Rongeurs
Utilisation de probiotiques dans la prise en charge des infections à Clostridioides difficile
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont identifiées par un trou dans l'oreille ou une puce sous-cutanée, gavées une fois par jour pendant dix-sept jours avec des souches probiotiques, infectées par Clostridioides difficile lors d'un gavage unique et rendues plus réceptives à la bactérie par une injection d'antibiotique. Le porteur annonce des diarrhées et une perte de poids, avec recueil quotidien des selles, la mise à mort finale servant à prélever les organes. Il conclut que le recours à l'animal est "indispensable" pour valider l'effet thérapeutique et qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du microbiote, tout en indiquant que la vérification in vivo est de toute façon exigible réglementairement.
Objectifs
Clostridioides difficile (C. difficile) est une bactérie impliquée dans la plupart des cas de colites associées aux antibiotiques, notamment dans les établissements de santé (24000 cas par an dont 14% de formes compliquée en France). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l’ordre de 3%. Les ICD représentent également un coût sanitaire important en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours hospitaliers et des surcoûts associés à leur prise en charge particulière. C. difficile a ainsi été classée comme « menace urgente » dans le dernier rapport du centre de prévention et de contrôle des maladies portant sur les menaces liées à la résistance antibiotique. Trois molécules antibiotiques sont utilisées actuellement pour le traitement des ICD. Bien que généralement efficaces elles présentent des inconvénients tels que le risque de sélection de bactéries résistantes, coût important voir échec thérapeutique. En effet, les ICD sont caractérisée par un taux de récidive important de l’ordre de 20% avec parfois des récidives multiples particulièrement invalidantes pour les patients. Les antibiotiques font partie des molécules les plus prescrites dans le monde et il a été démontré qu’elles peuvent induire des modifications du microbiote. La perturbation du microbiote intestinal appelé dysbiose est un facteur de risque pour les ICD. En effet, l’implantation de ce pathogène est favorisée dans ce contexte. Il est donc capital de rechercher des thérapeutiques complémentaires/alternatives aux antibiotiques telles que les probiotiques permettant d’épargner/restaurer le microbiote dans le cadre de la prise en charge des ICD. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Il a ainsi été montré que les probiotiques pouvaient participer au rétablissement du microbiote intestinale et de ce fait restaurant son effet de barrière contre les pathogènes. A ce jour diverses souches bactériennes et différentes combinaisons de ces souches ont été testées avec des effets variables pour traiter et prévenir le risque d’ICD. Ce projet de recherche a pour objet de développer des stratégies de lutte contre la colonisation intestinale de C. difficile grâce à l’utilisation de probiotiques ayant diverses propriétés. En effet, les mécanismes d’action des probiotiques peuvent être divers et nous allons tester plusieurs stratégies.
Bénéfices attendus
Le développement de nouvelles stratégies de lutte contre ce pathogène permettrait d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients et limiter le risque de récidives.
Procédures
Les souris seront identifiées par un trou dans l’oreille ou une puce insérée en sous-cutané avec un dispositif dédié aux rongeurs. Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale des souches probiotiques (1 gavage/jour pendant 17 jours) ou la souche de C. difficile (un gavage unique durant la procédure) et une injection d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection d’une durée de 10 secondes durant la procédure). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé quotidiennement (au maximum), sur la durée de l'essai.
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont de classe modérée. Elles incluent les actes expérimentaux d’identification, de gavage et l’unique injection d’antibiotique ainsi que les nuisances liées à l’infection par la bactérie C. difficile pour les groupes d’animaux qui y seront exposés comprenant des diarrhées et une perte de poids des animaux. Les méthodes d’identification (trou dans l’oreille, puce) essentielles pour suivre les animaux au cours du temps occasionnent également des nuisances.
Devenir
Le prélèvement d'organes à la fin des procédures expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.
Remplacement
Plusieurs tests in vitro ont permis de sélectionner les souches probiotiques présentant une activité anti C. difficile intéressante. L'étape de vérification de leurs activités in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique. La reconstitution des interactions entre le microbiote, l’hôte et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.
Réduction
Une planification statistique minutieuse basée sur les expériences passées du laboratoire et les publications scientifiques du domaine a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. En utilisant des logiciels statistiques spécifiques nous avons ainsi déterminé que pour pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 10 animaux par groupe seront ainsi nécessaires. Ainsi le nombre total d’animaux est de 300 pour minimiser le nombre d’animaux tout en préservant la validité statistique de l'étude.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques locaux permettant de limiter la souffrance des animaux lors des injection intrapéritonéales. Une procédure d’euthanasie anticipée est mise en place et des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Enfin, à terme, les souris seront identifiées par une puce insérée en sous cutanée permettant à la fois l’identification et le relevé de la température ». Le puçage avec relevé de température est une méthode nouvelle dans l’équipe permettant d’avoir un critère supplémentaire permettant d’objectiver l’état de santé de l’animal et pouvant constituer un point limite supplémentaire (fièvre ou hypothermie).
Choix des espèces
La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.
Etude comportementale et fonctionnelle de modèles murins des troubles du spectre autistique (TSA)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
6 950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 760 sous anesthésie sans réveil et 2 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est marquée et génotypée par prélèvement d'un disque d'oreille de 1 mm, ou par amputation de deux phalanges au maximum avant huit jours de vie. Certaines subissent une nage forcée de six minutes, jusqu'à trois fois à une semaine d'écart, une chirurgie du crâne d'une trentaine de minutes pour implanter un cadre métallique, des électrodes intracérébrales ou une fibre optique, et jusqu'à neuf injections intrapéritonéales. Le porteur écrit que les dommages escomptés sont minimes puisque les animaux doivent être en bonne santé pour être soumis aux tests comportementaux, et signale des blessures auto-infligées par toilettage excessif, caractéristiques des lignées étudiées, qui conduisent à la mise à mort.
Objectifs
Les troubles du spectre autistique (TSA) touchent une personne sur 100. Il s’agit d’un trouble neuro-développemental caractérisé par des anomalies de la communication sociale ainsi que des comportements stéréotypés et des intérêts restreints. Cependant, derrière cette définition générale se trouve un spectre d’états, allant de légères anomalies de traits de personnalité à des incapacités sévères. Récemment, la piste d’une altération des fonctions synaptiques à l’origine d’une partie des cas de troubles du spectre autistique a été confirmée par l’identification, notamment dans notre laboratoire, de mutations dans des gènes codant pour des protéines synaptiques nommées neuroligines, neurexines et SHANK. Notre laboratoire étudie le rôle de plusieurs protéines synaptiques modifiées par des mutations associées aux TSA dont deux protéines d’échafaudage de la densité post-synaptique des synapses glutamatergiques, Shank2 et Shank3. Nous travaillons en collaboration avec des psychiatres pour obtenir des données cliniques, que nous combinons aux données génétiques issues des ADN des patients évalués pour identifier des gènes associés aux TSA. Des modèles cellulaires et murins ont été développés pour mieux comprendre et caractériser expérimentalement le rôle des protéines codées par ces gènes de susceptibilité dans les TSA. Nous étudions ainsi les conséquences fonctionnelles de ces mutations in vitro et in vivo. Enfin, au laboratoire, nous examinons l’anatomie cérébrale et le comportement des animaux modèles. Nous explorons donc, sous des angles très divers, les relations entre génétique et susceptibilité aux troubles du spectre autistique. Le présent projet concerne les études in vivo chez les modèles murins de l’autisme disponibles au laboratoire et portant des mutations dans les gènes Shank2 ou Shank3. Il prolonge et complète directement 2 autres projets autorisés.
Bénéfices attendus
L’autisme représente un enjeu majeur de santé publique. Il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour améliorer les symptômes des TSA. Ce projet nous permettra de décrire et comparer de manière quantitative et qualitative les modalités de la communication au cours des interactions sociales, en conditions normales et pathologiques et de mettre en évidence de nouveaux phénotypes chez les souris modèles d’autisme grâce au développement de nouvelles tâches comportementales plus complexes et plus éthologiques que celles étudiées habituellement. Il permettra aussi de mieux comprendre les bases neurales, moléculaires et cellulaires impliquées dans les déficits comportementaux que nous identifierons et de tester de nouveaux traitements potentiels pour aider les personnes atteintes de ces troubles.
