Rongeurs

Des souris reçoivent jusqu'à cinq chocs électriques par séance, à raison d'une séance de 30 minutes par jour pendant neuf jours, dans un test fondé sur l'évitement du choc. 2 250 souris, dont des lignées génétiquement modifiées qui développent une forme de maladie d'Alzheimer, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur cerveau. Selon les protocoles, elles subissent aussi cinq injections dans l'abdomen, des séries de quatre tests de 3 minutes chaque jour, cinq jours par semaine pendant deux semaines, que le résumé ne nomme pas, et un isolement temporaire en cage individuelle. Le porteur qualifie le choc de "désagréable mais non douloureux", et écrit que les analgésiques centraux sont "à proscrire pour des raisons scientifiques".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de cinq gènes d’intérêts dans le fonctionnement normal et pathologique des cellules immunitaires du cerveau. Les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle épinière et jouent des rôles critiques à la fois dans son fonctionnement en conditions physiologiques et pathologiques. Les études récentes ont permis d’établir que la population de cellules immunitaires du cerveau est hétérogène et existe sous une grande diversité d’états microgliaux. Comment ces différents états sont contrôlés et quels sont leurs rôles dans le fonctionnement physiologique et pathologique du cerveau reste encore à déterminer. Notre équipe s’intéresse à plusieurs gènes qui de par leur localisation et/ou leur fonction dans d’autres cellules immunitaires sont susceptibles de jouer un rôle clé dans le contrôle de ces différents états microgliaux. L’objectif final du projet est donc de comprendre, dans différents contextes physiologiques et pathologiques (en particulier dans le contexte de la maladie d’Alzheimer), le rôle de ces cibles dans le fonctionnement des cellules microgliales. Pour ce faire, nous utiliserons une combinaison de lignées murines permettant de modifier l’expression de ces gènes spécifiquement dans les cellules immunitaires du cerveau. In fine, ce projet permettra de valider l’intérêt thérapeutique des gènes cibles dans les différents contextes envisagés.

Bénéfices attendus

1. Déchiffrer le rôle de gènes d’intérêt exprimés dans des cellules immunitaires dans le fonctionnement physiologique et physiopathologique des cellules immunitaires du cerveau (en particulier dans le contexte du développement de la maladie d’Alzheimer) 2. Valider l’intérêt thérapeutique de ces cibles pour le développement de stratégies thérapeutiques, notamment dans le contexte du développement de la maladie d’Alzheimer

Procédures

Les interventions prévues dans le cadre de ce projet sont : des injections dans l’abdomen (5 injections, à raison d’une injection par jour, sur 5 jours, durée d’une injection environ 10 sec) ; l’enchainement de tests pour évaluer le comportement cognitif des animaux (au maximum 1 série de 4 tests de 3 min (soit 12 min/animal/jour) chacun par jour, 5j par semaine sur 2 semaines ; chacun des tests étant non-invasif et reposant sur la propension des rongeurs à explorer leur environnement) ; un test basé sur l’évitement d’un choc électrique désagréable mais non douloureux (au maximum les animaux peuvent recevoir 5 petits chocs électriques par session, 1 session de 30 min par jour sur 9 jours). L’étude de l’effet de l’impact de la pathologie et/ou des gènes d’intérêt sur l’activité circadienne requiert l’emploi de tests impliquant des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement isolé temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer le bien-être des animaux tout au long de l'étude.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables découlant des interventions sont les suivants : Douleurs et stress léger de piqure d’aiguille dans le péritoine ; Stress léger et inconfort de certains tests de comportement. Isolement temporaire pour l’évaluation de l’activité circadienne.

Devenir

L'ensemble des animaux contribuant à ce projet sera mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés pour des analyses histologiques, cellulaires et/ou moléculaires.

Remplacement

Les cellules immunitaires du cerveau sont, par nature, des cellules ultra-sensibles à leur environnement. Pour comprendre leur rôle dans le fonctionnement physiologique ou physiopathologique du système nerveux central, il est nécessaire de les étudier dans un environnement aussi proche que possible des conditions natives. Dans ce contexte, les données récentes de la littérature indiquent que les morphologies, les fonctions ou encore le répertoire de gènes exprimés par les lignées cellulaires microgliales ou même les cultures primaires de microglies diffèrent substantiellement de ceux exprimés par les microglies fraichement isolées à partir de cerveaux adultes. L’utilisation d’animaux vivants est donc requise. Par ailleurs, certains des rôles des cibles que nous cherchons à évaluer (i.e. effets sur comportement cognitif, en particulier dans le contexte de la maladie d’Alzheimer) ne peuvent être réalisées que sur animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 2250) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement pertinent. Par ailleurs, nous avons défini des stratégies de croisement de manière à limiter au maximum la production d’animaux qui ne seraient pas utiles pour l’expérimentation. Il est bien établi qu’il existe un important dymorphisme sexuel dans la biologie des cellules immunitaires du cerveau, les études seront donc réalisées à la fois chez le mâle et la femelle. Par ailleurs, la maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative. Nos données antérieures et celles de la littérature indiquent que les cellules immunitaires du cerveau pourraient jouer des rôles fonctionnels différents en début et en fin de pathologie, les effets des cibles d’intérêts seront donc évalués à deux stades différents, au stade précoce et à un stade plus tardif. Dans la mesure du possible, nous réaliserons l'expérimentation comportementale, et les analyses post-mortem sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel permettant de déterminer le nombre d’animaux statistiquement requis en fonction des effets escomptés.

