Rongeurs
Evaluation pré-clinique de thérapies ciblées dans les leucémies aiguës humaines par un modèle de xénogreffe chez la souris immunodéficiente.
- Recherche appliquée
- Cancers
Jusqu'à vingt-quatre prises de sang à la joue, cinquante-six injections dans l'abdomen et cinquante-six gavages pour un seul animal : 12 606 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 11 460 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 146 un niveau léger. Chacune reçoit des cellules leucémiques prélevées sur des patients, développe la maladie et fait l'objet d'un suivi sanguin jusqu'à l'atteinte d'un point limite. Le porteur écrit que ces travaux pourraient à terme contribuer à réduire la dépendance aux modèles animaux, en identifiant des marqueurs évaluables directement chez les patients. L'effectif de 12 606 animaux, lui, n'est rapporté qu'à un calcul de puissance statistique dont aucun paramètre n'est donné.
Objectifs
Les leucémies aiguës sont des cancers rares au pronostic sombre. Elles se caractérisent par leur hétérogénéité et leur agressivité. Un défi majeur est la fréquente résistance aux chimiothérapies et les rechutes, qui contribuent au mauvais pronostic. Ce projet vise à tester des approches thérapeutiques prometteuses à l'aide d'un modèle de souris spécialement développé. En injectant des cellules leucémiques de patients dans ce modèle de souris, la maladie peut être reproduite expérimentalement pour évaluer l'efficacité de nouvelles molécules anti-cancéreuses. Ces expérimentations sont essentielles avant l'évaluation clinique de ces traitements chez les patients atteints de leucémie aiguë.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour objectif de confirmer l'efficacité de nouvelles molécules anti-cancéreuses pour le traitement des leucémies aiguës et d'élucider les mécanismes de résistance thérapeutique associés. En se concentrant sur cette forme rare mais agressive de cancer du sang, l'initiative vise à améliorer concrètement le pronostic des patients. De plus, le projet pourrait permettre d'identifier des biomarqueurs sur les cellules leucémiques des patients, en lien avec l'efficacité des molécules anti-cancéreuses testées. À terme, ces travaux pourraient contribuer à réduire la dépendance aux modèles animaux, en établissant des marqueurs d'efficacité évaluables directement chez les patients.
Procédures
Au cours de ce projet, une souris type sera soumise aux interventions suivantes : -Injection de cellules leucémiques sur souris vigile, sous anesthésie locale (durée : 30sec) : 1 injection unique/souris. -Prise de sang au niveau de la joue sur souris vigile : 2 fois par mois, puis 1 fois par semaine (durée : 30sec) jusqu'à l'atteinte d'un point limite (maximum : 24/souris). -Injection d'un traitement par voie intraveineuse sur souris vigile, sous anesthésie locale (durée : 30sec, maximum : 12/souris), -Injection d'un traitement par voie intraveineuse sur souris endormie (durée : 2 min, maximum : 12/souris). -Injection d'un traitement par voie intra péritonéale (durée : 30sec, maximum 56/souris). -Administration d'un traitement par voie orale (gavage, durée : 30sec, maximum : 56/souris).
Impact sur les animaux
Les éventuels nuisances ou effets indésirables attendus sont associés au développement de la leucémie chez les animaux (éventuelles douleurs, perte de poids, changement de comportement), au monitorage biologique (stress momentané lors de la contention, douleur aiguë lors de la prise de sang), et à l’application des traitements (stress de contention et légère douleur aiguë lors des injections et du gavage oral). Par ailleurs, du fait de leur phénotype dommageable (souris immunodéprimées), les animaux ont un irsque accru d'infection.
Devenir
Afin de récupérer les cellules leucémiques et de limiter les souffrances liées à la leucémie, toute souris ayant été injectée avec des cellules leucémiques au cours d'une des 2 procédures sera mise à mort. Par ailleurs, du fait de leur phénotype dommageable lié à l'état d'immunodépression, aucun animal ne pourra être remis en liberté à l'issue des 2 procédures. Par conséquent, tout animal inclus dans l'une des 2 procédures sera mis à mort à l'issue de celles-ci.
Remplacement
Les cellules leucémiques humaines étudiées ne peuvent être maintenues en culture. L'utiilisation d'un modèle de souris immunodéficient (NSG) permet de les maintenir fonctionnelles et de les expandre. Les lignées cellulaires de leucémies aiguës ne constituent pas une alternative viable, car elles ne reflètent pas les particularités individuelles des patients. Dans cette étude, le modèle de souris immunodéficient s'avère être le seul pertinent pour reproduire la réponse thérapeutique des patients. Ainsi, l'utilisation de xénogreffes dérivées de patients demeure indispensable en tant que modèle pour explorer les leucémies aiguës et évaluer l'efficacité de nouvelles thérapies, comme le souligne la littérature scientifique.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'obtention d'un résultat significatif déterminé par une approche statistique. Le nombre minimum d'animaux nécessaire sera calculé grâce à une analyse de puissance statistique et les résultats seont analysés par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront élevés au sein d'une animalerie dont le statut sanitaire apporte un niveau de stérilité important. Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages, sur portoir ventilé avec un accès à la nourriture et à la boisson ad libitum. Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement et une grille de score d'évaluation sera mise en place.
Choix des espèces
Les souris utilisées ont été décrites dans la littérature scientifique comme le modèle de référence pour greffer les cellules hématopoïétiques humaines, étudier le développement des leucémies humaines, et ainsi servir de modèles précliniques pour l'évaluation de nouvelles thérapies. Les animaux subiront une greffe de cellules humaines à l'âge adolescent/jeune adulte (6 à 12 semaines), car il s'agit de l'âge optimal pour obtenir les meilleures chances de succès de greffe.
Rôle des cellules endothéliales et musculaires lisses sénescentes dans le vieillissement vasculaire pulmonaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Vingt et un jours enfermées en continu dans un caisson à 9 % d'oxygène : c'est ainsi qu'une hypertension artérielle pulmonaire est provoquée chez une partie des 1 152 souris de ce projet, dont 384 seront tuées sans jamais se réveiller et 768 utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent de l'élastase par incision et injection dans la trachée pour déclencher un emphysème, avant une mesure de la fonction pulmonaire de quinze minutes sous anesthésie. Le porteur signale que les manipulations ont lieu pendant la phase de sommeil des souris et que la nourriture déclenchant le transgène est amère, ce qui leur fait perdre du poids. Il écrit dans le même paragraphe que les souris exposées à l'hypoxie chronique perdent du poids "sans apporter de douleur à l'animal" et ne montrent "aucune difficulté respiratoire", alors que le protocole vise à leur donner une hypertension pulmonaire.
Objectifs
Le vieillissement des vaisseaux sanguins avec diminution du nombre de capillaires est un élément clé du vieillissement de l'organisme, ce qui réduit l'apport de nutriments et d'oxygène aux tissus. Les cellules endothéliales (CEs) qui composent les vaisseaux, sont nécessaires à la fonction des poumons. Un nombre élevé de CEs vieillissantes est associé au vieillissement prématuré du poumon et à plusieurs maladies pulmonaires. Ces cellules vieillissantes ne sont plus capables de se diviser et libèrent des facteurs nocifs pour les poumons. Ceci a pour conséquence la diminution de la formation de nouveaux vaisseaux contribuant alors au phénomène observé avec l'âge et dans certaines maladies. Tout comme les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses jouent également un rôle dans le développement de maladies pulmonaires, et seront aussi étudiées. Notre objectif est d'évaluer l'impact du vieillissement des cellules endothéliales et musculaires lisses au cours du vieillissement et de deux maladies, l'hypertension (HTP) et l'emphysème pulmonaires. Pour cela, nous étudierons le vieillissement cellulaire, la fonction pulmonaire, la densité et le remodelage vasculaire chez des souris jeunes et âgées, avec ou sans maladies pulmonaires. De plus, nous travaillerons avec des souris génétiquement modifiées pour éliminer les cellules endothéliales et musculaires lisses vieillissantes afin d'étudier le rôle de ces cellules dans les maladies pulmonaires liées à l'âge.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer le rôle du vieillissement des cellules endothéliales et musculaires lisses pulmonaires avec l'âge et dans deux maladies pulmonaires liées à l’âge (hypertension artérielle et emphysème pulmonaires).
Procédures
Les différents animaux subiront une biopsie non invasive (1 seul geste de quelques secondes, ne nécessitant pas d'anesthésie) par poinçonnage d'oreille, effectuée au moment du sevrage (1 mois), nécessaire à leur identification. Les animaux seront placés dans un caisson à hypoxie, dans lequel la quantité d'oxygène est diminuée (9%) en continu (21 jours) permettant d’induire l’hypertension artérielle pulmonaire observée chez les patients. D’autre part, afin d’induire un emphysème pulmonaire, les animaux seront traités à l’élastase (ou contrôle sans effet) : une petite incision et injection au niveau de la trachée sont effectuées sous anesthésie générale, lors d’une seule procédure rapide de 5 minutes. A la fin de la procédure d'injection d'élastase et au bout de 21 jours suite au traitement, nous mesurerons les fonctions pulmonaires à l’aide d'un appareil durant 15 minutes environ pour chaque souris sous anesthésie générale, connectée grâce à une sonde.
