Rongeurs
Elevage de souris immuno-déficientes
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées à huit mois pour être remplacées par des femelles plus jeunes et plus fécondes, 104 souris reproductrices ouvrent un élevage qui en compte 805 au total, dans des conditions classées au niveau de souffrance léger. Les 701 souriceaux nés de ces accouplements rejoindront d'autres protocoles expérimentaux entre quatre et vingt-quatre semaines d'âge. Aucune intervention n'est pratiquée dans le projet lui-même, le phénotype suffisant à le rendre dommageable : privées de lymphocytes T et B, ces souris vivent sous hotte stérile, avec litière et aliment irradiés, sous le risque permanent d'une infection. Le porteur écrit qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et qualifie le modèle animal d'"indispensable" pour étudier des sous-populations de lymphocytes.
Objectifs
Ce projet consiste à élever une lignée murine immuno-déficiente, c'est à dire sans défense immunitaire, afin de générer les animaux nécessaires à la réalisation de plusieurs projets scientifiques. Ces souris possèdent une mutation génétique qui conduit à l’absence d’une partie du système immunitaire dans l’organisme : les lymphocytes T et les lymphocytes B. L'intérêt d'utiliser de tels animaux immuno-déficients dans des études scientifiques en immunologie est majeur. En effet, dans diverses études, un sous type cellulaire d'intérêt va être injecté et son devenir sera étudié (activation, prolifération, interaction avec les organes, etc) sans interactions avec d'autres cellules du système immunitaire. Ainsi seule le sous type cellulaire injecté sera étudié et analysé.
Bénéfices attendus
L’utilisation de ce modèle de souris immuno-déficientes va permettre de mieux comprendre le rôle de sous populations du système immunitaire étudiées, et en particulier des sous populations de lymphocytes T. Ces rôles seront étudiés dans un contexte non pathologique dans un premier temps afin d’étudier leur fonctionnement élémentaire. Dans un second temps, elles seront étudiées dans un contexte pathologique comme certaines maladies auto-immunes afin de comprendre leur rôle dans le contrôle de la pathologie. Les cellules étudiées dans ce modèle sont très semblables à celles présentes chez l’homme. Une meilleure compréhension de ces cellules immunitaires pourrait donc servir à mieux comprendre les maladies auto-immunes chez l’homme et donc à pouvoir proposer des thérapies en clinique.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à une intervention mais il s'agit d'un projet d'élevage dont le phénotype des animaux est considéré comme dommageable. Des interventions seront réalisées dans le cadre d'autres projets expérimentaux autorisés.
Impact sur les animaux
Les animaux ici en élevage présentent une immunodéficience acquise ce qui implique un risque accru aux infections.
Devenir
104 animaux seront mis en accouplement dans ce projet d'élevage. Après 6 mois en accouplement soit à 8 mois d'âge, les animaux seront euthanasiés afin de renouveler les accouplements avec des animaux plus jeunes et féconds. Les animaux issus de ces accouplements, soit 701 animaux, seront inclus dans d'autres protocoles expérimentaux dans le cadre d'une utilisation continue. L'inclusion des animaux dans un projet expérimental interviendra entre 4 et 24 semaines d'âge.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable pour étudier le rôle d’une population cellulaire au sein du système immunitaire, dans différents contextes pathologiques auto-immuns. Les organes et les réponses immunitaires étudiés sont complexes et il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu.
Réduction
805 animaux seront nécessaire pour obtenir des animaux pour la reproduction et les animaux qui seront inclus dans les projets expérimentaux pour aboutir à des résultats statistiquement fiables. Le nombre d'accouplement sera suffisant et nécessaire pour la production des animaux et toujours maintenu au strict nécessaire pour éviter un surplus d'animaux qui ne serait pas utilisés. La lignée étant cryo-préservée dans notre établissement, l’élevage pourrait être suspendu si pendant une période les animaux ne sont plus utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, avec un environnement dépourvu de pathogènes et d'opportunistes spécifiques, avec des conditions environnementales (température, hygrométrie, etc.) conformes à la règlementation en vigueur pour l'espèce utilisée. Le milieu est enrichi avec 2 types d’enrichissement pour toute la durée de l’élevage: bâton en bois à ronger pour la mastication et lambeaux de papier kraft pour la nidification changé toutes les semaines. Pour protéger les animaux avec un système immunitaire déficient, le change des animaux s'effectue sous hotte de change en conditions stériles et la litière et l'aliment sont irradiés. Les contrôles sanitaires sont réalisés tous les trimestres. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie. Une mise en place d’étiquettes au niveau des cages permet d'assurer un meilleur suivi (note d’observation au cas de blessure, présence de souris gestante ou naissance).
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé pour les études dans le domaine de l’immunologie car son système immunitaire est proche de celui de l’homme. Par ailleurs il existe de nombreux outils (anticorps, dosages de cytokines, modèles pathologiques, etc) qui nous seront nécessaires pour ces études et sont développés quasiment seulement chez la souris. Les animaux utilisés pour les accouplements pourront être mis en duo à partir de 2 mois (8 semaines d’âge), âge de bonne maturité sexuelle. Les accouplements seront renouvelés au maximum tous les 6 mois, soit à 8 mois d'âge. Les animaux utilisés pour l’élevage seront donc euthanasiés au maximum à 32 semaines (8 mois X 4 semaines). Au-delà, les animaux sont vieillissants et voient leur reproduction décroitre. Les animaux issus des accouplements seront quant à eux inclus dans d’autres projets préalablement autorisés (utilisation continue) entre 4 et 24 semaines d’âge.
Etude d’un candidat médicament pour la drépanocytose dans un modèle de souris Townes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Les souris utilisées sont génétiquement modifiées pour développer une drépanocytose, avec anémie, inflammation, difficultés respiratoires et occlusions vasculaires. 80 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé, sévère, et reçues à trois ou quatre semaines, un âge que le porteur rapproche de celui d'un jeune enfant. Les actes décrits se réduisent à deux prises de sang de 50 microlitres sous anesthésie gazeuse, l'essentiel de la souffrance tenant à la maladie inscrite dans leur génome. Toutes sont tuées pour l'examen anatomo-pathologique de leur cerveau, de leur cœur, de leur foie, de leur rate, de leurs poumons et de leurs reins, le porteur attendant du candidat médicament testé une espérance de vie allongée.
Objectifs
La drépanocytose ou anémie falciforme est une maladie génétique. L’espérance de vie des patients qui en sont atteints est fortement réduite. Cette maladie génétique qui est la plus fréquente en France est due à une mutation sur un gène codant pour une protéine fonctionnelle dans les globules rouges. Certaines conditions (température, stress, diminution de la concentration en oxygène, déshydratation) favorisent la formation de globules rouges de forme allongée en faucille induisant l’obstruction de vaisseaux sanguins, une anémie et des prédispositions aux infections bactériennes. L’objectif de ce projet est de tester un candidat médicament dans un modèle murin spécifique de la drépanocytose.
Bénéfices attendus
Nous attendons une amélioration de l'espérance de vie des animaux. Cette molécule pourrait être proposée aux patients qui expriment une forme sévère de la drépanocytose.
Procédures
Les animaux auront une prise de sang (50µl) quand ils atteignent l'âge de 6 mois donc une anesthésie gazeuse (2 minutes). Une prise de sang sera effectuée systématiquement quelquesoit l'âge de l'animal avant l'euthanasie.
Impact sur les animaux
Les études toxicologiques n'ont pas démontré d'activité toxicologique du candidat médicament. Les effets attendus sont l'expression des symptômes de la drépanocytose (anémie, inflammation, difficultés respiratoires et phénomènes vaso-oclusifs) chez les animaux non traités et une atténuation de ces symptômes chez les animaux traités.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour étude anatomo-pathologique de leurs organes (cerveau, coeur, foie, rate, poumon, rein).
Remplacement
Cette maladie a des conséquences sur tous les organes vitaux (foie, coeur, poumon, rate, rein, cerveau), comme il n'existe pas de système ex vivo capable de mimer la complexité entre les organes, un organisme entier s'impose pour réaliser cette étude.
Réduction
Les effectifs ont été calculés au plus juste en utilisant des animaux des deux sexes car la drépanocytose est une maladie à transmission autosomique. Comme chez l'homme, l'espérance de vie des animaux homozygotes HbS peut être considérablement réduite en l'absence de traitement. Nous avons porté les effectifs à 20 individus par groupe pour espérer mesurer une différence supérieure à 10% entre les moyennes de chaque groupe (risque 0,05 et puissance 0,8).
Raffinement
Les conditions d'hébergement (bruit, température, hydratation, stress..) ne doivent pas amplifier les symptômes de la maladie. L'enrichissement sous forme de buchette à grignoter et de matériel de nidification est présent. Les techniciens en charge de ces animaux les manipuleront par cup handling ou tubing. Les observations se feront sans stimuler et sans manipuler les animaux. La pesée des animaux sera effectuée par tubing. Des points limites ont été établis et une médication à base d’analgésique pourra être instaurée ainsi qu’une observation renforcée.