Raffinement

Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera effectué régulièrement. Des points limites spécifiques ont été définis (perte de poids continue et excessive (évaluée de manière visuelle); prostration ; poils ébouriffés, arrêt d’alimentation, etc.) et le raffinement s’appliquera pour une prise en charge adaptée des animaux. Pour les scores les plus importants, cette prise en charge pourra conduire à l’euthanasie de l’animal. En cas de blessures (notamment à la suite de bagarres entre animaux), des analgésiques d’application locale pourront être utilisés. Cependant, notre projet se référant à l’étude de processus neuroinflammatoires, l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques centraux (hors procédure d’euthanasie) est à proscrire pour des raisons scientifiques. . La présence d'une roue d'activité pour mesurer la rythmicité circadienne constitue un enrichissement très apprécié des souris. Ce test nécessite de travailler avec un seul animal par cage, mais les contacts visuels et olfactifs sont maintenus entre animaux de cages voisines.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le mieux adapté pour étudier les effets des modifications génétiques sur le comportement, les tissus, les cellules et les molécules des cellules immuitaires du cerveau. L'utilisation de la recombinase Cre pour contrôler ces modifications génétiques est particulièrement intéressante. C'est pourquoi les modèles murins, en particulier dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer, sont privilégiés. Ces avancées permettent de respecter au mieux les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Refinement). Nous utiliserons des animaux adultes à différents âges en fonction des sous-objectifs du projet : 2-3 mois pour les études en conditions physiologiques ; 4 et 8 mois, correspondant respectivement à un stade précoce et un stade avancé de la pathologie pour les lignées Alzheimer à début précoce; 9 et 12 mois, correspondant respectivement à un stade précoce et un stade avancé de la pathologie pour les lignées Alzheimer à début tardif.

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de tissu pour génotypage, cinq jours d'injections consécutives, puis seize semaines d'un régime riche en graisses ou d'eau sucrée au fructose, avant six heures de jeûne et un prélèvement de sang terminal. Le porteur attend qu'elles deviennent en surpoids et pré-diabétiques, avec un foie plus gras, et signale que les souris privées de production intestinale de glucose présentent un phénotype anxieux léger. Des organes sans utilité pour ce projet seront aussi prélevés afin de constituer une banque de tissus, le porteur affirmant que l'étude "nécessite l'utilisation d'animaux" parce que la stéatose met en jeu des échanges entre organes.

Objectifs

L’obésité connait une croissance alarmante et représente un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux traitements proposés. Une consommation trop importante en graisses et en sucres est un acteur majeur de l’obésité. Parmi les sucres mis en cause, le fructose, retrouvé dans les fruits ou de nombreux produits issus de l’industrie agro-alimentaire (boissons sucrées notamment) est l’un des plus dangereux. En effet, la surconsommation de fructose conduit à une accumulation de graisses dans les cellules du foie, conduisant à un désordre métabolique appelé stéatose hépatique, ou foie gras. Si la surcharge en graisses se poursuit, la stéatose peut évoluer après plusieurs années en cirrhose, avec un risque de cancer du foie. Ainsi, comprendre comment réduire l’impact de la consommation de fructose sur la santé du foie est primordial. En dehors des périodes de repas, l’intestin est capable de produire du sucre (glucose). Ce glucose spécifique, produit en très petites quantités n’est pas nocif pour l’organisme. A l’inverse, il joue un rôle de molécule signal capable d’informer certaines régions clé du cerveau ; Ainsi il exerce des effets bénéfiques anti-obésité, anti-diabète et anti-stéatose hépatique (foie gras). On sait maintenant que l’activation génétique de la production intestinale de glucose protège des troubles induits par une alimentation trop riche en graisses et en sucres. Et à l’inverse, l’absence de production intestinale de glucose favorise l’apparition de ces troubles, malgré une alimentation saine. Ce projet vise à déterminer si la production intestinale de glucose est capable d’éviter ou de diminuer l’apparition d’un foie gras lors d’une consommation excessive de fructose associée ou non à une alimentation trop riche en graisses. Pour cela, nous allons étudier des souris normales et des souris génétiquement modifiées chez lesquelles l’intestin ne permet pas de produire du glucose ou bien au contraire d’en produire davantage par rapport aux souris normales. Chez ces souris, nous étudierons les effets d’une surconsommation de fructose. Les souris recevront du fructose dans l’eau de boisson ou une alimentation riche en graisses pendant au maximum 16 semaines. La prise de poids sera suivie toutes les semaines. Après 16semaines, les souris seront mises à jeun puis les taux de sucre et de graisses sanguins seront mesurés. Nous évaluerons le niveau de stéatose hépatique (foie gras).

Bénéfices attendus

La prévention et le traitement de l’obésité et de ses complications est un enjeu majeur de santé publique, et une meilleure compréhension des mécanismes mis en jeu est nécessaire. Une consommation excessive de fructose (retrouvé notamment dans les boissons sucrées), est extrêmement néfaste puisque cela conduit à l’accumulation de graisses dans les cellules du foie. En effet, avec un fort pouvoir sucrant à moindre coût, le fructose est de plus en plus utilisé par les industriels et ses effets néfastes sur le corps sont de plus en plus décrits. A l’inverse des sucres issus de l’alimentation, le sucre produit par l’intestin est bénéfique puisqu’il est capable de diminuer l’obésité, le diabète et l’accumulation de graisses dans le foie induits par une alimentaire trop riche en graisses et en sucres. Ce projet a pour but de déterminer si la production de glucose par l’intestin pourrait protéger des effets néfastes de la consommation de fructose sur le foie. Ce projet permettra alors d’élargir encore un peu plus le spectre des effets bénéfiques de la production de sucre par l’intestin, et de pouvoir la proposer comme cible thérapeutique intéressante contre l’obésité et ses complications. Par ailleurs, ce projet permettra pour la première fois de déterminer s’il existe des différences entre les mâles et les femelles en ce qui concerne les effets la production intestinale de sucre ou du fructose sur la stéatose hépatique.

Procédures

- Le projet comporte une partie d’élevage des souris génétiquement modifiées. Par conséquent, il comporte des interventions à visée de génotypage. Ainsi, une biopsie de tissu (geste réalisé en quelques secondes) sera réalisée pour vérifier la modification génétique. - Les souris recevront des injections pendant 5 jour consécutifs. Ce geste est réalisé en quelques secondes. - Les souris recevront pendant 16 semaines, soit une alimentation standard ou une alimentation riche en graisses avec de l’eau normale, soit de l’eau contenant du fructose dans le biberon. - Les souris seront pesées toutes les semaines (geste réalisé en quelques secondes), et la consommation de boisson mesurée 2 fois par semaines. - Après 16 semaines de traitement, une mesure du taux de sucre dans le sang (glycémie à partir d’une goutte de sang et un glucomètre ; réalisé en quelques secondes) et un prélèvement de sang terminal et seront réalisés (en quelques secondes). Cela sera réalisé après une mise à jeun de 6h. - Enfin, les animaux seront mis à mort par une méthode respectant l’éthique animale, afin de prélever leurs organes (dont le foie pour analyser sa teneur en lipides).