Impact sur les animaux
Les différents animaux subiront une biopsie non invasive (un seul geste) par poinçonnage d'oreille, effectuée au moment du sevrage (1 mois). Cette méthode d'identification peut causer une douleur légère de courte durée. Une perte de poids modérée est attendue pour les souris exposées à l'hypoxie chronique, sans apporter de douleur à l'animal. Les souris ne montrent aucune difficulté respiratoire liée à l'hypoxie, seulement une légère fatigue. Les différentes procédures (hypoxie, instillation intratrachéale, mesure de la fonction pulmonaire) peuvent générer un stress chez l'animal, notamment lors de la manipulation au cours des pesées, de la préhension de l'animal lors des anesthésies ou encore lors des déplacements de cages. De plus, ces différentes manipulations sont effectuées durant la journée, moment au cours duquel les souris sont en phase de sommeil, cela induit alors également un stress. La nourriture spéciale permettant l'expression du transgène chez la souris a un goût amer, ce qui entraîne une légère perte de poids chez la souris.
Devenir
L'étude nécessite le prélèvement du sang et des organes (poumons, coeur, foie rein, rate) afin de mesurer différents paramètres biologiques (quantification des marqueurs de sénescence, expression de différents gènes) et histologiques (évaluation de dommages structurels au niveau du poumon), ainsi les animaux seront mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
En parallèle des études menées sur la souris, une étude sera portée sur des cellules issues d’échantillons pulmonaires obtenus lors d'une chirurgie chez des patients avec ou sans emphysème. La culture de cellules endothéliales permet d’étudier et de comparer des cellules de patients vs témoins sur différents critères. L’étude de souris génétiquement modifiées semble néanmoins incontournable afin d’étudier à l’échelle d’un organisme entier l’effet de l'élimination des cellules endothéliales et musculaires lisses vieillissantes sur des souris avec des maladies pulmonaires, nous permettant ainsi d’accéder à des données essentielles à la caractérisation de ces maladies.
Réduction
Nous choisissons d'étudier des groupes de 8 souris. Dans la mesure du possible, les groupes seront constitués de souris de même sexe, même âge, même fratrie pour réduire au maximum la variabilité des différentes mesures. Suite à la collecte des résultats, nous analyserons les données avec des tests statistiques.
Raffinement
L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent présent à l’animalerie ainsi que par les responsables de ce projet. L'environnement des souris sera composé de maisons ou tube en carton, du papier craft et du coton pour jouer. Les zootechniciens et responsables du projet seront en contact concernant le bien-être et la santé des animaux. Les points suivants seront considérés comme points limites pour les animaux qui seront mis à mort: 1. incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire. 2. Modification du comportement, douleur intense, détresse ou souffrance. 3. perte de poids trop importante, blessures diverses... Le poids des animaux sera mesuré chaque semaine et contrôlé au cours des différentes procédures, cependant nous nous attendons à une perte de poids chez les souris porteuses d'hypertension pulmonaire. Aucune perte de poids supérieure à 10% n'est attendue. Si un animal présente un de ces points limites, il recevra une anesthésie et une analgésie adaptée à la mise à mort.
Choix des espèces
Les modèles de maladies pulmonaires que nous souhaitons utiliser sont bien maitrisés et ont déjà largement été utilisés, ils ont fait l'objet de plusieurs publications. Nous utiliserons des souris à partir de l’âge de 2 mois. Le développement pulmonaire continue chez la souris après la naissance, et nous considèrons que ces animaux ont des poumons matures à partir de 2 mois. Nous suivrons leur évolution tout au long des différentes procédures, afin d'étudier l'effet des maladies pulmonaires sur les souris génétiquement modifiées. Nous étudierons également des souris âgées de plus de 18 mois pour étudier l’effet de l'augmentation de cellules vieillissantes chez ces souris mutantes.
Tutorat : raffinement et maintien des compétences des différentes techniques d’administration, de prélèvement et de préhension chez la souris
- Formation professionnelle
Issues d'études antérieures ou achetées à des fournisseurs parce qu'elles étaient de toute façon destinées à la mise à mort, 250 souris vont servir pendant cinq ans à entraîner le personnel d'une société aux gestes d'administration, de prélèvement et de préhension. 190 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 60 un niveau léger, à raison de quatre à cinq interventions par animal, injections de sérum physiologique et prises de sang sur animal vigile. La dernière intervention est un prélèvement sanguin sous anesthésie profonde, suivi de la mise à mort sans réveil. Le porteur range ce projet sous le terme de "raffinement" et calcule l'effectif sur la base de deux entraînements par an pour deux ou trois personnes, dix souris à chaque fois.
Objectifs
Les personnes travaillant avec des animaux de laboratoire doivent maitriser des gestes techniques plus ou moins complexes : administrations, prélèvements…. Leur formation initiale doit parfois être complétée par une formation spécifique, en fonction des études qu’ils seront amenés à faire et de l’évolution des connaissances et des pratiques. Pour ce projet, nous prévoyons d’utiliser au maximum 250 souris sur une durée de 5 ans. Dans la très grande majorité des cas, il s’agira d’animaux de réforme proposés par l’animalerie et non utilisés dans les projets de recherche et destinés à l’euthanasie. Le cas échéant, il s’agira d’animaux de réformes vendus par des organismes producteurs et fournisseurs de rongeurs car destinés à l’euthanasie. La personne en formation sera systématiquement accompagnée par une personne experte dont la maitrise est reconnue pour le geste (diplôme et attestation de compétence validée par la structure chargée du bien être animal). La formation se divisera en plusieurs étapes : formation théorique sans animaux, observation, réalisation sous une supervision directe. Pour valider l’acquisition des gestes, la personne experte tiendra compte de critères de réussite et de critères de réalisation, définis pour chaque geste technique. Au cas où personne ne maitriserait le geste, une formation auprès d’un formateur externe agréé serait réalisée pour le personnel de la société.
Bénéfices attendus
Bonne maitrise des gestes techniques par le personnel de la société amené à faire de l’expérimentation animal afin de garantir un bon respect du bien-être des animaux utilisés dans des projets expérimentaux.
Procédures
Chaque animal sera soumis à 4 à 5 interventions maximum, ces interventions comprenant des administrations de sérum physiologiques (n’excédant pas 1 à 2 minutes) ou des prélèvements de sang pouvant être effectués sur animaux vigils (n’excédant pas 1 à 2 minutes). Pour chaque procédure, après chaque intervention, les animaux bénéficieront d’un temps de récupération adéquat avant l’intervention suivante. Si les interventions induisent une douleur légère, alors les animaux pourront subir 4 interventions, si les interventions induisent une douleur modérée, alors les animaux ne subiront que 3 interventions de douleurs modérées potentiellement suivi d’une intervention induisant une douleur légère après un temps de récupération conséquent. La dernière intervention consistera en la réalisation des prélèvements sanguins ne pouvant être effectués sur animaux vigils, et pratiqués sous anesthésie générale profonde, d’une durée maximale de 20 minutes, suivie de la mise à mort sans réveil, donc sans effet douloureux.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables peuvent être un stress physique ou thermique de courte durée, et une douleur de courte durée à l’endroit des injections. Très rarement, il peut y avoir formation d’œdèmes ou possibilité d’infection.
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront euthanasiés à la suite du prélèvement sanguin terminal.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution, qui pourrait restituer fidèlement les comportements et réactions des animaux et/ou la manipulation des tissus vivants. Ces gestes étant très spécifiques de l’espèce, ils doivent être acquis chez l’espèce cible. En amont de tout nouvel entrainement, le manipulateur sera sensibilisé au geste à l'aide de vidéos techniques.
Réduction
Les animaux seront issus d'études antérieures ou d’animaux d’élevage destinés à l’euthanasie (car génotype ou phénotype non cibles) et utilisés pour plusieurs gestes techniques de ce projet lorsque ceux-ci sont compatibles. Le cas échéant, il s’agira d’animaux de réforme (destinés à l’euthanasie) proposés par l'établissement utilisateur ou un fournisseur d'animaux. Nous avons estimés le nombre d’animaux en considérant que 2 à 3 personnes seront systématiquement impliqués pour chaque projet d’expérimentation animale, sachant qu’en moyenne il nous sera nécessaire de s’entrainer 2 fois par an (en rapport avec le fait que la majorité des gestes techniques que nous utilisons par ailleurs dans nos autres projets sont des gestes nécessitant un entrainement régulier et en considérant 10 animaux pour chaque entrainement, cela correspond à un chiffre de 40 à 60 animaux nécessaires par an soit entre 200 et 300 animaux sur les 5 ans. Nous avons considéré la moyenne (ce qui reviens à 10 souris pour 2,5 expérimentateurs x2 entrainement par an).
Raffinement
Les animaux seront hébergés à plusieurs dans chaque cage afin de favoriser les interactions sociales et auront à disposition des objets dits d’enrichissement encourageant les comportements natifs des animaux (enfouissement, nidation…etc). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé en étroite communication avec les animaliers pour la recherche systématique de signes potentiels de souffrance qui devraient mener à prendre les dispositions nécessaires décrites dans cet demande d'appel à projet. Tous les gestes pouvant conduire à des douleurs seront réalisés sous anesthésie général avec l’administration d’anti-douleur en prévention.
Choix des espèces
Les souris qui seront utilisées dans ce projet correspondent à l’espèce cible autorisée pour l’établissement utilisateur, et que les personnes en formation auront à manipuler au cours des expérimentations. De plus environ 60 % des animaux utilisés pour la recherche pré-clinique sont des souris. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif de former le personnel sur l’animal à d’autres stades de développement.
