Rongeurs

Quinze minutes d'observation par jour pendant trois semaines sous pulvérisations de spray sucré, dix injections intrapéritonéales en dix jours, une restriction alimentaire faisant perdre jusqu'à 25 % du poids : 1 000 souris vont être utilisées, 336 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 664 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Certaines subissent en plus une chirurgie cérébrale de deux heures pour injecter un virus et implanter des fibres. Le porteur cherche à provoquer des comportements compulsifs, toilettage excessif, anorexie d'activité sur roue, effets de substances psychoactives, chez une lignée porteuse d'un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques. Il affirme que l'absence de méthodes alternatives l'"oblige" à recourir à ces modèles murins, et ne dit rien de ce qu'un comportement de souris permet de conclure sur un trouble psychiatrique humain.

Objectifs

Ce projet de recherche s’intéresse aux mécanismes communs sous jacents aux maladies psychiatriques. Les comportements habituels persistants et la compulsion sont considérés comme des caractéristiques communes à plusieurs pathologies telles que les troubles obsessionnels compulsifs, les troubles liés à la consommation de substances et les troubles du comportement alimentaire. L’identification d’un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques constitue un atout pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux pouvant être à l’origine de ces désordres psychiatriques à composante compulsive sur un modèle murin. Les objectifs de ce projet sont 1) identifier la vulnérabilité aux compulsions de ce modèle murin, 2) comprendre comment ce variant module l’activité de certaines régions cérébrales au cours de la mise en place de ces comportements compulsifs et 3) identifier des stratégies thérapeutiques pharmacologiques pour rétablir un comportement normal chez ce modèle murin.

Bénéfices attendus

Notre projet tend à comprendre les mécanismes neuronaux sous jacents à la mise en place de maladies psychiatriques à composante compulsive. A l’heure actuelle très peu de données permettent d’y voir clair et d’envisager une thérapie visant à empêcher voir réduire la sévérité de ces pathologies pour certaines mortelles. Notre travail permettra une meilleure compréhension sur ce sujet ainsi que d’approfondir nos connaissances sur ces pathologies psychiatriques. Nos travaux identifieront des facteurs et des processus qui permettront par la suite d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques afin de lutter contre ces maladies dévastatrices.

Procédures

Six procédures expérimentales seront effectuées afin de comprendre les bases neurobiologiques des désordres compulsifs. En utilisant des modèles murins nous évaluerons l’efficacité d’un traitement pharmacologique sur le rétablissement d’un comportement normal. Un premier aspect consistera à s’intéresser à la mise en place comportementale de la compulsion en étudiant le toilettage compulsif chez les animaux (procédures 1 et 4) à travers l’exposition et l’analyse comportementale des animaux exposés à des pulvérisation de spray sucrée sur le pelage (15 min d’observation quotidienne durant 3 semaines max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (10 injections max à raison 1 fois par jour pendant 10 jours–quelques secondes). Nous nous intéresserons ensuite à la compulsion observée lors de la mise en place de troubles du comportement alimentaire (procédures 2 et 5). Les animaux seront individualisés, exposés à une roue d’activité (libre accès dans la cage durant 3 semaines environ) et l’apport en aliment sera contrôlé (sur une période de 10 jours max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (7 injections max à raison 1 fois par jour pendant 7 jours max–quelques secondes). Enfin, nous nous intéresserons aux effets après administration ou non de substances psychoactives (procédure 3) délivrées quotidiennement en intrapéritonéale (1 injection par jour durant 6 jours – quelques secondes) et leur comportement sera enregistré avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale en amont (6 injections maxi à raison 1 fois par jour pendant 6 jours–quelques secondes). Les procédures 4 et 5 incluront une unique chirurgie au niveau cérébral qui se déroulera avant la mise en place des comportements de compulsion. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie permettra de pouvoir suivre les modifications neurobiologiques. Enfin, la procédure 6, inclura une chirurgie au niveau cérébral permettant d’administrer des vecteurs viraux permettant de modéliser différents modèles. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront ensuite exposés aux 2 types de compulsions (toilettage et alimentaire) de manière successive avec un temps de repos entre les deux. Les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour effectuer des analyses de prélèvements biologiques.