Impact sur les animaux

- Après 16 semaines de régime riche en graisses et/ou avec du fructose dans l’eau de boisson, les souris devraient être en surpoids, pré-diabétiques et avec un foie plus gras que celui des souris normales (mais sans impact sur leur mobilité). Dans cette étude, elles seront étudiées à un stade précoce du développement de l’obésité afin de limiter les complications liées à ces maladies. - Lors de la mise à jeun précédent la mise à mort (6h), l’ensemble des souris sont capables de maintenir une glycémie normale pendant ce temps court, ainsi aucun dommage supplémentaire n’est attendu chez les souris génétiquement modifiées par rapport aux souris normales. - Les souris sans production de sucre par l’intestin présentent un phénotype anxieux léger. Néanmoins, les conditions d’hébergement en milieu enrichi (nid, maison pour se cacher) sont suffisantes pour atténuer leur anxiété.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par une méthode éthiquement autorisée pour prélèvement du sang et de différents tissus. Des études moléculaires, histologiques et biochimiques seront réalisées afin d’évaluer l’impact de la production intestinale de sucre sur les effets du fructose et/ou du régime riche en graisses sur l’accumulation de graisses dans le foie. Des tissus non nécessaires à ce projet seront également prélevés afin de constituer une banque de tissus qui permettra à l’avenir de réduire le recours à des animaux supplémentaires.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles animaux puisque la pathologie étudiée, la stéatose hépatique, influence l’ensemble du métabolisme de l’organisme et implique des dialogues entre organes. De plus, le fructose est d’abord transformé par l’intestin en lipides (graisses), susceptibles de s’accumuler ensuite dans le foie. Le second site de transformation du fructose en lipides (graisses) est le foie. Ainsi, puisqu’elle implique de nombreux organes (et une communication entre eux), notre étude nécessite l’utilisation d’animaux. A l’issu des procédures, différents tissus non directement nécessaires à ce projet seront prélevés pour constituer une banque de tissus, commune au laboratoire et utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans nécessité d’animaux supplémentaires.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes. Ce nombre a été établi sur différents paramètres : La taille de l’effet, la puissance statistique ainsi que la variabilité entre les individus. Les années de pratique du laboratoire et du personnel qualifié nous ont permis de standardiser nos expérimentations le plus possible afin de diminuer les sources extérieures de variabilité inter-individus. Les modèles génétiquement modifiés nécessaires à ce projet sont conçus de telle sorte qu’ils permettent de produire à la fois des souris dont la PIG est réduite ou augmentée, et des souris témoins. Ainsi, l’utilisation des souris témoins issues de ces reproductions limite le recours à d’autres animaux, non génétiquement modifiés. De plus, afin de limiter la génération de souris avec un phénotype dommageable anxieux léger, le mâle ne sera pas constamment hébergé avec les femelles. Ceci évite ainsi une production en continu et permet d’obtenir un maximum d’animaux du même âge. De plus, un seul mâle sera nécessaire pour 2 cages de reproductions (contenant chacune 2 femelles). Enfin, les lots seront traités successivement afin de réduire le nombre de géniteurs nécessaires à l’obtention des groupes expérimentaux. Nous avons fait le choix ici d’étudier les mâles et les femelles afin de déterminer s’il existe une différence mâles/femelles des effets de la PIG et/ou du fructose sur la stéatose hépatique. Ainsi, si aucune différence n’est observée entre les sexes, les mâles et les femelles pourrons à l’avenir être regroupés dans des mêmes groupes expérimentaux, indépendamment du sexe. A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort afin de prélever différents tissus à analyser, mais également de nombreux autres tissus pour constituer une banque de tissus commune au laboratoire et utilisable à l’avenir pour certaines analyses moléculaires sans animaux supplémentaires.

Raffinement

D’après notre expérience, dans les conditions d’hébergement respectant la réglementation (en groupe et avec de l’enrichissement) aucun phénotype dommageable n’est observé chez les souris incapables de produire du glucose dans l’intestin. Cependant, une attention particulière sera portée sur toute manifestation de stress pour l’ensemble des animaux. Pour limiter leur stress, les animaux seront manipulés régulièrement par les personnes en charge des procédures expérimentales. Ils seront observés quotidiennement (état du pelage, mouvements/posture, morsures...) et pesés chaque semaine pour suivre leur prise de poids. L’échelle de grimace des souris sera utilisée quotidiennement pour nous aider à évaluer le bien-être des souris. En cas de petites plaies causées par les souris, une crème aux propriétés cicatrisantes et antiseptiques sera systématiquement appliquée par les zootechniciens. Nous aurons recours à des points limites définis et précoces. Plus précisément, nous serons attentifs au comportement, à l’apparence, et au poids de l’ensemble des souris. En cas d’atteinte d’un point limite, les souris pourront être mises à mort selon les méthodes autorisées par la législation si aucun moyen de traitement ou de prévention n’a été efficace. Les modèles génétiquement modifiés nécessaires à ce projet sont conçus de telle sorte qu’ils permettent de produire à la fois des souris dont la production intestinale de glucose/sucre est réduite ou augmentée, et des souris témoins. Ainsi, les souris témoins utilisées seront des souris issues des mêmes portées que les souris transgéniques, mais avec une production intestinale de glucose/sucre non modifiée. Ainsi, cela permet de maintenir l’ensemble des individus de la même portée, tout en s’affranchissant d’un éventuel effet cage lors de la mise en place des régimes. De plus, les cages seront séparées en fonction de leur traitement (en fonction de l’alimentation et s’ils ont du fructose dans le biberon).