Choix des espèces
Les animaux choisis sont des souris génétiquement modifiées (gènes de la globine alpha et beta) qui démontrent une grande homologie de symptômes avec ceux observés chez l'homme atteint de drépanocytose. Les animaux inclus dans notre étude résultent du croisement d'animaux hétérozygotes HbA/S qui sont facilement élevés chez notre fournisseur agréé. Nous recevrons des animaux âgés de 3-4 semaines donc des animaux jeunes dont le stade de croissance correspondrait chez l'homme à celui de jeune enfant. Il est important de travailler sur ces jeunes animaux car dans ce modèle animal de drépanocytose un animal de 3 mois correspond à un âge de 20 ans chez l'homme et car cette maladie est souvent diagnostiquée avant le stade adulte.
Le rôle de p38d dans l’homéostasie énergétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune enchaînant plusieurs protocoles métaboliques pour limiter les effectifs. Le régime riche en graisses démarre à cinq semaines et dure douze semaines, avec deux prises de sang, un test de tolérance au glucose de deux heures ponctué de sept mesures de glycémie, un test d'insuline d'une heure, quatre jours d'injections quotidiennes d'habituation avant l'administration de l'hormone de la faim, puis une injection de leptine. Un jeûne de vingt-quatre heures précède le test de réalimentation, jeûne que le porteur déclare sans danger, et les souris isolées en cage individuelle disposent de parois transparentes pour voir leurs congénères. Le cerveau est prélevé après une perfusion intracardiaque, au bénéfice d'une hypothèse sur le rôle d'une protéine kinase dans la régulation de l'appétit, dont les retombées annoncées contre l'obésité et le diabète restent au conditionnel.
Objectifs
Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel autour d'une constante. Une dérégulation du système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont fortement associées comme le diabète. Au laboratoire, nous étudions le développement de l'obésité et ses altérations métaboliques induits par le stress cellulaire. Nous avons ainsi mis en évidence une protéine qui compromet la fonction des cellules pancréatiques mais qui induit également l'obésité et la résistance à l'insuline. Cet effet est très probablement dû à une diminution de la prise de poids dans des conditions hypercaloriques. De manière intéressante, cette protéine n'est pas induite dans les tissus périphériques (foie, pancréas, tissue adipeux) mais elle est fortement exprimée dans le cerveau, y compris dans l'hypothalamus, le centre de régulation de l'appétit. Ainsi, notre objectif est de déterminer le rôle particulier de de cette protéine dans la régulation de la balance énergétique par le système nerveux central. Dans le cadre de ce projet, nous étudierons un modèle de souris dans lequel le gène codant pour cette protéine est invalidé dans tous les tissus de l'animal. Si nous observons un rôle de cette protéine dans le contrôle de la balance énergétique nous affinerons alors notre étude en invalidant cette protéine spécifiquement dans les neurones responsables de la régulation de l'appétit et de la satiété.
Bénéfices attendus
Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de type 2 en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés ne cesse d'augmenter et la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète est déjà présent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du Diabète de type 2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'une protéine kinase dans la régulation neuronale de la prise alimentaire. Cette étude est pertinente et innovante pour plusieurs raisons. Cette protéine joue un rôle essentiel dans la sécrétion d'insuline et mais sa fonction dans l'homéostasie énergétique reste inconnue. Comme le contrôle de la prise alimentaire est très complexe, les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage sa fonction dans la prise alimentaire et le gain de poids. Cette étude nous permettra de déterminer si cette protéine kinase est une nouvelle cible thérapeutique dans l’obésité.
Procédures
2 prélèvements sanguins (2 minutes) au début et à la fin du régime standard ou riche en gras (aux âges de 5,17 semaines) seront réalisés. Pour le test de tolérance au glucose, la durée de la procédure est de 2 heures. Un bolus de glucose est injecté par voie intrapéritonale (15 secondes). La glycémie sera évaluée (10 secondes) aux temps 0', 15', 30', 45', 60', 90', 120'. Pour le test de sensibilité à l'insuline, la durée de la procédure est de 1 heure. Une injection intrapéritonéale (15 secondes) d'insuline est effectuée. La glycémie sera évaluée (10 secondes) aux temps 0', 15', 30', 45', 60'. Concernant le test de sensibilité à l'hormone de la faim, les animaux reçoivent une injection intrapéritonéale (15 secondes) de liquide physiologique chaque jour pendant 4 jours (habituation). La prise alimentaire est mesurée en réponse à un bolus d'hormone de la faim (15 secondes). Pour le test de sensibilité à l'hormone de la satiété, les animaux reçoivent une première injection de liquide physiologique (15 secondes) puis le 2ème jour les souris reçoivent un bolus de leptine (15 secondes) afin de mesurer la réponse alimentaire. À la fin du phénotypage métabolique, les animaux préalablement anesthésiés sont perfusés en intracardiaque.
Impact sur les animaux
La procédure pour tester la sensibilité à l'hormone de la faim et l'hormone de la satiété nécessitent l'injection quotidienne de liquide physiologique afin d'habituer les souris avant le jour du test. Le test de réalimentation après un jeûne prolongé nécéssite une mise à jeun des souris pendant 24H. Cette durée de jeûne ne met pas en danger l'animal. Une diète riche en gras pour créer un environnement obésogène sera mise en place, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire et la mesure de la dépense énergétique nécessitent que les souris soient individualisées dans les cages. Ces cages individuelles sont transparentes afin que les animaux puissent se voir entre eux, mais aussi se sentir et s'entendre mutuellement. Le test de sensibilité à l'hormone hypoglycémiante peut provoquer une hypoglycémie chez la souris.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.
Remplacement
Toutes nos données publiées convergent vers une fonction de cette protéine kinase dans l'homéostasie énergétique. Pour tester nos hypothèses, nous avons maintenant besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.
Réduction
Nous utiliserons un total de 380 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées avec les mêmes cohortes de souris. Les différences de paramètres métaboliques attendues peuvent être modérées. Pour toutes cette raisons, le nombre d'animaux a éte déterminé en prenant en compte ces difficultés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement de certains animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Pour étudier le métabolisme, la souris est le modèle animal de référence. L’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifées dans lesquelle le gène codant pour la protéine d'intérêt est invalidé. Les animaux seront soumis à une diète riche graisse dès l'âge de 5 semaines et pour une durée de 12 semaines, âge auquel les strucutres cérébrales sont développées et fonctionnelles mais surtout âge auquel le régime riche en graisse est le plus efficace. Le phénotypage métabolique se terminera à l'âge de 23 semaines.
Rôle du subiculum dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trente à quarante-cinq minutes de chirurgie crânienne par animal, pour une injection dans le cerveau doublée d'une injection dans un vaisseau : 200 souris vont être utilisées, toutes tuées trois semaines plus tard, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que l'injection intracérébrale provoque une douleur et une perte de poids pouvant durer sept jours. Il s'agit de caractériser les astrocytes du subiculum, une région du cerveau liée à la mémoire, dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Les souris utilisées sont transgéniques, examinées à trois ou quatre mois avant les symptômes puis à sept ou huit mois, le porteur écartant les organismes plus simples au motif que leurs cellules gliales ressemblent aux astrocytes sans leur être identiques.
Objectifs
Notre cerveau encode, stocke et récupère nos souvenirs. Non seulement l'apprentissage et la mémoire sont indispensables pour l'interaction d'un individu avec l’environnement, mais ce sont aussi des processus cérébraux fondamentaux susceptibles d’être modifiés dans un grand nombre de maladies du cerveau, et donc d’altérer fortement la qualité de vie des personnes qui en souffrent. C’est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre les neurones et différentes cellulaire partenaires, dont les astrocytes. Nous faisons le constat que la contribution des astrocytes dans une région du cerveau impliquée dans la mémoire reste aujourd’hui totalement inexplorée que ce soit en conditions physiologiques mais également dans la maladie d’Alzheimer (MA). Nous proposons de caractériser les astrocytes de cette région et leur implication dans un modèle murin de la MA. Notre objectif à terme est de dégager de nouvelles pistes thérapeutiques pour la maladie d’Alzheimer et les démences en général.
Bénéfices attendus
Le projet a pour ambition de fournir de nouvelles connaissances sur la maladie d’Alzheimer et en particulier sur l’importance des interactions entre les neurones et les astrocytes. En identifiant ces mécanismes dans une région encore peu étudiée du cerveau, ce projet permettra d’avancer sur la compréhension de ces cellules en particulier sur l’idée qu’elles constituent une population hétérogène. Ces nouvelles connaissances collectées au cours de ce projet seront directement exploitées dans le domaine des pathologies cérébrales comme la maladie d’Alzheimer. Manipuler ces cellules pour les rendre plus efficaces à soutenir l’activité des neurones apparaît ainsi comme une stratégie thérapeutique alternative potentielle.