Procédures
Tous les animaux génétiquement modifiés devront être marqués et génotypés. Pour cela, une toute petite partie de l’oreille (disque de 1 mm) sera prélevée sur les animaux vigiles, généralement au moment du sevrage. S’il s’avère nécessaire de faire un marquage et un génotypage précoce pour prélever le cerveau de jeunes animaux, une phalangectomie concernant au maximum deux phalanges pourra être pratiquée jusqu’à 8 jours de vie (si deux phalanges sont amputées, elles seront faites sur deux pattes différentes). Les animaux seront soumis à des tests comportementaux ponctuels et sur plusieurs jours (tâches comportementales automatisées avec utilisation de portes automatiques), élaborés pour générer le moins de stress possible aux animaux. Toutefois, afin de tester les effets du stress chez certaines souris, elles seront exposées à un stress de nage forcée pendant 6 minutes, avec un maximum de trois expositions à une semaine d’écart. Les tests comportementaux nécessitent l’implantation d’une puce d’identification sous la peau de l’animal. Ce geste est effectué sous anesthésie gazeuse avec analgésie. Certains animaux seront soumis à une unique procédure chirurgicale permettant d’implanter, soit un cadre métallique à la surface du crâne, soit un dispositif d’électroencéphalogramme/électromyogramme (corps du dispositif sous-cutané et électrodes intracérébrales et intramusculaires), soit une fibre optique intracérébrale. La chirurgie dure environ 30 minutes. Certains animaux recevront des injections intrapéritonéales de composés pharmacologiques. Les animaux recevront au maximum 9 injections, avec au moins 3 jours d’écart entre deux injections.
Impact sur les animaux
Les dommages escomptés pour les animaux sont minimes car nous mettrons tout en œuvre pour supprimer douleur et souffrance qui pourraient être induites par les différentes procédures, d’autant plus que les animaux doivent être en bonne santé pour être soumis aux différents tests comportementaux. On peut s’attendre cependant à voir l’apparition d’états d’inconfort, de douleur ou de stress passagers chez certains animaux soumis à un stress induit volontairement, ou à une chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car les cerveaux seront prélevés pour des expériences ex vivo.
Remplacement
Pour identifier les mécanismes cérébraux mis en jeu et les effets de composés thérapeutiques sur les phénotypes associés à l’autisme, il est essentiel de faire des études sur des modèles animaux sociaux ayant un système nerveux entier et fonctionnel, et d’étudier les comportements et les états émotionnels associés au fonctionnement exécutif au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’homme. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique intègre entre les différentes régions du cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisant pour en faire des modèles d’étude pertinents.
Réduction
Dans les études comportementales classiques, la variabilité inter-individuelle est élevée. Il est donc nécessaire d’analyser au moins 15 souris par génotype, sexe et condition pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Nos nouvelles techniques de phénotypage dans l’environnement d’hébergement nous permettent de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Nous avons donc besoin de moins d’animaux (une douzaine par groupe à la fin des expériences) pour obtenir des résultats de très bonne qualité. Nous prévoyons 15 animaux par groupe en début d’expérience pour prendre en compte une potentielle perte d’animaux analysable au cours de la procédure (perte de puce d’identification ou autre) et avoir au moins 12 animaux analysables à la fin des expériences comportementales. Les expériences fonctionnelles seront réalisées sur des groupes de 10 animaux par condition. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et lignées de souris qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle les mêmes lignées de souris sont couramment utilisées. Notre expérience en chirurgie intracérébrale, études comportementales et immunomarquages nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre génotypes, sexes et conditions (avec ou sans traitement/stress) pour comparer les groupes. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les individus seront soumis à plusieurs procédures comportementales lorsqu’il n’y a pas d’interférence entre les procédures. Plusieurs procédures impliquant un apprentissage opérant ne pourront pas être faites sur un même animal car un apprentissage influencera l’autre. Les procédures sans apprentissage pourront, elles, être effectuées séquentiellement sur les mêmes animaux. Certains animaux ne pourront pas être réutilisés car leurs cerveaux seront prélevés à l’issue des expériences pour effectuer des études histologiques, cellulaires ou moléculaires. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.
Raffinement
Les animaux modèles de TSA bénéficient systématiquement d’un dôme dans leur cage d’élevage en plus de l’enrichissement standard. Avant chaque expérience non automatisée, nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Pendant toutes les expériences de comportement, les animaux seront manipulés très régulièrement (presque tous les jours), ce qui permet de diminuer fortement leur réactivité émotionnelle à la manipulation mais également de détecter le moindre changement d’attitude ou d’état physique. Pour les expériences automatisées (environnements complexes avec portes automatiques), les animaux seront laissés tranquilles dans leurs environnements de test et surveillés à distance via des interfaces permettant de visualiser et contrôler l’expérience. Concernant les chirurgies, des antidouleurs seront appliqués localement au moins 30 min avant la chirurgie. En période postopératoire, l’état général et les signes de douleur des animaux seront évalués régulièrement, selon la grille d’évaluation de la douleur, du stress et de l’inconfort du comité responsable du bien-être animal. Les animaux seront examinés régulièrement pour détecter précocement tout signe de détresse (changements de posture, yeux plissés, manque de toilettage) et la zone opérée sera inspectée minutieusement pour détecter précocement tout éventuel signe d’infection. Si nécessaire, des doses supplémentaires d’analgésique seront données. Pour l’ensemble du projet, en cas de dégradation de l’état de l’animal avant atteinte des points limites, une pesée quotidienne et les traitements adéquats seront appliqués. Si nécessaire, l’avis du vétérinaire sera demandé. L’atteinte des points limites conduira à la mise à mort de l’animal. Ces points correspondent à : une prostration, dos courbé et expression faciale très altérée, ou dénutrition majeure, ou perte de poids supérieure à 20%, et, pour les chirurgies, signes de douleur malgré l’analgésie, poils hérissés, animal prostré, hypothermie. En cas de blessures sévères, auto-infligées (par auto-toilettage excessif, caractéristique des lignées étudiées) ou dues à des agressions inter-individuelles, les animaux seront mis à mort. En cas de blessures légères, les plaies seront désinfectées et le milieu enrichi dans les cas d’auto-toilettage excessif.
Choix des espèces
Les manipulations génétiques sont actuellement les mieux connues et les plus élaborées chez la souris, ce qui permet d’invalider un gène défini et donc de générer des modèles murins de l’autisme en invalidant des gènes bien précis (éventuellement uniquement dans certaines régions cérébrales spécifiques). Les comportements de la souris commencent à être de mieux en mieux connus, même si les aspects liés à la communication chez ce modèle demandent à être approfondis et les circuits neuronaux associés précisés (ce que ce projet vise à faire). Les animaux seront utilisés pour la grande majorité à l’âge adulte (à partir de 7 semaines), afin que le développement de leur cerveau soit suffisamment mature pour la réussite et la reproductibilité des interventions chirurgicales, et pour l’homogénéité de leur comportement. Selon les résultats obtenus chez les adultes, des animaux plus jeunes seront également nécessaires pour étudier le développement (foetal et postnatal) des structures cérébrales impliquées dans les TSA.
Etude des mécanismes moléculaires impliqués dans la progression du mélanome oculaire
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées sous la peau du flanc avec des cellules de mélanome de l'œil, puis injectées dans l'abdomen trois fois par semaine sur animal vigile et sans anesthésie, pendant jusqu'à seize semaines, 422 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées pour récupérer les tumeurs et les organes porteurs de métastases. Le porteur décrit une croissance tumorale pouvant entraîner poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration et nécrose de la peau, auxquelles s'ajoutent rougeurs, infections et nécroses au point d'injection. Il annonce par ailleurs que la lignée cellulaire créée à cette occasion servira à des expériences in vitro permettant de "s'aligner sur le bien être animal".
Objectifs
Le mélanome oculaire est une tumeur cancéreuse de l’œil se développant à partir des cellules « les mélanocytes », responsables de la production de mélanine (le pigment de notre peau et de nos yeux). Ce cancer est le plus fréquent dans la population adulte. La majorité de ces mélanomes a pour origine l’uvée, un tissu de l’oeil. Si la tumeur primaire peut être traitée par énucléation ou irradiation, il a été mis en évidence que des micrométastases se propageaient via la circulation sanguine plusieurs années avant le diagnostic. Ces métastases sont fortement résistantes aux traitements par chimiothérapie ainsi qu’à la radiothérapie. L’absence de traitement efficace pour ces tumeurs entraine une mortalité à 90% dans les 6 mois qui suivent la découverte des métastases. Actuellement, il n’existe pas de traitement approuvé pour le mélanome uvéal métastatique. Il faut donc continuer à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression de cette tumeur pour identifier des cibles thérapeutiques et des traitements efficaces. Pour ce faire, nous avons réalisées des études du profil d’expression des gènes qui nous ont permis d’identifier de nouveaux candidats cibles intéressants. De plus, l’absence de modèles expérimentaux (cellulaires, animaux) de mélanome uvéal ne permet pas de tester l’efficacité préclinique de drogues dans un contexte de système immunitaire complet. Pour améliorer cela et pouvoir proposer des traitements personnalisés pertinents, nous désirons mettre en place un modèle de souris qui repose sur la greffe de cellules issues de biopsies de mélanome uvéal de souris dans des souris immuno-déficientes.
