Rongeurs
Etude des effets d’un facteur de croissance sur le muscle de la souris âgée.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
Six semaines de probiotiques dans l'eau de boisson, deux passages en tube de contention pour mesurer la composition corporelle, un test d'agrippement de quatre-vingt-dix secondes sur une grille retournée : 30 souris âgées de 21 mois vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le jour de la mise à mort, elles reçoivent un antidouleur sous la peau puis, trente minutes plus tard, un mélange d'anesthésiques dans l'abdomen avant un prélèvement sanguin, et sont tuées dans la foulée. Aucune n'est gardée vivante, les tissus étant collectés puis stockés pour des questions à venir. Le porteur justifie l'effectif par quinze souris par groupe et annonce que "cette procédure utilisera 45 animaux", quand le projet en déclare 30.
Objectifs
Le but du projet est d’étudier la capacité de probiotiques (bactéries non pathogènes) à transmettre la séquence ADN d’une molécule d’intérêt aux cellules de l’intestin de souris âgées, puis la capacité de ces cellules à produire la molécule d’intérêt, et enfin la capacité de celle-ci à agir sur les muscles des souris âgées pour augmenter leur masse musculaire et leur force musculaire.
Bénéfices attendus
Seuls les travaux menés précédemment chez des souris obèses ont permis une première validation des capacités de la molécule d’intérêt à augmenter la masse musculaire dans un modèle animal de sarcopénie. Si les résultats de cette étude chez les souris âgées sont positifs cela permettra de confirmer ces premières données et ainsi renforcer le potentiel de cette molécule comme candidat pour la prise en charge de la sarcopénie. Un essai clinique chez la personne âgée pourra ensuite être sérieusement envisagé. Ceci constitue une avancée non négligeable dans le domaine car il n’existe à l’heure actuelle aucune solution thérapeutique pour les personnes âgées atteintes de sarcopénie.
Procédures
Les 30 souris recevront des probiotiques dans l’eau de leur biberon (durée= 6 semaines). Deux analyses de la composition corporelle des 30 souris seront réalisées (souris vigiles, contention dans un tube placé dans l’appareil de mesure pendant moins de 2 minutes par souris). Une mesure de la force musculaire des 30 souris sera réalisée grâce à un test d’agrippement (souris vigiles se déplaçant librement sur une grille inversée pendant 90 secondes maximum). Avant la mise à mort, les 30 animaux recevront un antidouleur par injection sous la peau (durée=30 sec contention comprise/animal) puis trente minutes plus tard un mélange d’anesthésiques par une injection dans l’abdomen (durée=30 sec contention comprise/animal) pour effectuer un prélèvement sanguin (20 secondes). Toutes les souris anesthésiées seront mises à mort immédiatement après le prélèvement (2 secondes).
Impact sur les animaux
Cette procédure entraînera des nuisances légères sur les animaux. La mesure de la composition corporelle et le test de force musculaire entraîneront un léger stress chez les animaux. Les injections d’antidouleur et d’anesthésiques nécessaires pour le prélèvement de sang final peuvent générer une douleur et un stress chez l’animal. Aucun effet néfaste lié à l’ingestion des probiotiques n’est attendu.
Devenir
Les 30 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.
Remplacement
Le but du projet est d’étudier la capacité des probiotiques à transmettre les séquences ADN aux cellules de l’intestin des souris, puis la capacité de ces cellules à produire la molécule d’intérêt, et enfin la capacité de celle-ci à agir sur les muscles des souris âgées. Il s’agit d’une problématique complexe impliquant une cascade d’évènements et la communication entre plusieurs organes. Aucune alternative non animale n’est disponible pour répondre à une telle problématique. Ainsi ce projet requiert l’utilisation d’animaux vivants. Il est important de mentionner que la molécule d’intérêt a été testée en amont sur des cellules de muscle en culture afin de valider ses propriétés.
Réduction
Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Il est basé sur des études précédentes chez des souris injectées avec une molécule similaire. Pour observer une différence significative dans la taille des muscles, compte tenu de la variabilité et de la fragilité des muscles, il faut compter 15 souris/groupe. Cette procédure utilisera 45 animaux. Un maximum de tissus seront récoltés lors de la mise à mort des animaux puis stockés. Ces tissus seront disponibles pour répondre à d’autres questions qui pourront émerger ou pourront être partagés avec d’autres équipes. Cela permettra de ne pas répéter inutilement l’expérience.
Raffinement
L’état général des animaux et leur comportement seront étroitement observés 3X/semaine. Les animaux seront pesés 1X/semaine. La prise alimentaire sera contrôlée 1X/semaine également. Les probiotiques seront administrés dans l’eau de boisson et non par gavage pour éviter manipulation quotidienne, stress et douleur liés au gavage. Afin de limiter le stress des animaux au cours de la mesure de la composition corporelle et du test de force musculaire, les tests seront réalisés le matin (l’après-midi l’animalerie est plus calme et les animaux sont donc beaucoup plus enclins à dormir que le matin) et les animaux seront amenés dans la salle d’expérimentation 30 minutes avant les mesures et seront immédiatement replacés dans leur cage d’hébergement dès la fin des mesures. Pour limiter encore d’avantage le stress induit par la mesure de la composition corporelle, le temps nécessaire sera laissé à chaque animal pour qu’il entre volontairement dans le tube d’analyse. Une injection d’antidouleur puis une injection d’anesthésiques seront réalisées en amont du prélèvement de sang final pour éviter toute douleur. Tous les animaux seront immédiatement mis à mort à la suite du prélèvement de sang. Surveillance des animaux, pesées et tests fonctionnels seront réalisés uniquement par deux personnes pour limiter le stress. Des points limites suffisamment précis, prédictifs et précoces ont été définis afin d’éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Les connaissances relatives aux effets des probiotiques chez la souris ainsi qu’aux effets d’une molécule similaire sur le muscle de la souris font de cette espèce un modèle de choix pour répondre à la question posée. La physiologie de la souris âgée étant proche de celle de l’Homme sur plusieurs aspects (sarcopénie, ostéoporose, ralentissement du métabolisme), utiliser la souris âgée dans ce projet permettra d’obtenir des informations importantes pour transférer la technologie chez l’Homme dans un essai clinique. L’administration des probiotiques sera réalisée chez des souris âgées de 21 mois. A ce stade, les souris présentent une sarcopénie marquée et constituent donc un modèle idéal pour étudier les effets de la molécule sur le muscle et la force musculaire et évaluer son potentiel à être utilisée en clinique chez des personnes âgées présentant une sarcopénie.
Evaluation d’une thérapie génique basée sur l’utilisation d’un lentivirus dans le modèle souris de la glycogénose de type 3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
Les souris utilisées portent la glycogénose de type III, une maladie qui leur vaut à l'âge adulte une faiblesse musculaire et une fibrose du foie évoluant, dans un tiers des cas, vers des tumeurs. 522 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit une biopsie de la queue pour le génotypage, une injection intraveineuse du vecteur viral sous contention ou sous anesthésie selon l'âge, puis un prélèvement sanguin mensuel par voie mandibulaire. Le foie devant être analysé pour mesurer la correction apportée par la thérapie génique, aucune souris n'est gardée vivante.
Objectifs
La glycogénose de type III (GSDIII), également connue sous le nom de maladie de Forbes-Cori, est un trouble génétique rare qui affecte la façon dont notre corps stocke et utilise le glucose, qui est le principal carburant de notre corps. Normalement, le corps stocke du glucose sous forme de glycogène, une sorte de réservoir d'énergie, pour pouvoir l'utiliser lorsqu'il en a besoin, comme lorsqu'on fait de l'exercice ou on saute un repas. Dans la GSDIII, il y a un problème avec une enzyme spéciale, appelée GDE, qui aide à décomposer ce glycogène en glucose pour que le corps puisse l'utiliser. Sans cette capacité à bien décomposer le glycogène, le corps manque d'énergie au moment où il en a besoin. Le glycogène s'accumule alors de façon anormale dans les muscles et le foie, conduisant à une faiblesse musculaire et des problèmes hépatiques. Il n’existe pas de traitement permettant de guérir cette maladie. Notre projet est de corriger l’atteinte hépatique de cette maladie, grâce à l’utilisation d’un virus modifié, pour transporter le gène de la GDE jusqu’aux cellules du foie, afin qu’elles soient de nouveau capable de fabriquer cette GDE et d’utiliser le glycogène comme énergie. Avant qu’une telle stratégie ne puisse être utilisée pour traiter des malades, il est indispensable de tester son pouvoir thérapeutique sur le modèle animal de la GSDIII, ici la souris. Ce projet décrit les procédures expérimentales qui seront réalisées chez ces souris afin de déterminer l’efficacité du virus médicament. Dans un plus long-terme, une optimisation devra lui être apporter, afin de traiter en même temps le foie et les muscles.
Bénéfices attendus
Une des limites majeures pour le traitement de l’atteinte hépatique dans la GSDIII est le développement progressif de fibrose et la dégénerescence des cellules du foie au cours du temps. Notre projet peut répondre à cette problématique grâce à une stratégie thérapeutique basée sur l’utilisation d’un virus médicament intégratif pour transporter le gène manquant jusqu’aux cellules du foie. En effet, le gène transporté par ce type de virus s’intègre dans l'ADN de la cellule cible et permet ainsi une expression stable au cours du développement cellulaire, un réel avantage pour corriger à long-terme le défaut héptatique dans GSDIII, en particulier chez les patients pédiatriques, dans lesquels le foie subit une forte croissance.