Procédures
Chaque souris recevra une injection intracérébrale ainsi qu’une injection intravasculaire sous anesthésie et analgésie (30-45 min de chirurgie par souris). Trois semaines après, ces souris seront mises à mort pour analyse.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les souris utilisées dans ce protocole sont le stress lié à la contention lors de l’injection d’analgésique ainsi que la douleur et la perte de poids qui durent maximum 7 jours, induite par l’injection intra-cérébrale.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyse des tissus.
Remplacement
Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones et différentes cellules partenaires, dont les astrocytes. Ces cellules peuvent être étudiées in vitro à partir de cellules embryonnaires mais pour avancer sur le fonctionnement du cerveau adulte et sur l’importance des interactions métaboliques entre les neurones et les astrocytes, il est indispensable de passer à un modèle animal car ces interactions cellulaires, vasculaires et métaboliques ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles in vitro ou in silico. Ces modèles animaux, en particulier souris, permettent ainsi d’étudier les neurones et les astrocytes dans leur environnement natif, en interaction avec le système vasculaire. De plus, il existe des souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA) qui possèdent des mutations génétiques impliquées dans les formes familiales de la MA et reproduisent de nombreux symptômes de la MA. Ces souris modèles ont l’avantage de reproduire certains symptômes cliniques caractéristiques de la MA (ex. déficits mnésiques, anxiété). Au final, seule une approche sur un mammifère modèle possédant un cerveau complexe et exprimant des comportements sophistiqués peut nous permettre d’identifier le rôle des interactions métaboliques entre les astrocytes et les neurones, avec l’objectif à moyen terme de les cibler par des stratégies thérapeutiques adaptées.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 200 souris nées dans notre élevage ou achetées chez un fournisseur agréé. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux est réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liés aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. En particulier le maintien des souris sur une couverture thermostatée jusqu’à leurs premiers mouvements puis en chambre thermostatée jusqu’à leur réveil complet post-chirurgie permet de réduire la mortalité péri-opératoire des souris.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les interactions entre neurones et astrocytes ; les organismes modèles simples possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau des mammifères. Les souris transgéniques permettent d’étudier les interactions neurones-astrocytes dans le contexte génétique de la maladie d’Alzheimer. Le présent projet a pour but d'étudier les cellules gliales chez l’animal adulte et son altération au cours du vieillissement pathologique. Les animaux étudiés seront donc des animaux au stade pré-symptomatique (3-4 mois), et des animaux plus âgés (7-8 mois) correspondant aux phases symptomatiques de la maladie d’Alzheimer.
Role(s) sur le sommeil et la thermoregulation d’un facteur de transcription exprimé dans l’hypothalamus anterieur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour savoir si un gène qui contrôle la production d'insuline dans le pancréas agit aussi sur le sommeil et la température du corps, 350 souris, en partie génétiquement modifiées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, ou menées sous anesthésie sans réveil. 292 d'entre elles passent deux fois 48 heures en cage individuelle pour l'enregistrement de leur sommeil, 48 subissent une chirurgie pour une injection dans le cerveau, et 242 sont opérées sous anesthésie, sans réveil, pour le prélèvement du cerveau. Le porteur mentionne aussi un régime riche en graisses qui "induit une obésité et un diabète", sans dire combien de souris le reçoivent ni pendant combien de temps. Toutes les souris sont tuées à l'issue, pour l'analyse post-mortem de leur cerveau.
Objectifs
Les variations de glycémie liées à un diabète mal contrôlé sont fréquemment associées à des troubles du sommeil (sommeil fragmenté, cauchemars, apnées du sommeil, fatigue diurne) et à des défauts de thermorégulation (sueurs, hypothermie). L’hypothalamus antérieur contrôle plusieurs fonctions telles que le sommeil et la thermorégulation. Nous avons observé qu’un gène connu pour contrôler la synthèse de l’insuline en réponse au glucose dans le pancréas est également présent dans l’hypothalamus antérieur. Ce projet expérimental a pour but : (1) de caractériser anatomiquement et fonctionnellement les neurones exprimant ce gène dans l’hypothalamus ; (2) d’étudier le rôle de ce gène dans l’hypothalamus antérieur et sa régulation par le glucose; (3) d’établir dans quelle mesure la régulation de ce gène pourrait être responsable des troubles du sommeil et de la thermorégulation.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ce travail apportera une meilleure connaissance des réseaux neuronaux contrôlant le sommeil et la thermorégulation ainsi qu’un éclairage moléculaire nouveau sur le lien entre le diabète et certaines de ses comorbidités dans le système nerveux central. Ces connaissances fondamentales sont susceptibles d'ouvrir des pistes thérapeutiques nouvelles pour le traitement des troubles du sommeil associés au diabète, en ciblant par exemple les modifications post-traductionnelles de ce facteur de transcription.
Procédures
enregistrement de l'activite veille/sommeil en cage individuelle ( 2x 48h, n=292 souris ) procédure chirurgicale injection intracerebrale ( n= 48 animaux , durée de l'intervention : 30 minutes + 1h de reveil) chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil en vue du prélèvement du cerveau (n=242 animaux durée analgesie 30 minutes avant +15 minutes)
Impact sur les animaux
En l’absence de stimulation, aucun phénotype dommageable n’a été rapporté les lignées murines utilisées dans ce projet. L’effet de la stimulation de ces quelques neurones de l'hypothalamus antérieur est transitoire (1h) et son effet sur les animaux sera suivi en continu. Des perturbations du rythme de sommeil sont envisagées. Les chirurgies sont susceptibles d’entrainer une sensibilité post chirurgie. Les animaux récupèrent habituellement en quelques heures. Le sommeil des animaux est enregistré en en cages individuelles. Le régime alimentaire riche en graisse induit une obésité et un diabète.
Devenir
les animaux sont mis a mort pour permettre l'analyse post-mortem de leur cerveau (expression de gènes et de protéines d'interêt)
Remplacement
Il n’est pas possible d’étudier une fonction physiologique complexe comme la régulation du sommeil hors d’un organisme vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est optimisé pour permettre de mettre en évidence le résultat de façon statistiquement significative (puissance du test 80% risque alpha 5%) tout en minimisant le nombre d’animaux requis . La taille des groupes est donc calculée dans chacune des procédures en fonction des effets attendus. Dans le cas de l'étude anatomique, uniquement descriptive, le nombre retenu (n=10) est celui généralement mentionné dans les publication anatomiques comparables. La séquence expérimentale est optimisée (ex : étude anatomique suivant les test de sommeil) de façon a minimiser le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.
Raffinement
Les modèles conditionnels dans lesquels les modifications génétiques sont restreintes à quelques neurones de l’hypothalamus antérieur permettront d’éviter des phénotypes plus dommageables. Pour les enregistrements (48h), les animaux sont placés avec les memes elements d'enrichissement en cages individuelles où ils gardent un contact visuel entre eux. Les approches non invasives sont systématiquement privilégiées. L’administration par voie orale se fera, après habituation, en proposant le principe actif dans un petit volume de gélatine aromatisé aux fruits rouges. Lorsqu’une expérimentation nécessite une intervention chirurgicale, en plus de l’anesthésie générale, des anesthésiques locaux et des analgésiques seront systématiquement administrés en péri-opératoire.
Choix des espèces
L’existence et la disponibilité de souris génétiquement modifiées qui n’existent dans aucune autre espèce de vertébrés homéothermes (dont la température est régulée) nous permet d’entreprendre l’étude des mécanismes physiologiques complexes du système nerveux central tels que l'alternance veille /sommeil avec une approche causale du rôle d’un gène pour une fonction étudiée. Le rythme de sommeil, initialement très irrégulier avant le sevrage, mature progressivement. Le rythme de sommeil est considéré comme de type adulte 5 à 6 semaines après la naissance. De même, la thermorégulation, absente chez les souriceaux nouveaux-nés, se met en place progressivement. Nous enregistrerons donc le sommeil lorsqu’il est stable, sur des souris adultes, mais pas âgées, entre 2 et 6 mois.
Comparaison des effets anti-leucémiques des cellules CAR-iNKT versus CAR-T dans un modèle de leucémie aigue myéloïde EU1/2
- Recherche appliquée
- Cancers
Irradiées sur tout le corps à 2 Gy, 166 souris au système immunitaire déficient reçoivent des cellules leucémiques humaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent sans anesthésie une ou deux injections dans la veine, une injection dans l'abdomen chaque semaine et, pour 130 d'entre elles, trois prises de sang, puis sont toutes tuées au plus tard 80 jours après les injections, plus tôt si un point limite est atteint. L'équipe compare deux types de lymphocytes équipés d'un récepteur qui cible la tumeur, les CAR-iNKT et les CAR-T, contre la leucémie aiguë myéloïde. Les effets néfastes déclarés se limitent à la piqûre, présentée comme une douleur légère de courte durée, et à la leucémie, qui réduit l'activité des souris, les fait maigrir et peut former de petites tumeurs dans l'abdomen. L'irradiation n'y figure pas.