Impact sur les animaux

1/ La mise en place de la compulsion de toilettage peut entrainer un stress ou une anxiété chez les animaux (perte de poids 5-1 pourcents) 2/ L’isolement peut entraîner un stress et une souffrance chez les les animaux 3/ L’ABA nécessitant une restriction alimentaire progressive entraine une perte de poids conséquente chez l’animal après plusieurs jours (5-25 poucents) 4/ L’injection ip peut entraîner une douleur légère au point de piqure 5/ Les chirurgies stéréotaxiques (injections de virus et implantation de fibres) peuvent entraîner un affaiblissement des animaux pendant les heures suivant celles-ci. Un risque d’inflammation peut aussi être considéré suite aux sutures 6/ Un risque d’hypothermie est possible sous anesthésie tout comme un arrêt cardio-respiratoire

Devenir

L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses immunohistochimiques et moléculaires.

Remplacement

Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs impliqués dans la mise en place des désordres psychiatriques que nous étudions. Ainsi l’utilisation de rongeurs est nécessaire dans la mise en œuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires, moléculaires et neuronaux rentrant en jeu dans ces pathologies. L’absence de méthodes alternatives quant à l’étude des comportements compulsifs (de toilettage, du comportement alimentaire et de l’addiction) nous oblige à utiliser les modèles murins proposés.

Réduction

Le projet impliquera un total de 1000 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-individuelles et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux sont hébergés dans les conditions standard sur le plateau de phénotypage. Sauf procédure expérimentale le nécessitant, les souris seront hébergées par groupe de 2-5 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les animaux seront suivis durant l'ensemble de la procédure. A minima, une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire le stress. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent se battre et se blesser ; elles sont, dans ces cas, prises en charge immédiatement avec l’avis du comité de bien être animal et/ou du vétérinaire-référent de notre établissement utilisateur. Nous avons défini des points limites pour toutes les procédures. Si ces points limites sont atteints, nous consultons notre vétérinaire référent pour décider du devenir des souris.

Choix des espèces

Notre projet est basé sur l’étude d’un variant identifié chez des patients humains. L’expression de celui-ci chez la souris est indispensable pour mieux comprendre la vulnérabilité qu’il confère aux humains envers diverses maladies psychiatriques. Ainsi, le modèle souris constitue un atout pour développer efficacement notre projet. L’étude d’animaux est indispensable puisque nous explorerons les altérations physiopathologiques dans le cerveau et leurs conséquences sur le comportement. Les mécanismes qui sous-tendent le contrôle du comportement par le système nerveux central ne peuvent pas être abordés uniquement par des études à l’échelle cellulaire. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour comprendre les dysfonctionnement cérébraux opérants dans la mise en place des comportements compulsifs. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie et génomique). Nos études sur la mise en place des compulsions dans les maladies psychiatriques seront importantes non seulement pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de celles-ci mais permettront également d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques. Dans nos études, nous utilisons des animaux adultes, de plus de 8 semaines au moment du début des procédures décrites. En effet, nos études visant à identifier les bases neurales de la mise en place de comportements compulsifs se focalisent pour le moment chez l’adulte.

Les souris de cette lignée transgénique perdent spontanément leurs synapses à partir de six mois, dégénérescence construite pour reproduire la maladie d'Alzheimer. 700 vont être utilisées, 620 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 80 un niveau modéré, toutes tuées. Un fragment de queue est prélevé sur les souriceaux de 7 à 10 jours pour lire leur génotype, une partie subit une injection intracérébrale sous anesthésie d'une heure, une autre une injection intrapéritonéale. Les reproducteurs sont gardés jusqu'à six mois puis tués, le porteur indiquant qu'il ne sera possible ni de les placer ni de les réutiliser du fait de leur modification génétique.