Procédures
La gestion de l'élevage des souris GSDIII nécessite une biopsie (queue) afin de confirmer le défaut génétique des souris qui entreront en protocole ( réalisé une fois par animal, geste qui dure moins d'une minute). Ce projet décrit l'évaluation d'un traitement injecté par voie intraveineuse, sur animal vigile, placé sous contention: 1 seule injection par animal, ce geste dure 1 minute. Un bilan sanguin mensuel sera réalisé ches les souris, grâce à un prélèvement réalisé sous anesthésie générale (ce geste dure 1 minute)
Impact sur les animaux
Les souris GSDIII présentent à l'âge adulte une faiblesse musculaire, mais pas de difficulté motrice évidente ni essoufflement. Ces souris sont capables de s’alimenter et de se déplacer normalement. Elles développent, également à l'âge adulte une fibrose hépatique, pouvant entrainer, dans un tiers des cas, des tumeurs, vers l'âge de 14-15 mois. Nous utilisons des virus médicaments non dangereux et à des doses non toxiques, de ce fait aucune toxicité n’est attendue. Seuls les gestes techniques pourront provoquer d'eventuelles nuisances aux souris. Ces gestes comprennent une biopsie de la queue pour confirmer le défaut génétique, l’injection du virus (intraveineux) ainsi que de prélèvements sanguins mensuels. Ces actes de gravité légère seront réalisés à l’aide d’outils appropriés et auront des répercussions mineures pour l’animal.
Devenir
Afin de pouvoir évaluer la correction de la glycogénose de type III grâce au virus médicament, le foie doit être prélevé et analysé. Tous les animaux seront donc euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir récupérer cet organe.
Remplacement
Afin de sélectionner le virus médicament le plus performant, l’idéal serait de pouvoir le tester sur des cellules. Néanmoins, une fois dans l’organisme, le virus doit échapper au système immunitaire, traverser la paroi des vaisseaux sanguins et pénétrer dans le foie afin d’apporter le gène manquant. Malheureusement, ces étapes ne sont pas encore réalisables dans des cellules. Il est donc indispensable de devoir recourir à des animaux pour se rapprocher le plus possible de ce qu’il se passera chez l'humain.
Réduction
Afin d’utiliser un minimum d’animaux, nous avons utilisé une approche statistique nous permettant de définir le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir un résultat fiable nous permettant de répondre aux problématiques posées. De plus, des analyses post mortem seront effectuées sur les tissus de tous les animaux afin de s'assurer que le maximum d'informations possible est recueilli sur chaque animal.
Raffinement
Les souris utilisées lors de ce projet ne présentent pas de signes de douleurs évidents. En cas de biopsies à la queue, l'hémostase sera vérifiée en appliquant une pression sur la partie coupée de la queue avec de la gaze jusqu’à ce que le saignement se soit arrêté. L'animal sera ramené dans sa cage et surveillé pendant au moins 5 minutes pour détecter la réapparition d'éventuels saignements. Pour réaliser les injections par voie intraveineuse, les souris seront positionnées sous une source chaude pour favoriser la vasodilatation des veines. Selon l'âge des souris, elles seront réalisées dans la veine temporale, sous anesthésie (souriceaux) ou dans la veine de la queue sur animal vigile (adultes). Ces voies d’administration ont été choisies pour leur efficacité et leur rapidité. Ces injections seront réalisées lentement pour éviter toute augmentation brutale de la volémie. Un éventuel saignement sera stoppé par l’application d’une compresse au niveau du point d’injection. Après l’injection des différents vecteurs, les souris seront surveillées pour vérifier l’absence de signes de souffrance (souris prostrée, diminution d’activité locomotrice spontanée, poil piqué). Dès les premiers signes de souffrance, la souris sera pesée et surveillée quotidiennement. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée. Les prélèvements de sang mensuels seront réalisés par voie mandibulaire, sous anesthésie gazeuse (Isoflurane).
Choix des espèces
Les souris atteintes de la glycogénose de type III présentent les différentes caractéristiques de la pathologie observée chez l’humain. C’est un modèle validé par la communauté scientifique, prédictif de l’efficacité du traitement qui sera utilisé en clinique. Par conséquent, nous allons optimiser notre traitement dans cette espèce animale. Pour répondre à notre objectif, les souris seront traitées à différents stade de sévérité de la maladie (de la naissance à l’âge adulte), afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique de notre vecteur. Nous souhaitons comprendre si ce traitement sera capable de (i) prévenir la maladie chez les plus jeunes souris (traitement avant l’apparition de fibrose) et maintenir une correction sur le long-terme malgré la croissance du foie, et (ii) corriger la pathologie chez les souris plus âgées et donc plus sévèrement atteintes (traitement de foies fibrotiques).
Impact thérapeutique de l’administration de probiotiques humains sur le développement de la maladie inflammatoire aiguë du rejet du greffon chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées à la fin de chaque procédure pour que leurs organes soient étudiés, 742 souris vont être utilisées, dont 672 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les trois quarts sont irradiées puis reçoivent une greffe de moelle osseuse par injection rétro-orbitaire sous anesthésie, et les trois quarts sont gavées à la sonde, vigiles. Une réaction inflammatoire du système digestif est attendue, avec des injections de morphinique déclenchées selon le score obtenu à la grille de points limites. Sur l'effectif, le porteur écrit avoir réduit le nombre de souris "au minimum (n=5)", sans expliquer comment ce chiffre conduit aux 742 animaux déclarés.
Objectifs
Une modification du microbiote (flore bactérienne) a été reportée au cours de maladies inflammatoires intestinales aigues. Afin de lutter contre l’émergence de bactéries multirésistantes, il a été montré un très fort intérêt dans la modulation de cette flore par une approche de transplantation fécale du microbiote (en lieu et place de l’utilisation d’antibiotiques). L’enrichissement du microbiote en certaines espèces bactériennes est associé à une diminution des symptômes inflammatoires dans l’intestin. L’objectif du projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique (anti-inflammatoire) de probiotiques dans la souris dans le contexte d’une maladie inflammatoire aiguë.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont : - une meilleure compréhension du rôle du microbiote dans les maladies inflammatoires - l’identification d’espèces bactériennes utilisées comme probiotiques pour le contrôle des maladies inflammatoires. - la détermination de cocktail(s) de bactéries comme médicaments potentiels.
Procédures
Trois-quarts des animaux seront soumis à une irradiation (de quelques minutes) suivie d’une reconstitution en moëlle osseuse par voie (IV) intraveineuse rétro-orbitaire sous anesthésie générale. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste. Trois-quarts des animaux recevront une administration par voie orale (gavage). Ce geste est réalisé sur animaux vigiles avec une sonde de gavage de 24 gauge solide. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanée (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Tous les gestes IV, SC, gavage sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les animaux sont une réaction inflammatoire modérée du système digestif avec une modification de l’aspect et de la composition des selles. Le modèle d’irradiation avec reconstitution de moelle osseuse est un modèle expérimental modéré sans développement de pathologies. Du stress et une potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, peuvent être observés.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin d’étudier leurs organes.
Remplacement
Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Les multiples interactions entre types cellulaires différents et le microbiote nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité. Des études in vitro /bio-informatique ont été réalisées en amont de ce projet afin d’identifier un panel d’espèces bactériennes candidates pour la réalisation des cocktails de probiotiques.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=5) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste.
Choix des espèces
L’humanisation des souris avec un microbiote (flore intestinale) humain est un très bon modèle préclinique, donnant des résultats pouvant être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance. Les animaux utilisés au cours de ce projet auront entre 7 et 14 semaines de vie. A ce stade, le système immunitaire est mature.
Régulation de l’expression de PABPN1 dans le muscle squelettique de souris dystrophiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Pour comprendre comment une protéine impliquée dans la maturation des ARN messagers est régulée dans le muscle, 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Réparties en trois lots de 140, elles reçoivent une injection intramusculaire, une injection intraveineuse, ou deux injections suivies d'un transfert de gène localisé, chaque fois sous anesthésie. Le jour de la mise à mort, une mesure de contractilité musculaire de quinze minutes est pratiquée sous anesthésie, sans réveil, avant les prélèvements. Le porteur indique que les deux muscles tibialis antérieurs sont injectés chez chaque animal pour réduire l'effectif, et que toute souris montrant un signe de détérioration de sa santé est tuée immédiatement.
Objectifs
Une expansion anormale d’acides aminés dans une protéine impliquée dans la maturation des ARN messagers cause une maladie génétique musculaire appelée la dystrophie musculaire oculopharyngée (OPMD, prévalence de la pathologie 1/100 000 personnes en Europe). Le niveau de cette protéine est très bas dans le muscle mais très peu de choses sont connues concernant la régulation de cette protéine dans le muscle. Ce projet consiste à étudier sa régulation dans le muscle squelettique in vivo. Dans ce projet, nous modulerons plusieurs facteurs décrits comme régulateurs de cette protéine, afin d’étudier leurs effets sur l’expression de la protéine dans le muscle in vivo. Cette étude permettra de mieux comprendre sa régulation et d’envisager des approches thérapeutiques pour prévenir et limiter les conséquences de l'atteinte musculaire de l'OPMD.
Bénéfices attendus
L’étude de la régulation de l’expression d’une protéine mutée dans la dystrophie musculaire oculopharyngée (OPMD, prévalence de la pathologie 1/100 000 personnes en Europe) nous permettra de trouver des solutions pour restaurer un niveau fonctionnel suffisant de cette protéine dans les muscles atteints dans la maladie. Le bénéfice attendu est l’arrêt ou la diminution de la progression de la maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois interventions réalisées sous anesthésie. Le lot1 (140 animaux) sera soumis à une injection intramusculaire (sous anesthésie). Il s'agit d'une intervention de très courte durée (l'injection elle même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage d'origine. En fin de procédure, le jour de l'euthanasie, les souris sont soumises à une mesure in situ de la contractilité (acte sans réveil effectué sous anesthésie et sous analgésie) d’une durée de 15 minutes suivie de l'euthanasie e et des prélèvements. Le lot2 (140 animaux) sera soumis à une injection intraveineuse (sous anesthésie). Il s'agit également d'une intervention de très courte durée (l'injection elle même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage d'origine. En fin de procédure, le jour de l'euthanasie, les souris sont soumises à une mesure in situ de la contractilité (acte sans réveil effectuée sous anesthésie et sous analgésie) d’une durée de 15 minutes suivie de l'euthanasie et des prélèvements. Le lot3 (140 animaux) sera soumis à deux injections intramusculaires (sous anesthésie), suivi par un transfert de gène localisé dans le muscle (sous anesthésie et sous analgésie). Il s'agit également d'une intervention de très courte durée (l'injection elle même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes). Les souris sont ensuite replacées dans leur cage d'origine. En fin de procédure, le jour de l'euthanasie, les souris sont soumises à une mesure in situ de la contractilité (acte sans réveil effectuée sous anesthésie et sous analgésie) d’une durée de 15 minutes suivie de l'euthanasie et des prélèvements.