Objectifs
Ce projet porte sur l'utilisation des lymphocytes T natural killer invariant (iNKT), des cellules immunitaires capables de cibler et de détruire naturellement les cellules cancéreuses associées à la leucémie. En ajoutant une molécule ciblant la tumeur (le CAR) aux iNKT, on leur confère une meilleure capacité à cibler spécifiquement les cellules cancéreuses et à s'activer plus efficacement après le contact avec celles-ci. Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde, où la greffe de moelle est le seul traitement curatif, mais malheureusement inaccessible à tous les patients, les approches de thérapie génique impliquant des cellules CAR sont en développement. Les premières études chez l'homme ont montré des réponses prometteuses mais de courte durée, nécessitant une optimisation. Une alternative envisagée est l'utilisation de cellules immunitaires moins susceptibles de s'épuiser dans le temps. Les lymphocytes iNKT se présentent comme des candidats potentiels dans ce contexte, offrant ainsi une piste intéressante pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie.
Bénéfices attendus
Dans le contexte de la leucémie aiguë myéloïde (LAM), les thérapies génétiques sont toujours en développement. Cependant dans la leucémie aiguë lymphoïde (LAL) elles sont déjà utilisées en clinique avec des résultats très probants. Il est possible d'explorer de nombreuses voies d’optimisation de ces thérapies, notamment en changeant leur base cellulaire. L’utilisation d'un sous-type de lymphocytes rare et naturellement anti-tumoral, les iNKT, permettrait une meilleure action directe contre les cellules tumorales avec une double action : la modification génétique et l'efficacité naturelle de la cellule. De plus, les iNKT ont aussi un effet contre les cellules empêchant l'action du système immunitaire. Ils peuvent aussi activer ce dernier, par leur production importante de molécules d’activation. Le développement de CAR-iNKT serait une très bonne opportunité d’amélioration des approches par cellules CAR.
Procédures
-Une radiothérapie corporelle totale de faible dose (2 gy) de chaque animal soit 166 souris -Une injection intra-veineux (IV) sur animal vigile, une seule fois en début d’expérience pour 18 souris, deux injections pour 148 souris. -Une injection intra-péritonéal (IP) sur animal vigile, une fois par semaines pour toutes les souris soit 166. -Un prélèvement de sang sur animal vigile, pour les animaux des tâches 2 et 3 soit 130 animaux à J21, J42 et J63 après injection des cellules leucémiques.
Impact sur les animaux
La piqure d'aiguille pour l’injection et le prélèvement entraîne une douleur légère de courte durée. L'administration de cellules tumorales entrainera une diminution de l’activité, une perte de poids, et possiblement le développement de petites tumeurs en intra-abdominal dans les trois premières semaines sans traitement.
Devenir
Les souris étant partiellement dépourvu de système immunitaire et ayant reçu une injection de cellules humaines leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animale, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 80 jours post injections, ni en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences en laboratoire sur des modèles cellulaires pour valider la fonctionnalité des cellules humaines, et de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. Le projet est essentiellement basé sur la recherche d’efficacité et des meilleures conditions d’administration des cellules, ce qui ne peut pas être déterminé sur cellules, et ce qui permettra de prévoir les conditions des essais cliniques.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris pour chaque étape du projet au minimum nécessaire pour les études statistiques, en se basant sur des expérimentations antérieurs ainsi que sur la littérature, et en calculant le nombre nécessaire sur la base de logiciel adequats. Nous avons aussi réuni des expérimentations afin de mutualiser les contrôles. Ainsi, au maximum 166 souris seront utilisées. L'utilisation de l'imagerie par bioluminescence avec anesthésie permet d'obtenir des données sur la progression tumoral sans sacrifice de l'animal. Suite à la mise à mort certains organes seront récupérer ainsi que du sang pour des analyses complémentaires.
Raffinement
Les souris seront dans une cage contenant de l’enrichissement (buchette en bois, frisure de papier Craft et coton) avec maximum 4 à 5 individus par cage dans un secteur spécifiquement adapté pour leur état immunitaire déficient. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Des points limites sont mise en place.
Choix des espèces
La souris permet l’élaboration d’un modèle de greffe de cellules humaines, car cette souris dépourvu de système immunitaire ne rejete pas les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire humaine. Ce modèle permet d’une part d’étudier l’impact de nouvelles thérapies cellulaires sur le contrôle anti-leucémique, et d’autre part d’analyser les mécanismes d’action des cellules de thérapie cellulaire. Les résultats obtenus seront indispensables à l’élaboration d’essais cliniques chez l’homme dans un second temps. Les souris sont expérimentées entre 8 et 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe des cellules humaine est meilleure dans cette période de vie.
Evaluation des biomatériaux pour la réparation de tissu cardiaque dans un modèle d’infarctus chez le rat 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Le thorax ouvert et une artère coronaire ligaturée pour provoquer un infarctus, puis rouverts une semaine plus tard par le sternum pour qu'un patch soit collé sur la zone lésée, 320 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue. Chaque opération dure trente à quarante minutes, les prises de sang s'échelonnent aux jours 1, 7, 30, 60 et 90, les échographies aux jours 5, 30, 60 et 90, chacune sous anesthésie. Le projet évalue un biomatériau censé imiter la matrice extracellulaire cardiaque, faute de traitement curatif de l'insuffisance cardiaque. Le porteur présente des interventions menées sous anesthésie "pour le confort des animaux" et annonce par ailleurs une mortalité post-opératoire de 30 %.
Objectifs
L'ischémie cardiaque, un problème où le coeur manque d'oxygène, est la principale cause de décès dans le monde depuis deux décennies. Ce manque d'oxygène entraîne des dommages au coeur, conduisant à une maladie chronique appelée insuffisance cardiaque. Récemment, des scientifiques et des médecins se sont intéressés à des thérapies alternatives basées sur l'ingénierie tissulaire pour réparer le coeur. Une méthode récente qui a attiré l'attention des chercheurs et des médecins est l'utilisation d'une structure appelée matrice extracellulaire native, obtenue à partir de tissus dépourvus de cellules. Cependant, cela présente des défis tels que le manque de donneurs, le risque d'infection, et des déséquilibres chimiques et physiques qui peuvent affecter les tissus et les cellules. Dans ce contexte, notre équipe de recherche vise à développer un biomatériau imitant les caractéristiques de la matrice extracellulaire cardiaque pour être utilisé comme une sorte de "squelette" actif dans le traitement de l'insuffisance cardiaque. Notre idée est de combiner différents matériaux dans un patch cardiaque unique, avec des propriétés physiques et chimiques contrôlées, ainsi que la matrice extracellulaire naturellement sécrétée contenant les éléments nécessaires à la réparation des tissus. Nous pensons que cette approche fournira un environnement optimal aux cellules cardiaques, favorisant ainsi la réparation du coeur après une ischémie cardiaque. Nous prévoyons de démontrer l'efficacité de ce patch en évaluant la réparation cardiaque chez le rat, en analysant les tissus grâce à des techniques d'imagerie médicale et de mesure morphologique après l'implantation du patch dans un modèle chirurgical simulant l'ischémie cardiaque.
Bénéfices attendus
Aujourd'hui, il n'existe malheureusement aucun traitement curatif pour l'insuffisance cardiaque causée par des lésions chroniques du coeur. Les solutions actuelles se concentrent principalement sur le soulagement des symptômes pour améliorer la qualité de vie des patients. De plus, ces traitements sont souvent associés à des effets indésirables. La transplantation cardiaque reste une option thérapeutique, mais elle est souvent réservée en dernier recours en raison de ses contraintes importantes. Heureusement, des avancées récentes ouvrent la voie à des thérapies alternatives pour traiter la perte de tissu cardiaque, en évitant la formation de cicatrices et le remodelage du coeur. Une approche prometteuse utilise ce qu'on appelle la matrice extracellulaire (MEC) native, obtenue par un processus de décellularisation des tissus. Cette MEC agit comme un matériau biologique pour réparer le coeur, et certains produits basés sur cette technologie sont déjà disponibles sur le marché. Les avantages de la MEC sont nombreux, car elle présente des propriétés physiques favorables et des composés qui régulent le comportement des cellules cardiaques et leur communication. Cependant, l'utilisation de MEC d'origine animale a ses limites, notamment en raison du nombre restreint de donneurs, des risques d'infection et des différences physiques et chimiques qui peuvent affecter la physiologie des tissus et des cellules. Notre projet innovant vise à créer un patch cardiaque qui offre un environnement propice aux cellules cardiaques, permettant ainsi une amélioration de la fonction cardiaque après un épisode d'ischémie. Cette avancée pourrait représenter une percée majeure dans le traitement de l'ischémie cardiaque, offrant de nouvelles perspectives d'amélioration de la santé cardiaque.