Choix des espèces

Les effets de la production intestinale de glucose (sucre) sur le métabolisme glucidique et énergétique ont été étudiés chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs, tels que le poisson, montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Ainsi, le modèle murin est compatible avec notre étude en raison de la disponibilité des souris génétiquement modifiées et des nombreux outils d’analyse. De plus, les phénotypes des souris utilisées dans ce projet ont été largement caractérisés. L’invalidation de la production intestinale de glucose sera faite à l’âge de 7 semaine (chez les souris témoins également) et les différents traitements commenceront 5 semaines après, soit à l’âge de 12 semaines. Ce temps de latence de 5 semaines permet une disparition complète des modifications du métabolisme induits par la molécule injectée. Afin de conserver les mêmes conditions expérimentales dans toute notre étude, les animaux n’ayant pas besoin de cette injection pour activer la production intestinale de glucose seront étudiés au même âge, soit 12 semaines. Par ailleurs, les résultats décrit dans la littérature ne proviennent que de souris mâles. Notre objectif est d’approfondir ces résultats mais également d’étudier si nous observons les mêmes résultats chez les femelles. Nous utiliserons donc à la fois des souris mâles et femelles.

12 788 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 11 088 subissent une biopsie de la queue, 4 808 une injection dans le sinus rétro-orbital, 12 588 reçoivent un composé pharmacologique par l'eau de boisson jusqu'à quatre mois d'affilée, et 6 336 passent des tests cognitifs nommés, actimétrie, labyrinthe en Y et labyrinthe de Barnes. Ces souris portent des modifications génétiques qui reproduisent les lésions de la maladie d'Alzheimer, que le porteur décrit pourtant comme dépourvues de "phénotype dommageable". Aucun calcul ne vient soutenir ces effectifs, le RNT indiquant seulement que le nombre a été "réduit au maximum" pour cinq familles de composés brevetés par l'équipe.

Objectifs

L’objectif général de notre projet consiste à comprendre le mode d’action, a découvrir la cible et à optimiser l'effet thérapeutique de 5 familles de composés pharmacologiques innovants, brevetées par notre équipe, dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer (MA). Cette maladie neurodégénérative liée à l’âge, est caractérisée par la présence de deux types de lésions neuropathologiques cérébrales particulières: les dépôts amyloïdes, constitués de peptides amyloïdes et les dégénérescences neurofibrillaires (DNF), qui résultent de l’agrégation de protéines microtubulaires Tau anormalement phosphorylées. Nos composés se différencient des molécules développées jusqu’à présent par un mécanisme d’action qui s'adresse à ces deux caractéristiques de la maladie. L’étude de l'action de nos composés sur les deux processus lésionnels, la neuroinflammation et les fonctions cognitives de la MA nécessite l’utilisation de modèles intégrés. Elle ne peut pas être abordée sur d’autres systèmes biologiques. Nos composés pharmacologiques ont fait l'objet de nombreuses études in vitro préalables aux analyses in vivo. Une première étape a permis d'éliminer les composés présentant de la toxicité cellulaire. Les composés sélectionnés ont ensuite été caractérisés en fonction de leurs capacités à inhiber l'expression et la phosphorylation de la protéine Tau sur ses sites pathologiques et à inhiber la voie amyloïdogénique dans des modèles cellulaires caractérisés. Le chef de file de chacune des 5 familles a été sélectionné. Leur effet thérapeutique doit maintenant être analysé par des approches intégratives dans des modèles expérimentaux reproduisant soit les altérations de la protéine Tau, soit les lésions amyloïdes. La cible thérapeutique sera également validée in vivo après identification dans nos modèles cellulaires. Ainsi, l'efficacité et la sélectivité de nos candidats médicaments sera renforcée. Les résultats obtenus grâce à nos modèles expérimentaux constituent une étape essentielle et préalable à la translation vers le patient sur le plan thérapeutique, mais également sur le plan diagnostic. Notre stratégie expérimentale a déjà fait ses preuves par le passé. Elle a permis le développement d’une start-up et la mise en place d’essais cliniques. Ainsi, notre projet permet de lever des interrogations fondamentales quant aux processus mis en jeu dans la MA, mais il répond également à des besoins cliniques en termes de thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet combine des approches expérimentales pré-cliniques indispensables à la validation des effets bénéfiques de composés innovants. Il permet de disséquer les mécanismes lésionnels et les fonctions cognitives, de comprendre le mode d’action de nos composés et d’optimiser leur structure chimique. L’originalité de ce projet repose sur une action originale de nos composés, à la croisée des voies induisant les altérations de la protéine Tau et les lésions amyloïdes. Les pathologies liées à la neurodégénérescence ne bénéficient, à l’heure actuelle, d’aucun traitement permettant de ralentir ou stopper la maladie. Elles touchent plusieurs dizaines de millions de personnes dans le monde. Nous bénéficions du soutient de la SATT et d’Inserm Transfert pour la valorisation et la protection de nos résultats. A plus long terme, nos données pourront implémenter les approches cliniques existantes et susciter des essais cliniques ultérieurs.

Procédures

11088 animaux subiront une biopsie de la queue pour le génotypage. 4808 animaux subiront une administration intraveineuse rapide et unique dans le sinus retro-orbital. 12588 feront l’objet d’une administration de composé pharmacologique. Les molécules seront préférentiellement administrées via l’eau de boisson (composés solubles dans l'eau), pendant 4 mois maximum. Alternativement, les composés pourront être administrés par voie orale ou par voie intra-péritonéale (administration journalière, 100 à 150 µL). Les animaux seront alors traités pendant 1 mois maximum. En dernier recours, si une administration par voie intra-veineuse devait être réalisée, une seule injection sera réalisée (100 µL max). Les fonctions cognitives seront étudiées sur 6336 animaux grâce à des tests comportementaux afin d’étudier les effets des composés sur les déficits cognitifs associés à la pathologie. La motricité globale des individus est analysée par un test d’actimétrie. La mémoire spatiale à court terme est évaluée par le test du labyrinthe en Y. La mémoire à long terme est évaluée par le test du labyrinthe de Barnes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables consistent aux douleurs associées à la réalisation de la biopsie de la queue ou à la douleur au point d'injection lors des administrations. Il peut également y avoir un impact oculaire suite aux injections retro-orbitaires. Ces nuisances possibles seront prises en charge de manière adéquate.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort au point d’analyse final. Des études histochimiques, moléculaires et biochimiques seront réalisées sur les échantillons de cerveaux afin d’analyser les modulations des caractéristiques physiopathologiques spécifiques aux modèles.