Approche de thérapie génique dans un modèle murin de sclérose latérale amyotrophique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Les souris de ce projet portent une mutation qui leur fait développer une sclérose latérale amyotrophique, avec des difficultés motrices et des crises d'épilepsie que le porteur classe comme phénotype dommageable. 3 000 d'entre elles vont être utilisées, 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 2 400 un niveau léger. Chaque animal subit une biopsie de la queue vers sept jours, une injection intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie, jusqu'à deux électromyogrammes de vingt minutes avec un risque d'automutilation, et jusqu'à treize tests de démarche répartis sur douze mois, les souris non traitées perdant leur motricité en fin d'étude. Les animaux injectés sont tués pour des analyses post-mortem, ceux de l'élevage dont le génotype ne convient pas également, les autres passant en "utilisation continue" dans les autres projets de l'équipe.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer l’effet thérapeutique d’une approche de thérapie génique pour la maladie de Charcot sur un modèle de souris de la pathologie. Ce projet sera divisé en 2 axes, le premier concernant l’élevage de la lignée de souris modèle de la pathologie et un second pour l’approche de thérapie génique et le suivi de l’efficacité.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet est d’établir la preuve de concept de l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour la sclérose latérale amyotrophique chez un modèle de souris de la pathologie. Si l’efficacité est avérée pour l’une des thérapies testées cela pourrait permettre de proposer des essais cliniques chez l’Homme, et donc à long terme d’améliorer la prise en charge des patients atteints de maladie de Charcot, pathologie pour laquelle il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement curatif (8000 patients en France avec 1000 nouveaux cas par an en France).
Procédures
Un prélèvementde l’extrémité de la queue pour génotypage sera effectué une fois sur animal vigile de 7 à 10 jours et durera moins d’une minute par animal. - Les animaux ont une injection intraveineuse (durée 5 min) sous anesthésie générale - les animaux subiront maximum 2 électromyogrammes (durée 20min) sous anesthésie et analgésie adaptée - les animaux seront soumis à des tests comportementaux repartis sur 12 mois pour analyser leur démarche (2 min) donc 13 fois maximum durée 2 min , leur exploration spontanée (20 min) deux fois maximum Un prélèvement de sang sera réalisé sur les animaux (sous anesthésie) avant leur euthanasie (durée 2 min) Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire à la fin de la procédure. Les animaux pourront developper une atteinte motrice et presenter des crises d’épilepsie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont : - une légère et brève douleur au moment du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage - un risque cardio-respiratoire et hypothermique durant l’anesthésie - un stress de l'animal lors des contentions et des manipulations, changements de pièces pour les tests comportementaux, la prise de sang - une perte de motricite en fin de vie pour les souris non traitées en fin d’etude - un leger picotement au niveau de la patte lors de l’electromyogramme et un risque d’automutilation - Un léger picotement lors des injections intrapéritonéales - un leger picotement lors de la prise de sang terminale – Les animaux utilisés dans ce projet ont un phenotype dommageable se traduisant par des difficultés motrices et des crises d’épilepsie.
Devenir
En fin de procédure tous les animaux injectés seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem pour recueillir nos données d’efficacité. Les animaux d’élevage seront maintenus au cours du projet jusqu’à l’âge de 6 mois maximum. Les animaux non porteurs des genotypes d’intérêt seront euthanasié. Les autres animaux de génotype souhaité seront en utilisation continue dans nos autres projets de recherche.
Remplacement
Le projet vise à valider une thérapie génique pour la maladie de charcot incurable à l’heure actuelle chez l’Homme. Les modèles in vitro ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaires de cette approche ; elle nécessite à présent d’être validée dans un contexte physiologique de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 15 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 3000 souris sera nécessaire pour ce projet afin de générer les lots expérimentaux nécessaires ainsi que pour nos autres projets de recherche. Nous adapterons notre production à nos besoins expérimentaux et pourront donc générer moins de 3000 animaux.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, La procédure a été mise en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux disposent de nourriture adaptée à leur stade physiologique (gestation et allaitement ou animaux de stock) et d’eau ad libitum. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et des soins adaptés. Le change (de la litière, abreuvement, nourriture) est réalisé 1 fois par semaine ou tous les 15 jours en fonction des besoins de la cage. Le milieu est enrichi à l’aide de carré de coton de bâtonnet de bois à ronger et si nécessaire supplémenté de lanières de kraft, et de maison de type celldom. Les animaux seront hébergés par 3 à 5 souris par cage ventilée au maximum, si nécessaire en cas d’agressivité de mâles les animaux seront séparés ou isolés. Un animal peut se retrouver seul lorsqu'il est le dernier animal de la cage et qu'aucun regroupement n'est possible (sexe, âge) avec des maisonnettes rajoutées dans ce cas en plus de l’enrichissement classique. Nous incluons dans notre étape d’injection uniquement des animaux en bonne santé, avec la mise en place de gel ophtalmique et la prévention de l’hypothermie en plaçant les souris sur un tapis chauffant. Un suivi rapproché est effectué au réveil. Le prélèvement pour le génotypage est limité à environ 1 mm à l'âge de 7-10 jours environ (moins de sensibilité à le douleur et cicatrisation rapide), c’est un geste rapide et maitrisé qui est réalisé dans un endroit calme par des personnes compétentes. Les prises de sang sont réalisées sous anesthésie et les electromyogrammes sous anesthésie et analgésie. Les tests de comportement sont réalisés en vigile par du personnel formé. Nous injectons un analgésique avant le produit euthanasiant
Choix des espèces
L’objectif du projet est d’évaluer l’effet thérapeutique d’une approche de thérapie génique pour la maladie de Charcot sur un modèle de souris de la pathologie. Les souris ont entre 4 et 12 semaines pour l’évaluation de notre approche thérapeutique et seront suivies jusqu’à 12 mois maximum. Pour l’elevage les reproducteurs sont utilisés entre 6 semaines et 6 mois.
Bénéfice d’un traitement chez la souris par des polyphénols naturels sur le vieillissement physiologique ou pathologique de la maladie d’Alzheimer (EU 2/3)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Identifiées par une boucle d'oreille et une biopsie de la queue au sevrage, 1 345 souris passent des tests de mémoire à trois, six, douze et dix-huit mois, dont un test en piscine réparti sur cinq jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque mois, elles sont placées dans une autre cage le temps de recueillir trois crottes. 592 d'entre elles font en plus une à deux heures de route vers deux autres établissements pour des imageries cérébrales sous anesthésie, après plusieurs heures de mise à jeun, et toutes sont tuées pour prélever cerveau et intestin. Le porteur signale que les femelles de cette lignée transgénique peuvent mourir subitement à quinze mois sans signe annonciateur, et espère que le projet conduira à terme à la production d'un complément alimentaire pour les personnes âgées.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est la démence la plus commune parmi les démences de la personne âgée où elle représente un peu plus de deux tiers des cas. L’âge est le principal facteur de risque de la maladie d’Alzheimer. En France, le nombre de personnes âgées de 65 ans ou plus et atteintes de la maladie d’Alzheimer serait compris entre 560 000 et 730 000 suivant les études. Même si la recherche reste très active pour cette maladie, aucun traitement n’est actuellement capable de modifier efficacement l’évolution de la maladie et la cause demeure toujours inconnue pour la forme la plus représentée dans la population. Des travaux récents soulignent le rôle du microbiote intestinal dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. La recherche de molécules capables de modifier le microbiote intestinal tout en prévenant d’autres altérations du système nerveux central observées chez le patient devient aujourd’hui une priorité pour de futurs traitements. Plusieurs études soulignent le rôle modulateur de certains polyphénols sur le microbiote intestinal pour avoir un écosystème bactérien bénéfique sur la santé humaine. Toutefois, l’interaction entre les polyphénols et ce microbiote est complexe et des recherches approfondies sont nécessaires pour valider cette cible périphérique dans la maladie d’Alzheimer. L'objectif de notre projet est d'étudier l'effet de plusieurs polyphénols sur l'évolution des troubles cognitifs dans un modèle de la maladie d'Alzheimer chez la souris. Trois établissements utilisateurs seront impliqués dans ce projet.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet conduira, à plus long terme, à la production d’un complément alimentaire visant à mieux vivre chez les personnes âgées.
Procédures
Dans l’établissement utilisateur EU1, les souris sont identifiées en posant une boucle d'oreille numérotée et les caractéristiques génétiques nécessaires à l'étude sont connues en réalisant une biopsie de la queue au sevrage. Les souris (1048) seront soumises à des tests du comportement pour évaluer les troubles cognitifs et moteurs liés au vieillissement physiologique et pathologique (Alzheimer) : au total 3 tests réalisés à 3, 6, 12 et 18 mois. Les tests de mémoire à court terme sont au nombre de 2, ils se feront respectivement 7 jours et 3 jours avant le début du test de mémoire à long terme. Chaque test de mémoire à court terme dure moins de 20 minutes. Le test de mémoire à long terme demande 4 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour de 60 secondes espacés d'une heure. Le 5ème jour, la souris passe une seule fois le test sur 60 secondes. Durant tout le projet, les fèces seront recueillies 1 fois par mois. Les souris seront placées 5 min dans une nouvelle cage le temps du recueil de 3 crottes spontanées et retourneront dans leur cage d’origine. Dans un autre établissement utilisateur (EU2 à 1 heure de l’EU1), des souris (296) suivront deux imageries cérébrales pour évaluer le flux sanguin (30 min), l'inflammation et le métabolisme (60 min) qui nécessite la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie. Dans un autre établissement utilisateur (EU3 à 2 heures de l’EU1), d'autres souris (296) suivront une imagerie par résonance magnétique (30 min) après administration orale de glucose. Dans les deux EUs une anesthésie gazeuse, régulée sera réalisée sur tapis chauffant thermorégulé durant l'examen.