Procédures
Des animaux participeront à une étude simulant une crise cardiaque. Tout d'abord, ils seront traités avec des antidouleurs et placés sous anesthésie et seront ventilés mécaniquement, puis une incision sera pratiquée sur le côté de leur poitrine. En utilisant un fil spécial, une ligature sera placée autour d'une artère importante du coeur pour provoquer une crise cardiaque simulée. Cette procédure durera entre 30 et 40 minutes et sera réalisée sous anesthésie pour le confort des animaux. Une semaine plus tard, ces mêmes animaux recevront un traitement sous forme d'un patch cardiaque. Encore une fois, ils seront ils seront traités avec des anti-douleurs et placés sous anesthésie et respiration assistée, puis une petite incision sera faite au niveau de la poitrine (sternum) pour exposer la zone du coeur touchée. Le patch sera fixé à cette zone à l'aide d'une colle médicale. Cette intervention durera également entre 30 et 40 minutes et sera réalisée sous anesthésie. Pour évaluer l'efficacité des traitements, des prises de sang seront effectuées aux jours 1, 7, 30, 60 et 90 pour examiner les changements dans leur santé (durée de l'intervention: 5 minutes). Des images du coeur seront également prises aux jours 5, 30, 60 et 90 à l'aide d'une échographie cardiaque, le tout sous anesthésie (durée de l'intervention: 10 minutes). À la fin de l’étude, une perfusion sera réalisée sous anesthésie, sans que les animaux se réveillent, pour évaluer le fonctionnement du coeur. Ces évaluations permettront de suivre la récupération du coeur après les différentes interventions.
Impact sur les animaux
Induction de l'ischémie cardiaque, une procédure simulant une crise cardiaque, sera réalisée en pratiquant une incision sur le côté gauche de la poitrine et en ligaturant une artère importante du coeur. Les animaux ressentiront une douleur post-opératoire modérée. Des prélèvements sanguins seront effectués aux jours 1, 7, 30, 60 et 90, avec une douleur modérée. L'implantation du patch cardiaque, réalisée par une incision sur le thorax, peut entraîner une douleur post-opératoire. La mortalité post-opératoire après induction de l'ischémie cardiaque et implantation du patch cardiaque est de 30 %. Les animaux peuvent ressentir du stress en raison des anesthésies répétées. Il y a également un risque d'infection au niveau des sutures et un risque de cicatrisation déficiente.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés après 7, 30, 60 ou 90 jours suivant l'implantation du patch. Cette mesure sera prise dans le but d'analyser les tissus du coeur, en évaluant des aspects tels que la présence de cicatrices, le nombre de cellules, leur multiplication, l'intégration du patch, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et les changements dans la matrice extracellulaire. Ces informations nous aideront à mieux comprendre l'efficacité du traitement et son impact sur la récupération du coeur.
Remplacement
Actuellement, il n'est pas possible de reproduire avec précision l'action des patchs cardiaques dans un tissu cardiaque en laboratoire ou par simulation informatique. Il n'existe pas de modèle fiable, que ce soit in vitro (dans une boîte de culture) ou in silico (simulation numérique), pour imiter une crise cardiaque. De nombreuses études scientifiques se basent sur des modèles expérimentaux d'ischémie cardiaque chez le rat, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de la maladie chez l'homme. Pour étudier les changements au niveau cellulaire, des analyses des tissus sont nécessaires, impliquant malheureusement l'euthanasie des animaux. Cependant, au cours des deux dernières années, des expériences ont été menées in silico (modélisation 3D) et in vitro (culture de cellules cardiaques) au sein de notre unité. Ces travaux ont permis de réduire le nombre de biomatériaux à tester in vivo (dans des organismes vivants) et d'établir un processus de fabrication robuste des patchs cardiaques. Ces avancées sont essentielles pour mieux comprendre et traiter les problèmes cardiaques dans le futur.
Réduction
Nous utilisons des méthodes d'imagerie non invasives, comme l'échocardiographie, qui nous permettent de suivre les changements chez les mêmes animaux au fil du temps. De plus, nous avons effectué des calculs statistiques pour déterminer le nombre optimal d'animaux nécessaires à nos études, visant à obtenir des résultats significatifs sans avoir à utiliser un grand nombre d'animaux. Ces calculs ont été réalisés à l'aide d'un test spécifique, et pour détecter une différence significative entre les groupes d'étude et les groupes témoins. Les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés pour garantir la fiabilité de nos conclusions.
Raffinement
Nous nous assurons que les conditions de vie des animaux sont optimales. Ils sont placés en petits groupes de trois dans des cages et nous enrichissons leur environnement. Nous respectons également leur rythme jour-nuit et leur accordons le temps nécessaire pour s'acclimater avant toute procédure. Nous avons mis en place des normes strictes pour garantir le bien-être des animaux. Nous utilisons des techniques d'imagerie non invasives, comme l'échocardiographie, et nous recourons à l'anesthésie et à des analgésiques pour toutes les procédures afin de minimiser tout inconfort. Les animaux seront surveillés quotidiennement, avec un suivi clinique réalisé chaque jour pendant la première semaine, puis deux fois par semaine par la suite. Cette surveillance sera effectuée en se basant sur une grille spécifique permettant d'identifier précocement les signes de douleur. En fonction de l'état des animaux, des mesures seront prises pour minimiser la douleur au maximum. Cela peut inclure l'application de soins locaux au site opératoire, l'administration d'analgésiques, et dans les cas de souffrance sévère, l'euthanasie sera envisagée pour mettre fin à la douleur.
Choix des espèces
Nous avons choisi avec soin le modèle animal pour nos recherches, en optant pour des rats, une sélection basée sur les publications scientifiques les plus pertinentes dans le domaine. L’implantation de patchs cardiaques et le modèle d’ischémie cardiaque chez le rat ont été décrites dans de nombreuses publications internationales de prestige. Les dimensions du coeur du rat permettent l’induction de l’ischémie, l'implantation du patch et l'analyse en imagerie. Les rats seront utilisés à un stade adulte car la population humaine présentant des ischémies cardiaques est relativement âgée. Les animaux seront utilisés à 9 semaines de vie ce qui correspond à un stade adulte.
Formation aux techniques d’administration et de prélèvement chez la souris
- Formation professionnelle
Prises en priorité parmi les souris qui n'ont pas été incluses dans les projets auxquels elles étaient destinées, 1 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souris subit jusqu'à six administrations de solution physiologique et six administrations d'eau par voie orale sur animal vigile, deux micro-prélèvements de sang par jour, puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins sous anesthésie et un prélèvement terminal. La finalité est l'entraînement d'expérimentateurs aux gestes d'administration et de prélèvement, la mise à mort intervenant dès que le nombre maximal d'actes fixé par le projet est atteint. Le porteur indique qu'un premier apprentissage peut se faire sur des animaux déjà tués, et qualifie malgré tout le recours à l'animal vivant d'"indispensable" pour que les opérateurs éprouvent les réactions de la souris vigile.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’enseigner et de maintenir les compétences des expérimentateurs sur différentes techniques d'administration et de prélèvement chez la souris, couramment employées dans le cadre de leur projet. La formation est assurée par un formateur désigné et compétent.
Bénéfices attendus
Le projet permet l’apprentissage et/ou la révision de compétences et de connaissances nécessaires à la réalisation d’administration et de prélèvement de qualité chez la souris. A l’issue de celui-ci, les expérimentateurs formés seront ainsi capables de réaliser les gestes techniques enseignés en totale autonomie et en aisance technique, facilitant ainsi l’obtention de résultats scientifiques de qualité tout en préservant le bien-être animal.
Procédures
• Sur animal vigile : Administration d’une solution physiologique (maximum 6 fois) ; administration d’eau per os (maximum 6 fois) ; Micro-prélèvement de sang (maximum 2 fois /jour). • Sur animal anesthésié (anesthésie gazeuse) : Administration d’une solution physiologique (maximum 6 fois) ; Prélèvement de sang (maximum 4 fois) ; Prélèvement de sang terminal.
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère lors de l’administration de la solution physiologique.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Atteinte d’un point limite justifiant l’euthanasie ; Atteinte du nombre maximal d’administrations/prélèvements décrit dans le projet.