Bénéfices attendus
Le premier but de ce projet est de développer une lignée de cellules de mélanome uvéal murin qui sera utile à la communauté internationale. Ce modèle sera utile à l’ensemble de la communauté scientifique travaillant dans ce domaine pour des études in vivo mais aussi in vitro permettant de s’aligner sur le bien être animal. Une fois ce modèle établi, il sera aussi possible d’étudier l’efficacité de certaines molécules dans des animaux ayant un système immunitaire complet dans le but de lutter contre la progression du mélanome uvéal.
Procédures
Les souris seront toutes injectées en une fois en sous-cutané (sous la peau) sur le flanc avec des cellules de mélanome uvéal murin. Après observation de la croissance tumorale, les souris sont traitées trois fois par semaine avec les différents produits décrits, par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) en alternant les côtés à chaque injection. La durée de traitement sera définie par la croissance tumorale et l’expérience sera arrêtée lorsque la tumeur aura atteint un volume défini (ou un maximun de 16 semaines après injection des cellules). Cette intervention ne nécessite pas d’anesthésie et est effectuée sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection de traitement. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des traitements pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose,..). Le site d’injection sera également surveillé.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) présentant des métastases afin de réaliser des analyses in vitro.
Remplacement
En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir complètement de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent la survie de cellules de mélanome oculaire murin fraichement isolées à partir d’une biopsie et de travailler de façon intégrée où l’écosystème tumoral est reproduit. Cependant, la nouvelle lignée cellulaire de mélanome oculaire murin pourra être utilisée pour des expériences in vitro.
Réduction
En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test statistique. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) afin de réaliser des analyses in vitro. Il est fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inférieur à la fin du projet. En effet, certaines procédures ou parties de procédures pourront être abandonnées, ou le nombre d’animaux réduit, en fonction des résultats obtenus. Dans le meilleur respect du bien-être animal et dans le but de réduire, nous utiliserons des souris immunodéprimés mâles et femelles provenant de notre élevage.
Raffinement
En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi et observées quotidiennement par les animaliers et de façon exhaustive deux ou trois fois par semaine par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, stress ou inconfort. Les manipulateurs, habitués à l’expérimentation sur les souris, éviteront tout dommage à l’animal lors des injections.
Choix des espèces
La souris est un mammifère ayant des similitudes avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi ainsi qu’une petite taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Les deux modèles de souris que nous utiliserons dans ce projet sont commercialisés, bien connus et de nombreuses études ont déjà été réalisées à partir de ces modèles. Pour les procédures expérimentales, les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature.
Exploration du statut inflammatoire et du stress oxydant chez des souris ob/ob nourries avec des régimes supplémentés de lait contenant des bioactifs issus du colza
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Comparer des tourteaux de colza pour améliorer la qualité du lait de vache et la santé du bétail : 60 souris ob/ob, génétiquement obèses, sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent pendant cinq semaines des croquettes fabriquées à base de laits de vache lyophilisés, avec recueil d'urines et de fèces, puis sont mises à mort sous anesthésie pour prélever le sang cardiaque et les organes. Le porteur qualifie les méthodes de non invasives et affirme qu'aucune méthode de substitution in vitro ou in silico n'existe pour étudier l'effet de ces extraits sur l'inflammation et le stress oxydant. Les groupes comptent neuf animaux, six pour le témoin, et le bénéfice mis en avant reste la sélection de sources de choline pour la filière du colza et de l'alimentation du bétail.
Objectifs
L’objectif fondamental de ce projet est d’optimiser la qualité des tourteaux de colza pour améliorer la santé du bétail, la qualité du lait produit et la santé du consommateur humain. Par ailleurs, des études précédentes ont démontré que les plantes de la famille des Brassicacées comme le colza, ont des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires importantes. Dans cette étude, nous chercherons à comparer le potentiel santé (antioxydant et anti-inflammatoire) de différents tourteaux de colza chez un modèle d’obésité génétique ob/ob caractérisé par stress oxydant et une inflammation élevée.
Bénéfices attendus
Dans cette étude, nous comparerons les effets santés de laits de vache ayant consommé différents tourteaux de colza, notamment leurs capacités à réduire l’inflammation et le stress oxydant chez un modèle de souris ob/ob. Pour cela, des marqueurs génétiques et biochimiques inflammatoires et du stress oxydant seront mesurés ainsi que les modifications métaboliques. En termes de bénéfices du projet, nous évaluerons les capacités d’un lait de vache contenant des bioactifs du colza pour améliorer le statut inflammatoire et le stress oxydant chez un modèle préclinique d'obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à un nourrissage ad libitum aux différents régimes pendant 5 semaines, prélèvements d’urines et de fèces puis mise à mort et prélèvements de sang et d’organes.
Impact sur les animaux
Une nouvelle alimentation pourrait engendrer un stress chez l’animal. Une période d’acclimatation d’une semaine en début de la procédure sera réalisée afin d’habituer les souris au nouveau régime alimentaire (croquettes régimes fabriqués à base de laits de vache lyophilisés).
Devenir
Tous les animaux à l’issue de la procédure seront mis à mort pour le recueil du matériel biologique nécessaire aux analyses comprenant le sang cardiaque et les organes.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro ou in silico pour étudier l’impact des extraits bioactifs issus de l'alimentation sur l’inflammation et le stress oxydant.
Réduction
Le nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes. Notre expérience sur l’étude du statut inflammatoire et du stress oxydant chez des souris ob/ob nourries avec des régimes supplémentés de lait contenant des bioactifs issus du colza sera conduite sur des groupes de 9 animaux. En effet, notre experience avec les souris ob/ob montre qu’un minimum de 9 souris est nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les paramètres biologiques étudiés, à l'aide de tests statistiques appropriés. Des études similaires ont été conduites sur des groupes de 9 à 10 animaux. Nous chercherons à mettre en évidence des différences statistiquement significatives entre les groupes au niveau des analyses biochimiques et métabolomiques à l'aide de méthodes statistiques appropriées. Un groupe de souris contrôle négatif nourries avec un régime AIN nous permettra de valider l’effet « matrice ». Ce groupe contrôle ne comportera que 6 animaux. Des points limites stricts et spécifiques seront appliqués.
Raffinement
Les méthodes utilisées sont non invasives. Les animaux sont hébergés en cage de 3. L’environnement sera enrichi par la présence d’un igloo en plastique et de matériel de nidification (bandelettes de papier kraft). Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Enfin, une anesthésie sera réalisée lors du prélèvement final.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les liens entre l’alimentation et les réponses anti-inflammatoires et anti-oxydantes. Le modèle ob/ob est une souche reconnue pour présenter une inflammation et un stress oxydant important. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l'achat et d'environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir des paramètres confondants tels que le vieillissement.
Evaluation préclinique d’un nouvel intracorps dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pesées à chaque manipulation, puçées sous anesthésie, testées jusqu'à deux fois par semaine sur leur fonction motrice et neuromusculaire, injectées chaque mois et exposées trois fois à des traceurs radioactifs pour une heure d'imagerie, les souris de ce projet développent en plus spontanément une paralysie progressive. 596 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit une atrophie musculaire, des troubles de la marche et une dysfonction intestinale responsable d'un décès prématuré, tout en ramenant les nuisances liées aux actes expérimentaux à des douleurs au point d'injection et à un stress de manipulation. Toutes seront mises à mort pour prélever différents tissus, la décision étant prise après 48 heures sans amélioration chez les souris qui montrent des signes de mal-être.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par une dégénérescence des neurones impliqués dans la motricité (motoneurones) et aboutissant à la mort dans les 2 à 5 ans suivant la détection des symptômes. Les mécanismes à l’origine de la maladie sont encore mal compris, et il n’y a aucun traitement efficace existant actuellement. Une caractéristique de la maladie est l’agrégation d’une protéine dans les motoneurones et les cellules gliales (cellules formant l’environnement des neurones). Donc, cibler ces agrégats et empêcher leur formation pourrait constituer une démarche thérapeutique d’intérêt. Nous avons récemment identifié un fragment d’anticorps (appelé intracorps) se fixant spécifiquement à la protéine concernée et qui présente des effets protecteurs in vitro. L’objectif de ce projet est d’évaluer ses effets in vivo dans un modèle murin de SLA. .
Bénéfices attendus
Pour la première fois, nous allons i) Apporter des données longitudinales sur ce modèle de SLA, utiles pour tout nouveau test de médicament et ii) Apporter des données sur les effets de l’intracorps.