Objectifs

Au cours de la maladie d’Alzheimer, des pertes de synapses, les connexions entre les neurones, se produisent dans le cerveau. Ces pertes sont bien corrélées à l’intensité des troubles cognitifs caractérisant la maladie. Ainsi, des traitements visant à réduire ces pertes pourraient protéger contre les déficits cognitifs. Un contrôle local des quantités de calcium au niveau des synapses est indispensable à leur maintien. Notre objectif est de déterminer si les pertes de synapses dans un modèle murin de maladie d’Alzheimer pourraient être dues à des altérations de la régulation du calcium au niveau des synapses.

Bénéfices attendus

On estime que plus de 850 000 personnes sont affectées par la maladie d’Alzheimer en France, avec une espérance de vie de 8 à 12 ans à partir du moment où le diagnostic est établi. Le mécanisme des pertes de synapses dans la maladie d'Alzheimer est encore très mal connu. Ce projet a pour objectif de tester l’implication d’altérations du contrôle des niveaux de calcium au niveau des synapses dans ces pertes. La preuve de l’implication de telles altérations pourrait, à plus long terme, orienter vers une nouvelle piste thérapeutique.

Procédures

Un élevage de souris transgéniques modèles de maladie d'Alzheimer présentant des pertes de synapses sera effectué. Cela nécessitera de prélever un fragment de queue à l’âge de 7 à 10 jours (une fois, durée de moins d’une minute par animal) pour déterminer leur patrimoine génétique. Des souris auront une chirurgie consistant en une injection intracérébrale unique sous anesthésie générale, avec une prise en charge analgésique adaptée. Cette procédure durera une heure et sera faite une seule fois. D’autres souris recevront une injection intrapéritonéale unique d’un traitement pharmacologique (une fois, durée de moins d’une minute par animal). Les souris seront euthanasiées en fin de période de maintien par une méthode réglementaire pour prélèvement et analyses.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront une légère et brève douleur lors du prélèvement de l’extrémité de la queue pour déterminer leur patrimoine génétique. Les souris génétiquement modifiées que nous utilisons dans ce projet développent spontanément une perte de synapses avec l'âge, mais elles seront euthanasiées au début de cette perte. La contention des souris nécessaire pour les manipulations et notamment pour les injections peut entrainer du stress.. Les injections peuvent entrainer une légère douleur au point d’injection. La chirurgie effectuée sous anesthésie générale comporte des risques rares associés à l'anesthésie (hypothermie, arrêt cardio-respiratoire). De plus, les souris pourraient ressentir un inconfort et des douleurs post-opératoires suite à la chirurgie.

Devenir

A la fin des procédures les souris seront euthanasiées afin de prélever leur cerveau pour analyser l'effet des traitements. Les animaux reproducteurs seront maintenus jusqu’à 6 mois pour garder des facultés de reproduction optimales. Ils seront ensuite euthanasiés car il ne sera pas possible de les replacer ou les réutiliser du fait de leurs modification génétique.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative, autre que le recours aux modèles animaux, pour atteindre les objectifs du projet. En effet le mécanisme de la neuro-dégénérescence dans la maladie d’Alzheimer n’est pas connu. Or les modèles animaux de la maladie d’Alzheimer sont les seuls à permettre d’étudier la perte progressive de synapses adultes au sein d’un organisme où les voies de signalisation sont interconnectées.