Impact sur les animaux
Dans notre projet, nous injectons des AAV (virus adéno-associés) en intramusculaire (dans le muscle tibialis anterior) et en systémique (dans la veine de la queue) et nous réalisons un transfert de gène localisé dans le muscle. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection, l'animal pourrait alors ressentir une douleur locale au niveau du site d'injection. Lors des anesthésies effectuées pour l'ensemble des gestes techniques, les risques/contraintes peuvent être les suivants: effets sur les variables physiologiques (température, tension, oxygénation) pendant l'anesthésie. Après la mesure de la contractilité du muscle squelettique réalisée sous anesthésie/analgésie (durée d'environ 15 minutes), les animaux sont euthanasiés avant la fin de l'anesthésie générale afin d'éviter tout effet indésirable ou douleur.
Devenir
Tous les animaux des procédures sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. L’analyse des muscles injectés et des autres organses (foie, etc) est indispensable pour ce projet. L'euthanasie de l’ensemble des animaux est donc requise
Remplacement
L'expression d’une protéine impliquée dans la maturation des ARN messagers dans le muscle squelettique est étroitement contrôlée. Les modèles de culture in vitro disponibles ne permettent pas de récapituler la complexité présente in vivo et ne permettent pas d’arriver à une maturation comparable à celle in vivo justifiant le choix d’utilisant la souris comme modèle
Réduction
Chaque groupe sera constitué de 10 animaux pour obtenir des résultats statistiques. Dans le respect de la règle des 3R, une première série d’ expériences sera réalisée sur 5 souris. Le nombre sera incrémenté exclusivement si besoin. En outre, afin de réduire le nombre de souris utilisées (dans le respect de la règle des 3R) pour chaque souris nous injecterons le muscle Tibialis Anterior de la patte gauche et de la patte droite. Au maximum un total de 420 souris seront utilisées dans ce projet. Des études préliminaires ont montré la faisabilité de cette approche (il n’y a pas d’interférence expérimentale entre l’injection de deux Tibialis Anterior). Afin de comparer les groupes de sujets, nous réaliserons une analyse statistique.
Raffinement
Pour le raffinement, les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons ou tunnel en carton ou carré de coton compacté. Suite à l’acte chirurgical, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience afin de déceler des signes de douleur. Pour les injections en intramusculaire et en systémique, les souris sont anesthésiées. Les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la perte de poids, des plaies au site d’injection, une croissance excessive des dents seront évalués régulièrement. Les animaux qui montrent un signe quelconque de détérioration de leur santé seront euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus commun utilisé dans des études de régénération musculaire et de compréhension des mécanismes physiopathologique du muscle squelettique. Nous utiliserons des souris d’âge adulte (8-40 semaines) : cela nous permettra d’analyser les changements de la régulation de notre protéine d’intérêt en modulant des protéines décrites dans la littérature comme ses régulatrices, dans un environnement contrôle adulte.
Analyse de l’effet de vésicules extracellulaires modifiées sur la croissance tumorale et les réponses immunes.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Des cellules tumorales leur sont injectées, puis la tumeur est mesurée au pied à coulisse une à deux fois par semaine. Jusqu'à 14 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent deux injections de traitement par semaine pendant neuf semaines, une injection de produit d'imagerie dix minutes avant chaque séance, et un prélèvement sanguin sous anesthésie toutes les deux semaines, l'objet du projet étant de tester des vésicules extracellulaires modifiées comme piste d'immunothérapie. Le porteur décrit pourtant des modèles qui "nécessitent un minimum d'intervention" et ne demandent "pas l'administration d'anti-douleurs", chez des souris porteuses de tumeurs pendant neuf semaines.
Objectifs
Le cancer est actuellement la deuxième cause principale de décès à l'échelle mondiale. L'immunothérapie a révolutionné le traitement de certains patients mais dans environ 70% des cas, cette approche s’avère inefficace. Pour améliorer les traitements, il est essentiel de comprendre comment le cancer communique avec notre système immunitaire. Une partie de cette communication se fait via de petites vésicules lipidiques appelées "vésicules extracellulaires", porteuses d’informations génétiques et protéiques, sécrétées par les cellules tumorales mais aussi les cellules du microenvironnement tumoral. Elles peuvent moduler la croissance des tumeurs, notamment en interagissant avec la surface des cellules immunitaires ou après capture par ces mêmes cellules. Il existe une grande variété de vésicules, certaines semblent aider le cancer à se développer en empêchant le système immunitaire de reconnaître le cancer, alors que d’autres semblent aider l’organisme et son système immunitaire à se débarrasser du cancer. Il est nécessaire de comprendre quelles vésicules renferment l’activité anti-tumorale et quelles vésicules contiennent l’activité pro-tumorale, afin de pouvoir créer de nouveaux traitements anti-cancéreux efficaces. De récentes études ont montré qu’on peut changer la composition des vésicules extracellulaires en modifiant les cellules qui les sécrètent. Nous avons identifié quelques molécules cibles ou produits pharmacologiques, qui changent les propriétés des vésicules extracellulaires in vitro, en particulier quand elles interagissent avec des cellules du système immunitaire. Nous devons donc évaluer l’effet in vivo de ces vésicules modifiées ou de leur sécrétion in situ sur la croissance des tumeurs et leur reconnaissance, voire leur destruction par le système immunitaire. L’objectif de ce projet est de caractériser un nouveau mode de communication entre les cellules cancéreuses et le système immunitaire pour identifier des vésicules extracellulaires capables de diminuer la croissance et la progression des tumeurs. Il pourrait ouvrir la voie au développement de futures thérapies anticancéreuses utilisant ces vésicules modifiées ou leur sécrétion locale.
Bénéfices attendus
Le cancer est la seconde cause de décès dans le monde, malgré les récentes innovations thérapeutiques. Les immunothérapies visant à reprogrammer le système immunitaire contre le cancer présentent une efficacité spectaculaire chez certains patients, mais très variable et le bénéfice n’est observé que sur un nombre limité de patients. Il est donc essentiel de développer de nouvelles approches ou combinaisons d’approches pour bénéficier à un plus grand nombre de patients. Les vésicules extracellulaires permettent une communication entre les cellules tumorales et le système immunitaire, et peuvent aussi interférer avec les traitements d’immunothérapies. Ce projet étudie l’utilisation de vésicules extracellulaires modifiées par les chercheurs, comme nouveaux outils de thérapie anti-tumorale, permettant d’augmenter l’activité du système immunitaire contre les cellules cancéreuses. Il découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de lignées cellulaires en culture. Avant d'envisager toute application clinique ou thérapeutique chez l'Homme, l’étude de ce processus dans un modèle de tumeur in situ chez la souris est une étape cruciale. Nous prévoyons d'atteindre ces objectifs dans les cinq prochaines années. Les résultats que nous recueillerons grâce à ce projet peuvent ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques utilisant la modification de la sécrétion des vésicules extracellulaires par les chercheurs, seule ou en combinaison avec d’autres traitements.
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées aux souris vigiles (1 fois par expérience – durée du geste inf à 10 sec). Les animaux seront suivis, à raison de 1 à 2 fois par semaine soit sur animaux vigiles pour mesurer la tumeur au pied à coulisse soit par imagerie sur animaux anesthésiés (durée de l’anesthésie 10 min). Dix minutes avant chaque séance d’imagerie, les animaux seront injectés avec un produit spécifique pour l’imagerie (durée du geste inf à 10sec) Certains animaux recevront également des traitements par injection à raison de 2 fois par semaine pendant 9 semaines maximum (durée du geste inf à 10 sec) ou à raison de 2 injections au cours de l’expérience (9 semaines max) (durée du geste inf à 10 sec) Un prélèvement sanguin est effectué une fois toutes les 2 semaines sur les animaux anesthésiés(durée de l’anesthésie inf à 5 min).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors des injections de cellules tumorales seront celles liées à injection elle-même (gêne de courte durée et de faible intensité due à l’introduction d’une aiguille). Suite à ces injections les animaux développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (gêne de courte durée). Ces types de traitement n’induisent pas d’effets secondaires négatifs connus. Pour le suivi des réponses immunitaires, des prélèvements sanguins pourront être effectués. Ces prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés pour réduire le stress lié à la contention et la douleur liée à la piqûre elle-même.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture, ayant permis la caractérisation des vésicules extracellulaires modifiées et de leur mode d’interaction avec les cellules cibles, tumorales et immunitaires. Le projet, ayant pour objectif final d’identifier des traitements ciblant les vésicules extracellulaires permettant l’activation des réponses immunes anti-tumorales, nécessite l’utilisation d’un modèle préservant la complexité de la composition du tissu tumoral, notamment de l’infiltration des cellules immunitaires, et de l’organisme entier. A notre connaissance, aucun modèle in vitro (co-culture, organoïde) ou in silico ne peut se substituer à un modèle animal. Le modèle murin est le plus adapté compte tenu de l’organisation de son système immunitaire, proche de celle de l’Homme.