Procédures
- Pesée lors de chaque manipulation (duree :
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques, modèle de sclérose latérale amyotrophique, développent spontanément un phénotype neurodégénératif, avec des symptômes moteurs, des troubles de la marche, une perte de poids et une atrophie musculaire. Ce modèle développe également une dysfonction intestinale responsable d’un décès prématuré, qu’il est possible de prévenir par la mise en place d’une alimentation gélifiée. Les nuisances attendues liées aux actes expérimentaux réalisés sur les animaux sont les suivantes : Injection du placebo ou de l’intracorps: douleur au point d’injection. Nuisances liées à l’imagerie: stress lié à la manipulation, douleur au point d’injection du traceur ou risque d’hématome . Prélèvements sanguins: douleur mandibulaire au point de prélèvement ou risque d’hématome si prélévement par veine caudale. Tests comportementaux: stress lié à la manipulation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des analyses sur différents tissus prélevés.
Remplacement
Les modèles in vitro que nous utilisons pour nos projets sont inopérants dans une telle étude qui vise à étudier un organisme dans son ensemble. En revanche, l’intracorps a d’abord été testé dans des modèles cellulaires surexprimant la cible du médicament. Le candidat a démontré sa capacité à réduire l’aggrégation de la protéine dans ces modèles. Le candidat a fait l’objet d’un brevet sur sa séquence du fait de ses effets dans des modèles in vitro (publication en cours) et les essais pré-cliniques sont indispensables à la poursuite du développement du candidat.
Réduction
le nombre de groupe a été optimisé et le nombre d’animaux par groupe a été réduit à son maximum. De plus, l’utilisation de l’imagerie in vivo au cours du temps permet la réduction du nombre d’animaux utilisés. Huit groupes de 24 souris, soit 576 souris sur 5 ans + 20 souris d’entrainement seront utilisées dans le projet. Les effectifs ont été choisi sur la base d’une analyse bibliographique, de l’utilisation d’un test de puissance, de la prise en compte de la fragilité du modèle.
Raffinement
Les souris transgéniques développant des troubles de la dysfonction intestinale liés au développement de la maladie, de la nourriture gélifiée sera également mise à disposition dès le stade présymptomatique afin de prévenir l’apparition de ce symptôme. Les conditions d’élevage inclueront un enrichissement du milieu (papier absorbant, cabanes, et/ou tubes). Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur (Injection sous-cutanée d'un antidouleur ). La blessure est également désinfectée. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être (hypothermie, prostration, etc...) et intervenir si nécessaire (injection sous-cutanée de solution saline à 37°C pour l’hydratation, nourriture appétente Des points limites sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et auscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessures). Les points limites seront déterminés selon une grille de cotation. La décision de mise à mort est prise s’il n’y a pas d’amélioration dans les 48h. L’imagerie en tomographie d’émission de positons (TEP) est une méthode permettant de suivre l’évolution de la maladie sur un même sujet évitant ainsi l’évaluation par autopsie nécessitant des mises à mort à différents temps, ce qui constitue une mesure de réduction et de raffinement. Imagerie : Pendant 4 jours avant l’imagerie du radiotraceur, pour minimiser leurs stress, une habituation des animaux sera réalisée. Cette période d’habituation consiste pendant les 4 jours précédents l’imagerie à prendre l’animal en contention pour mimer l’injection du traceur en i.p., placer l’animal dans une cage maintenue à une température de 37°C pour une durée de 30 min, puis replacer l’animal dans sa cage. Le jour de l'imagerie l’induction d’anesthésie sera réalisée en gazeux et pendant les imageries les animaux seront maintenus à 1,8-2%. Une protection oculaire sera appliquée. L’animal sera maintenu durant toutes les expérimentations d’imagerie sur lit chauffant, le rythme respiratoire et la température corporelle seront surveillés. Dès son réveil, l’animal sera remis dans sa cage d’hébergement.
Choix des espèces
Il y a peu d’animaux modèle de la SLA, seul le modéle de souris transgénique possède les caractéristiques recherchées pour notre projet. Les modèles in vitro que nous utilisons pour d’autres projets sont inopérants pour notre étude qui vise à étudier un organisme dans son ensemble. Les souris seront reçues à leur 7ème semaine de vie. Ceci permettra de débuter le traitement avant le début d’apparition des symptômes de la SLA.
Caractérisation de lignées de rats portant des mutations dans le gène CLCN4
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Entre 12 et 20 semaines d'âge, des rats porteurs de mutations d'un gène lié à une maladie neurodéveloppementale rare, et des rats témoins, passent une batterie de tests : activité locomotrice et anxiété, coordination, force musculaire, troubles compulsifs, apprentissage et mémoire, fonction musculaire sous anesthésie, avec une prise de sang et un prélèvement de fèces sous contention. 96 rats, dont 64 mutants et 32 témoins, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes. Le projet doit vérifier si ces lignées reproduisent les symptômes de la maladie humaine, et pour l'une des mutations le porteur parle d'un "léger phénotype" chez des mâles plus chétifs, plus agressifs, qui peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Les tests ne sont désignés que par ce qu'ils mesurent. Le porteur évoque un test "impliquant de l'eau" seulement pour décrire le séchage des rats, et cite en passant, pour une partie d'entre eux, une perfusion au paraformaldéhyde absente de la description des procédures.
Objectifs
La maladie liée au gène d'intérêt est une maladie neurodeveloppementale rare liée au chromosome X. Elle affecte les deux sexes et est associée à une déficience intellectuelle, à l'épilepsie, à des problèmes gastro-intestinaux et à des troubles du mouvement et du comportement. Ce gène code pour une protéine dont la fonction et le mode d'action n'est pas encore bien compris. Ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie de ce syndrome et les développements thérapeutiques potentiels. Les besoins médicaux des patients souffrant de cette pathologie restent largement insatisfaits. Seules des thérapies multidisciplinaires de soutien sont disponibles. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie en utilisant un modèle animal approprié.
Bénéfices attendus
Étant donné l'absence actuelle de modèle animal approprié pour cette pathologie, nous pensons que si la caractérisation des modèles de rats montre une récapitulation précise des symptomes associés à cette maladie, les résultats du travail proposé auront un impact significatif : Cela ouvrira la voie à une analyse plus approfondie des aspects génétiques, fonctionnels et cliniques de la maladie, avec la possibilité de générer des données significatives et translationnelles, et ainsi mieux comprendre la physiopathologie. Ce projet nous permettra ainsi d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie du syndrome et les développements thérapeutiques potentiels.
Procédures
Nous allons réaliser les tests d'exploration fonctionnelle suivants de 12-20 semaines d'âge, chacun des tests étant réalisé une seule fois : Mesure de l'activité locomotrice et anxiété (30 minutes) observations cliniques (5 à 10 minutes); tests de coordination (4 sessions de 20 minutes maximum en 2 jours + 18 minutes au total sur 3 jours); test de force musculaire (5 minutes environ); test pour évaluer des troubles compulsifs (30 minutes); test d'apprentissage et mémoire (45 minutes au total en 8 jours); test pour évaluer la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie; le suivi du poids des animaux (1X/semaine); prélèvement des fécès (30 secondes) et prélèvement sanguin (30 secondes) sous contention rapide. L'ensemble des animaux de l'étude recevront pour le test de la fonction musculaire, une injection d'anesthésique et une autre de son réversant.
Impact sur les animaux
Une des mutations ponctuelles induit un léger phénotype : les mâles sont notamment plus chétifs, plus agressifs, ils peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Lors des injections d'anesthésique, les animaux sont maintenus en contention rapide de quelques secondes le temps d'injecter le produit, ce qui peut stresser un court instant l'animal avant d'être relaché dans sa cage. De même, la prise de sang pour les animaux qui ne seront pas perfusés au paraformaldéhyde (PFA), sera réalisée sous contention rapide durant quelques secondes.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques et de protéomique)
Remplacement
L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant des mutations dans le gène d'intérêt et d'observer si ces modèles sont représentatifs de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, déficience intellectuelle, hypotonie, troubles neurologiques, anomalies cérébrales, anxiété, comportement compulsif, déficit d'attention, constipation, difficultés d'alimentation, petite taille et microcéphalie. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptômes de la pathologie associés au gène d'intérêt.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 64 animaux mutants (16 mâles mutation 1 + 16 femelles mutation 1 + 16 mâles mutation 2 + 16 femelles mutation 2) et 32 animaux contrôles (16 mâles + 16 femelles) pour évaluer le phénotype des animaux. Les animaux contrôles seront mutualisés pour les deux mutations, permettant ainsi de réduire le nombre total de rats. Ce nombre de rats permettra d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes. Afin de monter les cohortes expérimentales, nous allons réaliser un type de croisement qui va générer des animaux tous potentiellement constitutifs de la cohorte expérimentale, ce qui permet de limiter fortement le nombre d'animaux générés.
