre 5h30 et 13h30.
Impact sur les animaux
Pour le développement de ce modèle pathologique divers signes cliniques pouvant entraîner un inconfort pourront être observés: en lien avec le développement d’un diabète de type II : polyphagie, polyurie – polydipsie, troubles de la vision, asthénie, pathologie cardio-vasculaires (accident vasculaire cérébral, crise cardiaques), néphropathie, neuropathie, rétinopathie; en lien avec l’obésité: accumulation de graisse viscérale et augmentation du poids pouvant entraîner une difficulté à se mouvoir, pathologie cardio-vasculaire; en lien avec une insuffisance hépatique : état général dégradé, encéphalopathie hépatique, ictère, asthénie, anorexie, ascite, troubles de la coagulation, vomissement (hématémèse), diarrhée (méléna ou hématochésie). Des nuisances peuvent également être induites par les prélèvements sanguins et les injections et les effets potentiellement toxiques de composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Le modèle induisant des modifications délétères pour la santé de la souris, les souris seront mises à mort en fin d'étude.
Remplacement
Il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement qui mimerait le développement d'un syndrôme métabolique (diabète, obésité, NASH) tout en objectivant l’efficacité de molécules agissant, entre autres, sur l’activité du système immunitaire, la mort cellulaire, le stress oxidatif ou les taux d’insuline et de lipides dans le sang. Les modèles murins en général, et plus particulièrement la souris avec un foie et/ou un système immunitaire humanisé(s), constituent donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre cette maladie.
Réduction
Un total de 990 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 33 études de 4 groupes (contrôle négatif, contrôle positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe. Le nombre d'animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur les effets attendus de la série, ainsi que des tests statistiques paramétriques et non paramétriques. Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Six morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. À leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle cumulative de scores (donnés entre parenthèse) prenant en compte : l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, l’activité, la couleur des muqueuses et le score corporel. Les souris seront évaluées quotidiennement et l’échelle sera appliquée dès que nécessaire. Une souris avec un score clinique ≥ à 7 sera euthanasiée pour raison éthique. Le poids sera monitoré 1 à 3 fois par semaine. Le suivi de l’évolution pondérale pourra être adapté au stade de l’étude. Une perte de plus de 25%, calculée à partir du poids mesuré le plus élevé, sera considérée comme une raison de mise à mort. Une augmentation importante du poids et une obésité entraînant une invalidité sera aussi considérée comme une raison de mise à mort. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les prélèvements au sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie générale.
Choix des espèces
L'utilisation de modèles murins dans les syndromes métaboliques a déjà été démontré dans la littérature scientifique. Par ailleurs, nous maitrisons l'humanisation du système immunitaire ainsi que l'humanisation du foie chez les souris. En se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre avec cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de l'age de 16 semaines pour les animaux humanisés, ceci prenant en compte une période d'humanisation de 12 semaines (minimum) qui peut être réalisée à partir de l'age de 3 à 4 semaines. Les animaux non humanisés seront utilisés à partir de l'age de 6 à 8 semaines afin d'utiliser des animaux adultes. Les études seront réalisées sur des groupes d'âges homogènes.
Evaluation de l’effet neuroprotecteur de la photobiomodulation sur des modèles murins de la maladie de Huntington.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
366 souris, de deux souches porteuses de la maladie de Huntington et de souches témoins, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Cinq jours par semaine, elles sont immobilisées 90 secondes pour un traitement de la tête par la lumière, avec des prises de sang éveillées tous les quinze jours, des IRM sous anesthésie jusqu'à une fois par mois et des tests de mouvement et de mémoire que le texte ne nomme pas. Si cette première partie est concluante, une seconde ajoute une chirurgie de 90 minutes pour implanter une source de lumière dans le cerveau. Dans les deux parties, les souris sont tuées dès que leurs symptômes moteurs évoluent "au-delà d'une gêne modérée". Le porteur compte parmi les bénéfices des "publications scientifiques et présentations en congrès", et renvoie un éventuel essai clinique à des "études complémentaires". Il présente aussi la seconde partie comme un moyen de limiter "le nombre de gros mammifères" d'une étude ultérieure.