Impact sur les animaux
Inconfort transitoire lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse, associé à une douleur légère et transitoire liée à la pose de la boucle d’oreille et la biopsie. Tests comportementaux : stress léger et transitoire pour les tests de mémoire à court terme minimisé par l’habituation ; stress modéré et transitoire et sensation de froid légère et transitoire lors du test de mémoire à long terme avec des essais espacés d’une heure pour laisser le temps à la souris de se réchauffer. Concernant les protocoles d’imagerie dans l’EU2 nécessitant la mise à jeun des animaux quelques heures avant l’imagerie, il est possible d’avoir les effets suivants sur 5 min maximum : Inconfort/douleur au niveau du site d’injection des agents de contraste ; Inconfort au niveau du site d’apposition de la sonde d’image ultrasonore ; Stress lié à la contention (imagerie) ; Stress lié à la phase de réveil de l'anesthésie gazeuse. L’imagerie au sein de l’EU3 est une technique non invasive. Cependant durant l’examen, un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé entre l’animal et le lit, peut subvenir, du fait de la variabilité inter-animaux, de la sensibilité aux anesthésiques. Cette nuisance entraînera l’arrêt de l’expérimentation. L’administration orale de glucose avant l’imagerie peut induire un stress et une souffrance et des blessures physiques si l’animal bouge mais cela est très rare car la canule utilisée sera en matière souple avec un bout arrondi et le geste sera exercé par une personne qualifiée. Aucune autre nuisance n’est connue sur ce modèle murin transgénique mise à part la mort subite à 15 mois chez les femelles sans signe annonciateur.
Devenir
Tous les animaux inclus dans la demande d’autorisation de projet seront mis à mort avec la répartition suivante dans chaque établissement utilisateur : - EU1, 456 seront mises à mort pour le prélèvement du cerveau et de l’intestin en vue de réaliser des analyses biochimiques et de biologie moléculaire et d’étudier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Les couples reproducteurs de plus de 6 mois et souris surnuméraires (297 au total)) seront mises à mort après inclusion dans des études hors champ. - 296 souris seront envoyées vers chaque établissement utilisateur EU2 et EU3 qui disposent de systèmes d'imagerie cérébrale indispensables à l'étude. Ces souris (592) seront mises à mort après les imageries pour des analyses biochimiques et de biologie moléculaire post-mortem.
Remplacement
Des études préliminaires in vitro ont déjà été réalisées pour étudier l’efficacité des polyphénols à une dose non toxique pour différentes cellules du cerveau permettant ainsi de définir les doses ciblées dans cette demande de projet. Ici, il est important de prouver les effets bénéfiques de ces polyphénols sur le vieillissement physiologique et pathologique Alzheimer mais aussi de s’assurer qu’elles n’ont pas d’impact délétère sur les fonctions physiologiques de l’organisme. Il n’existe pas d’autres méthodes alternatives pour juger de l’effet d’une nouvelle molécule à visée thérapeutique in vivo dans le cadre du vieillissement qu’il soit physiologique ou pathologique.
Réduction
Deux collaborations nationales sont envisagées dans ce projet et dans les deux cas il s’agit d’étudier les effets bénéfiques de polyphénols. Le fait de regrouper ces études sur la même demande de projet permet une réduction du nombre de souris. Par ailleurs, plusieurs paramètres sont mesurés chez une même souris, permettant ainsi de réduire encore le nombre de souris. Une souris permettra en final de générer des données aussi bien au niveau périphérique avec l’analyse du microbiote intestinal mais aussi au niveau cérébral. Enfin, le projet se déroulera par étapes. Si les résultats bénéfiques dans les étapes antérieures restent très faibles voire absents, des lots d’animaux ne seront pas inclus dans la suite du projet. Ainsi le nombre d’animaux indiqué est un nombre maximum. Pour estimer le nombre d’animaux par lot de souris, nous avons utilisé un calcul qui tient compte de la variabilité des réponses du vivant ; le nombre d'animaux par lot permettra d'obtenir des résultats robustes sur le plan statistique.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en animalerie exempt de tout organisme pathogène spécifique et opportunistes (couples reproducteurs) ou tout organisme pathogène spécifique en respectant l’Arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d’aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques et leurs contrôles. Une période d’acclimatation de 10 jours minimum sera respectée avant l’introduction des souris dans une procédure. Pour diminuer les stress lors de la prise de l’animal pour les tests comportementaux, les animaux seront manipulés par préhension durant les 2 semaines qui précèdent les tests à raison d’une fois par jour. Pour le test comportemental en piscine, il est prévu de maintenir les souris dans ses mains en coupe posées sur une serviette (utile pour éponger l’eau) avant de les remettre dans leurs cages qui seront placées sur un tapis chauffant pour réchauffer les souris entre chaque essai. Dans les EU2 et EU3, les animaux seront hébergés en zone SPF en maintenant les interactions sociales des groupes de souris dans les sous-lots suivis dans l’EU1 avec une période d’acclimatation de 10 jours, température de 20-24°C, avec un enrichissement du milieu changé régulièrement (jouet en plastique : tunnel, igloo, maison). Pour diminuer les stress liés aux sorties des cages et aux contentions, les animaux seront régulièrement manipulés par le personnel en charge de l’étude. Le transport des animaux sera assuré vers les établissements utilisateurs collaborateurs par une société agréée pour le transport de rongeurs. Les cages seront réceptionnées par l’EU1 avant la date de transport pour permettre aux zootechniciens(nes) de prendre le temps de préparer les cages en incluant l’enrichissement, les gels hydriques en bonne quantité et l’alimentation nécessaire. Les anesthésies avec exsanguination seront réalisées sur tapis chauffant à température régulée. Toutes les anesthésies et analgésies prévues respecteront les résumés caractéristiques des médicaments utilisés (posologie). Pour les imageries dans les EU 2 et 3, du gel ophtalmique sera appliqué afin de compenser la sècheresse oculaire. Dans les 3 EUs, il est prévu une fois par semaine, une pesée des animaux avec l’utilisation d’une grille de scores et la mise en place de points limites gradés et d’actions en réponse à l’atteinte des points limites.
Choix des espèces
Dans le cadre de la maladie d’Alzheimer, il existe différents modèles murins génétiquement modifiés. Le modèle choisi est largement utilisé dans la littérature et surtout présente une cinétique progressive des lésions comme chez l’homme contrairement à d’autres modèles murins plus agressifs. Pour ce modèle, il est donc aisé de faire des comparaisons avec les autres études déjà publiées. Les souris seront incluses dès l’âge de 3 mois, âge pour lequel aucun stigmate Alzheimer n’est détectable donc très intéressant pour définir les données basales avant tout traitement. Des lots de souris seront utilisés jusqu’à l’âge de 12 mois où la perte de mémoire est quantifiable ainsi que les caractéristiques biologiques de la maladie. D’autres lots seront suivis jusqu’à l’âge de 18 mois où la perte neuronale pourra être quantifiée ainsi que les autres paramètres déjà quantifiés à 12 mois pour voir leur évolution.
Rôles de l’interleukine-1beta (IL-1β) en conditions physiopathologiques.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Perte de poids continue, prostration, poils ébouriffés, arrêt de l'alimentation : ces seuils déclenchent la mise à mort des souris qui les atteignent. 8 704 souris vont être utilisées dans ce projet, toutes tuées pour prélever leurs organes, 3 456 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 5 248 un niveau modéré. Elles reçoivent des injections, subissent des chirurgies d'environ quarante minutes, passent une demi-heure en imagerie et enchaînent des tests comportementaux quotidiens de cinq minutes pendant une semaine, certains composés provoquant des crises de type épileptique que le porteur décrit comme douloureuses. Dans la partie du projet consacrée à l'inflammation, il écrit qu'il n'est pas possible d'administrer des analgésiques sans modifier les résultats expérimentaux.
Objectifs
I'interleukine (IL1) est une molécule essentielle dans l’initiation de l’inflammation suite à une infection ou une lésion. Cette molécule est en outre impliquée dans le développement de nombreuses pathologies comme l’arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, le diabète de type 2 et contribue au développement de maladies de type auto-inflammatoire. De nombreuses études suggèrent également que cette molécule modulerait de nombreux processus physiologiques ou pathologiques comme la mémoire ou la douleur. Cependant, en l’absence d’outils pertinents permettant d’étudier cette cytokine dans le temps et dans l’espace, les rôles précis de l'IL1 secrétée par différents types cellulaires selon le contexte physiopathologique ne sont pas connus ou controversés. Notre équipe a récemment développé un modèle de souris exprimant un capteur de l’IL1 qui émet de la lumière. Cette souris ‘2 en 1’ permet 1/soit de visualiser chez l’animal de façon spatiale et temporelle la production d’IL1 par mesure de la luminescence, 2/ soit d’inactiver spécifiquement la synthèse de l’IL1 dans un type cellulaire donné. Basé sur ce modèle murin innovant, ce projet a pour but de déterminer précisément le rôle de l’IL1 et les voies de signalisation cellulaire gouvernant sa libération, dans différents contextes physiologiques et pathologiques. A terme, ce projet devrait permettre d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement de différentes pathologies impliquant l’IL1. Ce projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les bénéfices espérés du projet sont multiples : Il est attendu une meilleure compréhension du rôle de l’ IL1 dans divers contextes physiopatholoqiues et ainsi proposer de nouvelles pistes therapeutiques ciblant l’inflammation. Plus précisément, grâce à l’utilisation d’animaux exprimant un capteur de l’ IL1, nous pourrons définir précisément la provenance de cette molécule et la signalisation cellulaire associée à sa libération. De plus, l’invalidation génique de l’IL1 dans un type cellulaire donné nous permettra d’évaluer spécifiquement la contribution de l’ IL1 dans le développement de l’inflammation, des douleurs associées et des comorbidités anxio-dépressives.