Remplacement
Un primo-apprentissage de certaines compétences pourra être réalisé sur animaux euthanasiés. Cependant, pour finaliser une formation efficace et permettre aux opérateurs d'aborder les animaux dans des conditions comparables à celles utilisées dans les différentes études en leur fournissant l’apprentissage de l'approche de l'animal, de sa contention et des gestes techniques ainsi que les réactions comportementales de l'animal vigile, le recours à l’animal reste, malgré tout, indispensable.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, plusieurs gestes sur un même animal seront réalisés. Les animaux n'ayant pas été inclus dans les projets pour lesquels ils étaient destinés seront utilisés en priorité. Le nombre d’animaux pourra, également, être réduit par l’utilisation d’animaux euthanasiés provenant d’autres projets.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux, avec un minimum de 2 enrichissements de milieu. Dans le cas où une souris doit être maintenue seule (agressivité, euthanasie de ses congénères) un enrichissement supplémentaire sera ajouté dans la cage. Les souris seront hébergées dans des « zones protégées » dont les conditions d’environnement et d’hygiène sont contrôlées (barrière aseptique) pour éviter toute contamination et assurer ainsi le maintien de leur statut sanitaire. Le volume et la fréquence des prélèvements de sang suivront strictement les recommandations émises par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA). En fonction du site et du type de prélèvement, ils seront réalisés sous anesthésie gazeuse associée à un analgésique local ou un antiseptique. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie gazeuse en combinaison avec un analgésique opioïde. Certaines injections pourront être réalisées sous anesthésie gazeuse et la taille des aiguilles utilisées sera la plus petite possible afin de limiter la douleur. L’apparence/comportement de l’animal ainsi que la perte de poids seront suivis et évalués de manière précise, tout au long de la procédure, grâce à un tableau de scoring. Ils pourront justifier la mise en place d’enrichissement supplémentaire, d’une surveillance accrue ou l’euthanasie de l’animal. L’aspect général de l’animal (apparence, comportement) sera suivi au minimum 1 fois/semaine et le poids, au moins 1 fois/mois et avant chaque session de formation. Un temps de récupération de 24h minimum par animal sera respecté entre 2 session de formation. Si un animal présente une lésion cutanée mineure, une pulvérisation de spray cicatrisant et antiseptique (jusqu’à 2 fois/jour jusqu’à guérison complète) pourra être réalisée.
Choix des espèces
La souris étant le modèle d'étude utilisés lors des projets, il est donc pertinent que la formation/maintien des compétences soit réalisé sur cette espèce. Les souris utilisées auront un âge compris entre 7 et 40 semaines lors de leur entrée dans la procédure. Il pourra, notamment, être conditionné par les mises à mort programmées dans l'animalerie.
Rôle du microenvironnement dans les pathologies inflammatoires et intestinales
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant quatorze jours, deux prises de sang et une injection dans le sinus rétro-orbitaire avant la mise à mort : 4 080 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 600 d'entre elles et modéré pour 3 480. Le projet porte sur les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin et sur les cancers qu'elles favorisent. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est attendue s'agissant de la faim, de la soif, de la peur, de la détresse, de la douleur ou de la maladie, puis énumère les effets possibles, poils hérissés, difficultés à s'alimenter, perte de poids, sang dans les selles, prostration, gêne respiratoire, difficulté à se déplacer et inflammation péri-anale. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées du fait de la pathologie chronique qu'on leur a provoquée.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans les pathologies intestinales chroniques. Malgré le succès de certains traitements, les maladies chroniques inflammatoires intestinales restent encore aujourd’hui très fréquentes et peu soignables, par exemple la maladie de Crohn et les rectocolites inflammatoires. Ce terrain inflammatoire peut également favoriser le développement des cancers intestinaux. Ces pathologies ont donc un impact majeur sur la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de répondre à un sujet de santé publique et de besoins scientifiques et cliniques afin d’améliorer la compréhension de certaines pathologies et le traitement des patients.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes biologiques menant aux pathologies intestinales inflammatoires et tumorales. Notre étude permettra de mieux comprendre les processus impliqués, dans le but de proposer des nouvelles cibles thérapeutiques visant à améliorer les traitements actuels des maladies chroniques intestinales.
Procédures
Prélèvement sanguin : quelques secondes, 2 fois pendant la procédure à une semaine d’intervalle Injections péritonéales : quelques secondes, 1 fois /jour pendant la période analysée (max 14 jours) Injections dans le sinus rétro-orbitaire : quelques secondes (1 fois avant mise à mort sur souris anesthésiée)
Impact sur les animaux
Il n’est pas attendu de nuisances ou effets indésirables concernant les libertés individuelles de l’animal concernant la faim/soif, peur/détresse, stress physique/thermique, douleur/lésion/maladie, environnement (stabulation). L’impact sur les animaux pourra se traduire par des poils hérissés, des problèmes d’alimentation, une perte de poids, du sang dans les selles, une prostration, une difficulté de respiration, une difficulté de mobilité, ou une inflammation locale péri-anale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils ont une pathologie chronique qui peut avoir des répercussions sur leur bien-être si pas de mise à mort.
Remplacement
Notre projet s’intéresse à l’interaction de différents types de cellules du microenvironnement intestinal, y compris les cellules immunitaires, endothéliales, et épithéliales. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire, inflammation, régimes), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui a un système immunitaire similaire à l’homme.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expérience le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation.
Raffinement
Afin de limiter l’inconfort, nous pratiquerons des méthodes de raffinement en mettant en place des points limites spécifiques et précoces selon la procédure, chauffer les cages si besoin lors d’analgésie, renforcer l’enrichissement des cages, et assurer un traitement adéquat d’analgésie selon les procédures appliquées et points limites établis.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies intestinales car des modèles sont bien établis et récapitulent la pathologie chez l’homme. De plus, la souris comporte tous les composants du système immunitaire inné et acquis, qui jouent un rôle essentiel dans l’inflammation chronique et sont semblables dans les pathologies intestinales humaines, de ce fait ce sont des bons modèles pour notre étude. Les conditions d’expérimentation proposées sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants en soumettant les animaux au moins de souffrance possible. Les souris seront âgées de 4 à 30 semaines car nous étudierons ces pathologies dans le jeune adulte (après sevrage) et l’adulte
Essai de traitement préclinique sur un modèle de déficience intellectuelle et d’autisme liée à l’X
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tester si un composé administré par voie orale corrige les déficits comportementaux d'un modèle murin d'autisme et de déficience intellectuelle liés au chromosome X : 64 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une puce RFID implantée sous la peau sous anesthésie gazeuse, avec couverture antalgique, puis un prélèvement de sang à la veine temporo-superficielle. Les épreuves comportementales sont nommées, champ ouvert, labyrinthe en Y et reconnaissance du nouvel objet, et le porteur les décrit comme non invasives, sollicitant "principalement la curiosité et la mémoire de l'animal". Les souris qui perdent 15 à 20 % de leur poids ou qui montrent des signes de douleur, immobilité, poil hérissé, flancs creusés, sont mises à mort avant le terme.
Objectifs
Le projet vise à tester un composé chimique agissant sur des récepteurs des neurones, et dont l’action positiive a déjà été observée sur des modèles d’autisme. Au cours de ce projet on espère restaurer le phénotype comportemental trouvé défaillant chez le modèle murin porteur d’une mutation dans le gène PTCHD1 par l’administration orale d’un composé chimique. On propose un protocole de caractérisation du modèle murin après un prétraitement et pendant l’administration de cette molécule. Nous allons focaliser notre analyse sur des déficits observés chez ces souris mutantes dans l’activité exploratoire dans le test de champ ouvert, la mémoire de travail dans le labyrinthe en Y et la mémoire de reconnaissance du nouvel objet ; tous ces tests sont non invasifs et sollicent principalement la curiosité et la mémoire de l’animal. Le gène Ptchd1 étant situé sur le chromosome X, seuls les males porteurs de mutation de ce gène développe la maladie. Ici nous réaliserons l’étude uniquement sur des males porteurs ou non de la forme mutée du gène et qui seront soumis ou pas au traitement.
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous allons progresser dans la compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires, associés à des retards mentaux et aussi pouvoir peut-etre proposer une molécule thérapeutique.
Procédures
Implantation d’une puce RFID par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse et avec une couverture antalgique (durée 30 minutesmaximum); un prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse (durée 5 minutes)
Impact sur les animaux
L’injection de la puce RFID sous la peau et le prélèvement sanguin à la veine temporo-superficielle peuvent entrainer un stress ou une brève douleur chez l’animal
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour prélèvement d’échantillons
Remplacement
La souris est la seule espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. Il n’existe pas de méthodes alternatives pour observer l’effet de médicaments sur des processus comportementaux et mnésiques intégrés. Seul l’évaluation sur des animaux vivants conduit à conclure sur l’efficacité d’un traitement améliorant l’apprentissage et la mémoire. Nous savons déjà que le modèle de souris utilisé dans cette étude montre des déficits d’apprentissage dans les tests envisagés. Cette étude requiert ainsi l’utilisation d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe pas de méthode autre que l’étude in vivo.