Réduction
1. Nous utiliserons de façon générale 10 souris par groupe expérimental. Ce nombre prend en compte la variabilité intrinsèque à nos modèles, notamment le taux d’obtention de tumeur suite à l’injection de cellules tumorales. Il se base aussi sur nos connaissances de ces modèles tumoraux et de leur cinétique et variabilité de développement. Les lignées tumorales modifiées pour sécréter des vésicules extracellulaires différentes, et l’absence de conséquence directe sur la multiplication des cellules ont toutes été validées in vitro. 2. le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe sera défini à l’aide d’outils statistiques. 3. Pour chaque procédure et chaque molécule, 2 expériences montrant une absence d’effet sur la croissance tumorale seront utilisées comme point d’arrêt de l’expérience, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. 4. Si les 2 premières modifications testées s’avèrent avoir l’effet recherché, nous ne continuerons pas avec les autres molécules. Le nombre total d’animaux utilisés sera réduit de 14160 (nombre maximum) pour 5 molécules testées à 7446 pour 2 molécules.
Raffinement
Les modèles développés pour ce projet nécessitent un minimum d’intervention sur les souris, réduisant le stress et la douleur potentielle, et ne nécessitent pas l’administration d’anti-douleurs. Les animaux greffés seront contrôlés deux à trois fois par semaine afin de vérifier que le développement de la tumeur n’ait pas d’effet notable sur le bien-être général, ni sur leur poids (en prenant en compte le poids additionnel de la tumeur). Une grille de score sera utilisée pour évaluer leur état de manière objective. Si un état général compromis est observé, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Comparé à d’autre modèles animaux, la souris est le modèle de choix pour les recherches en immunologie et cancérologie pour sa proximité avec l’homme, et nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris. Les modèles de tumeurs transplantées sont de plus couramment utilisés chez cette espèce Les souris seront utilisées à l'âge adulte (8 à 16 semaines) afin qu’elles aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, l'âge adulte permet d'étudier un système immunitaire mature.
Identification et caractérisation de molécules ciblant les récepteurs d’aryl hydrocarbone (AHR) chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 200
2 440 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré pour les souris et menées sans réveil pour les rats. Les souris reçoivent des injections dans la veine du pénis ou de la queue, jusqu'à cinq anesthésies gazeuses et cinq séances d'imagerie de deux heures réparties sur cinq semaines. Les rats subissent une chirurgie de trente minutes pour la pose de cathéters dans la veine et l'artère fémorales, puis deux heures d'imagerie ponctuées de six prélèvements sanguins, sans jamais se réveiller. Le porteur écrit qu'après la sélection in vitro de dix molécules, il est "nécessaire" de les tester sur "l'animal vivant (organisme entier)", ni la barrière hémato-encéphalique ni la fonction d'entrée artérielle ne pouvant selon lui être modélisées autrement.
Objectifs
Récemment, l’étude de cette protéine s’est intensifiée car un dysfonctionnement de l’activité et de l’expression de cette protéine a été retrouvé en cancérologie (glioblastome, cancer du côlon, etc…) et dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Dans ces pathologies, cette protéine est fréquemment sur-exprimé et/ou sur-activé, ce qui fait de cette protéine une cible d’intérêt pour le développement de nouveaux radiotraceurs à visée thérapeutique et/ou diagnostique. In vitro, des tests d’activation et d’inhibition de cette protéine ont permis de sélectionner 10 molécules candidates. Ces molécules ont toutes la spécificité de pouvoir être marquées au fluor 18. Les résultats obtenus sont très encourageants. Il est maintenant nécessaire de les tester sur l’animal vivant (organisme entier) pour valider leur potentielle utilisation à visée diagnostique et/ou thérapeutique. La validation de l’utilisation d’une molécule candidate consiste à démontrer que cette molécule sera un outil performant permettant de quantifier l’expression de cette protéine .
Bénéfices attendus
Différentes études ont montré que cette protéine joue un rôle fondamental dans le développement et le fonctionnement de notre organisme. Plusieurs études ont montré que des dysfonctionnements liés à cette protéine étaient impliqués dans des maladies auto-immunes (polyarthrite rhumatoïde, lupus érythémateux), dans des maladies inflammatoires du tube digestif (maladie de Crohn, rectocolite hémorragique…), les pneumopathies obstructives chroniques, ou encore différents types de cancers . Disposer d’un radiotraceur permettant de quantifier cette proteine in vivo serait un atout important pour les patients atteints de ces maladies afin d’aider à l’amélioration de leur prise en charge. De même, de nombreuses équipes de recherche sont en cours de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant cette protéine dans ces maladies. Dans ce contexte, disposer d’un traceur radioactif spécifique de cette protéine permettra de mieux caractériser les mécanismes d’action de ces médicaments et de définir les doses nécessaires à leurs potentiels effets thérapeutiques.
Procédures
Pour une expérimentation concernant l'injection d'un produit qui durera au total 125min: elle sera réalisée une seule fois sous anesthésie générale (induction, maintien lors de l'injection) pendant 5 min sur des souris, injection dans la veine du pénis ou veine caudale 1 fois pendant 30 secondes. Pour une autre procédure concernant l'injection de 2 produits , d'une durée totale d'environ 150min , les souris auront 2 anesthésies gazeuses pendant 5 min lors de injection en intra-veineux (IV) (induction, maintien lors de l'injection) et injection en intraveineux 2 fois pendant 30 secondes à 20min d'intervalle. Pour l'expérimentation de l'imagerie: les souris auront 5 anesthésies gazeuses durant 130min à la fréquence d'une fois par semaine sur une durée totale de 5 semaines (induction, maintien pendant imagerie de l'animal) , 5 fois une pose de cathéter en intra-veineux, d'environ 10 min et ou 5 fois une injection intrapérionéale pendant 10 secondes et 5 imageries pendant 120min d'une fréquence 1 fois/semaine pendant 5 semaines. Pour la procédure des rats, cette expérimentation durera environ 2h30, elle sera réalisée une seule fois sur l'animal sous anesthésie générale. les animaux seront soumis à une chirugies d'environ 30 minutes pour la mise en place des cathéters à la veine et l'atrère fémoral. les rats seront ensuites imagés pendant 120 min. au cours de l'imagerie , des prélèvements sanguins seront réalisés pendant l'imagerie à 1min, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min et 120 min).
Impact sur les animaux
La manipulation avant l'anesthésie entraine un léger stress chez l'animal. La contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Une douleur au point d’injection du radiotraceur ou de l’antagoniste peut-être ressentie jusqu’à la mise à la mort. Un hématome associé à une douleur au niveau de la queue à la pose ou au retrait du cathéter peut apparaitre. Une injection intrapéritonéale peut provoquer de la douleur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour des études ex-vivo
Remplacement
Cette étude in-vivo fait suite à de nombreuses étapes de mise au point et de caractérisation in vitro. La caractérisation in vivo et la validation d’un radiotraceur ne peuvent s’effectuer sans l’utilisation de modèles animaux. En effet, la fixation d’un radiotraceur dans les différents organes d’intérêt, ainsi que le passage de la barrière hémato-encéphalique ne peuvent être modélisés in vitro/in silico. De plus, la fonction d’entrée artérielle ne peut-être substituée par une modélisation mathématique car l’objectif final est d’obtenir la vérité terrain de la distribution systémique et la fixation du radiotraceur au sein de l’organisme entier vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux détaillé dans ce document est maximal est sera revu à la baisse en fonction de la quantité de molécules qui passeront l’étape de biodistribution froide, donc ayant montré une fixation spécifique. Ce projet sur 5 ans pour 10 molécules nécessite l’utilisation de 2 espèces : - 2160 souris sauvages (non transgéniques) et 280 souris transgéniques pour la protéine concernée - 200 rats Wistar. Des tests statistiques seront réalisés à la suite de ces études.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les animaux seront observés une à deux fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en œuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit lors de ce projet. Pendant le protocole, si nous constatons des bagarres dans les cages, nous procéderons à une séparation des individus. En cas de blessures, nous appliquerons un nettoyant et un désinfectant sur la plaie jusqu’à la cicatrisation complète. La posture de l’animal et sa réactivité à des stimuli externes seront monitorés chaque jour. Pendant les expérimentations, l’induction d’anesthésie gazeuse sera réalisée à 3% et les animaux seront maintenus à 2%, une protection oculaire sera appliquée. Si au cours du projet, les animaux présentent des signes de souffrance (poils hérissé, prostration…) la décision de la mise à mort sera prise par une personne habilitée à ce geste. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Une grille de score sera utilisée pour évaluer les expressions faciales une fois par semaine, le lendemain des expérimentation d'imagerie. Lors du protocole de la chirurgie, l’induction d’anesthésie sera réalisée en gazeux à 4% et les animaux seront maintenus à 3%, une analgésie sera injectée durant tout la chirurgie et un anesthésique local sera appliqué au niveau du site d'incision. Une protection oculaire sera également appliquée. Durant cette manipulation, l'animal sera maintenu sur un tapis chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés.
Choix des espèces
Le seul moyen de s’assurer de la spécificité d’un radiotraceur envers sa cible est d’utiliser des animaux qui n’expriment pas cette cible, soit des animaux transgéniques (souris) pour le gène désiré. En revanche pour la fonction d’entrée artérielle, dont le but est de caractériser la pharmacocinétique du radiotraceur, le rat sera utilisé car cette procédure n’est pas à l’heure actuelle réalisable chez la souris. Nous utiliserons des souris adultes afin d'avoir une taille de cerveau compatible avec la technique d'imagerie utilisée dans ce protocole et des rats adultes qui ont la taille adaptée pour la réalisation de la chirurgie.