Procédures
L'ensemble des animaux recevront des injections, des chirurgies et feront des tests comportementaux. Dans l'EU1, les expériences d'injection, de chirurgies et de tests comportementaux seront réalisés. Dans l'EU2, l'imagerie des animaux sera réalisée ainsi que des injections. Les tests comportementaux permettront de déterminer les troubles des fonctions motrices et cérébrales. Les animaux seront gardés en vie deux mois, le reste des animaux sera gardé en vie au maximum 15 jours après l'induction de l'inflammation. Les test comportementaux ont une durée de 5 minutes quotidiennes, pendant une semaine. Les chirurgies ont une durée d'environ 40 minutes. L'imagerie des animaux dure 30 minutes.
Impact sur les animaux
Des douleurs légères des injections par piqure, des douleurs à prendre en charge pendant et après des chirurgies. Des composés vont induire des crises de type épilepsie qui sont douloureuses pour les animaux. Les tests de comportement vont induire un stress modéré dans certaines conditions.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur l’utilisation d’un modèle murin unique et innovant permettant de suivre précisément dans le temps et dans tout l’organisme l’expression d’une molécule pro-inflammatoire. Il permettra également de ne plus avoir l'expression, spécifiquement dans un type cellulaire donné, de cette interleukine afin de definir de nouvelles pistes therapeutiques. Il n’est donc pas possible de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. Enfin, notre projet s’appuie sur différents tests comportementaux chez l’animal ainsi que l’obtention d’organes pour en étudier les caractéristiques histologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement pertinents. L’avantage de notre souris exprimant le capteur de l’IL1 est la réutilisation possible d’un même animal pour un suivi longitudinal, notamment lors de la mesure de bioluminescence in vivo à différents temps, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, nous avons défini des stratégies de croisement de manière à limiter au maximum la production d’animaux qui ne seraient pas utiles pour l’expérimentation. Il est bien établi qu’il existe un important dymorphisme sexuel dans les mécanismes inflammatoires. Les études seront donc réalisées à la fois chez le mâle et la femelle. Les tests comportementaux et l’analyse des tissus seront effectués sur les mêmes animaux afin d‘en réduire le nombre. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation du logiciel G Power (ver 3.4.10) approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. La taille de chacun des lots d’animaux à générer pour ce projet a été calculée sur la base de tests paramétriques permettant de détecter une différence significative sur la base d’un risque d’erreur α fixé à 5% et une puissance de 0.80.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué régulièrement. Des points limites spécifiques ont été définis (perte de poids continue et excessive; prostration ; poils ébouriffés, arrêt d’alimentation, etc.) et le raffinement (adminstration d’antalgiques ou analgesiques) s’appliquera pour une prise en charge adaptée des animaux. Pour les scores les plus importants, cette prise en charge pourra conduire à l'euthanasie de l’animal. Dans la partie de notre projet s’intéressant à l’inflammation dans différents contextes inflammatoires, il n’est pas possible d’utiliser des analgésiques ou des antalgiques afin de ne pas modifier les résultats expérimentaux. Pour le transport des animaux, nous suivrons la procédure validée par le réseau des animaleries de Montpellier, après demande d'autorisation auprès du vétérinaire et de la direction départementale de la protection des populations. Nous ajoutons à la litière des frisottis et/ou des buchettes en bois, des aliments et du gel hydrique.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu dans la caractérisation des mécanismes sous-tendant l’inflammation. Ce modèle permet également l'utilisation de souris invalidées pour nos cibles d'intérêt ou exprimant des biosenseurs, ce qui permet de facilement considérer les rôles et fonctions de différentes protéines. De plus, les études précédentes de référence ont été réalisées sur des souris, ce qui permet de se baser et de comparer directement les résultats qui seront obtenus Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 2 et 6 mois), ce qui permet de s’affranchir des effets développementaux et de senescence.
Compréhension des mécanismes immunitaires associés aux anticorps thérapeutiques dans un modèle d’infection respiratoire à Pseudomonas aeruginosa et évaluation d’une protection à long terme chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Infectées puis réinfectées par la bactérie Pseudomonas aeruginosa au moyen d'un cathéter introduit dans la trachée, 3 390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue. 1 680 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 1 710 autres un niveau léger. Le porteur écrit qu'aucun traitement antidouleur ni anti-inflammatoire ne peut être administré pendant l'évolution de la maladie, faute de quoi l'évaluation des traitements testés serait faussée, et décrit une inflammation et une gêne respiratoire douloureuses selon leur intensité. L'alternative aux antibiotiques que le projet dit vouloir ouvrir, des anticorps inhalés combinés à des immunomodulateurs, en reste au stade des données précliniques.
Objectifs
Les infections respiratoires provoquent le décès de plus de 3 millions de personnes chaque année dans le monde. Ces pneumonies bactériennes ou virales sont particulièrement problématiques du fait de l’augmentation importante des phénomènes de résistances aux chimiothérapies antimicrobiennes. Aujourd’hui, les anticorps sont administrés exclusivement par voie intraveineuse. Or, cette voie n’est pas appropriée pour le traitement des maladies pulmonaires. En effet, les anticorps ne diffusent pas passivement dans les différents compartiments de l’organisme. Après administration intraveineuse, seule une fraction négligeable de l’anticorps accède au territoire pulmonaire. Depuis plusieurs années, des données précliniques soutiennent l’intérêt de l’inhalation pour améliorer l’efficacité des anticorps. Cette voie d’administration est d’ores-et-déjà une référence pour l’utilisation de bronchodilatateurs ou de corticoïdes chez les patients atteints d’asthme ou de bronchopneumopathies obstructives. L’inhalation permet d’administrer d’a,nticorps directement dans le poumon, sous la forme d’un aérosol. Lors d’infections respiratoires, ceci permettrait une plus grande rapidité d’action des anticorps, une forte concentration à proximité de l’agent pathogène, tout en limitant le passage systémique et les potentiels effets secondaires des anticorps. Nous avons démontré que le processus d’aérosolisation permettait d’administrer des anticorps ayant conservé leurs propriétés physiques et immunologiques, grâce à l’utilisation de dispositifs médicaux adéquats et au développement de formulations spécifiques. Nous avons également démontré qu’un anticorps dirigé contre la bactérie Pseudomonas aeruginosa, responsable de pneumonies, administré par inhalation, atteignait les poumons en plus grande quantité comparativement à une administration par voie intraveineuse. Ceci est associé à une meilleur efficacité. Des études préliminaires ont montré qu'une administration pulmonaire unique d'un anticorps anti-microbien avec certains agents immunomodulateurs permet de protéger les individus face à une seconde infection. Ce projet vise donc à décrire et comprendre les réponses immunitaires anti-infectieuses à long terme induites par des anticorps administrés par voie pulmonaire en combinaison avec des agents immunomodulateurs afin de favoriser leur transfert vers la clinique.
Bénéfices attendus
Ce projet, basé sur des données préliminaires solides, vise à développer des stratégies thérapeutiques innovantes basées sur des combinaisons d’anticorps et d’immunomodulateurs inhalés pour induire une réponse à long terme contre des pathogènes respiratoires. Cette approche anticorps/immunomodulateurs offrirait une alternative thérapeutique aux antibiotiques/antiviraux, contre des pathogènes résistants, avec un effet durable permettant de prévenir les infections secondaires. Elles permettraient notamment de traiter les infections respiratoires à P. aeruginosa dans un contexte de bronchopneumopathies obstructives, de mucoviscidose et d’infections nosocomiales ou communautaires. Ces pathologies représentent un lourd tribut en termes de morbi/mortalité, perte de productivité et coût pour le système de santé. L’inhalation d’anticorps en combinaison avec des immunomodulateurs, pourrait offrir les avantages d’une nouvelle option thérapeutique face à l’antibiorésistance et d’un effet à long terme pour prévenir de nouvelles infections (chez un même individu) par ce pathogène, qui est rencontré à la fois lors d’infections respiratoires aigües mais aussi chroniques. Plus largement, l’inhalation d’anticorps en combinaison avec des immunomodulateurs pourraient être exploitée dans d’autres pathologies infectieuses respiratoires (infections à d’autres bactéries résistantes aux antibiotiques comme Klebsellia pneumoniae, Acinetobacter baumani ou d’autres infections virales comme le virus respiratoire syncitial, le SARS-CoV-2 ou le virus de la grippe). Les effets à court terme et à long terme des anticorps sont déjà documentés et utilisés pour le traitement de diverses pathologies. Il s’agit ici d’utiliser une voie optimale pour l’administration des anticorps à visée respiratoire (voie inhalée) et de potentialiser leurs effets en combinant les anticorps avec des immunomodulateurs pour en faire des médicaments plus efficaces contre la réapparition d’infections secondaires. La voie inhalée propose une administration non-invasive directement dans le territoire malade (poumon) pour une action rapide dans le tissu malade.