Réduction

Au cours du projet nous estimons que nous produirons au maximum 700 souris. Les animaux générés permettront de renouveler les reproducteurs de notre élevage, de réaliser les procédures expérimentales, et de réaliser des analyses nécessitant uniquement la collecte de tissus post-mortem. Nous ne produirons que le nombre strictement nécessaire d’animaux. De plus, le nombre d’animaux utilisés pour les procédures expérimentales (320) est réduit au maximum, la taille des groupes d’animaux ayant été établie pour obtenir une puissance statistique suffisante. Il sera en effet nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Le prélèvement d’un fragment de queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera limité à une taille minimale et sera réalisée en même temps que l’identification pour limiter le nombre de manipulations des souriceaux. Il est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Si un reprélèvement était nécessaire il sera réalisé au niveau de l’oreille de l’animal et n’aura lieu que s’il est justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. Pour réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse : (i) les souris ont à disposition, comme élément d’enrichissement, des composants de nidification et des batonnets ; (ii) une surveillance quotidienne des paramètres environnementaux (lumière, température, hygrométrie) est réalisée ; (iii) une surveillance quotidienne des animaux est effectuée, afin de détecter un état de stress ou de douleur. Des points limites sont définis pour chaque procédure et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. La procédure chirurgicale est réalisée sous anesthésie avec une analgésie adaptée. Nous réaliserons un suivi rapproché en post-opératoire afin de détecter tout signe de douleur de l’animal. Les souris que nous utilisons dans ce projet présentent une perte de synapses à partir de l’âge de 6 mois, elles seront euthanasiées à ce moment là donc au début de la perte de synapses, et donc avant que cela n’engendre un impact visible sur leur état général.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèles autres que ces souris pour atteindre les objectifs du projet. Le traitement visant à prévenir les pertes de synapses sera effectué à 3 mois, avant que les pertes de synapses ne soient observées chez les souris, et ses effets seront analysés 3 mois après injection, quand ces pertes sont significatives. Le traitement pharmacologique visant à réverser la perte de synapses sera effectué à 6 mois, quand cette perte est significative. Ses effets seront analysés après 1 jour, 1 semaine et 1 mois pour déterminer s’il y a un effet, et combien de temps il persiste. Les géniteurs seront utilisés entre 2 et 6 mois d'âge, période optimale pour la reproduction des souris.

1 590 souris sont utilisées dans cet établissement, l'un des deux du projet, dont 935 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Injections de la cible vaccinale, saignées répétées des veines mandibulaire et saphène, ponctions cardiaques au terme de l'immunisation, exposition à des moustiques infectés : toutes sont tuées à l'issue. Le porteur annonce un vaccin universel protégeant contre plusieurs flavivirus, tout en situant le projet au stade de l'optimisation du protocole d'immunisation. Sur le remplacement, il écrit que "le modèle animal est incontournable" et qu'aucun autre modèle ne permet ce test, après avoir produit ses données préliminaires in vitro.

Objectifs

Le projet de recherche permettra de développer une nouvelle stratégie de vaccination contre tous les flavivirus. Les flavivirus sont un groupe de virus transmis par les moustiques et causant différents types de symptômes pouvant entraîner la mort. La stratégie consiste à inhiber la transmission de ces virus lors d’une piqûre de moustique. L’avantage de cette nouvelle stratégie est qu’elle sera universelle et pourra protéger contre plusieurs maladies causées par plusieurs flavivirus avec un seul vaccin. Le projet se déroulera dans 2 EU.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) la caractérisation d'un candidat vaccin contre plusieurs maladies transmises par les moustiques, ii) une augmentation de la compréhension fondamentale de l’infection lors d’une piqûre de moustique. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin à large spectre contre plusieurs maladies à fort potentiel épidémique dans le monde et en Europe. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de centaines de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique des maladies transmises par les moustiques.