Raffinement
Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâton à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. Le type de croisement choisi pour monter cette cohorte expérimentale permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer la cohorte et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs dans la colonie et ainsi ne pas avoir d'animaux avec un potentiel phénotype dommageable (puisque seul les mâles sont atteints). Les animaux auront passé une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors des différents transferts de leur cage d'hébergement vers les différents tests. Dans le test impliquant de l'eau, les rats après les séances, seront séchés à l'aide d'une serviette puis placés sous une lampe chauffante afin d'être parfaitement secs au moment du retour dans leur cage d'hébergement. Lors de l'anesthésie, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur.
Choix des espèces
Le modèle rat portant des mutations dans le gène d'intérêt permet de reproduire tout ou partie des symptômes de la pathologie observés en clinique humaine (données préliminaires). Par ailleurs, le gène d'intérêt du rat se trouve sur le chromosome X comme chez l'Homme, contrairement à la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le calendrier échelonné des divers tests de phénotypage démarrera à l'âge de 12 semaines, et durera 6-8 semaines pour réaliser l'ensemble des tests.
Analyse des anomalies de cellules du cerveau dans un modèle de lésions cérébrales induites par la naissance prématurée chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Injectés d'interleukine 1 bêta pendant leurs cinq premiers jours de vie pour provoquer une inflammation cérébrale, des souriceaux peuvent en mourir dans 5 à 10 % des cas. 3 508 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de cerveau. Le projet teste un traitement donné au sevrage pour éliminer les cellules microgliales, puis évalue à 2 mois la mémoire par un test de peur qui associe une sonnerie à trois chocs électriques à la patte, et le comportement social par le choix entre un congénère inconnu et un objet. Une partie des souris subit à 45 jours une incision de la peau du crâne et une perforation de l'os pour l'injection d'un produit qui lèse le cerveau, opération qui peut entraîner, dans 10 % des cas, des infections, des troubles de la conscience persistants ou des troubles moteurs. Le porteur retient des souris blanches pour la taille des portées et les "qualités maternelles" des mères, censées limiter le stress des souriceaux injectés sans anesthésie.
Objectifs
La prématurité est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. Un lien causal entre infection maternelle et naissance prématurée a été mis en évidence. En effet, une réaction inflammatoire chez le fœtus peut entrainer une inflammation cérébrale et par conséquent, des lésions cérébrales connues sous le nom d’encéphalopathie du prématuré. Ces lésions favorisent ensuite l’apparition de troubles du développement neurologique, en particulier les troubles du spectre autistique. Parmi les acteurs clés de l'inflammation cérébrale, on retrouve les cellules microgliales ou microglies, cellules immunitaires résidentes du cerveau. La morphologie et les fonctions des microglies sont altérées lors d’un stimulus inflammatoire précoce, conduisant notamment à des altérations moléculaires et comportementales (diminution du comportement social) caractéristiques des troubles du développement neurologique. De plus, il a été montré dans des modèles animaux associant une inflammation néonatale à une deuxième agression cérébrale, cette fois à l’âge adulte, un phénomène de sensibilisation, aggravant l’intensité de cette 2ème agression. Le remplacement spontané de ces cellules microgliales altérée par de nouvelles cellules, après leur élimination par un traitement médicamenteux (que l'on nomme recolonisation microgliale), pourrait contribuer à la correction de certaines de ces anomalies dont le rétablissement de la maturité des neurones et du comportement social. Les objectifs de cette étude sont donc d’abord de préciser les conséquences de cette inflammation précoce sur la mise en place des structures cérébrales et le comportement chez les adultes des deux sexes, de déterminer le potentiel de ce traitement quant à la correction de ces troubles neurologiques, et ensuite d’étudier le rôle des cellules microgliales dans la sensibilisation à une 2ème agression à l’âge adulte, et de déterminer le potentiel thérapeutique de la recolonisation microgliale dans ce contexte.
Bénéfices attendus
Grâce à ce modèle souris d’inflammation précoce, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de l’élimination de cellules microgliales cérébrales altérées et leur remplacement pour traiter les troubles du développement neurologique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise. De plus, nous déterminerons pour la première fois l'efficacité de la stratégie de renouvellement des microglies sur l’intensité des lésions cérébrales pouvant survenir à l’âge adulte dans ce modèle de trouble du neuro développement en fonction du sexe. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur la capacité de cette approche à être appliquée dans une stratégie médicale précise.
Procédures
Les injections réalisées sur les souriceaux d’une molécule inflammatoire connue, l'interleukine-1beta (IL-1β), durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation de leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Le traitement testé sera ensuite administré dans l’alimentation au sevrage des animaux à la troisième semaine de vie et pendant 3 semaines. Les animaux seront soumis à deux tests afin d’évaluer leur mémoire et leur comportement social à 2 mois. Pour la mémoire, les animaux recevront un léger choc électrique suite à une sonnerie à 3 reprises. Deux jours plus tard, ils seront placés dans cet environnement et leur comportement de peur lors du retentissement de cette sonnerie, se traduisant par une immobilisation de l’animal, sera évalué. En termes de comportement social, les souris auront le choix d’interagir avec un nouvel animal ou avec un objet, une préférence pour l’interaction avec l’animal est attendue. L’interaction avec le nouvel animal devrait susciter l’intérêt et constituera le critère d’évaluation (reniflements, etc.). Des animaux seront aussi soumis, à 45 jours de vie, à une chirurgie pour injection intracranienne d'un produit créant une lésion du cerveau : sous anesthésie générale, la peau du crâne est incisé, une perforation de l'os du crâne est réalisée, puis le produit en question est injecté dans le cerveau. A l’issue de la chirurgie, les animaux seront maintenus vivant 5 jours avant euthanasie pour réalisation d’analyses. Enfin, des animaux subiront une chirurgie à 60 jours afin de mesurer l’activité neuronale dans différentes zones du cerveau. Pour cela, les animaux seront endormis et un antidouleur leur sera administré. L’imagerie est ensuite effectuée. L’animal est ensuite euthanasié.
Impact sur les animaux
Pour les souriceaux durant la première semaine de vie, les injections peuvent causer une douleur transitoire et locale. Les injections induisent une inflammation, par conséquent les souriceaux peuvent présenter des signes de déshydratation, ont un retard de croissance, et un retard dans la pousse du pelage par rapport aux souris contrôles. Ces effets perdurent environ 2 semaines. Les injections peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie interne dans l’abdomen, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Pour cette raison, l'apparition d'hémorragie sera particulièrement surveillée entre le premier et le 5e jour de vie. Bien que les injections durant les premiers jours de vie soient des gestes très rapides, ils peuvent induire un stress lié à la séparation avec la mère pendant ce laps de temps. Concernant le traitement médicamenteux pour éliminer les cellules microgliales, il sera administré pendant 3 semaines dans le régime alimentaire ou par injection pendant 5 jours selon les résultats d’une étude préliminaire. Les effets indésirables qui pourraient survenir incluent un changement de la structure du visage et du crâne. Les tests comportementaux peuvent également induire un stress chez l’animal, en particulier le test comprenant un choc à la patte. Pour cela, nous avons déterminé les durées minimales nécessaire afin d’étudier ces comportements pour minimiser la présence de nos animaux dans des environnements qui pourraient impacter leur bien-être. La chirurgie n’induira pas de nuisances, l’animal étant endormi par anesthésie et sa douleur contrôlée par un antidouleur, il est ensuite euthanasié. Concernant les injections intracrâniennes du produit créant une lésion cérébrale, il s’agit d’une chirurgie pouvant entrainer des douleurs (incision de la peau du crâne et perforation de l'os du crâne) qui sera pris en charge par administration d'un traitement antidouleur, et dans de rares cas (10%) : - des infections du site opératoire - des troubles de la conscience persistants - des troubles moteurs. Ces complications peuvent entrainer un défaut d’hydratation et d’alimentation des animaux. Une surveillance spécifique est donc mise en place post procédure.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés aux stades d’intérêt (Jour 42 et 60 après leur naissance) pour les analyses. Les prélèvements de cerveaux permettront d'étudier de manière approfondie l’inflammation cérébrale et l’efficacité du traitement pour la protection du cerveau en développement.