Procédures
_Infection et ré-infection par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min _Administration des agents immunomodulateurs par voie intranasale : sous anesthésie générale, 1 fois, 20secondes _Administration de l’anticorps ou des agents immunomodulateurs par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min _Administration des agents immunomodulateurs par voie intraveineuse : en tube à contention, 1 fois, 1min 30secondes _Administration des agents immunomodulateurs par voie orogastrique : en contention, 1 fois, 30secondes _Prélèvement de sang : sous anesthésie générale, 1 fois/semaine, 1min
Impact sur les animaux
Les infections peuvent générer une inflammation et une gêne respiratoire qui peuvent être douloureuses selon leurs intensités. Les animaux peuvent également présenter des douleurs associées à un stade avancé de la maladie. Aucun traitement antidouleur ou anti-inflammatoire ne peut malheureusement être envisagé pendant l’évolution de la maladie car ceci entrainerait un facteur confondant avec l’évaluation de l’efficacité des stratégies thérapeutiques et la compréhension des mécanismes inflammatoires/immunitaires associés. Les nuisances associées aux administrations des agents thérapeutiques/agent pathogène comprendront: le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et la douleur associée à l'introduction d'un cathéter dans la trachée pour la voie orotrachéale; le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et l'administration d'un bolus de 40µL pour la voie intranasale; le stress généré par la contention et la douleur associée à l'introduction d'une sonde de gavage dans l'œsophage pour la voie intragastrique; le stress généré par le maintien dans un tube à contention pour la voie intraveineuse.
Devenir
L’objectif de ce projet est d’améliorer nos connaissances dans les réponses immunitaires associées aux anticorps thérapeutiques/immunomodulateurs anti-infectieux inhalés. Ceci, afin d’améliorer leur transposabilité vers une utilisation clinique. Ainsi, à l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements (lavages nasaux, broncho-alvéolaires / prélèvements des poumons, rate, ganglions drainant) seront réalisés afin d’analyser les dynamiques des populations immunitaires.
Remplacement
Jusqu’à présent, aucun système in vitro ne permet de reproduire les caractéristiques/processus associés aux infections respiratoires et le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent et nécessaire pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modèles murins d’infection à P. aeruginosa sont très bien décris dans la littérature et permettent de mimer les phénomènes observés chez l’Homme. Les outils moléculaires, permettant une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires mis en jeu dans la protection à long terme induit par les Ac/immunomodulateurs, sont disponibles chez la souris.
Réduction
Le nombre d’animaux est optimisé en réalisant un maximum d’analyses sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …). Les modèles murins d’infection à P. aeruginosa sont maitrisés par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point. De plus, les expériences sont organisées avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Un grand nombre de données ont déjà été générées permettant de réduire le choix des doses (bactérie et traitements) et des temps d’analyses. Nous utiliserons des outils statistiques adéquats. La souris est le modèle le plus adapté pour ces études précliniques car nous pouvons étudier la mécanistique de l’effet à long terme induit par les Ac/immunomodulateurs délivrés par voie pulmonaire avec des outils appropriés (cytométrie en flux, microscopie confocale, Luminex,….).
Raffinement
Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de l’état clinique (selon notre score) des animaux sera réalisée de façon pluriquotidienne par les expérimentateurs afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale et l’atteinte des points limites décrits. Ceci inclura une attention particulière à l’observation du poids de l'animal et d'un certains nombres de symptômes qui seront utilisés pour établir un score clinique. Si l’un des points limites est atteint, les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale après anesthésie à l’isoflurane 2,5%. Un soin particulier sera apporté les 7 jours suivants une infection avec des visites biquotidiennes à l’animalerie. De la nourriture en gel sera déposée de manière préventive dans les cages pendant cette période afin de faciliter l’accès à l’eau et à la nourriture pour les animaux impactés par l’infection.
Choix des espèces
L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable, car les réponses vaccinales font (1) intervenir un certain nombre de cellules immunitaires différentes, (2) sont directement liées au contexte inflammatoire de l’hôte et (3) dépendent de l’organe considéré et donc de la voie d’administration. Le modèle infectieux à Pseudomonas aeruginosa se caractérise par une réponse inflammatoire exacerbée rapide (1 à 3 jours). L’utilisation de la souris se justifie également d’un point de vue technique avec la disponibilité au sein du laboratoire de l’ensemble des réactifs/kits/consommables spécifiques de cette espèce permettant de caractériser les réponses immunitaires à long terme associée aux anticorps. Des animaux âgés de 6-8 semaines seront utilisés. Des individus plus jeunes (âges inférieurs à 6 semaines) sont à proscrire du fait du développement incomplet de leur système immunitaire, ce qui pourrait perturber l’évaluation des traitements. Des individus plus vieux (âges supérieurs à 12 semaines) sont également à proscrire du fait d’un poids souvent élevé incompatible avec certaines procédures. Ce facteur poids rend les animaux plus résistants à l’infection et là encore pourrait gêner la correcte évaluation de l’efficacité de la réponse immunitaire au traitement.
Contribution à la lutte contre les pullulations de campagnols terrestres par une approche immunocontraceptive orale
- Protection de l’environnement
Capturés par piégeage dans les zones de pullulation d'Auvergne, 170 campagnols terrestres vont être utilisés en captivité puis tués, 50 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 120 un niveau modéré. Ils ingèrent des comprimés d'alginate contenant des peptides destinés à les rendre stériles, après une mise à jeun la veille, et subissent des prélèvements de sang, de salive et de sécrétions vaginales sous anesthésie, hebdomadaires pour deux des douze lots. Le porteur compte la captivité elle-même parmi les nuisances, ces animaux étant sauvages, et les met à mort pour récupérer un maximum de sérum et examiner leurs organes reproducteurs. L'effectif dépendra de l'efficacité des campagnes de piégeage et des pics de pullulation, et le porteur indique qu'aucune approche statistique n'est développée dans ce projet.
Objectifs
Les pullulations importantes et l’expansion des aires de colonisation du rongeur fouisseur nuisible Arvicola terrestris scherman (ATS ou campagnol terrestre) dans les éco-systèmes agronomiques et touristiques de moyenne montagne, sont des problèmes de plus en plus cruciaux en Auvergne, comme en Franche Comté et dans d’autres pays voisins en Europe. Afin de compléter les outils existant dans la lutte contre les pullulations d’Arvicola terrestris, nous développons depuis 2018 des vaccins immunocontraceptifs qui pourraient limiter les capacités reproductrices de ce rongeur nuisible. Cette demande s’inscrit dans la phase 3 du projet. Pendant la phase 1, des séquences peptidiques immunogènes ont été sélectionnés sur les antigènes spermatiques déterminés suite à des immunisations avec des spermatozoïdes entiers de campagnols par voie sous-cutanée. Lors de la phase 2, les animaux ont été immunisés avec les peptides individuels déterminés lors de la phase 1, par voie sous-cutanée et aussi gastrique (gavage) qui sera la voie utilisée sur le terrain. Ces tests d’immunogénicité ont été associé à la recherche d’une formulation appétente pour les rongeurs dans leur habitat naturel, aboutissant à l’obtention de comprimés de biopolymères d’alginate que les campagnols ingèrent. Lors de la phase 3 qui débutera en 2024, les objectifs principaux nécessitant l’utilisation d’animaux dans des procédures expérimentales seront : 1- de déterminer la nature finale et la concentration des peptides à administrer ainsi que la fréquence d’administration pour obtenir une immunisation efficace (production d’IgA mucosales dans les fluides biologiques [salive et serum] et dans les sécrétions des tractus génitaux mâles [épididymes, vésicules séminales, prostate] et femelles [sécrétions des cornes utérines et de l’épithélium vaginal]) ; 2- de continuer à développer la forme galénique pour la rendre plus appétente (si possible) et résistante aux conditions d’humidité rencontrées sur le terrain ; 3- de comprendre les mécanismes immunitaires responsables de l’effet contraceptif observé.
Bénéfices attendus
Les pullulations importantes et l’expansion des aires de colonisation du rongeur fouisseur nuisible Arvicola terrestris scherman (ATS) dans les écosystèmes agronomiques et touristiques de moyenne montagne sont des problèmes de plus en plus cruciaux en Auvergne, comme en Franche Comté et dans d’autres pays voisins en Europe. Les incidences économique, écologique et environnementale sont très importantes et la situation préoccupante. Malgré une surveillance accrue et une lutte chimique raisonnée, mais non conforme aux exigences de la réglementation européenne, le constat est fait qu’il est nécessaire de mieux articuler les stratégies de lutte et de développer de nouveaux outils. Le projet proposé consiste en la mise au point d’un vaccin contraceptif efficace pour juguler les pullulations cycliques du rongeur fouisseur nuisible ATS. L’enjeu réside dans l’obtention d’un maximum de spécificité d’espèce associé à une grande efficacité. Si un tel vaccin contraceptif peut être développé, il sera une alternative à la lutte chimique utilisée à ce jour. Ce projet s'inscrit dans la lutte contre un rongeur sauvage nuisible.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, des prélèvements vaginaux et des prélèvements salivaires, tous effectués sous anesthésie générale. Pour 10 lots sur 12, il s’agira d’un prélèvement initial et d’un prélèvement terminal en fin de procédure. Pour 2 lots sur 12, il s’agira de prélèvements hebdomadaires nécessitant une injection intrapéritonéale pour les prélèvements de salive (permettant de déclencher une hypersalivation) chez les mâles (sang et salive pour les mâles, sang et prélèvements vaginaux pour les femelles) et d’un prélèvement terminal. Les mises à jeun la veille de la prise des comprimés ainsi que l'hébergement en captivité seront également des nuisances puisque ce sont des animaux sauvages.