Etude de l’efficacité de nouvelles molécules pour traiter ou prévenir l’inflammation intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Une colite est induite par voie orale au DSS chez 1 200 souris, dont 900 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 300 d'un niveau modéré. Le porteur annonce dès l'induction une perte de poids, de la diarrhée, des pertes de sang et des douleurs intestinales. Le détail des procédures ne porte pourtant que sur les prélèvements sanguins, jusqu'à 0,2 mL par semaine à la veine caudale ou jugulaire, sans revenir sur l'induction elle-même. Toutes les souris sont tuées à la fin de chaque procédure, pour prélever des tissus et mesurer la motilité intestinale post mortem.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), touchent chaque année des milliers de personnes en France, avec des phases inflammatoires suivies de rémissions. Les symptômes incluent diarrhée, fièvre, douleurs abdominales, fatigue et perte d’appétit, rendant leur traitement complexe. L'objectif thérapeutique et préventif évolue vers la recherche d'une "rémission physiologique". Malgré les avancées des thérapies biologiques, leur coût élevé et leur efficacité parfois limitée nécessitent le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les effets pléiotropiques des molécules et les enjeux thérapeutiques sous-jacents rendent indispensables l’utilisation de modèles in vivo. Le modèle d’inflammation intestinale est indispensable pour étudier les effets d’une molécule sur un organisme entier et pour accélérer le passage en clinique chez l’homme. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou préventives pour les MICI chez la souris. Dans ce modèle préclinique, l'inflammation est induite oralement par le DSS chez la souris. En ce qui concerne le choix d’un modèle aigu ou chronique, il dépendra d’une part du mécanisme d’action de la molécule à tester et d’autre part de la cible thérapeutique. De la même façon, la fréquence, la voie et le volume des administrations seront variables puisque dépendants des molécules. Celles-ci seront effectuées en total respect de la directive européenne 2010/63/UE.
Bénéfices attendus
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) touchent chaque année des milliers de personnes en France, avec des phases inflammatoires suivies de rémissions. Les symptômes incluent diarrhée, fièvre, douleurs abdominales, fatigue et perte d’appétit, rendant leur traitement complexe. Malgré les avancées des thérapies, leur coût élevé et leur efficacité parfois limitée nécessitent le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives. La validation de molécules anti-inflammatoires dans des modèles de MICI murins serait un premier pas vers des tests chez l'humain et la possible commercialisation de molécules pouvant soulager ces millers de personnes en France atteintes de MICI.
Procédures
Selon la molécule à tester, un prélèvement sanguin pourra être réalisé au cours ou à la fin de la procédure expérimentale. La fréquence et le volume dépendront de l'étude. Cependant, les prélèvements seront effectués en total respect de la réglementation internationale et européenne. A savoir, pour une souris de 25 g, un volume inférieur à 0.2 mL (10% du volume sanguin circulant) sera prélevé 1 fois par semaine ou bien un volume inférieur à 0.3 mL (15% du volume sanguin circulant) sera prélevé 1 fois toutes les 3-4 semaines. Le site de prélèvement sera soit la veine caudale soit la veine jugulaire (sous anesthésie gazeuse : 3% pour induction-1.5% pour maintien). Un prélèvement tissulaire post-mortem, à la fin de l’expérience, sera réalisé.
Impact sur les animaux
Dès l’induction de la pathologie, les animaux pourront avoir une perte de poids, de la diarrhée, perte de sang, douleur intestinales.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanaisés à la fin de chaque procédure afin de réalisé des prélèvements tissulaires et l'étude de la motilité intestinale post-mortem.
Remplacement
Le modèle murin de colite induite au DSS est très proche de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques pour les douleurs viscérales. De plus, la douleur et l'inflammation sont des réactions intégrées de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans leur intégralité.
Réduction
Une veille bibliographique est/sera effectuée pour éviter de refaire des expérimentations déjà réalisées par d'autres équipes. De plus, le nombre d'animaux a été consciencieusement établit avec le minimum nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement signfiicatifs (en prenant en compte la variabilité interindividuelle). Tout au long des différentes procédures les animaux seront observés et pesés. La présence de sang dans les selles et le comportement/aspect général de l'animal seront également analysés. Cette méthode non-invasive permettra donc de suivre au cours du temps, sur un même animal, l'évolution de la pathologie. Ce projet permettra de réaliser 30 études sur 5 ans.
Raffinement
De la ouate et des igloos seront ajoutés, permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour. Pour chaque procédure des points limites ont été défini pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent de la formation et de l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maitrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences des personnes concernées.
Choix des espèces
Les méthodes alternatives, permettant une évaluation de l’inflammation au niveau du colon sont peu représentatives de la pathologie humaine. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques et préventive pour les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. De plus, l'inflammation est une réaction intégrée de l'organisme entier impossible à reproduire in vitro dans son intégralité. Le modèle murin a été choisit de part la prédominance de cette espèce dans les publications concernant les MICI et la validité des modèles utilisés dans cette étude. Nous utiliserons des souris âgées d’au moins 8 semaines car nous souhaitons utiliser des animaux adultes et matures. De plus, c'est l'âge utilisé classiquement dans la litterature pour ces modèles.
Effet des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma sur le développement à long terme de pathologies cardiovasculaire (coeur/poumon) et troubles du rythme associé chez la souris âgée 3/3
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Irradiées au rayonnement gamma sur le corps entier à l'âge de 15 mois, transportées entre trois établissements, 375 souris subissent des échographies mensuelles sous anesthésie, des courses sur tapis, des mesures de pression à la queue en tube de contention, une stimulation transœsophagienne et une ouverture du thorax sans réveil. Les procédures vont d'un niveau de souffrance modéré à sévère, et toutes les souris sont tuées pour prélever cœur et poumons. Le projet vise à alimenter les normes de radioprotection en simulant l'exposition de personnes âgées vivant en territoire contaminé après un accident nucléaire. Le porteur écrit que l'irradiation "n'entraine ni douleur ni brulure" et que l'hypertension induite "sera indolore", dans le même texte où il signale un risque d'hémorragie lors de la chirurgie thoracique et un arrêt cardiaque possible sous anesthésie.
Objectifs
La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons effectuer une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé. Actuellement, des résultats préliminaires ont mis en évidence un effet des doses faibles à modérées (inférieur ou égal à 500mGy) sur le développement d’arythmies atypiques à long terme et également l’observation d’un remodelage des vaisseaux pulmonaires. Il parait alors intéressant de vérifier le rôle du système nerveux sympathique et de l’hypertension artérielle pulmonaire sur la physiologie et le maintien de la fonction cardiaque. L’impact de l’âge au moment de l’irradiation sera évalué à partir de la dose 100mGy pour laquelle il y a le début de développement de maladies cardiovasculaires et également des troubles du rythme dans le contexte de l’exposition faible. L’objectif de ce projet sera d’évaluer la potentialisation ou non de l’âge sur un modèle expérimental d’exposition externe unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur le coeur et les vaisseaux du poumon seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique. Ce projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances d’un point de vue mécanistique sur l’impact de l’âge au moment de l’exposition et les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur le système vasculaire (pulmonaire et cardiaque), le système nerveux sympathique cardiaque et sur le développement de troubles du rythme radio-induite afin d’améliorer et d’actualiser les connaissances et participer à la détermination des normes en radioprotection pour des institutions du domaine de la radioprotection.
Procédures
Tous les animaux seront transportés pendant 5 min de l’EU1 à l’EU2. Certains animaux seront exposés aux rayonnements gamma (EU2) pendant 3 min à 1h. L’irradiation aux doses utilisées dans le projet n’entraine ni douleur ni brulure que ce soit pendant l’irradiation ou après. Seules des modulations d’expression des protéines et une légère diminution de la fonction cardiaque ont été observées à long terme, sans conséquence clinique pour les animaux. Tous les animaux seront transportés pendant 5 min de l’EU2 à l’EU1. Certains animaux subiront des échographies (20 min) effectuées sous anesthésie (EU1) avant, 5 jours après irradiation puis tous les mois jusqu’au transport vers l’EU3. Certains animaux seront soumis à deux expériences de course sur tapis (EU1) pendant 10 min suivies d’une échographie d’environ 6 min qui seront réalisées à une semaine d’intervalle par rapport à l’échographie cardiaque. Les animaux auront donc 2 fois 2 anesthésies à une semaine d’intervalle. Pour ces animaux, la pression artérielle sera aussi mesurée à la queue (EU1) sur animaux vigiles (procédure indolore de 10 min) après accoutumance à la contention pendant 5 jours ce qui permet de limiter autant que possible le stress de la manipulation. Les animaux seront placés 10 minutes, 1 fois par jour pendant 5 jours dans un tube à contention. Cette mesure sera prise 5 fois : 1 fois par mois à une semaine d’intervalle avec les échocardiographies. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Ces souris seront ensuite transportées (30 min) vers l’EU3 et une semaine d’acclimatation sera réalisée. Ils seront anesthésiés et analgésiés à 4 jours d’intervalle une fois pour des stimulations transoesophagiennes de 5 min (EU3) et une fois pour la prise de pression artérielle pulmonaire, procédure chirurgicale sans réveil (EU3). Tous les animaux subiront un prélèvement de sang effectué sous anesthésie/analgésie avant l’euthanasie par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Néanmoins un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de la mise en boite d’irradiation (375 animaux) et lors des mesures de de pression artérielle (125 animaux) même s’il y a habituation au tube à contention. Les procédures avec aiguille (375 animaux) peuvent potentiellement conduire à une douleur, à une peur et à des infections. Le transport animaux (375 animaux) entre les sites peut engendrer une peur temporaire et un stress thermique de courte durée. Les animaux subiront certains actes chirurgicaux qui pourront entrainer de la douleur palliée par une administration préalable d’analgésique. Lors de la procédure chirurgicale sans réveil, il peut y avoir une hémorragie. Ces actes chirurgicaux sont réalisés sous anesthésie et seront suivis de l’euthanasie de l’animal, sans qu’il ne reprenne conscience. L’anesthésie peut aussi entrainer un arrêt cardiaque.
Devenir
A la fin de la procédure toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (coeur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.
Remplacement
Pour mimer l’exposition corps entier de résidents âgés vivants en zone contaminée après un accident nucléaire par exemple celui de Tchernobyl, il est nécessaire d’avoir recours à une exposition externe à des doses faibles de rayonnements ionisants gamma (imitant les rayonnements ionisants du CS137) sur un modèle intégré (cardiomyocytes et fibres nerveuses). De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique comme la régulation de la pression artérielle ne peuvent être évalués qu'in vivo, tout comme l’évaluation de la fonction cardiaque, c'est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins. Néanmoins pour une partie du projet, dès que possible, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture. Néanmoins, il est très difficile d’obtenir des cellules de provenant de souris âgées et de maintenir ces cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.