Remplacement

Ce projet combine des approches expérimentales pré-cliniques, indispensables à la validation des effets bénéfiques de composés innovants. Les résultats obtenus grace à nos modèles expérimentaux consituent une étape essentielle et préalable à la translation vers le patient sur le plan thérapeutique, mais également sur le plan diagnostic. Notre équipe de recherche a recours à des systèmes biologiques alternatifs aux modèles animaux (techniques de biologie moléculaire et cellulaire) préalablement à l’étude de l’impact des composés sur les deux processus lesionnels, la neuroinflammation et les fonctions cognitives de la maladie d'Alzheimer qui ne peuvent être abordés sans l’utilisation de modèles intégrés.

Réduction

Notre plan d’expériences permettra de limiter le nombre d’individus au maximum. Une première procédure permettra définir deux concentrations, ainsi qu’un protocole d’administration et un schéma thérapeutique optimaux pour chaque des chefs de file de chacune des 5 familles de candidats médicaments. Les données récoltées seront exploitées et maximisées pour chaque individu afin de limiter ou d’éviter l’utilisation subséquante d’animaux supplémentaires. Pour chacun des groupes d’individus, le nombre a été réduit au maximum tout en permettantl’obtention de résultats robustes (différences statistiquement observables).

Raffinement

Les modèles expérimentaux sont maitrisés par notre équipe et répandu dans les laboratoires étudiants les mécanismes lésionnels et les fonctions cognitives dans la maladie d'Alzheimer. Les points d’analyses nécessitant une mise à mort ont été clairement définis grâce à la bibliographie. Les animaux seront hébergés en groupe. Des éléments d’enrichissement du milieu seront disposés dans chaque cage. Un suivi hebdomadaire des paramètres macroscopiques comportementaux (prostration, isolement, douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable) sera réalisé, en lien avec le personnel animalier. Toute modification de comportement sera prise en charge par des approches appropriées. Les signes de souffrance seront recherchés de manière active, en lien la personne en charge du suivi du bien-être animal (SBEA). Les animaux présentant un des points limites spécifiés dans chacune des procédures seront mis à mort dans une salle dédiée.

Choix des espèces

Dans notre étude, nous utilisons des souris de fond génétique C57BL/6J et génétiquement modifiées. Les modèles utilisés ne présentent pas de phénotype domageable. Ils reproduisent les altérations de la protéine Tau (modèle THY-Tau22) ou les lésions amyéloïdes (modèle APP/PS1) observées lors de la maladie d'Alzheimer et permettent d’étudier les mécanismes pathologiques et l’impact de nos candidats médicaments sur le processus lesionnels et les fonctions cognitives par des approches intégratives et complémentaires (transcriptomique, protéomique, étude du comportement, histochimie). Nos traitements, à visée curative, sont donc administrés à des animaux agès de 6 mois, période à partir de laquelle la pathologie est avérée. Dans les procédures qui nous permettront de valider notre cible thérapeutique, d’étudier son impact sur le developpement de la maladie et les concéquences de sa modulation, la surexpression ou l’inhibition de l’expression de cette cible sera réalisée grace à un protocole utilisé classiquement par les équipes de recherche, consistant à une injection unique d’un vecteur chez de jeunes animaux.

Une trentaine de minutes de chirurgie crânienne, répétée trois mois plus tard pour près de la moitié d'entre elles, puis six séries de tests moteurs étalées sur un an. 195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des fibrilles d'alpha-synucléine leur sont injectées dans le cerveau pour y provoquer une maladie de Parkinson, avec ralentissement des mouvements et perte d'équilibre attendus trois à six mois plus tard chez les souris non traitées. Le porteur nomme les tests, rotarod pour la coordination, épreuve de balance, mesure de force musculaire, et retient la souris parce que son petit cerveau favorise la diffusion des fibrilles, avec des animaux inoculés à 12 mois et suivis jusqu'à 24 mois pour reproduire l'âge tardif de la maladie humaine.

Objectifs

Notre objectif est d’évaluer l’effet thérapeutique d’un vecteur viral de type adénovirus (AAV) dans le cadre d’un projet de thérapie génique ciblant la maladie de Parkinson, en utilisant un modèle de souris âgées de plus de 12 mois atteintes de la maladie de Parkinson. Les vecteurs virus adéno-associé recombinants (rAAV) ont récemment montré des résultats encourageants pour le traitement de maladies génétiques. La thérapie génique par vecteurs AAV est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative sévère caractérisée par la mort d’un certain type de neurones (dopaminergiques) et dont la fréquence augmente chez des personnes de plus de 60 ans. Cette affection provoque des difficultés motrices importantes voire invalidantes. Même s’il existe des traitements qui peuvent améliorer les symptômes, il n’existe pas à ce jour de traitement curatif de la pathologie. L’accumulation dans certains neurones d’agrégats de protéines composés d’alpha-synucléine est un mécanisme central de la maladie humaine qui conduit à la mort des neurones. Pour mettre au point une thérapie génique innovante, notre objectif est de créer un modèle d’étude de la maladie pertinent, pour cela nous utiliserons le modèle souris, dans lequel nous inoculerons des agrégats (fibrilles) d’alpha-synucléine dans le cerveau. Deux études ont déjà pré-établi la faisabilité de ce type de modélisation. Pour mimer la phase la plus sévère de la maladie, nous devrons recréer les conditions pathologiques chez des souris assez âgées. Nous inoculerons donc les fibrilles chez des souris âgées de 12 mois, pour mimer l’âge tardif de survenue chez l’homme. Nous étudierons les effets de transfert des gènes thérapeutiques introduits via des vecteurs viraux dans le cerveau de ces souris, pour contrecarrer les mécanismes de la maladie. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique sur les paramètres pathologiques, cliniques, cellulaires et biochimiques, des souris-modèles ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement chez l’homme. En résumé, l’objectif du projet est d’établir un modèle préclinique pour tester un nouveau vecteur de thérapie génique, constituant ainsi la première étape d’une démarche translationnelle en direction de la maladie humaine. Cette démarche nécessite l’établissement d’une preuve de concept thérapeutique dans l’espèce souris.