Remplacement
L’étude de la complexité de la réponse inflammatoire au niveau cérébral, ses conséquences et son traitement requiert l’utilisation d’un organisme vivant complet avec une maintenance du milieu physiologique et des interactions entre les différentes cellules et organes à plusieurs stades de développement. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux est utilisé pour traiter des données statistiquement exploitables. De ce fait, il est nécessaire d’avoir n=10 animaux par groupe expérimental, avec 10% d’animaux supplémentaires dans les groupes recevant la molécule inflammatoire, compte-tenu de la mortalité probable due à l’inflammation. Une seule et même analyse sera dupliquée seulement en cas de variabilité. Les études de mises au point de nos techniques sont également indispensables et comptent le nombre minimum d'animaux. Les analyses requièrent des processus de préparation différentes, un seul et même prélèvement ne peut donc pas servir pour plusieurs analyses.
Raffinement
Les mères et les souriceaux sont hébergés dans des cages enrichies en essuie-tout pour qu’elles puissent y faire leur nid. Les femelles souris blanches ont d’excellentes qualités maternelles, ce qui constitue un bon choix pour minimiser le stress des souriceaux qui subiront la procédure d’injection, même si c’est un acte peu douloureux, réalisé sur animal sans nécessité d’anesthésie. Après le sevrage les animaux seront hébergés avec un maximum de 6 animaux par cage. Pendant les 5 jours d’injection, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités, et le tonus ; à distance de l’inflammation on réalisera une surveillance régulière pour détecter une fluctuation importante du poids ou des troubles du comportement (isolement, agressivité). Si l’un de ces points limites est atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. À la fin de l’étude les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Le choix de la souris est pertinent d’un point de vue scientifique en termes de reproductibilité, des connaissances biologiques de l’espèce et du temps de reproduction. L’administration de l’interleukine-1β permettra d’étudier les voies impliquées dans la neuroinflammation et établir des stratégies neuroprotectrices. Cette inflammation au niveau du cerveau pendant les 5 premiers jours de vie permet de simuler une inflammation pendant la grossesse chez l’Homme. Suite à l’inflammation, les cellules altérées dans le cerveau seront éliminées par un traitement chez les souris avant l’adolescence et remplacées spontanément par des nouvelles cellules. La correction des troubles structuraux et comportementaux sera ensuite étudiée à l’âge adulte (2 mois). En plus d’une connaissance bien établie sur le développement neurologique chez la souris, les souris blanches présentent de nombreux avantages pour une étude développementale tels que le nombre de souriceaux par portée, qui permet de réduire le nombre de femelles gestantes, ainsi que les qualités maternelles de la mère.
Caractérisation d’un nouveau gène candidat impliqué dans les myopathies congénitales
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Toutes tuées à la fin de l'étude pour des analyses histologiques et moléculaires, 24 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Douze portent l'invalidation d'un gène candidat des myopathies congénitales, les douze autres forment le groupe témoin. Après une biopsie de phalanges vers le sixième jour de vie, chaque souris passe un test de coordination motrice tous les mois de 2 à 8 mois, puis, à 8 mois, avant et après une heure de course forcée sur tapis roulant, un test de douleur où sa queue est exposée à une source de chaleur et 24 heures d'isolement dans une cage de mesure d'activité. Elle est ensuite anesthésiée, son muscle tibial antérieur disséqué pour en mesurer la contraction, puis elle est tuée. Le porteur juge l'emploi de souris "indispensable" et y voit un "modèle d'étude idéal de myopathies", en invoquant 96 % d'homologie de la protéine étudiée et des techniques de mesure perfectionnées depuis des années dans son équipe.
Objectifs
Notre travail est principalement axé sur l’étude de nouveaux gènes impliqués dans les myopathies congénitales. Après analyse de données de séquençage d’ADN de plus de 500 patients atteints de myopathies, trois mutations dans un même gène ont été identifiées. Néanmoins, nous ne savons pas si ces mutations sont la cause de la myopathie ou si elles sont là par hasard. Au cours de notre projet, des analyses moléculaires effectuées sur cellules humaines suggèrent que ces mutations mènent à la perte de fonction de la protéine et donc à un effet pathologique. La mesure de l’activité motrice et neuro-sensitive des souris présentant une invalidation du gène d’intérêt permettra éventuellement de confirmer la présence de symptômes associés aux myopathies, tels que retrouvés chez les patients, et cela à l’échelle d’un organisme entier. En dernier lieu, des analyses sur tissus prélevés chez les souris permettront de comprendre les mécanismes de la maladie liée à ce gène et ainsi d’ouvrir des perspectives thérapeutiques. Le gène étant sur le chromosome X, cette maladie concerne très rarement les femmes. Nous n'étudierons donc que les souris mâles. Nous utiliserons 12 mâles dont le gène d’intérêt est intact et 12 mâles dont le gène est invalidé que nous comparerons.
Bénéfices attendus
Les différents tests d’activité motrice et de neurosensibilité chez la souris permettront de rendre compte de symptômes similaire à ceux des patients atteints de myopathies et d’ainsi confirmer à l’échelle d’un organisme entier ce qui est observé au niveau moléculaire. Les souris analysées constitueront ainsi un modèle murin de myopathie. L’étude de l’activité des souris par test de coordination motrice chaque mois permettra d’observer ou non une différence d’activité en fonction de l’âge de la souris et ainsi de confirmer que nos études à l’âge de 8 mois sont appropriées. Les mesures de neurosensibilité et d’activité spontanée dans la cage sont réalisés avant et après effort sur tapis roulant. Cette décision a été prise car les patients ayant une mutation du gène présentent des douleurs et faiblesses à l’effort. Une fois que l’implication de ce gène dans les myopathies est confirmée, le diagnostic de patients présentant une mutation de ce gène sera facilité et leur prise en charge sera améliorée. Des études plus approfondies permettront de comprendre les mécanismes de la maladie et d’ainsi envisager des nouveaux traitements.
Procédures
Chacune des 24 souris seront soumises à une série de 5 tests au total. De 2 à 8 mois et de manière mensuelle, la coordination motrice des souris sera analysée une fois par mois pendant moins d'une heure sur animal vigile. A 8 mois, des tests de douleur avec exposition au chaud (~1h) et test de mesure d'activité spontanée dans une cage (~24h) seront réalisés avant et après effort sur tapis de course (~1h). Ces trois tests seront réalisés sur animal vigile. A la fin de ces tests, toutes les souris subiront une mesure d'activité contractile sur muscle tibial antérieur dissequé (~1h par souris). L'animal sera anesthésié au préalable. Les muscles seront conservés pour des tests histologiques et moléculaires. Une biopsie de phalanges des souris est effectuée autour du sixième jour de vie dans le but d’analyser l’ADN de l’animal et d’ainsi vérifier la présence ou non du gène d’intérêt. Cette même biopsie servira également à l'identification de l'animal.
Impact sur les animaux
Nous nous attendons à observer un phénotype dommageable après effort sur tapis, de manière similaire aux patients présentant les mutations du gène étudié. En effet, les patients présentent des douleurs musculaires après activité physique. D’anciens travaux préliminaires sur ce modèle animal n’ont relevé aucun phénotype dommageable avant 4 mois. Etant donné que nos tests débutent à 2 mois, nous nous attendons à potentiellement observer des nuisances dès l’âge de 2 mois. Une faiblesse physique et douleur chez la souris pourra mener à une difficulté à se déplacer dans les cages, une difficulté à manger et éventuellement à respirer et une diminution des comportements sociaux et d’exploration. Parmi les différents tests, nous nous attendons à observer des nuisances lors de l’activité sur tapis qui provoque une fatigue de l’animal. La locomotion de la souris après retour dans sa cage risque d’être impactée. Le test de mesure de la douleur qui expose la queue de la souris à une source de chaleur provoque une douleur de très courte durée, égal au temps de réaction de la souris. La mesure d’activité spontanée dans une cage implique un isolement social pendant 24h. La mesure des propriétés contractiles musculaires nécessite une injection d'anesthésique et d'antalgique au préalable. La biopsie des phalanges décrite en 5.6.1 provoque une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette étude afin de procéder à des analyses histologiques et/ou moléculaires.
Remplacement
Afin de limiter les tests sur animaux, des études de l’activité à l’échelle moléculaire et cellulaire sont réalisées sur cellules humaines. L'utilisation d’animaux est cependant indispensable car les symptômes observés chez les patients atteints de myopathies et mécanismes de la maladie ne peuvent être observés et confirmés que dans un organisme entier. En effet, l’ensemble du tissu musculaire en lien avec le système nerveux sont étudiés. Le produit du gène étudié est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire sur la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies.