Réduction
Au total, 375 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 25 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. De plus on considère une mortalité possible due à la longévité des souris âgées pour nos groupes qui seront gardés pendant 3 mois post-irradiation, on constituera des groupes de 25 animaux pour obtenir un nombre d’animaux suffisant pour nos analyses statistiques. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Les animaux sont pesés en début de procédure et avant la chirurgie. Un analgésique est administré en sous cutané pour atténuer la douleur de l’ouverture du thorax. Lors des différents protocoles, un arrêt cardiaque durant l’anesthésie sera traité par massage cardiaque. La profondeur de l'anesthésie sera vérifiée en testant l'absence de réflexe de retrait de la patte (après pincement). Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application d’antiseptique, crème antibiotique ou par administration d’antibiotique. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum. La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi avec des lanières de papier, morceau de bois et maison en carton. En cas de bagarres, les animaux pourront être isolés. Les souris seront suivies de façon hebdomadaire. Elles seront pesées régulièrement une fois par mois. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée par les zootechniciens et hebdomadaire par le porteur de projet. Le transport des animaux (entre EU1 et EU3) se fera dans un véhicule climatisé et les animaux seront placés dans des boites de transport avec litière et gel hydrique. La durée de transport srea de 30 min. Si avant ou après le transport un animal montre des signes de souffrance (locomotion, isolement, apparence) lié, il sera euthanasié. Les EU1 et EU2 étant dans le même bâtiment, le transport se fera dans des boites de transport avec litière.
Choix des espèces
Ce projet vise à déterminer l’impact de l’âge sur le développement de pathologies cardiovasculaires (hypertension artérielles pulmonaire, cardiomyopathies) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes âgées en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 15 mois au moment de l’irradiation car ça correspond au début de la vieillesse chez la souris. Des souris C57BL/6 males âgés seront utilisées pour ce projet afin de pouvoir comparer avec les études déjà effectuées sur des souris mâles jeunes. Il est prévu par la suite d'évaluer les effets de l'irradiation faible dose sur des souris femelles jeunes et âgées.
Evaluation in vivo de l’impact d’une bithérapie anticancéreuse innovante sur le système immunitaire et recherche d’applications en immunologie clinique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous la peau une pompe implantée en dix minutes de chirurgie, puis des injections dans le ventre ou sous la peau, avec une douleur pouvant durer quarante-huit heures après l'opération. L'effectif se déduit d'un montage, cinq groupes, six moments de mise à mort, cinq souris par point d'analyse, plus 10 % pour les décès imprévus. Les souris sont tuées à chacun de ces moments parce que les analyses réclament un volume de sang qu'on ne peut pas prélever sur un animal vivant, le porteur présentant cette mise à mort comme un moyen de limiter le nombre total de souris.
Objectifs
Objectif principal : Evaluation de la tolérance d’un traitement anticancéreux sur le système immunitaire chez des animaux. Objectifs secondaires : Evaluation de l’efficacité d’un traitement innovant pour inhiber l’activation de certaines cellules du système immunitaire en vue d’une application dans des situations où ces cellules sont sur-activées (maladies auto-immunes et auto-inflammatoires), évaluation des mécanismes permettant cet effet.
Bénéfices attendus
Ce projet présente 2 bénéfices attendus principaux. Le premier est la poursuite du développement d’un traitement qui pourrait être utilisé chez l’Homme pour le traitement de cancers. La preuve d’efficacité sur des souris a été réalisée en amont, mais l’évaluation de l’effet du traitement sur les défenses immunitaires est indispensable (rôle important de celui-ci dans le cancer) et n’a pas pu être réalisée précedemment (absence de système immunitaire chez les souris étudiées précedemment). Le deuxième objectif est le développement potentiel d’un traitement luttant contre les maladies du système immunitaire, par exemple les maladies auto-immunes.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d’interventions : - Mise en place d’une pompe sous cutanée : Le geste sera réalisé sous anesthésie générale et sous traitement contre la douleur, et dure environ 10 minutes par souris. Ce geste sera réalisé sur l’ensemble des animaux (220 animaux), à une seule reprise. Cette pompe sous-cutanée est nécessaire à l’administration continue d’un des traitements à l’étude. - Injections intrapéritonéales et sous-cutanées : Une injection d’un faible volume par seringue sera réalisée au niveau du ventre des souris (injection intrapéritonéale) ou sous leur peau (injection sous-cutanée) afin de leur administrer un autre traitement. Il s'agit d'une procédure vigile durant moins d'une minute par souris. Cette intervention sera appliquée à 220 animaux. - Les souris seront euthanasiées à la fin de l’experimentation (durant 0 à 21 jours), sous anesthésie générale. Cela est nécessaire pour permettre un recueil de sang suffisant pour les analyses qui répondront aux objectifs de l’étude. Immédiatement après la mise à mort, les souris seront autopsiées et leurs organes conservés.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient subir les nuisances et effets indésirables suivants : - Douleur légère à modérée pouvant durer 48h suivant la chirurgie de pose de la pompe sous-cutanée. Chirurgie réalisée sous anesthésie générale puis administration systématique d’antalgiques suivant la chirurgie. - Douleur légère de quelques secondes lors des administrations médicamenteuses par injections sous-cutanées ou intrapéritonéales. - Des effets indésirables des traitements étudiés sont possibles, mais une étude préliminaire a permis de s’assurer de l’absence d’effet indésirable dans les 24 premières heures de traitement, et un ajustement de dose est prévu si un effet indésirable est constaté à forte dose. - Stress léger lors des manipulations quotidiennes (pesées et contentions). - Aucun inconfort n’est prévu au moment de la mise à mort, celle-ci étant réalisée sous anesthésie générale.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement d’un volume de sang suffisant pour la réalisation des analyses. Cela permet de limiter le nombre de souris nécessaires en optimisant le volume prélevé à chaque souris lors de la mise à mort. Par ailleurs, un prélèvement sanguin si important ne serait pas possible du vivant de la souris. Le stress de l’animal est réduit au minimum par le biais d’une anesthésie générale profonde.
Remplacement
Une étude chez l’animal est nécessaire pour plusieurs raisons : - Aucun modèle experimental en laboratoire ne reproduit avec fiabilité la complexité du système immunitaire, qui est très complexe et interagit avec de nombreux facteurs. L’animal est pour l’instant irremplaçable dans ce champ de la recherche. - La tolérance de l’association thérapeutique à l’épreuve sur le système immunitaire n’est pas connue, et l’objectif final est un transfert à l’Homme de cette bithérapie.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre minimal d’animaux pour ce projet en tenant compte de plusieurs exigences : - Le traitement étudié comporte deux composantes, qui doivent être associées pour que le traitement fonctionne, avec une notion de synergie. L’évaluation scientifique d’un traitement synergique nécessite d’évaluer individuellement les deux composantes en plus de les étudier associées, afin de démontrer l’effet synergique entre les deux. - Nous avons choisi d’administrer un agent connu et utilisé couramment, comme contrôle positif en ce qui concerne l’action du traitement à l’étude sur un phénomène biologique appelé la « methylation de l’ADN». Cela impose un groupe supplémentaire. - Plusieurs points de suivi sont nécessaires afin d’évaluer une efficacité et une toxicité temps dépendantes. Chacun de ces points de suivi impose une mise à mort de l’animal, car les analyses permettant de répondre aux objectifs principal et secondaires nécessitent un volume de sang supérieur à ce qu’il serait possible de prélever de manière répétée sans compromettre le bien-être de l’animal. Chacun de ces points nécessite un minimum de 5 souris pour réaliser les calculs nécessaires. Enfin, il est également important d’observer les effets d’un traitement lorsque le système immunitaire est activé. Ainsi 15 souris par groupes recevront une injection contenant un composé connu pour activer celui-ci. Au total, en considérant les 5 groupes à l’étude, les 6 points de mise à mort (dont 1 commun à l’ensemble des groupes), avec 5 souris par point statistique, et en considérant un risque de décès non lié aux traitements de 10% des animaux, un total de 225 souris sont nécessaires à l’étude.
Raffinement
Toutes les mesures seront prises pour limiter les nuisances attendues ou non liées aux manipulations des animaux et aux procédures. Le bien-être animal fera l’objet d’une évaluation bi-quotidienne tous les jours week end compris. Pour limiter le stress, une période d’acclimatation standardisée de 7 jours sera respectée avant la première procédure sur l’animal. Pendant cette période, les animaux seront habitués au contact humain et aux manipulations par le biais de jeux. Les manipulations auront lieu dans un environnement calme et par un manipulateur qualifié pour l’experimentation l’animale, pour le confort de l’animal et pour limiter la durée des manipulations. En cas de douleur ou d’inconfort modéré, un antidouleur simple sera administré. Si la douleur persistait ou semble plus que modérée, un antidouleur plus puissant sera administré. En cas de signe indiquant une douleur sévère définissant un point limite, la souris sera mise à mort pour éviter toute prolongation inutile de sa souffrance.
Choix des espèces
Les souris utilisées (souche C57Bl6) constituent un modèle animal très bien connu, fréquemment utilisé pour les études portant sur de nouveaux médicaments. Les souris seront accueillies au laboratoire à un âge compris entre 6 et 10 semaine.