Réduction
Le nombre de 16 Individus par groupe a été estimé en fonction des expériences conduites précédemment et pour atteindre des résultats exploitables de manière statistique dans le cadre d’expérience d’évaluation comportementale. Pour avoir une bonne puissance du test statistique, un maximum de 16 animaux par génotype et par traitement est requis. Il prend en compte le fait qu’un petit nombre d’individus (1-3 par lots) pourrait ne pas faire les tests d’apprentissage. Par ailleurs, le gène PTCHD1 est porté par le chromosome X. Sa mutation a seulement des conséquences dans le sexe mâle chez l’homme. Aussi les traitements et les tests de comportement ne s’effectueront que sur les mâles, sexe dans lequel se déclare la maladie chez l’homme, et dans lequel on détecte les déficiences chez la souris.
Raffinement
Les animaux sont suivis pour des signes de douleur (immobilité, aspect rouge ou gonflé au niveau de l’insertion de la puce, traces de griffure ou de morsure, respiration difficile, hérissement du poil, attitude voûtée, déshydratation et flancs creusés). L’implantation de la puce RFID se fera sous anesthésie gazeuse et avec une couverture antalgique, suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Les animaux en souffrance ou présentant des signes de perte de poids (15 à 20%), seront mis à mort par un gradient progressif de CO2. Néanmoins nous n’attendons pas d’observer de tels effets avec ce composé et ce protocole qui a déjà été conduit dans un autre contexte de maladie génétique sans nuissance détectée sur le bien-être des animaux. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray de dermidine(R) seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont très développées. La nécessité d'utiliser des animaux transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la maladie humaine. Les animaux seront testés à l’âge adulte (8-11 semaines) après un traitement commencé à 6 semaines afin d’étudier des jeunes adultes capables de réaliser les tests cognitifs et restant dans un âge proche de celui dans lequel la maladie est observée et quantifié chez l’homme.
Etude du rôle de métabolites de la flore microbienne intestinale dans le développement de l’obésité et du diabète chez la souris : enrichissement et transfert de flore intestinale.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une microcoupure d'un millimètre à l'extrémité de la queue chaque semaine, deux tests de tolérance au glucose de six prélèvements chacun, une inoculation de flore intestinale par voie rectale sous anesthésie : 284 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 20 d'entre elles et modéré pour 264. Une partie est utilisée comme donneuse de caecum, les autres reçoivent un régime hyperlipidique destiné à les rendre obèses et diabétiques. Il s'agit d'établir un lien de cause à effet entre des bactéries intestinales productrices de 4-crésol et l'équilibre glycémique, avec des applications thérapeutiques annoncées à moyen terme. Le porteur retient la souris pour ses homologies de régulation glucidique avec l'humain et fixe leur âge entre trois et six mois, le temps que leur microbiote se stabilise.
Objectifs
Ce projet vise à mettre en évidence un lien de cause à effet entre la modification de la flore intestinale et la santé métabolique du rongeur. De nombreuses études mettent en évidence le rôle de modifications de l’architecture de la flore intestinale dans le risque de nombreuses maladies auto-immunes, métaboliques, neurodéveloppementales et neuro-dégénératives, y compris au cours du diabète de type 2. En revanche, l’impact physiopathologique de bactéries individuelles de la flore intestinale, connues pour synthétiser des produits à effets bénéfiques sur la santé, sur les caractéristiques et l'évolution de ces maladies est mal connu, et ce projet vise à en élucider les mécanismes à travers des études in vivo chez la souris. Plus particulièrement nous étudierons l'impact de bactéries productrices de 4-cresol, un métabolite synthétisé exclusivement par la flore bactérienne intestinale, sur l'homéostasie glucidique dans un modèle préclinique de diabète de type 2 : la souris soumise à un régime hyperlipidique. De plus, nous étudierons également l'impact d'un transfert de flore venant d'animaux résistants à l'obésité afin de mettre en évidence des effets protecteurs éventuels chez les souris receveuses. Ce projet sera réalisé en conformité avec la règle des 3Rs et dans le respect du bien-être animal. Ce projet durera 3 ans et le nombre total d'animaux utilisés est de 284 souris.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de valider l'effet de métabolites de la flore bactérienne sur l'homéostasie glucidique de l'hôte et d’envisager des applications thérapeutiques dans le diabète chez l’Homme. En effet le rôle causal de produits de bactéries individuelles présentes naturellement dans le microbiote intestinal sur la modulation de la prise de poids et de l'équilibre glycémique n'est pas encore complètement démontré. Cela représente toutefois une piste prometteuse pour le traitement de l'intolérance au glucose et du diabète. Les résultats attendus pourraient ouvrir notamment de nouvelles perspectives pour le traitement du diabète de type 2, à moyen terme, avec l’élaboration de nouveaux produits probiotiques.
Procédures
Les animaux seront pesés 2 fois par semaine. Des prélèvements de sang au niveau des vaisseaux caudaux seront réalisés une fois par semaine (10 microlitres) pour mesure de la glycémie et de l'insulinémie basale (sauf pour les animaux des lots 1 et 2 utilisés comme donneurs de caecums). Des tests de tolérances au glucose (gavage par voie orale d'une solution de glucose 20% à 2g/kg) seront réalisés 15 jours après le transfert de flore, puis 2 mois après (les 2 tests seront donc espacés de 6 semaines). La glycémie sera mesurée aux temps 0, 10, 30, 45, 60 et 90) à l'aide d'un lecteur de glucose grâce à des prélèvements par les vaisseaux caudaux et à raison de 5 microlitre par prélèvements (25 microlitre par test). Pour résumer pour chaque animal: prélèvement basal (une fois par semaine):10 microlitres. Test de tolérance au glucose : 50 microlitres. Les animaux destinés au transfert de flore seront anesthésiés à l'isoflurance pendant quelques minutes dans la cage d'induction afin de s'assurer de leur immobilité pendant l'inoculation de la flore par voie rectale. Cette voie d'administration est parfaitement maîtrisée par l'équipe.
Impact sur les animaux
Compte tenu de notre expérience dans le type de procédures mises en oeuvre dans ce projet, qui ont toutes été déjà optimisées, nous ne prévoyons pas de nuisances ou effets indésirables (sauf l'induction de l'obésité et diabète, nuisance légère) qui pourraient conduire à la mise à mort anticipée des animaux. En ce qui concerne l'acte "transfert de flore", l'inoculation de flore par gavage que nous utilisons chez l’animal est une technique qui necessite une contention de courte duree (
Devenir
A l'issue des procédures les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus et du plasma en vue de mesures biochimiques.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire. Cependant, nous avons entamé une réflexion sur le développement d'approches in vitro du type "organ on chips" qui permettent de mimer quelques interactions entre organe. Certains des travaux réalisés in vitro auront pour but de remplacer, au moins en partie, les approches in vivo.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons effectué un travail en amont qui nous a permis d'identifier des cibles d'intérêts parmi les bactéries grâce à des analyses de criblage in vitro et in silico. Ainsi cette sélection, effectuée en partenariat avec des experts en microbiologie, a abouti à ne retenir que les bactéries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront testées in vivo, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à l'étude.
Raffinement
Les animaux seront maintenus avec leurs congénères dans des milieux enrichis avec des morceaux de bois et des tubes en carton, ce qui permettra d'améliorer leur bien être. Ils seront également observés quotidiennement et un suivi du poids et de la prise alimentaire seront réalisés 2 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance. En cas de perte de poids supérieure à 15 % , ou d'atteinte d'un point limite défini par notre grille de scoring décisionnel, l'animal sera euthanasié. Pour réduire le stress infligé aux animaux, le transfert de flore par voie rectale sera effectué sous anesthésie légère après passage dans une chambre d'induction à l'isoflurane, et le diamètre de la sonde est adapté à la taille de l'animal. Un intervalle de temps d'au moins 2 semaines est prévu entre le transfert de flore et le premier test. Pendant les tests de tolérance au glucose, les prises de sang seront réduites au minimum pour permettre le dosage d'insuline par des kit Elisa ultrasensibles (nécessitant 5μl de plasma), et les tests eux-mêmes seront espacés de 6 semaines.
Choix des espèces
Les modèles précliniques de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique et de l’adiposité. Adulte de 3 à 6 mois afin que le microbiote intestinal soit stable.
Analyse de la co-infestation Schistosoma-Plasmodium chez le modèle murin
- Protection de l’environnement
Toutes tuées à la fin de chaque procédure pour que leur foie, leur moelle osseuse et leurs intestins soient analysés, 1 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 240 d'entre elles et modéré pour 940. Elles sont infestées par des larves de schistosome après une heure passée à patauger dans l'eau, puis infectées par le Plasmodium responsable du paludisme par injection intrapéritonéale. À partir du quatrième jour, la queue est incisée deux fois par jour sur moins de deux millimètres pour évaluer la parasitémie, les souris devenant anémiées et pouvant souffrir d'hypoglycémie. Le porteur affirme que "le passage par l'animal de laboratoire est obligatoire" faute de cycle parasitaire réalisable in vitro, et rapproche l'infestation de l'absence de douleur rapportée par les humains contaminés.