Réduction
Etant donné que le suivi en fonction de l’âge par test de coordination n’est pas invasif, cela va permettre de réutiliser les souris pour les autres tests et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Chacune des souris subira la totalité des tests au cours de sa vie. Etant donné que le test de force musculaire nécessite l’anesthésie puis la mise à mort de l’animal, les tissus d’intérêt pour analyses histologiques seront prélevés au même moment. Aucun autre animal ne sera donc sacrifié à cet effet. En ce qui concerne les tests avant et après efforts, ceux-ci n’ont de sens pour comparaison statistique que si un même animal effectue les tests avant et après l’effort. Cela réduit encore une fois le nombre d’animaux utilisés. Enfin, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum tout en permettant d'obtenir une puissance statistique suffisante. Nous pouvons affirmer d’après la littérature qu'au total 24 souris seront nécessaires pour conclure sur le projet : 12 souris modèles de myopathie et 12 souris contrôles saines.
Raffinement
Une vigilance accrue aux moindres signes de douleur pendant les tests ou dans la cage sera appliquée grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Les nuisances sur l’animal seront évitées autant que possible et le test arrêté si une des nuisances apparait. La mise à mort de l’animal sera appliquée si la douleur est trop élevée. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage dès l'apparition des premiers signes de difficulté pour se déplacer et notamment après l’activité forcée sur tapis. A partir du sevrage, une perte de poids de 20% en moins de 2 semaines ou une immobilité prononcée conduira à la mise à mort. Le suivi du poids se fera une fois par semaine, voire 1 fois par jour si une baisse de poids est observée. Afin de réduire le stress des souris, celles-ci subiront une habituation à l’environnement du test un jour avant les tests et seront toujours manipulées à l’aide de tunnels. Lors de la mesure de force musculaire, les souris seront profondément anesthésiées à l’aide d’un anesthésique puissant. Afin d’éliminer toute forme d’inconfort et de douleur, une molécule à fort potentiel analgésique sera également administrée accompagnée d’un anxiolytique utilisé pour son fort pouvoir sédatif. L’animal est ensuite déposé sur une plaque chauffée afin d'éviter une hypothermie. Afin de protéger et humidifier l’œil, un gel sera appliqué. Avant de débuter l’opération, l’efficacité et la profondeur de l’anesthésie sont vérifiées par une pression exercée manuellement sur les pattes et la queue. Si le rongeur ne montre aucune réaction, l’opération chirurgicale et le test peuvent être réalisés.
Choix des espèces
La protéine issue de notre gène d’intérêt est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire propres à la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies. Les animaux subiront un test de coordination chaque mois de 2 à 8 mois afin d'obtenir un suivi de l'activité motrice selon l'âge. Cette gamme d’âges permettra d’avoir le plus de données possibles pour conclure, tout en maximisant le temps de repos des souris. Les autres tests moteurs et neurosensitifs seront effectués à l'âge de 8 mois, âge où la souris atteint ses capacités musculaires maximales. Les souris seront sexuellement matures lors de l’ensemble des tests. Elles seront adolescentes de 2 à 3 mois et adultes de 3 à 8 mois jusqu’à la fin des tests.
Acquisition et maintien de compétences techniques sur le rongeur
- Formation professionnelle
Rats : 400
Hamsters dorés : 180
Autres rongeurs : 550
Recrutés autant que possible parmi des rongeurs de réforme, 1 930 rongeurs, 800 souris, 400 rats, 180 hamsters dorés et 550 autres rongeurs, vont être utilisés pour former doctorants et personnels de laboratoire, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Les apprenants les saisissent, les contiennent, leur font une injection, parfois par gavage avec un risque de fausse route, deux prises de sang par session, notamment à la queue par coupe ou incision, et un frottis vaginal pour les femelles. Sur ce total, 1 000 sont déclarés réutilisés, le porteur annonçant la réutilisation des rongeurs sans dommage et la mise à mort de ceux qui atteignent un point limite, alors que les procédures prévoient aussi une prise de sang terminale sous anesthésie. Il écarte toute méthode de remplacement, ces gestes exigeant selon lui "un organisme dans sa globalité".
Objectifs
Le projet vise à répondre à la réglementation française sur l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques ou éducatives qui par l'arrêté du 1er février 2013 oblige à ce que tout personnel des établissements utilisateurs qu'il soit personnel de recherche ou étudiant soient formés aux gestes et déclaré compétent pour les gestes qu'il aura à réaliser ultérieurement dans le cadre de ses activités scientifiques. L'objectif est donc de former aux gestes de bases employés en expérimentation animale sur rongeurs comme la préhension, la contention de l'animal mais également l'administration de substances et le prélèvement de sang sur animal vigile. Une partie de cette formation consistera à délivrer la partie pratique de la formation intiale niveau concepteur aux étudiants en première année de thèse : préhension, contention, injections élémentairtes et la formation dans son ensemble s'adressera aux personnels de laboratoires ou personnels zootechniques dans le cadre de leur formation lors de leur recrutement ou du maintien des compétrences tout au long de leur carrière.
Bénéfices attendus
La phase pratique des séances de formations en expérimentation animale permet aux personnes d'appréhender les grands principes de manipulation et d'avoir un premier enseignement des bonnes pratiques zootechniques lors de l'utilisation d'animaux. Selon les besoins en rapport avec les projets de recherche développés ensuite dans les laboratoires, l'apprentissage des gestes réalisés avec un tuteur technique puis validé par un membre de la cellule du bien-être animal permettra de garantir la compétence acquise et au personnel ou étudiant formé de devenir autonome dans ces pratiques expérimentales. Concernant la formation continue des personnels déjà en poste le bénéfice sera de garantir le niveau des compétences requises en lien avec leurs missions zootechniques ou expérimentales. La formation continue permettra également de créer une dynamique en contribuant à faire évoluer les pratiques en expérimentation animale en tenant des évolutions éthiques notamment en terme de raffinement et donc d'inclure les méthodes alternatives développées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une préhension et contention qui ne durera pas plus de 5-10 minutes le temps de réaliser les injections (durée 1 minute). Ils seront également soumis à deux prélèvement sanguins sur animal vigile ou anesthésié qui ne dureront pas plus de 15 minutes, à un frottis vaginal (animaux femelles uniquement) sur animal vigile d'une durée de 2 minutes . Ils seront soumis sous anesthésie/analgésie à un prélèvement sanguin terminale d'une durée de 5 minutes. Chaque animal ne pourra subir qu'un type d'injection et deux prélèvements sanguins au cours de chaque session de formation. Les animaux seront soumis sous anesthésie/analgésie à un prélèvement sanguin terminale d'une durée de 5 minutes
Impact sur les animaux
La préhension et la contention peuvent provoquer un stress ponctuel pour l'animal. Les injections pourraient provoquer un saignement, un hématome, une inflammation. L'administration par voie orale (gavage) pourrait provoquer une fausse route. Le prélèvement sanguin à la queue (coupe ou incision) pourrait conduire à une inflammation . Les prélèvements sanguins pouraient entrainer une douleur aigue , un hématome.
Devenir
A l'issu des procédures les animaux seront soit réutilisés si aucun dommage n'a été observé, soit mis à mort si les points limites ont été atteints.
Remplacement
La formation intègre des gestes techniques en lien avec l'expérimentation animale qui ne peuvent être réalisés que sur animal vivant entier car ces gestes nécessitent un organisme dans sa globalité (système cardio-vasculaire fonctionnel et intègre, cerveau...).
Réduction
Aucune analyse statistique ne sera réalisée car il s'agit de formation. Le nombre d'animaux/procédure a été estimé en fonction du niveau des apprenants et des attendus des tuteurs. Pour les formations spécifiques réglementaires, il s'agit d'une initiation aux gestes et donc il n'y a donc aucune validation des gestes. Un seul animal/apprenant suffit donc à cette initiation aux gestes. Pour l’acquisition de nouvelles compétences techniques ou la formation initiale et continue des personnels de laboratoire ou zootechniques, les gestes enseignés pourront faire l'objet d'une validation de la part des tuteurs. Nous avons alors évalué le nombre d'animaux/apprenant à N=2. Il s’agira autant que possible d’animaux de réforme. Un maximum de trois gestes seront réalisés sur un même animal réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Lorsque cela sera nécessaire, pour des raisons liées aux gestes réalisés ou à l'espèce manipulée, les animaux seront anesthésiés pour limiter le stress, la souffrance ou l'inconfort. Tous les animaux utilisés seront au préalable habitués à la préhension et contention avant chaque session de formation afin de limiter le stress lorsque ces gestes seront réalisés par les apprenants. En alternative à la préhension par la queue ou le corps , pour la souris ou le rat, la méthode du tunnel qui consiste à apprendre à l'animal à entrer de façon volontaire dans le tunnel intégré en tant qu'enrichissment dans la cage sera proposée ce qui permet de sortir les animaux de leur cage sans les manipuler au risque de les stresser. Les animaux seront maintenus en groupe dans des cages enrichies avec le matériel dédié à chaque espèce leur permettant ainsi d'exprimer des comportements naturels comme ronger et nidifier. Pour limiter la souffrance animal des points limites prédictifs ont été définis pour chaque procédure du projet.