Procédures

Dans la procédure 1 (P1), nous optimiserons l’immunisation contre la cible vaccinale. Nous injecterons les souris avec la cible vaccinale à 0 et 14j et ferons des prélèvements sanguins à 0, 14 et 28j au niveau des veines mandibulaire/saphène par alternance. Les injections et prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P2, nous testerons l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur l’infection par piqûre de moustiques infectés. Les souris seront injectées avec la cible vaccinale comme dans la P1, puis exposées aux moustiques infectés sous anesthésie générale. L’exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30 min. Nous effectuerons ensuite des prélèvements sanguins tous les 2j par les veines mandibulaire/saphène par alternance pendant 14j. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P3, nous collecterons le sérum de souris immuniser pour identifier les antigènes (Ag) de la cible vaccinale. Après immunisation comme dans la P1, le sang des souris sera collecté par ponction cardiaque sous anesthésie générale à 14j après la dernière immunisation. La ponction cardiaque sous anesthésie durera 10 min. Dans la P4, nous déterminerons si la protection contre l’infection est liée aux anticorps. Nous collecterons le sérum de souris immunisées comme dans la P3 par ponction cardiaque. La ponction cardiaque sous anesthésie générale durera 10 min. Nous injecterons ensuite le sérum dans des souris, exposerons les souris anesthésiées à la piqûre de moustiques infectés, et collecterons le sang des souris par ponction des veine mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pour évaluer l’infection pendant 14j. L’exposition aux moustiques durera moins de 30 min. Les prélèvements sanguins sous anesthésie dureront quelques min. Dans la P5, nous testerons les différents Ag identifiés dans la P3. Nous injecterons les souris avec chacun des Ag comme dans la P1. Nous exposerons ensuite les souris aux moustiques infectés sous anesthésie, et réaliseront des prélèvements sanguins par ponction des veines mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pendant 14j. L'injection des Ag durera quelques min. L'exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30min. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans l’EU2 seront réalisées les protocoles d’injection d’Ag et le prélèvement avant infection. Dans l’EU1 seront réalisées les protocoles d’infection par piqûre de moustique et toutes les procédures sur animaux infectés.

Impact sur les animaux

Douleur passagère au niveau du site d’injection de la cible vaccinale, des antigènes et de l’anesthésique. Douleurs légères au point des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendu aux points de piqûres des moustiques. Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, fièvre, stress, comportement anormal, troubles neurologiques, liés à l’infection.

Devenir

A la fin des expériences ou lors d’une souffrance sévère, les souris seront mises à mort sous anesthésie.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun model autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet de l’immunisation sur l’infection par exposition à une piqûre de moustique infectés. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles in vitro.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris, nous optimiserons le protocole de vaccination et ne reproduiront que le protocole optimisé dans les autres expériences.

Raffinement

Les souris seront maintenues 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements en alternance, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. L’eau et la nourriture seront à volonté. Elles seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffant pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et dessèchement de la cornée (nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée). En dehors des expériences, le suivi des animaux s’effectuera chaque jour. Les animaux seront transportés entre les EU dans leur cage en couvrant la cage d’un tissu opaque pour ne pas stresser les animaux.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris de type sauvage avec un système immunitaire complet. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. Nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter ces souris par piqûre de moustique. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 à 8 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate et une piqûre par plusieurs moustiques simultanément.

Immunisées à J0 puis à J14, saignées par la veine mandibulaire ou saphène tous les deux jours pendant quatorze jours, 1 590 souris sont ensuite exposées sous anesthésie à des moustiques porteurs de flavivirus, trente minutes par séance. Le protocole en déclare 655 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 935 un niveau modéré, avec perte de poids, fièvre, troubles neurologiques et comportement anormal liés à l'infection. Une partie est saignée par ponction cardiaque sous anesthésie pour récupérer le sérum. Toutes sont tuées, à la fin des expériences ou plus tôt si la souffrance devient sévère.