Impact sur les animaux
L'hébergement en captivité constituera une nuisance modérée, la mise à jeun la veille de la prise des comprimés une nuisance légère, les différents prélèvements (salive, sang, vaginal) nécessitant une anesthésie représenteront des nuisances modérées.
Devenir
A l’issue des procédures d’immunisation, les animaux sont mis à mort de manière à pouvoir prélever un maximum de sérum immun, mais aussi pour étudier les effets des immunisations sur les organes reproducteurs ainsi que sur les organes du système immunitaire muqueux commun. Ces organes seront utilisés pour des quantifications moléculaires, de l’histologie et de la détection des processus immunitaires mis en œuvre par des techniques d’immunofluorescence.
Remplacement
Il n’est pas possible actuellement de substituer l’utilisation d’animaux pour étudier la réponse immunitaire comme celle évaluée dans ce projet (réponse déclenchée par ingestion d’un cocktail de peptides immunogènes ayant des effets sur les muqueuses des tractus reproducteurs mâle et femelle).
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à 5 par sexe et par groupe afin de pouvoir conserver une bonne mise en évidence vis-à-vis de la variabilité des réponses immunitaires inter-individuelles. Aucune approche statistique n'est développée dans ce projet. Le nombre d'animaux utilisés sera dépendant de l'efficacité des campagnes de piégeage et variera en fonction des saisons ainsi que des pics de pullulation dans la région Auvergne, caractéristiques de cette espèce. En fonction de notre capacité d'hébergement et de ces contraintes, nous estimons qu'un maximum de 170 animaux seront utilisés dans le cadre de ce projet. De plus, les animaux utilisés pour un des objectifs du projet (évolution de la forme galénique) pourront être réutilisés dans les procédures d’immunisation.
Raffinement
Les animaux seront hébergés individuellement dans des cages placées dans des armoires ventilées pour mimer l’habitat naturel de ces rongeurs et leur permettre une activité normale. Les campagnols recevront une nourriture comprenant des végétaux frais (carottes et salades principalement). Les cages comprennent des cachettes et du matériel leur permettant de faire leur nid. Ils sont manipulés avec précaution par un personnel formé à l’élevage d’animaux de la faune sauvage. Notre projet ne doit pas provoquer de dommages physiques sur les animaux. Cependant, si des animaux tombent malades ou sont blessés accidentellement, ils seront pris en charge, tant que les soins, eux-mêmes, ne génèrent pas un stress trop important chez ces rongeurs qui peuvent être facilement effrayés par les manipulations. Si le traitement n’est pas possible, nous procèderons à l’euthanasie si la souffrance se maintient.
Choix des espèces
Le projet concerne une espèce sauvage classée comme nuisible par arrêté préfectoral n°2015-155. La spécificité de la réponse immunitaire ainsi que des molécules impliquées dans la reconnaissance des gamètes nécessite de travailler sur l'espèce cible dans son entier. Les animaux doivent être sexuellement matures. Nous utiliserons donc des animaux au stade adulte ayant un poids supérieur à 70 grammes
Le role des macrophages périvasculaires dans le drainage cérébral : effets sur les maladies neurodégénératives.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
1 036 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une seule injection dans le cou, de dix minutes, et le porteur qualifie les nuisances attendues de "très minimes" tout en signalant que les souris de la lignée APP/PS1 peuvent mourir prématurément du fait de leur phénotype dommageable. Certaines sont suivies jusqu'à 700 ou 800 jours d'âge pour observer les macrophages périvasculaires aux stades avancés, l'objectif déclaré étant de comprendre comment ces cellules participent à l'accumulation des plaques amyloïdes de la maladie d'Alzheimer. Le porteur justifie l'usage de la souris par le fait que ces macrophages n'ont été décrits que chez les rongeurs, ce qui exclut selon lui les espèces non couvertes par la réglementation comme le nématode ou la drosophile.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer, c'est quand le cerveau accumule une sorte de déchet appelé "plaque amyloïde". Cela se produit car le cerveau a des problèmes pour se débarrasser de ces déchets, ce qui fait qu'ils s'agglutinent et se déposent. On a découvert que des cellules spéciales appelées macrophages, qui normalement aident à nettoyer ces déchets, peuvent être en partie responsables de ce problème. Ils sont comme des éboueurs, mais dans ce cas, ils semblent avoir du mal à faire leur travail correctement. Notre idée, c'est de comprendre exactement comment ces cellules contribuent à la maladie d'Alzheimer, depuis le tout début jusqu'aux stades avancés. On pense qu'en comprenant mieux leur rôle, on pourrait trouver des moyens de les aider à mieux faire leur travail et ainsi empêcher l'accumulation de ces déchets. Pour cela, on va : 1. Regarder de près comment ces cellules et les plaques se développent ensemble dans le cerveau au fil du temps. On veut aussi voir quand ces cellules commencent à mal fonctionner. 2. Essayer de comprendre comment ces cellules fonctionnent au niveau moléculaire. Cela pourrait nous donner des indices sur ce qui déclenche et aggrave la maladie. On espère aussi trouver des signes qui pourraient nous aider à détecter la maladie plus tôt. 3. En comprenant mieux le rôle de ces cellules dans le nettoyage du cerveau, on espère pouvoir restaurer cette fonction chez les personnes atteintes de la maladie d'Alzheimer. Pour nos recherches, on dispose de modèles de souris qui reproduisent certains aspects de la maladie d'Alzheimer. Cela nous permettra d'étudier ces cellules et de tester des idées pour voir si elles pourraient aider à ralentir la progression de la maladie. Si nos découvertes sont fructueuses, cela pourrait ouvrir la porte à de nouveaux traitements pour la maladie d'Alzheimer et d'autres maladies du cerveau, ce qui pourrait aider à retarder leur évolution.
Bénéfices attendus
La maladie d'Alzheimer est causée par un problème de nettoyage du cerveau, mais on ne comprend pas encore très bien comment cela se produit. Avec notre recherche, nous espérons : 1. Mieux comprendre comment les macrophages périvasculaires agissent dans le cerveau. 2. Découvrir le rôle spécifique des macrophages périvasculaires dans le nettoyage des plaques amyloïdes dans le cerveau. 3. Trouver de nouvelles idées pour traiter la maladie d'Alzheimer, en plus des traitements actuels.
Procédures
Les animaux auront des injections au niveau du cou. Chaque souris subira une seule injection de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues seront très minimes. Cependant, il est possible que les animaux soient stressés suite à leur contention et aux injections. Ils pourront donc être sujets à des fluctuations de poids et présenter une douleur locale au niveau du site d’injection, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite. De plus, les souris de la lignée APP/PS1 peuvent être sujette à une mort prématurée, entrainant leur phénotype dommageable.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chacune des procédures dans le but de prélever les organes (cerveaux, méninges et moelle épinière) pour des études post-mortem.
Remplacement
Ce projet nécessite l’étude de macrophages dans leur contexte environnemental et dans leur tissue natif. L’étude in-vitro ne présente pas le contexte tridimensionnel et physiologique nécessaire à la caractérisation de leurs rôles, alors il n’est pas possible de s’affranchir de l’expérimentation animale. Etant donné que ces macrophages sont décrits seulement chez les rongeurs, l’utilisation des modèles animaux qui ne sont pas soumis à une règlementation comme c elegans, drosophila melanogaster, etc ; n’est pas possible.
Réduction
Sur la base de notre expérience, le nombre est calculé au plus juste pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser, grâce notamment à une réalisation séquentielle de nos expériences évitant l’initiation de travaux avant la caractérisation complète des outils et méthodes utilisés. Nous utiliserons mâles et femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à générer dans le cadre de l’élevage maintenu au sein de notre animalerie.
Raffinement
Toutes les expériences sont réalisées sous anesthésie générale, combinée à un traitement analgésique. De plus, les animaux seront suivis à l’aide d’une grille de score, des relevés de poids seront réalisés et des points limites précoces seront établis pour prendre en charge rapidement toute douleur ou mal être observé. Si les animaux montrent de tels signes, ils recevront un traitement adapté.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les macrophages périvasculaires avant et après le déclenchement de la maladie d’Alzheimer. Ceci nécessite l’utilisation de souris du stage jeune (âge 22 jours), jeune adulte (âge 60 jours) jusqu’au stade adulte très avancé (âge 700-800 jours). Nos données suggèrent que le pic de présence des macrophages périvasculaires est aux alentours de 22 jours et que les macrophages périvasculaires sont altérés chez les souris APP/PS1 très agées. Nos données suggèrent également que le défaut de drainage observé chez nos souris est maximal à 4 mois.
Formation de personnels au prélèvement de liquide céphalorachidien sur des rats et des souris
- Formation professionnelle
Rats : 21
Pour entraîner des personnels à prélever du liquide céphalorachidien, 21 souris et 21 rats sont opérés sous anesthésie générale profonde et tués sans phase de réveil. La procédure dure quinze minutes chez les rats et vingt-cinq chez les souris, temps d'anesthésie compris, et aucune connaissance n'en sortira. Le porteur décrit un déroulé en trois temps, exposé théorique, démonstration, puis mise en pratique par les apprenants sous la surveillance d'un vétérinaire formateur. Il affirme que cette mise en pratique "ne peut être évitée" et que l'apprentissage est impossible sur des cadavres, le prélèvement n'y étant pas réalisable.