Objectifs
Des études ont démontré que la lumière ralentie la maladie de Parkinson. La maladie de Huntington touche 6000 personnes en France. C’est une maladie génétique rare qui se traduit par la mort de neurones. Les symptômes handicapent grandement le quotidien des patients, et la maladie n’a pas à ce jour de traitement . La maladie de Huntington présente des similarités avec la maladie de Parkinson. Les objectifs de ce projet sont 1. d’évaluer sur des modèles souris de la maladie de Huntington si un traitement par la lumière permet de ralentir le développement de la maladie, au même titre que pour la maladie de Parkinson et 2. de préciser la région du cerveau la plus à même de recevoir le traitement.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra d’évaluer si le traitement par la lumière protège les neurones, comme cela a été observé dans la maladie de Parkinson. Les travaux seront aussi valorisés au travers de publications scientifiques et présentations en congrès. La deuxième partie du projet permettra de préciser les régions du cerveau les plus appropriées pour recevoir le traitement par la lumière. Si l’effet de protection des neurones par la lumière est avéré, comme il l’a précédemment été pour la maladie de Parkinson, des études complémentaires pouvant conduire jusqu’à un essai clinique, porteur d’espoir pour les patients, seront envisagées.
Procédures
Dans la première procédure, les animaux subiront une contention 5 jours par semaine de 90 secondes afin de permettre le traitement. Les animaux sont préalablement habitués à cette contention. Le traitement est indolore, et n’induit pas de gêne ou inconfort. Pour évaluer l’effet du traitement nous mesurerons les mouvements des animaux et leur mémoire (tests n’excédant pas 15 minutes) et feront des IRM réguliers (n’excédant pas 1 heure) : initialement puis pour les plus fréquents tous les mois (pour les animaux dont l’espérance de vie est réduite), et tous les 3-4 mois pour les animaux avec une espérance de vie normale. Les IRM seront réalisées sous anesthésie générale. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront effectués tous les 15 jours. Si besoin un prélèvement de queue de quelques millimètres pourra être réalisé de facçon unique sur animal anesthésié pour sa caractérisation génétique. Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale avec administration préalable d’antalgique dès que les symptômes moteurs de la maladie évolueront au delà d’une gêne modérée. Si l’efficacité du traitement est concluante, la deuxième partie du projet nécessitera une chirurgie (maximum 90 minutes) pour placer un implant délivrant de la lumière directement dans le cerveau, pour définir quelle région est la plus appropriée pour recevoir le traitement. Le traitement, permis par l’implant ne nécessitera plus de contention car la lumière sera contrôlé à distance. Les animaux seront évalués comme précédemment (même fréquence et durée pour les prélèvements sanguins, l’IRM et les tests comportementaux), et euthanasiés sous anesthésie générale avec administration préalable d’antalgique dès que les symptômes moteurs de la maladie évolueront au-delà d’une gêne modérée.
Impact sur les animaux
Certains modèles animaux Huntington utilisés conduisent naturellement à une perte progressive des possibilités de mouvement de l’animal ; l’animal se nourrit et boit moins facilement et perd du poids progressivement. Certains animaux ont une durée de vie plus courte que la normale, et ne peuvent plus se déplacer correctement en fin de vie. La contention pour illuminer la tête des animaux ainsi que la réalisation des tests comportementaux peut engendrer de façon temporaire, le temps que l’animal s’habitue à l’expérimentateur, à une peur légère. Le traitement en lui-même n’induit ni chaleur, ni douleur. La chirurgie induit de façon temporaire (24-48h) et maitrisée une douleur modérée du fait des points de suture. Par expérience, les animaux tolèrent ensuite bien le dispositif qui est adapté à leur morphologie.
Devenir
Les animaux subiront un traitement par la lumière pour évaluer si cela permet de limiter le développement de la maladie de Huntington. Si les animaux de mise au point n’ont pas besoin d’être euthanasiés pour les mises au point sur pièce anatomique, ils seront utilisés dans les mises au point de la procédure 2. A l’issue de ces procédures, et en compléments des évaluations et de l’imagerie, les animaux seront euthanasiés pour récupérer leur cerveau pour évaluer si le traitement a protégé les neurones.