Transmission virale inter-espèces chez des animaux vertébrés dans un contexte insulaire
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 20
Autres rongeurs : 60
Autres mammifères : 100
Autres oiseaux : 200
Reptiles : 100
Autres amphibiens : 100
Chauves-souris endémiques de La Réunion, oiseaux, rats, tangues, geckos et amphibiens, le projet cible toute la communauté de vertébrés d'un même site. 600 animaux sauvages vont être capturés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, soit 200 oiseaux, 100 chauves-souris, 100 petits mammifères terrestres, 100 reptiles et 100 amphibiens. Chacun subit en cinq à dix minutes un écouvillon de fèces, un prélèvement d'urine, un écouvillon buccal, une prise de sang et un retrait de parasites, sans anesthésie pour les oiseaux, que le porteur juge plus risquée que les gestes eux-mêmes. La capture peut provoquer hyperthermie, déshydratation, essoufflement et cyanose des muqueuses, et si la plupart des animaux repartent, les individus des espèces visées par un arrêté préfectoral de destruction, rats noirs, rats bruns, souris grises, tangues, musaraignes, agames et geckos verts non indigènes, ne sont pas relâchés.
Objectifs
L’émergence des zoonoses (maladie causée par un agent infectieux pouvant se transmettre entre l’homme et d’autre animaux vertébrés) est liée à un ensemble de facteurs environnementaux, populationnels et intrinsèques aux agents infectieux. L’étude de ces facteurs permet d’évaluer le niveau de menace associé aux agents infectieux, mais également leur risque d’émergence, en particulier dans les populations humaines. Les zoonoses impliquant, par définition, des échanges d’agents infectieux entre des espèces animales vertébrées et l’homme, l’estimation du potentiel de sauts d’espèces de ces agents infectieux est une étape incontournable à l’évaluation du risque. Le franchissement de la barrière d’espèce est cependant conditionné par les contacts, directs ou indirects, entre espèces de vertébrés, mais aussi par les propriétés moléculaires des agents infectieux et leur capacité à se multiplier et se transmettre dans de nouvelles espèces. A La Réunion, quatre familles virales ont été décrites chez le Petit Molosse (Mormopterus francoismoutoui) : les Coronaviridae, les Paramyxoviridae, les Astroviridae et les Rhabdoviridae. Les analyses phylogénétiques réalisées sur ces virus semblent indiquer la possibilité d’échanges entre chauves-souris, rongeurs, et potentiellement oiseaux, en particulier pour les Paramyxoviridae et les Astroviridae. Le sens de ces échanges de virus (chauves-souris vers autres groupes taxonomiques, ou inversement), de même que la fréquence, le mode de transmission (par contact ou transmission environnementale) ou encore la capacité de ces virus à induire une excrétion virale assurant une transmission pérenne chez une nouvelle espèce, sont des aspects pour lesquels nous n’avons pas d’élément de réponse. L’objectif de ce projet est d’estimer le potentiel de changement d’hôtes des virus associés au Petit Molosse. Nous nous focaliserons sur les Coronaviridae, les Paramyxoviridae et les Astroviridae, pour lesquels la présence d’ARN viral a été mise en évidence à de nombreuses reprises. Les Rhabdoviridae ne seront pas inclus dans cette étude, étant donné qu’ils ont été mis en évidence uniquement sur la base d’analyses sérologiques (6), que leur détection sur des chauves-souris vivante est extrêmement rare, et du fait de leur potentiel limité à s’implanter durablement chez de nouveaux hôtes
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mettre en évidence des échanges des virus entre les chauves-souris et les autres espèces de vertébrés partageant le même habitat, et de déterminer le sens de ces échanges. La prise en compte du statut des espèces à La Réunion, indigènes ou introduites, permettra de confirmer la transmission de virus depuis des espèces synanthropiques (e.g. rats, pigeons) vers le Petit Molosse, seule espèce de mammifère endémique sur l’île. Nous apporterons également des réponses sur le mode de transmission inter-espèces, par l’analyse d’échantillons environnementaux (e.g. guano, terre, eau). Pour les Coronaviridae et les Paramyxoviridae, la faible diversité génétique permettra l’application de systèmes de détection spécifiques, de quantifier la charge virale et de confirmer le statut de réservoir de ces espèces. L’analyse de la diversité génétique des Astroviridae confirmera l’hypothèse d’une circulation « écosystémique » de ces virus. L’ensemble de ces résultats affinera notre évaluation du risque zoonotique associé à ces « virus réunionnais ».
Procédures
Pour chaque animal, les prélèvements suivant seront réalisés : (i) un prélèvement de fèces par écouvillon ou collecte dans le sac de contention, (ii) un prélèvement d’urine pour les mammifères, (iii) un prélèvement de salive (écouvillon oropharyngé ou buccal), (iv) une prise de sang (excepté pour les amphibiens), et (v) des parasites hématophages (pour les oiseaux et mammifères). L'ensemble de ces prélèvements durera environ 5 minutes pour chaque animal. L’anesthésie des oiseaux étudiés dans le projet représente en soit une procédure de classe supérieur à celle qui sera réalisée ici. Afin de limiter le stress des oiseaux nous n'anesthésierons donc pas les animaux dans le cadre de ce projet.
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées sur animaux sont toutes légères et courtes, mais le cumul de gestes est à prendre en compte car la durée de capture sera en conséquence plus longue. Nous estimons la durée de marquage et de prélèvements biologique (écouvillons et prise de sang) de 5 à 10 minutes par animal (quel que soit le groupe taxonomique). Toutes les espèces concernées étant des espèces sauvages non captives, l’ensemble des procédures induira un stress sur les animaux. Les nuisances attendues seraient des effets aiguës liés à la manipulation, mais nous n’attendons aucun effet sur le long terme, étant donné le caractère non invasif des procédures réalisées. Même si des mesures de raffinement et des points limites adaptés seront mis en place, nous pouvons observer des effets indésirables en relation avec le stress aiguë lié à la captivité : hyperthermie, déshydratation, essoufflement, cyanose (coloration anormale bleutée de la peau qui indique un manque d’oxygène dans le sang) des muqueuses, fatigue. La procédure de prélèvement sanguin serait la plus invasive. Nous pourrions observer exceptionnellement des hématomes sur les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront replacés, excepté les individus d’espèces soumises à un arrêté préfectoral de destruction ne seront pas relâchés dans l'environnement (Rat noir, rat brun, Souris grise, Tangue, Musaraigne, Agame des roches et geckos verts diurnes non indigènes).
Remplacement
Le projet porte spécifiquement sur la diversité et la transmission des agents infectieux chez des animaux sauvages, dans leur environnement naturel. Les espèces ciblées ne peuvent donc pas être remplacées.
Réduction
Le nombre maximal d'animaux utilisés sera de 100 à 200 par groupe taxonomique, ce qui permettra d'avoir un seuil de détection viral acceptable d'un point de vue statistique. Cette approche est en accord avec les stratégies d'expérimentation que nous avons utilisé dans le passé qui ont permis d'obtenir à la fois des résultats valides d'un point de vue statistique sans pour autant affecter la douleur, la souffrance et l'angoisse infligées aux animaux.
Raffinement
Pour les oiseaux, nous réaliserons les captures principalement à l’aube, pour une durée maximale de 5 heures. Nous éviterons de manipuler des oiseaux par temps de pluie, pour ne pas altérer l’étanchéité des plumes. La pose d'une bague permettra également d'identifier individuellement les oiseaux et de les relâcher immédiatement en cas de recapture. Pour les prises de sang, la vitesse normale de coagulation pour les oiseaux n'est pas connue, mais est habituellement considérée d'une durée d'environ cinq minutes. Le stress et les températures élevées sont susceptibles d'affecter cette durée. La fin de l'écoulement sanguin sera vérifiée avant le relâché des oiseaux. Enfin, l'hydratation des oiseaux sera réalisée de façon systématique avec une solution de glucose. Pour les chauves-souris, les captures se déroulerons le matin lors du retour des chauves-souris dans leur gîte, ou en fin d’après-midi afin de relâcher les individus au moment du coucher du soleil, heure normale à laquelle les chauves-souris partent s’alimenter. Les animaux seront capturés à l’aide d’un filet à papillon, en approchant délicatement les individus accrochés sur les parois de la grotte. Les chauves-souris seront immédiatement hydratées avec de l’eau et placées individuellement dans des pochons propres opaque, suspendus au calme et à l’ombre et recouverts d’un tissu polaire. Pour les petits mammifères terrestres, les animaux seront maintenus dans leur cage-piège à l’ombre recouvert d’un drap pour diminuer le stress avant manipulation. Un biberon d’eau sera proposé à tous les animaux quand ils seront encore dans leurs cages-pièges, avant le début de la contention. Une durée maximum sera fixée pour la réalisation de tous les actes dès lors que l’animal est contenu. Cette durée sera de 10 minutes maximum par individu, de la contention au relâché. L’environnement de l’animal pendant toutes les manipulations sera contrôlé : endroit calme, à l’abri du soleil, en sécurité, propre, avec une faible luminosité. Pour les reptiles et amphibiens, les captures se feront de deux heures après le lever du soleil à deux heures après le coucher du soleil. Cela permettra de couvrir l’ensemble des plages horaires d’activité des différentes espèces. Les animaux capturés seront placés dans des sacs en tissus pour diminuer le stress avant les mesures et seront relâchés sur la zone de captures.
Choix des espèces
Ce projet porte spécifiquement sur un ensemble d’espèces (communauté) partageant le même habitat. Nous ciblerons donc la totalité des espèces de vertébrés identifiées sur notre site d’étude : chauves-souris, oiseaux, petits mammifères terrestres, reptiles et amphibiens. Le nombre précis d’espèce ne peut être indiqué en amont du projet car il dépendra des opportunités de captures des animaux sur le terrain. Nous ciblons cependant : 1 espèce de chauves-souris, 10 espèces d’oiseaux, 5 espèces de petits mammifères terrestres, 11 espèces de reptiles et 2 espèces d’amphibiens. Les animaux seront classés en deux grandes catégories d'age pour ce projet : juvénile et adulte. Tous seront échantillonnés, excepté pour les amphibiens ou seuls les adultes seront capturés. Pour les autres groupes taxonomiques, les jeunes non sevrés ne seront pas capturés (poussins et jeunes mammifères non volant/sevrés).