Objectifs

Le projet de recherche permettra de développer une nouvelle stratégie de vaccination contre tous les flavivirus. Les flavivirus sont un groupe de virus transmis par les moustiques et causant différents types de symptômes pouvant entraîner la mort. La stratégie consiste à inhiber la transmission de ces virus lors d’une piqûre de moustique. L’avantage de cette nouvelle stratégie est qu’elle sera universelle et pourra protéger contre plusieurs maladies causées par plusieurs flavivirus avec un seul vaccin. Le projet se déroulera dans 2 EU.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) la caractérisation d'un candidat vaccin contre plusieurs maladies transmises par les moustiques, ii) une augmentation de la compréhension fondamentale de l’infection lors d’une piqûre de moustique. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin à large spectre contre plusieurs maladies à fort potentiel épidémique dans le monde et en Europe. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de centaines de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique des maladies transmises par les moustiques.

Procédures

Dans la procédure 1 (P1), nous optimiserons l’immunisation contre la cible vaccinale. Nous injecterons les souris avec la cible vaccinale à 0 et 14j et ferons des prélèvements sanguins à 0, 14 et 28j au niveau des veines mandibulaire/saphène par alternance. Les injections et prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P2, nous testerons l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur l’infection par piqûre de moustiques infectés. Les souris seront injectées avec la cible vaccinale comme dans la P1, puis exposées aux moustiques infectés sous anesthésie générale. L’exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30 min. Nous effectuerons ensuite des prélèvements sanguins tous les 2j par les veines mandibulaire/saphène par alternance pendant 14j. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P3, nous collecterons le sérum de souris immuniser pour identifier les antigènes (Ag) de la cible vaccinale. Après immunisation comme dans la P1, le sang des souris sera collecté par ponction cardiaque sous anesthésie générale à 14j après la dernière immunisation. La ponction cardiaque sous anesthésie durera 10 min. Dans la P4, nous déterminerons si la protection contre l’infection est liée aux anticorps. Nous collecterons le sérum de souris immunisées comme dans la P3 par ponction cardiaque. La ponction cardiaque sous anesthésie générale durera 10 min. Nous injecterons ensuite le sérum dans des souris, exposerons les souris anesthésiées à la piqûre de moustiques infectés, et collecterons le sang des souris par ponction des veine mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pour évaluer l’infection pendant 14j. L’exposition aux moustiques durera moins de 30 min. Les prélèvements sanguins sous anesthésie dureront quelques min. Dans la P5, nous testerons les différents Ag identifiés dans la P3. Nous injecterons les souris avec chacun des Ag comme dans la P1. Nous exposerons ensuite les souris aux moustiques infectés sous anesthésie, et réaliseront des prélèvements sanguins par ponction des veines mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pendant 14j. L'injection des Ag durera quelques min. L'exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30min. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans l’EU2 seront réalisées les protocoles d’injection d’Ag et le prélèvement avant infection. Dans l’EU1 seront réalisées les protocoles d’infection par piqûre de moustique et toutes les procédures sur animaux infectés.

Impact sur les animaux

Douleur passagère au niveau du site d’injection de la cible vaccinale, des antigènes et de l’anesthésique. Douleurs légères au point des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendu aux points de piqûres des moustiques. Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, fièvre, stress, comportement anormal, troubles neurologiques, liés à l’infection.

Devenir

A la fin des expériences ou lors d’une souffrance sévère, les souris seront mises à mort sous anesthésie.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun model autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet de l’immunisation sur l’infection par exposition à une piqûre de moustique infectés. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles in vitro.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris, nous optimiserons le protocole de vaccination et ne reproduiront que le protocole optimisé dans les autres expériences.

Raffinement

Les souris seront maintenues 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements en alternance, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. L’eau et la nourriture seront à volonté. Elles seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffant pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et dessèchement de la cornée (nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée). En dehors des expériences, le suivi des animaux s’effectuera chaque jour. Les animaux seront transportés entre les EU dans leur cage en couvrant la cage d’un tissu opaque pour ne pas stresser les animaux.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris de type sauvage avec un système immunitaire complet. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. Nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter ces souris par piqûre de moustique. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 à 8 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate et une piqûre par plusieurs moustiques simultanément.