Remplacement
La littérature permet de savoir que le traitement par la lumière est efficace dans la maladie de Parkinson. C’est un élément très encourageant pour espérer obtenir des résultats positifs pour la maladie de Huntington, car ces 2 maladies ont de nombreux points communs. Les études des effets de la lumière sur des modèles cellulaires ont mis en évidence une difficulté de transposition des résultats obtenus sur les modèles physiologiques in vivo (absence d’effet, ou modalités d’illumination complètement différentes de celles effectives in vivo). Les effets du traitement par la lumière impliquent probablement un intermédiaire encore non identifié, et non présent dans les cultures de cellules, empêchant ainsi l’anticipation des effets de la lumière in vitro. L’évaluation des effets neuroprotecteurs du traitement dans le cadre de la maladie de Huntington nécessite donc une évaluation chez l’animal, d’autant plus pour mesurer l’impact sur les performances motrices et cognitives. Les modèles de souris étant bien décrits et facilement manipulables sont adaptés pour une première évaluation. Des souches de souris de même fond génétique sont utilisées pour les mises au point, car il n’est pas nécessaire d’utiliser une souche à phénotype dommageable pour mettre au point les différentes étapes de l’étude. La deuxième partie du projet permettra de limiter le nombre de gros mammifères qui seraient nécessaires dans une étude ultérieure.
Réduction
Les données seront analysées par des tests statistiques. Des animaux au phénotype non dommageable seront utilisés pour les mises au point afin d’optimiser l’utilisation des animaux Huntington. La phase de mise en place sera stoppée dès que toutes les procédures seront maitrisées et reproductibles sur 3 animaux consécutifs. Les animaux n’ayant pas besoin d’être euthanasiés à l’issue des mises au point de la première procédure seront utilisés pour la procédure 2. L’évaluation des effets du traitement nécessite 2 souches complémentaires de souris Huntington, et des contrôles associés au phénotype non dommageable. On estime à 10% le nombre de souris qui seront euthanasiées précocement ne permettant pas de recueillir les données de façon adéquate. Deux types distincts et incompatibles d’analyse des pièces anatomiques sont nécessaires. La deuxième partie du projet ne sera réalisée que si les résultats de la première partie sont concluants. Elle reproduira la première étude en comparant 3 régions du cerveau pouvant recevoir le traitement (traitement localisé). Le total maximal de souris nécessaires pour ce projet sera de 366.
Raffinement
Les animaux seront surveillés de façon journalière. Le traitement, les tests et l’IRM ne sont pas douloureux ; une habituation préalable à la contention et aux expérimentateurs permettra de réduire le stress des animaux. Les IRM seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux réintègreront leurs groupes sociaux dès les tests effectués. Dans la deuxième partie du projet, les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et traitement antalgique. De l’hydrogel sera mis dans la cage et les animaux pesés chaque semaine pour évaluer et limiter la perte de poids naturelle de ces souris (du fait de la maladie). Les euthanasies seront effectuées sous anesthésie générale et antalgie, dès que les points limites sont atteints permettant de limiter la durée pendant laquelle la souffrance due au phénotype dommageable atteint un stade sévère.
Choix des espèces
L’effet d’un traitement et son impact sur les mouvements, la mémoire et l’espérance de vie, ne peut s’évaluer que sur un organisme entier. Les souris sont des modèles bien connus, et une première évaluation ne nécessite pas d’organisme plus évolué. La littérature permet de bien connaitre les modèles d’étude, et d’adapter le protocole pour évaluer l’impact de notre traitement. Les animaux seront réceptionnés à l’âge de 3 semaines afin d’être sevrés, et de démarrer le traitement en phase précoce de développement de la maladie, l’espérance de vie étant assez courte (3 mois) pour l’une des souches, et les symptômes de la maladie apparaissant assez rapidement, comme c’est le cas dans la maladie humaine.