Etude chez la souris des mécanismes d’action de l’œstradiol dans la régulation hypothalamique de la fonction de reproduction au moment de la puberté.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
Une partie des femelles est ovariectomisée sous anesthésie, avec pose d'un implant hormonal, pour les rendre réceptives lors des tests d'accouplement. 400 souris vont être utilisées, dans des procédures allant d'un niveau de souffrance léger à modéré, une partie d'entre elles étant opérées et tuées sans reprendre conscience. Le porteur nomme les tests, accouplement spontané pendant neuf heures pour les mâles, activité locomotrice en corridor circulaire pendant deux heures, anxiété en labyrinthe à croix surélevé. Il écrit que l'ovariectomie et la supplémentation "n'entrainent pas d'inconfort des animaux" une fois la récupération passée, dans le paragraphe même où il reconnaît que cette chirurgie provoque stress et douleurs, et toutes les souris finissent tuées pour prélèvement du cerveau.
Objectifs
L’infertilité est aujourd’hui un enjeu majeur de santé publique dont les causes et les mécanismes d’action demeurent mal compris. La fertilité repose sur une régulation adéquate par le cerveau des régions impliquées dans les fonctions de reproduction. L'organisation de ces structures cérébrales, en particulier dans l’hypothalamus, est contrôlée par les hormones stéroïdes sexuelles, testostérone et estradiol, pendant des périodes critiques de développement, de la naissance à la puberté. Le but de ce projet de recherche est de comprendre le rôle de l’œstradiol au cours du développement pubertaire dans les changements de plasticité de l’hypothalamus. Des souris seront utilisées afin d’investiguer les mécanismes d’action de l’œstradiol dans l’organisation pubertaire des réseaux neuraux sous-jacents la régulation des fonctions de reproduction. Les données issues de ce projet aideront à mieux comprendre les troubles pubertaires et contribueront à élucider les mécanismes d’actions impliquées dans le contrôle des fonctions de reproduction mâle et femelle. Cela pourrait ainsi conduire à développer des stratégies thérapeutiques spécifiques au sexe et à l’âge pour remédier aux troubles de la fertilité.
Bénéfices attendus
La puberté est une période critique de la vie qui permet d’atteindre la maturité sexuelle et ainsi permettre la reproduction. C’est une période cruciale de transition entre l’enfance et l’âge adulte qui, en plus de l’apparition des caractères sexuels secondaires, s’accompagne d’importants changements psychiques et comportementaux. Néanmoins de manière surprenante les mécanismes cérébraux sous-tendant ces changements sont aujourd’hui encore mal compris. Les données obtenues dans ce projet contribueront à déterminer les mécanismes d’action qui contrôlent l’organisation pubertaire du cerveau par les hormones stéroïdes sexuelles. Ceci est particulièrement pertinent si nous voulons développer de meilleurs traitements pour les troubles de la puberté mais également pour les troubles psychiatriques et comportementaux qui se manifestent souvent pendant cette période.
Procédures
Une partie des femelles subiront un acte de chirurgie afin d’induire la réceptivité par retrait chirurgical des ovaires et pose d’un implant hormonal : procédure chirurgicale d’une durée maximale de 10 minutes sur animaux anesthésiés ayant reçu une injection d’analgésique 20 minutes avant. Le comportement des mâles et femelles sera analysé à l’âge adulte : - comportement spontané d’accouplement (2 tests séparés de 15 jours, d’une durée 9h pour les mâles ; 3 tests séparés de 10 jours d’un durée de 30 minutes pour les femelles, sur animaux vigiles). - test d’activité locomotrice spontanée dans un corridor circulaire (durée de 120 minutes sur animaux vigiles) et test d’anxiété spontanée dans un labyrinthe à croix surélevé (durée de 9 minutes sur animaux vigiles). Une partie des animaux subiront un acte unique de chirurgie terminale effectuée sous anesthésie et analgésique d’une durée de 20 minutes. Les animaux restants seront anesthésiés profondément et euthanasiés. A l’issue de cet acte terminal les prélèvements sont réalisés pour analyse.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales d’anesthésiques et d’antalgiques peuvent générer une douleur légère au point de piqure. L’anesthésie est également associé à certains risques (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire…). Un léger inconfort peut être généré par la première introduction des souris dans les dispositifs liés aux tests comportementaux. Un stress peut être lié à l’isolement des mâles avant les tests de comportements. De plus, un stress peut être lié à la chirurgie effectuée chez les femelles. Cette chirurgie peut également entrainer des douleurs. Après la récupération post-opératoire, l’ovariectomie et la supplémentation n’entrainent pas d’inconfort des animaux.
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses immunohistochimiques et moléculaires.
Remplacement
L'étude du rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses neuroanatomiques et neuroendocrines. Il n'est donc pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives.
Réduction
Le nombre total d'animaux utilisé est de 400, ce qui permet une analyse combinée des mâles et des femelles et cela à différents stades du développement pubertaire. Des protocoles biologiques différents ne permettent pas d’effectuer toutes les analyses sur les mêmes échantillons. Les effectifs utilisés ont été calculés au plus juste afin de garantir la puissance statistique, compte tenu de la variabilité interindividuelle. Afin de réduire le nombre d'animaux, plusieurs régions du cerveau seront analysées en même temps pour le même animal. Les autres organes (hypophyse, ovaire, dents, squelette...) seront proposés aux collaborateurs de l'équipe comme cela est fait habituellement au sein de l’équipe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L'hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d'espace et d'environnement. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. L'anesthésie profonde de l'animal est vérifiée par le pincement de la patte arrière et l'absence du réflexe de clignement de paupière suite à une stimulation de l'œil. Une analgésie sera effectuée 20 minutes avant la chirurgie terminale.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et neuroanatomiques grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...), et de données dans la littérature permettant d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Des souris mâles et femelles adultes seront utilisés. De plus, des souris mâles contrôles et mutants seront utilisés aux jours postnataux (JPN) 25, JPN30, JPN35 et JPN45 ; et des souris femelles contrôles et mutantes seront utilisées aux jours postnataux JPN35, JPN40, JPN45 et JPN55. Ce projet vise à étudier la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire, l’utilisation de ces différents âges permettra d’étudier le plus précisément possible les mécanismes d’action de l’estradiol lors du développement pubertaire.
Modèles préclinques de cancer ovarien.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées de cellules de cancer ovarien humain, 800 souris immunodéficientes reçoivent ensuite un candidat médicament, jusqu'à une fois par jour pendant quatre semaines, avec quatre prises de sang sous anesthésie et une imagerie hebdomadaire. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées à l'issue, pour caractériser l'effet du traitement sur leurs organes et sur la tumeur. Le laboratoire réalise ces essais comme prestataire, pour des partenaires publics ou privés, et met en avant la reproductibilité et la robustesse de ses modèles. Il écrit dans le même paragraphe que ces modèles "demandent à être améliorés" et que les thérapies innovantes qu'ils laissent espérer relèvent d'un "futur proche".
Objectifs
Malgré les progrès de la chirurgie et de la chimiothérapie, le cancer de l'ovaire reste l'une des principales causes de décès par cancer chez les femmes, avec le cancer du poumon et le cancer du sein. Le cancer de l'ovaire développe souvent une résistance aux thérapies conventionnelles, ce qui rend son traitement difficile à un stade avancé. La mise en œuvre de nouvelles approches thérapeutiques est donc nécessaire pour améliorer le traitement de la maladie. Dans ce contexte, nous avons pour objectif de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments innovants.
Bénéfices attendus
En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-oncologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.
Procédures
L’ensemble des animaux subira une transplantation de cellules tumorales ovariennes humaines (1 injection durant 1 min / animal) puis recevra des administrations de candidats thérapeutiques dont la fréquence et la route seront dépendantes de la pharmacocinétique du composé à évaluer. Une partie des animaux subira des prélèvements sanguins (au maximum 4) réalisés sous anesthésie volatile (5 min/souris), en alternant les sites de prélèvement et espacés d’au minimum 7 jours afin de favoriser la cicatrisation. Enfin, le suivi du développement tumoral sera effectué hebdomadairement par imagerie optique par bioluminescence, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris).
Impact sur les animaux
Les animaux développeront une pathologie tumorale humaine potentiellement grave pouvant engendrer une détresse modérée. La transplantation des cellules cancéreuses et l’administration (voie spécifique de chaque candidat thérapeutique) du traitement à évaluer (au maximum quotidien durant 4 semaines) engendreront une brève douleur légère. Les anesthésies associées aux prélèvements sanguins (au maximum 4) et à l’imagerie optique (hebdomadaire) seront une source potentielle d’un stress de courte durée. L'ensemble des manipulations ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir caractériser ex-vivo l’effet de l’administration des candidats médicaments sur les organes et/ou la tumeur.
Remplacement
Notre projet se fera dans la continuité d'études in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance tumorale. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer la biodistribution du candidat thérapeutique évalué, ni le role du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale ou les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine et qui permet en plus de faire un suivi de l’évolution du développement tumoral par des mesures cinétiques non invasives par bioluminescence.
Réduction
Les études in vivo ne seront réalisées que sur les molécules candidates qui auront démontré une efficacité maximale in vitro. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir démontrer que l’effet de nos molécules est significatif par rapport aux groupes contrôles. De plus, lorsque ce sera possible, nous mutualiserons les groupes contrôles. La comparaison de différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés aux petits échantillons.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé non invasif à savoir des acquisitions de bioluminescence par imagerie optique sous anesthésie volatile. L'hébergement des animaux est effectué conformément aux réglementations locales et européennes, sous le contrôle d'un vétérinaire et avec l'aide d'un personnel technique qualifié. Les animaux seront ainsi hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour/12h nuit) et la nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. De plus, afin de respecter leur instinct grégaire et d'assurer une absence de peur et d'anxiété, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de dômes en carton et/ou de coton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et une pesée à minima bihebdomadaire, par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance, de blessure ou de maladie nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Nous avons retenu le modèle murin car l’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de tumeurs humaines chez un individu hôte d’une espèce différente. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature et dans nos propres études, pour ce type de modèle d’injection de cellules tumorales humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.