Bénéfices attendus

La thérapie génique par vecteurs AAV est en plein développement dans plusieurs maladies humaines, notamment dans certaines affections neurologiques. Elle s’appuie sur une dizaine d’années d’essais chez l’homme (plus de 2000 patients, atteints de diverses maladies, ont reçu des vecteurs AAV). Elle est considérée comme un des principaux espoirs de traitement curatif, à condition de prouver ses effets, dans un premier temps, dans des modèles animaux pertinents. La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative sévère dont la fréquence augmente chez les personnes de plus de 60 ans. Elle n’a pas de traitement curatif et son évolution est invalidante. Cette maladie est caractérisée par la mort de neurones dopaminergiques entraînée par l’accumulation anormale d’agrégats de protéines riches en alpha-synucléine (une protéine présente normalement sous forme non agrégée dans les neurones). Pour tester un traitement innovant notre objectif est de créer un modèle d’étude pertinent de la maladie chez la souris, en inoculant des fibrilles d’alpha-synucléine dans le cerveau. La mise en évidence d’un effet bénéfique de la thérapie génique dans notre modèle ouvrirait une possibilité nouvelle de traitement applicable à l’homme.

Procédures

Chirurgie : Préparation de l’acte chirurgical et de l’anesthésie -Durée : 30 minutes -1 fois pour 90 souris -2 fois pour 90 souris à 3 mois d’intervalle Acte chirurgical : injection de fibrilles et/ou de vecteur thérapeutique et/ou d’une solution saline -Durée : 30 minutes -1 fois pour 90 souris -2 fois pour 90 souris à 3 mois d’intervalle Habituation à l’expérimentateur : 3 minutes par souris et par jour, durant 5 jours consécutifs Tous les 2 mois, 6 fois au total Tests comportementaux : Trois types de tests comportementaux seront réalisés tous les 2 mois après l’injection de fibrilles sur afin d’évaluer la balance, la coordination et la force musculaire de l’ensemble des animaux. Ces tests vont permettre d’étudier les effets du traitement par transfert de gène thérapeutique dans le cerveau des souris pour contrecarrer les mécanismes de la maladie de Parkinson. Test 1 : test de coordination Durée : 20 minutes/jour cad 4 passages d’environ 5 minutes max sur le rotarod avec 1 heure de repos entre chaque passage. Répétition : 3 jours consécutifs Test 2 : test de balance Durée : 20 minutes par jour Répétition : 4 jours consécutifs Test 3 : test de force musculaire Durée : 15 minutes Répétition : 3 jours consécutifs Ces trois types de tests seront réalisés au total 6 fois au maximum pour tous les animaux.

Impact sur les animaux

Les complications liées à aux chirurgies sont rares mais peuvent entrainer : - une altération grave du comportement, - des séquelles de traumatisme non-résolues par traitement, - un incident d’anesthésie avec séquelles (troubles respiratoires, fausse déglutition), - une hémorragie sévère en cours de chirurgie, - une perte de poids au cours de la semaine suivant l’intervention. L’injection de fibrilles d’alpha-synucléine entrainera un développement progressif de la maladie de Parkinson qui se traduira par des déficits moteurs (ralentissement des mouvements, perte d’équilibre). Ces symptômes devraient apparaitre environ 3 à 6 mois après l’injection de fibrilles dans le groupe des souris non traitées par vecteur thérapeutique. Une perte de poids peut en découler.

Devenir

A la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés. Le but est de prélever les organes post-mortem des animaux, et d'effectuer des analyses biomoléculaires et histologiques. Les cerveaux et les foies de ces animaux seront prélevés. Le but est de regarder l’effet des vecteurs thérapeutiques sur les marqueurs de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Toutes les constructions génétiques (vecteurs viraux) utilisées seront caractérisées in vitro avant leur utilisation chez l’animal. Des études in vitro sur des cultures de cellules ont déjà été menées. Cependant, elles ne nous permettent pas d’évaluer l’efficacité des constructions génétiques pour corriger les manifestations cliniques de la maladie à l’échelle de l’organisme entier.

Réduction

La constitution des groupes est basée sur notre expérience et le type d’analyses réalisées nous permettant d’obtenir des données statistiquement significatives pour évaluer l’effet thérapeutique du traitement. Nous avons effectué une large recherche bibliographique afin de nous assurer de ne pas dupliquer des protocoles expérimentaux déjà réalisés. Cette recherche bibliographique nous a permis d'optimiser nos procédures et le nombre d'animaux à utiliser afin d'obtenir des résultats statistiques exploitables, robustes et valables. Les effectifs prévus ont été réduits au maximum. Ce nombre, validé par le un logiciel spécialisé, permettra de fournir un résultat fiable et statistiquement analysable pour chaque sous-groupe.