Objectifs
La bonne formation des expérimentateurs est un point clé de la réalisation d’une recherche reproductible et conclusive. Elle permet également de garantir le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux à utiliser dans les procédures. Dans ce projet, un vétérinaire va venir dans nos locaux afin de former des personnes à ce prélèvement. La partie pratique sera précédée d’un exposé théorique permettant de souligner les précautions à prendre et les raffinements à mettre en place
Bénéfices attendus
Avec ce projet nous participons à la formation aux gestes techniques des personnels impliqués dans les expériences ce qui va améliorer le bien -être des animaux et la qualité de nos recherches.
Procédures
Les animaux de ce projet seront tous amenés à subir un prélèvement de LCR sous anesthésie générale profonde. La durée de la procédure est de 15 min chez le rat et de 25min chez la souris en tenant compte du temps d’anesthésie.
Impact sur les animaux
Un inconfort et un stress transitoire lier aux injections des anesthésiques.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience sans phase de réveil.
Remplacement
Bien qu’il soit possible de se préparer à la réalisation de gestes techniques sur animal vivant par le visionnage de vidéo de démonstration, la discussion avec des experts et la lecture de référence bibliographique, la mise en pratique après une démonstration ne peut être évitée. De plus l’apprentissage ne peut pas se faire sur des animaux morts car le prélèvement n’est pas possible sur des cadavres.
Réduction
L’apprentissage sera réalisé avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux. Ainsi le vétérinaire formateur choisi est un expert en la matière. La formation sera faite en trois temps : un exposé théorique, une démonstration puis seulement après une mise en œuvre sous la surveillance du formateur par les apprenants.
Raffinement
L’apprentissage sera réalisé avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux. Ainsi le vétérinaire formateur choisi est un expert en la matière. La formation sera faite en trois temps : un exposé théorique, une démonstration puis seulement après une mise en œuvre sous la surveillance du formateur par les apprenants.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris et des rats non transgéniques. Il est important que la formation se fasse sur les espèces qui seront ensuite utilisées dans nos expérimentations. Nous utiliserons des souris de 8 semaines (35g environ) et des rats de 6 semaines (200-250g environ) afin d’être dans les conditions réelles de mise en œuvre des prélèvements de LCR.
Caractérisation du mécanisme pathologique des synucléinopathies par microscopie à fluorescence
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
968 souris vont être utilisées dans ce projet, dont 744 tuées sous anesthésie sans jamais se réveiller pour prélever des tissus destinés aux cultures de neurones et aux coupes de cerveau, et 224 soumises à un génotypage et à un tatouage à l'âge de sept jours, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les cultures sont préparées à partir d'embryons et de nouveau-nés jusqu'à dix jours, pour suivre au microscope l'agrégation d'une protéine rendue fluorescente. Une vingtaine de souris seront replacées en élevage pour préserver la lignée dans un projet suivant, le reste étant tué à la fin du projet. Le porteur présente la culture de cellules neuronales comme un modèle qui "remplace les expériences sur des animaux vivants", tout en précisant que cette culture exige le maintien d'une colonie de souris et le prélèvement de tissus après leur mise à mort.
Objectifs
Dans plusieurs maladies dégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la démence à corps de Lewy, des agrégats d’une protéine appelée synucléine entrainent la mort des cellules neuronales du cerveau. La perte de ces cellules est responsable des symptômes que l’on observe chez les patients aux stades avancés de la maladie. Pour trouver un éventuel traitement il est essentiel de comprendre les premières étapes de ces maladies qui se produisent souvent plusieurs années avant les symptômes cliniques. Par contre, la plupart des recherches précédentes sur la maladie de Parkinson a étudié la formation d’agrégats dans des tubes à essai ou en utilisant des modèles expérimentaux très simples tels que les cellules de levure. Pour arriver à comprendre la maladie dans l’homme, il est pourtant nécessaire d’utiliser un modèle expérimental adapté, tel que le cerveaux de souris. L'objectif de ce projet est donc d'étudier la formation des agrégats des protéines dans des cultures de cellules neuronales de souris. Le projet devrait ainsi permettre de mieux comprendre la mort des cellules du cerveau dans la maladie de Parkinson et d'autres maladies dégénératives, et d'apporter des nouvelles pistes pour un traitement.
Bénéfices attendus
Pour ce projet, nous avons développé un nouveau modèle de souris dans lequel la protéine synucléine est fluorescente. Ceci permet de suivre son agrégation dans les cellules et tissus neuronaux à l'aide de la microscopie à fluorescence de pointe. Deux séries d’expériences sont prévues. Premièrement, nous allons cultiver des cellules neuronales prélevées des embryons, ce qui nous permet de regarder les cellules sous un microscope et de tester différents traitements pharmacologiques. Deuxièmement, nous allons étudier la présence de la synucléine dans des coupes de cerveau, pour identifier les régions du cerveau les plus affectés par la maladie. Ainsi, le projet ouvre des nouvelles pistes pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la maladie de Parkinson et d'autres maladies similaires. De plus, le modèle développé dans le cadre de ce projet représente un système expérimental puissant dans lesquels des approches thérapeutiques peuvent être testées, par exemple en utilisant des substances qui empêchent l'agrégation des protéines.
Procédures
En total 224 souris seront génotypés pour le maintien de la lignée et la sélection des animaux pour l’expérimentation. Cette procédure consiste à prélever un échantillon de tissu pour l’analyse de l’ADN des souris âgées de sept jours qui sont identifiées par tatouage réalisé en même temps. Pour les deux gestes, les souris sont tenues pendant environ 20 secondes, au cours desquelles un échantillon est prélevé (1 seconde) et le doigt tatoué (3 secondes), avant d'être replacées dans la cage.
Impact sur les animaux
Le prélèvement et le tatouage pour le génotypage sont des gestes rapides (dégrée de sévérité légère), réalisés uniquement sur certains animaux. Une légère contusion et stress associé peuvent se produire lorsque l’animal est tenu pendant cette procédure.
Devenir
Les animaux génotypés sont principalement utilisés pour des prélèvements de tissu pour l’expérimentation (cultures neuronales, immunohistochimie). Ils seront euthanasiés par une technique légale selon leur âge avant le prélèvement. Les souris génotypés qui ne sont pas utilisés dans des expériences seront euthanasiés à la fin du projet, sauf une vingtaine de souris qui pourront être replacés en élevage pour la préservation de la lignée dans le cadre d’un nouveau projet.
Remplacement
La majorité des expériences seront réalisées dans des cellules neuronales en culture ou des prélèvements de tissu. Ce modèle remplace les expériences sur des animaux vivants. Étant donné que la synucléine est fortement exprimée dans des cellules neuronales, d'autres modèles expérimentaux ne peuvent pas substituer l'utilisation du modèle animal. Cependant, la mise en culture des neurones implique le maintien d’une colonie de souris ainsi que le prélèvement de tissu après l’euthanasie des animaux.
Réduction
La lignée de souris qui contient la protéine synucléine fluorescente sera maintenue dans une forme pure (dite homozygote) dans la mesure du possible, permettant de réduire de plus de la moitié le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux est réduit au minimum nécessaire à l'obtention d'un nombre statistiquement suffisant de données expérimentales. Les expériences préliminaires pour la mise au point des techniques d'imagerie seront réalisées sur d'autres modèles cellulaires établis afin de réduire l'utilisation d'animaux le plus possible.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans une animalerie agrée, en groupe sociaux, dans des conditions de température et humidité contrôlées. Elles ont accès libre à la nourriture et l'eau. Au sevrage, des croquettes humides sont placées au fond de la cage pendant la première semaine et leur consommation est vérifiée. Les cages présentent un enrichissement du milieu dont la présence d'un "nid" sera le signe de souris calmes, regroupées et sociables. Les animaux sont régulièrement surveillés, en tenant compte de leur comportement (pas de difficulté de déplacement, isolation, signes de stress) et de l'absence de blessures.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour étudier les pathologies du cerveau, et largement utilisé dans la recherche biomédicale. Un marquage par fluorescence permet la visualisation de ces processus sous le microscope, ce qui demande la préparation des cultures neuronales à partir de tissu prélevé d'embryons et de nouveau-nés jusqu'à un âge de 10 jours. A ce stade de développement les cellules neuronales prélevés peuvent être mis en culture, ce qui permet de faire des expériences dans des cellules vivantes. L'analyse microscopique de la synucléine dans des coupes de cerveau fixé s'effectuera avec du tissu prélevé d’animaux adultes.
Combinaison de deux inhibiteurs dans un modèle de xénogreffe chez des souris immunodéficientes et des modèles d’hypercroissance 1/5
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Trente semaines de gavages quotidiens et d'injections dans l'abdomen deux fois par semaine, huit prélèvements sanguins par animal : 12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties sur cinq établissements. S'y ajoutent la pose chirurgicale d'implants d'œstrogène, une injection de cellules tumorales humaines, une ligature vasculaire et une biopsie de la queue au sixième jour de vie. Le porteur indique que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et de passage du liquide dans les poumons, et que les tumeurs devenues volumineuses provoquent des douleurs et des difficultés à s'alimenter. Les souris des procédures d'expérimentation sont tuées pour exploration anatomique, celles de l'élevage restent en vie pour l'accouplement, à l'exception des mâles immunodéficients.
Objectifs
Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.
Bénéfices attendus
Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements
Procédures
Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)
Impact sur les animaux
Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.
Devenir
Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.
Raffinement
Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.