Objectifs
Le paludisme, également connu sous le nom de malaria, est une maladie infectieuse causée par le parasite Plasmodium transmis à l’Homme par piqûre d’un moustique infecté. Fléau économique et sanitaire, le paludisme constitue, avec près de 500 000 morts par an, la première parasitose et la troisième cause de mortalité au monde après la tuberculose et le SIDA et touche principalement l’Afrique subsaharienne, l’Asie du Sud-Est et l’Amérique du Sud. Dans l’ombre ces trois maladies infectieuses majeures, la Bilharziose ou schistosomiase est une maladie parasitaire faisant partie des maladies tropicales dites négligées, classée seconde après le paludisme, selon l’OMS. Les schistosomes infectent plus de 200 millions de personnes et causerait 200 000 morts par an. Le projet consiste à développer un modèle murin de co-infection afin d’analyser les interactions entre les parasites ainsi que la réponse physiologique de l’hôte dans le cas d’infections contrôlées. Ce modèle murin permettra également de tester des molécules actives sur les deux parasites. Des souris de deux souches différentes (CBA/J et C57BL/6J) seront infectés avec les deux pathogènes simultanément ou en différé afin d’analyser l’évolution de la virulence du pathogène dans un environnement changeant (i.e. hôte infecté par le paludisme) mais aussi la modulation de cet environnement hôte vis-à-vis de l’infection de ces deux pathogènes. Spécialistes de la schistosomiase, nous n’analyserons que les modifications du schistosome sous l’influence d’un environnement changeant (i.e. hôte infecté par le paludisme).
Bénéfices attendus
Malaria et schistosomiase sont les deux principales maladies parasitaires affectant les pays d’Afrique subsaharienne. Aujourd’hui, la plupart des recherches sont tubulaires et concernent soit un pathogène, soit l’autre. Pourtant de nombreuses études sur le terrain montrent l’interaction qui existent entre ces deux pathogènes. Le développement de ce modèle de co-infection permettra : à court terme, la compréhension des interactions phénotypiques et moléculaires dans l’association tri-partites souris-schistosome-plasmodium. A plus long terme, de tester l’effet de nouvelles molécules thérapeutiques ciblant les deux parasites (Alkoxyamine ou trioxaquines, par exemple).
Procédures
Plusieurs prélèvements sur souris seront effectués à des fins expérimentales et de maintien de cycle notamment des frottis sanguins afin d'évaluer la parasitémie à Plasmodium. A partir de 4 jours post-infection, la parasitémie à Plasmodium sera évaluée 2 fois par jour à partir d’un frottis sanguin
Impact sur les animaux
Concernant l’infection par le schistosome, le temps passé à patauger dans l'eau (1 heure) peut provoquer un stress chez l'animal. Les larves étant de petite taille, le transport à travers l’épiderme ne doit pas engendrer une souffrance importante. Les humains exposés ne relatent pas de douleur lorsqu’ils ont été contaminés. Les symptômes visuels sont le grossissement du foie et de la rate dû à l’accumulation des œufs du parasite. Ces effets sont chroniques. Les parasites sont récupérés avant que le parasite n'induise de souffrance. Concernant l’infection par le plasmodium, celle-ci se fait par injection intrapéritonéale qui engendre un stress de manipulation ainsi qu'une douleur d'injection. Des prélèvements dans le but de mesurer la parasitémie seront effectués deux fois par jours par incision de moins de 2mm sur le bout de la queue, la coupe de la queue est facile à réaliser et ne provoque qu'une douleur ou une angoisse minime. Une crème anesthésiante à base de lidocaïne sera appliquée en amont de la procédure sur la zone de coupe. La souris sera placée dans un tailveiner qui permet une contention de la souris afin de la maintenir et de minimiser le stress de la manipulation, facilitant le prélèvement. Les animaux seront anémiés et peuvent souffrir d’hypoglycémie ainsi que d’hyperinsulinémie. Les nuisances seront limitées car notre objectif est de traiter les animaux aux antimalariques avant que le parasite ne tue son hôte.
Devenir
Necéssité d'analyser les foies, moelles osseuses, intestins et autres post-mortem pour les besoins de l'expérience. Les souris seront donc toutes euthanasiées à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Pour les parasites, le passage par l'animal de laboratoire est obligatoire car on ne peut pas réaliser le cycle in vitro. En effet, le parasite a besoin d’un hôte vertébré et les rongeurs sont connus pour être des animaux réservoirs chez toutes les espèces de schistosomes. De plus, dans le contexte notre étude le rôle du vertébré est prépondérant car il s’agit d’analyser la réponse de l’hôte face aux co-infections.
Réduction
Le nombre de souris totales utilisées pour ce projet est de 1180 (dont 20 souris de maintien de cycle. Nous avons compté 10 souris de chaque sexe (n= 20) pour chaque temps de prélèvement dans chaque groupe. Au regard de plusieurs études antérieures visant à étudier la coinfection de plasmodium et schistosoma dans le modèle murin et d’un test statistique, le choix de 10 souris par expérimentation a été établie comme étant suffisant pour analyser la variation dans le modèle de coinfection. 1 lot équivaut à 10 souris. Chaque expérimentation correspond à un point temporel clé - dans la parasitémie des parasites et la symptomatologie de l’infection - de dosages et de mesures physiologiques et immunologiques nécessitant la mort des souris.
Raffinement
Les infestations se font avec un nombre optimal de parasites (assez pour être infectieux mais pas trop pour ne pas tuer la souris, soit 106 érythrocytes maximum pour le Plasmodium et 90 larves (~20 couples) de Schistosoma par souris) permettant à la fois le bien-être de l’animal et la survie de l’hôte. Une surveillance quotidienne par les zootechniciens est effectuée (surveillance visuelle, mesures de la température et du poids). Aucun rongeur femelle à l’animalerie ne reste isolé pour la sociabilité et le bien-être. Les mâles ne peuvent être replacés car ils se battent entre eux. Les animaux bénéficient d’enrichissements de milieu tels que des tunnels en plastique ou en carton, des petits bouts de bois à ronger et des carrés de coton pour la nidification. Ces différents enrichissements leur permettent d’avoir des activités ludiques et sociales. La mortalité ne survient jamais à l’issue de l’infestation ; nous n’utilisons ni des souris jeunes ni des souris âgées. Durant l’expérience tout rongeur retrouvé en souffrance, c’est-à-dire ayant atteint un score de 3 dans les points limites (exemple : incapacité irréversible ou prolongée à s'alimenter ou à s'abreuver, distension abdominale significative, émaciation (état de chair 1/5) etc.) est euthanasié. Aucune médication n’est donnée car l’hépatosplénomégalie n’est pas réversible ; de manière plus générale, aucune médication ne peut être donnée car interférences avec le développement des parasites. La parasitémie au schistosome n’évolue pas post-infestation contrairement au paludisme. Les souris servant à l’entretien de la souche de Plasmodium sont mises à mort dès que leur parasitémie dépasse 30% avant que celles-ci présentent des signes de souffrance (4-5 jours suivant leur infection).Une parasitémie de 80% constituera un point d’arrêt. Pour le schistosome, le point d’arrêt a été fixé à 5 mois afin d’éviter toute altération du bien-être animal.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler sur Schistosoma mansoni et Plasmodium yoelii nigeriensis. Nous avons choisi d’infecter les souris car il n’y a pas de souches consanguines à l’exception des rats. Les souches consanguines permettent d’obtenir des souris génétiquement identiques qui présentent une variété moindre d’un point de vue génétique et immunologique. Cela permet d’obtenir une base uniforme pour comparer les variations dues à une infection comme c’est le cas pour cette procédure. De plus, la diversité étant moindre, les résultats sont statistiquement plus homogènes et cela permet de minimiser le nombre de souris utilisées. Cependant le rat ne peut être infecté que par Plasmodium. C’est également sur le modèle souris qu’il existe le maximum d’information dans la littérature concernant les interactions Schistosoma/rongeur ou Plasmodium/rongeur. Lors du lancement de l’expérience, les souris seront âgées de 6 semaines pour la souche CBA/J et de 7 semaines pour les C57BL/6J ce qui correspond à environ 25 à 30 grammes. Les infestations par le parasite entraînant de fortes mortalités chez les rongeurs plus jeunes ou plus âgés. Elles seront suffisamment jeunes pour avoir un système immunitaire optimal. L’âge a également été choisi en fonction du poids ; 25 à 30 g étant un poids suffisant pour infecter les souris sans les affaiblir.