Raffinement

Pour l'administration des fibrilles et du vecteur thérapeutique, des protocoles anesthésiques et analgésiques adaptés seront mis en place selon la procédure. Nous surveillerons l’état de santé des souris tout au long de l’expérience, et de manière accrue en post-opératoire. Cela permettra une intervention immédiate et de appropriée si des signes de souffrance apparaissent et les points limites sont atteints. Tout au long de l’expérience un suivi précis des souris sera mis en place : pesées et observations hebdomadaires des animaux. L'application de critères de points limites permettra de veiller au bien-être des animaux. Afin de suivre l’apparition des signes cliniques de la maladie de Parkinson et d’évaluer l’effet du vecteur thérapeutique sur la maladie, un suivi précis des animaux sera mis en place à + 2 mois post-opératoire, âge à partir duquel les premiers signes cliniques de la maladie de Parkinson devraient apparaître : mise en place de tests de comportement tous les 2 mois afin de suivre une éventuelle modification du comportement de l’animal et le développement de déficits moteurs. Les souris seront habituées progressivement aux protocoles comportementaux et aux examinateurs. Cela permettra d’avoir un suivi régulier et proche des animaux. Enfin, nous assurerons le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation en limitant leur angoisse grâce au suivi des conditions d’hébergement, et d’utilisation de cages proposant un environnement riche.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme espèce d’étude préclinique a plusieurs justifications : - l’établissement d’un modèle original chez la souris de la maladie de Parkinson à un stade avancé permettra des études des mécanismes de la maladie et permettra également de tester des traitements ; - l’existence de modèles souris de maladie peu sévère basés sur l’inoculation de fibrilles établit la faisabilité de notre projet ; - la grande majorité des études de thérapie génique commence dans un modèle de souris pathologique, et selon les résultats peut se déployer secondairement chez le primate ; - la petite taille du cerveau de souris est propice à la diffusion étendue des fibrilles, ainsi qu’à la diffusion du vecteur thérapeutique à partir de son point d’injection ; - la maitrise par notre équipe des tests moteurs chez la souris permet une étude fine des défauts neurologiques. Nous avons déjà testé des vecteurs comparables dans des souris modèles d’autres maladies. Nous utiliserons des souris âgées de 12 mois au moment de l’injection des fibrilles accompagnée ou non d’une injection de vecteur thérapeutique. Cela permettra de mimer l’âge avancé de la maladie humaine. Le comportement de ces souris sera étudié entre l’âge de 14 et 24 mois.

Rendus migraineux par une injection quotidienne pendant quatre jours, puis soumis au test de Von Frey qui mesure leur réaction à une stimulation, une minute toutes les quinze minutes pendant deux heures, 400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le cinquième jour, une injection locale et deux injections sous-cutanées leur sont administrées sous anesthésie générale. L'objectif tient en peu de choses, le porteur indiquant que l'activité antimigraineuse de la molécule est déjà établie et cherchant seulement à comparer les voies d'administration et une dose plus faible. Tous les rats sont tués à l'issue, le RNT justifiant leur mort par une "impossibilité de récupérer les animaux du fait des procédures réalisées", sans dire lesquelles.

Objectifs

Nous savons que la molécule d'intérêt a bien une activité dite antimigraineuse. Le but de ce projet est d'étudier l'amélioration de la douleur dans un modèle de migraine, selon différentes voies d’administration de la molécule d'intérêt et de tester l’effet de cette molécule à une dose plus faible.

Bénéfices attendus

A moyen terme, selon les résultats obtenus, ce projet nous permettra de mieux connaitre le mécanisme d'action de la molécule d'intérêt et proposer des cibles thérapeutiques avec des effets secondaires limités. Dans le contexte de ce projet, une diminution de l'effet antimigraineux après l'administration centrale indiquera que la majorité de l'effet antimigraineux de ces agonistes est dûe à une action sur les récepteurs delta opioïdes localisés en périphérie, notamment dans le ganglion trigéminale. Il serait donc accessible à des molécules qui ne passent pas la barrière hémato-encéphalique ce que permettrait d'avoir la même efficacité et moins d'effets secondaires.

Procédures

Les interventions dans ce projet sont prévues sur une durée maximale de 5 jours. Ce sont des injections (intrapéritonéales i.p.) sur des animaux vigiles (maximum 5 injections). Les premiers 4 jours de l'induction du modèle de migraine chronique, chaque animal reçoit au maximum une injection i.p. par jour (durée d’intervention : 1min). Au 5ème jour de l'induction de la migraine chronique ou le premier jour de l'induction de la migraine aigue, une injection locale et/ou deux injections sous-cutanées seront réalisées sous anesthésie générale. Dans le cas du test comportemental de Von Frey, nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum conformément aux règles éthiques éditées par l'International Association for the Study of Pain (IASP). L’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements (intervention de 1 minute par rat, toutes les 15 minutes pendant 120 min, maximum).

Impact sur les animaux

Le modèle de migraine, que ce soit en aigu ou en chronique, ne montre pas d'effets indésirables sur les animaux autre que le développement d'une douleur modérée majoritairement faciale. L'injection centrale (intra-cisternale) ou systémique (sous-cutanée ou intra-veineuse) de la molécule d'intérêt est réalisée sous anesthésie. L'administration de cette molécule peut produire une augmentation transitoire de la mobilité.

Devenir

Impossibilité de récupérer les animaux du fait des procédures réalisées.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet, il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Il n'existe dans la littérature aucune méthode alternative (in vitro ou in silico) pouvant répondre à l'efficacité d'un produit à potentiel thérapeutique anti-migraineux. Un animal entier avec un système nerveux intégré est un préalable à une étude pertinente dans le domaine de la douleur. Une méthode in vitro ne pourrait rendre compte de la douleur car elle supprimerait de nombreux paramètres (régulations...) et rendrait le résultat réducteur voir inadapté. Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l'effet d'une molécule sur le seuil nociceptif. Les études in silico constituent dans le domaine de la migraine une étape encore trop primaire aujourd'hui.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum (n=10/groupe/sexe). Les animaux seront hébergés collectivement (au moins 2 par cage), avec de l'enrichissement, afin d'éviter le stress. Pas de groupe témoin pour le modèle de migraine (réutilisation des données précèdentes) ni de groupe véhicule pour l'administration sous-cutanée car il a déja été réalisé dans l'étude précèdente. Le nombre d'animaux par groupe est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. D’après les données du laboratoire nous prévoyons une perte maximum 15 à 20% (complexité de la technique d'admnistration, exclusion après la phase d'habituation, rats non-répondeurs à l'ISDN). L’ensemble des données sera analysé par une analyse de variance à 2 ou 3 voies (effet douleur et/ou traitement et/ou sexe) en mesures répétées (ou non) et suivi d'un test post-hoc.

Raffinement

Pendant sept jours, les rats seront acclimatés à l’animalerie. Les conditions d'hébergement sont standard et enrichies à l'aide de rouleaux en carton permettant aux animaux de se cacher. Les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les expériences peuvent être interrompues si un point limite est atteint (mise à mort).

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Adultes (6-8 semaines) pour comparaison avec les autres données de la littérature.

1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une greffe de cellules tumorales, des injections de vecteurs viraux dans la tumeur et deux prélèvements de sang sous anesthésie, la taille de la tumeur étant mesurée au pied à coulisse sur animal éveillé. Le porteur reconnaît que les cellules injectées peuvent former des métastases, entraîner une perte de poids importante et dégrader l'état général, et que les vecteurs peuvent déclencher une inflammation générale. Sur le remplacement, il affirme que seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration entre cellules immunitaires et cellules tumorales, et qu'une nouvelle approche thérapeutique "ne peut se faire que chez l'animal".

Objectifs

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, en témoigne le succès des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients ayant ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie beaucoup selon les cancers. Alors que les mécanismes de résistance primaires et secondaires ont été identifiés au cours des dernières années, il apparait que pour les tumeurs faiblement immunogènes et/ou avec un faible infiltrat immunitaire, de nouvelles stratégies doivent être développées afin de stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. On sait que l’efficacité d’une réponse inflammatoire dépend de la qualité et de la quantité de médiateurs inflammatoires tels que cytokines et chimiokines produites dans le microenvironnement tumoral (MET). Dans ce contexte, les vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ciblant les cellules tumorales et/ou immunitaires semblent un outil idéalement adapté à des approches de vaccination/immunothérapie. L'objectif du projet est d’utiliser de nouveaux AAV codant pour des cytokines d’intérêt afin de stimuler les réponses immunitaires dirigées contre la tumeur. Nous avons développé des AAV codant pour l’une des 4 cytokines murines suivantes : IL-12sc (protéine de fusion entre les sous-unités IL-12p40 et IL-12p35) qui module l’activité des lymphocytes T et cellules NK, IFN-α ayant des activités anti-tumorales, GM-CSF (facteur stimulant granulocytes et macrophages) et IL-15sushi (protéine de fusion entre le domaine sushi de la chaine α du récepteur à l’IL-15 avec la cytokine IL-15) dont le rôle anti-tumoral est établi. Nous pensons que l’injection intra-tumorale des AAV codant pour une cytokine donnée ou plusieurs (combinaison d’AAV codant pour des cytokines différentes ou un AAV codant pour plusieurs cytokines à la fois) entrainera une production locale et aiguë de ces cytokines favorisant le recrutement et l’activation des cellules immunitaires dans le MET, ce qui permettra de générer une réponse immunitaire anti-tumorale efficace permettant une diminution de la croissance tumorale, voire un rejet de la tumeur. Nous envisageons également de combiner cette stratégie thérapeutique avec 1) les immunothérapies utilisant des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (CTLA-4 et PD-1/PDL1) et 2) avec des AAV codant pour des protéines capables d’induire une mort cellulaire immunogénique (ou mort cellulaire inflammatoire capable d'induire la stimulation du système immunitaire).

Bénéfices attendus

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, comme en témoigne le succès des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients bénéficiant de ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie considérablement entre les différents cancers. De nouvelles thérapies innovantes ont donc besoin d'être mise en place. Pour ce faire, nous attendons que l'injection intra-tumorale des AAV codant pour les différentes cytokines (IL-12sc, IFN-α, GM-CSF et IL-15sushi), induise une réponse immunitaire permettant un rejet de la croissance tumorale et l'augmentation de la survie des animaux traités. De plus, l'utilisation de nos vecteurs codant pour ces différentes cytokines seule, mais aussi en combinaison avec d’autres immunothérapies déjà bien connues (tels qu’un anti-PD1, anti PD-L1 ou anti-CTLA-4) et/ou en cours de développement dans le laboratoire (l’utilisation d’AAV codant pour des protéines capables d’induire une mort cellulaire immunogénique et de permettre l’initiation d’une réponse immunitaire antitumorale), aura pour but : (1) d’apporter des effets à long terme chez nos animaux avec la mise en place d'une réponse immunitaire amplifiée et (2) de permettre le contrôle voire le rejet à long terme des différents modèles tumoraux. Les vecteurs AAVs possèdent de nombreux avantages et ont déjà été approuvés en clinique en Europe et aux Etats-Unis. Il est donc envisageable de produire ces vecteurs pour une utilisation chez l'homme, si nos stratégies se montrent convaincantes.

Procédures

- Prélevements de sang sur souris anesthésiées : 2 prélevements par souris à 10 jours d'intervalle, 15 secondes - Injections de cellules tumorales et de vecteurs AAV sur souris anesthésiées, 10 secondes - Mesures de la taille de la tumeur au pied à coulisse sur souris vigile, 45 secondes

Impact sur les animaux

Une fois injectées, les cellules tumorales peuvent former des tumeurs secondaires (métastases) dans différents tissus causant de la souffrance animale. Pour limiter cet écueil, le nombre des cellules tumorales à injecter est bien documenté dans la littérature, minimisant de ce fait ce phénomène. Les modèles tumoraux peuvent aussi induire une perte de poids importante et un mauvais état global de l'animal. De plus, l'injection d'AAV pourrait induire une inflammation systémique si les différents AAV vont transduire différents organes ou tissus de l'animal. Cependant, nous limitons cet effet secondaire par une injection intra-tumorale avec un volume d'injection limité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever le sang et des organes pour analyse. Aucun animal ne peut donc être replacé, adopté ou réutilisé.

Remplacement

Seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration qui existe entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique ne peut se faire que chez l’animal. Dans ce cadre la souris est utilisée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée pour optimiser les protocoles expérimentaux et s’assurer de la non-obtention de résultats déjà publiés. Le nombre d’animaux utilisés sera déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée qui peut être limitée en se basant sur une grille d’observation visant à définir des points limites à partir desquels l’expérience sera arrêtée immédiatement. Si les animaux présentent des signes de douleur, de la buprénorphine sera administrée (0,05 mg/kg). Un enrichissement est également apporté par des abris de cellulose et des carrés de coton vierge.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris permet aussi l’utilisation de modèle transgénique, des modèles de Knock-Out qui peuvent être intéressants dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le cancer. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (animaux âgés entre 6 et 8 semaines au début du protocole) afin que le système immunitaire soit mature au moment de l’inoculation de la tumeur et de l’injection intra-tumorale des différents AAV.