Choix des espèces
Le rat et la souris seront les espèces animales prinicpalement utilisées dans le cadre de la formation pratique incluse dans la formation des étdudiants puisque ces deux espèces sont les plus manipulées et utilisées dasn les projets de recherche scientifiques. D'autres espèces de rongeurs plus spécifiques des domaines de recherche ciblés par les apprenants seront également utilisées afin de former les étudiants et personnels impliqués dans les projets de recherche. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte à partir de 3 mois. Selon les gestes enseignés, nous pourrions être amenés à affiner notre choix en prenant également en considérant le poids et le sexe de l'animal.
Etude transcriptionnelle des stades de la spermatogenèse par synchronisation chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Un médicament proposé à la bouche avec une pipette chaque jour, dès le lendemain de la naissance et jusqu'au huitième jour de vie : 105 jeunes souris mâles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées entre 70 et 84 jours par surdose d'anesthésique suivie d'une perfusion de fixateur histologique, pour prélever les testicules. Le blocage puis la relance de la différenciation des spermatogonies servent à synchroniser la spermatogenèse et à lire jour après jour les gènes exprimés, les retombées annoncées sur l'infertilité humaine et sur un contraceptif masculin restant au conditionnel. Le porteur affirme que seule une approche expérimentale sur des animaux répond à ces questions, la souris partageant selon lui 99 % d'identité de gènes avec l'être humain et les mécanismes de l'acide rétinoïque étant conservés dans le testicule.
Objectifs
La spermatogenèse décrit le processus de production des spermatozoïdes à partir des spermatogonies. Il se déroule dans les tubes séminifères du testicule, débute à la naissance et se poursuit jusqu'à l'age adulte. Il s'agit d'un processus asynchrone permettant une production continue de spermatozoïdes. Le fait que ce processus soit asynchrone rend son etude difficile. En synchronisant les testicules des animaux avec 2 médicaments on s'assure de pouvoir étudier précisément chaque étape de la spermatogenèse. Les testicules des animaux traités servent à réaliser des analyses qui permettent de mettre en évidence les gènes exprimés.
Bénéfices attendus
Dans la mesure où les médicaments utilisés ici agissent sur la différenciation des spermatogonies de la même manière chez l'homme et chez la souris, il est logique de penser que les mécanismes régissant la spermatogenèse qui sont découverts dans ce projet sont pertinents pour l'Homme. Ainsi, en identifiant les gènes nécessaires à la différenciation des spermatogonies, nous obtiendrons des pistes pour évaluer des cas d'infertilité Humaine, qui sont en augmentation constante dans le monde. De plus, la possibilité de perturber temporairement la signalisation de l'acide rétinoïque représente également une stratégie pour développer de nouveaux contraceptifs masculins non chirurgicaux.
Procédures
Toutes les interventions décrites ci-dessous nécessitent d’immobiliser les souris avec la main (contention non traumatisante de 20 à 30 secondes). L'administration de médicament pour bloquer la différenciation des spermatogonies est réalisée quotidiennement de l’âge de 2 jours jusqu'à l'âge de 8 jours. L'administration de médicament pour rétablir et synchroniser la différentiation des spermatogonies est réalisée 1 fois à l’âge de 8 jours. L'administration d’anesthésique/analgésique en dose létale pour perfuser un fixateur histologique (étape finale de mise à mort) est réalisée entre l’âge de 70 jours et 84 jours. Les souris sont sous anesthésie générale profonde en moins de 5 minutes. La perfusion qui dure 10 minutes résulte en la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Il y a une nuisance liée au fait que les souriceaux sont manipulés à partir du jour suivant leur naissance. Ils reçoivent quotidiennement un médicament par voie orale (à l'aide d'une pipette). La pointe de la pipette est proposée à la bouche du souriceau jusqu'à ce qu'il commence à boire. En ce qui concerne l'administration du 2ème médicament ou d’anesthésique, la douleur est similaire à celle provoquée par l'introduction d'une aiguille sous la peau.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvements de tissus en vue d'analyses
Remplacement
La spermatogenèse est un processus complexe qui fait intervenir plusieurs types cellulaires du testicule. Les interactions entre les cellules somatiques et des cellules germinales sont essentielles pour assurer une production continue de spermatozoïdes. Notre étude vise à examiner le profil d’expression des gènes impliqués dans la spermatogenèse dans un contexte physiologique où ces interactions cellulaires sont préservées. Il est important de souligner que seule une approche expérimentale impliquant des animaux permet de répondre à ces questions. Le remplacement par un système in vitro (1er R de la règle des 3R) est impossible.
Réduction
Dans le cadre de ce projet, nous ferons usage de souris issus d'un fond génétique mixte. Étant donné que notre étude se concentre sur la spermatogenèse, seuls les mâles (statistiquement, représentant la moitié des naissances) sont employés dans les expériences. Nous réalisons une analyse des testicules jour après jour pendant deux cycles complets de spermatogenèse, s'étalant sur une période de 15 jours. Le nombre d’animaux est calculé de manière à respecter les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés, tout en garantissant la qualité et la robustesse statistique des résultats obtenus. Le projet est arrété dès que nous obtenons 3 animaux dont le testicule contient 1 des 12 stades du cycle de l'épithélium séminifère.
Raffinement
Toutes les mesures requises sont mises en place pour assurer le bien-être des animaux. Un nid de coton ou un nid végétal est ajouté dans chaque cage pour diminuer le stress de l’animal et faciliter la thermorégulation de l’animal, comme cela est fait dans toutes les cages. Nous surveillons régulièrement le bien-être et l’état de santé des animaux et nous apportons des soins appropriés en cas de besoin, notamment l'administration d'analgésiques. Toute modification de leur comportement indiquant une souffrance ou de l'anxiété est immédiatement signalée aux responsables de la structure du bien-être animal (SBEA) afin de prendre les mesures correctives nécessaires. Les manipulations et les traitements sont effectués par un expérimentateur qualifié afin de minimiser toute perturbation potentielle pour les animaux. Nous appliquons le principe du raffinement (troisième "R" de la règle des 3R) dans notre projet en optimisant les conditions de travail avec les animaux.
Choix des espèces
Notre étude vise à identifier les gènes exprimés lors de la spermatogenèse dans un système physiologique, notamment dans ses fonctions paracrines (entre les différents types cellulaires du testicule) et endocrines (dans l'organisme entier). Seule une approche expérimentale avec des animaux permet de répondre à ces questions. D’autre part la souris possède 99% d’identité de gènes avec l’Homme, et les mécanismes cellulaires à l’œuvre et impliquant l’acide rétinoïque dans le testicule de souris sont conservés dans le testicule de l’Homme. Dans ce projet, nous utilisons des souris mâles provenant d'un fond génétique mixte. Pour couvrir la totalité des stades de la spermatogenèse nous prélevons les testicules tous les jours à partir de l'age de 70 jours, pendant 15 jours.
Etude des effets cardiovasculaires de l’infection au Sars- Cov2 dans des modèles murins EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système respiratoire
Modifiées par transgénèse pour exprimer le récepteur humain du SARS-CoV-2, les souris de ce projet sont rendues infectables par un virus qui provoque chez elles une maladie pulmonaire et parfois intestinale. 1 680 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 562 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un prélèvement caudal pour génotypage, des administrations intranasales sous anesthésie, jusqu'à trois semaines d'hypoxie chronique, une chirurgie du cou avec injection intratrachéale et jusqu'à cinq injections intrapéritonéales. Le porteur indique que les conséquences peuvent aller de la perte de poids et de la diarrhée à l'affaiblissement, la malnutrition puis la mort, et que la mise à mort finale sert à mesurer la pression pulmonaire sous anesthésie avant de prélever les tissus.
Objectifs
L’objectif de notre recherche est de mieux comprendre les altérations vasculaires et cardiaques liées à l'infection au SARS-Cov2. Nous allons utiliser des modèles murins (des souris transgéniques exprimant le récepteur humain du virus) afin de pouvoir suivre in vivo les effets de l'infection et de l'inflammation induite par cette infection. Notre but est d'augmenter les connaissances sur les conséquences au long cours du Covid19 pour améliorer la prise en charge des patients. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2) car des étapes ne peuvent pas être réalisées dans l'établissement d'origine et nécessite l'utilisation d'un établissement secondaire. Aucun animal supplémentaire n'est ajouté par rapport au projet principal déjà autorisé 1/2.
Bénéfices attendus
Ces études nous permettront d’évaluer au long cours les altérations de la fonction cardiovasculaire à la suite d’une infection au SARS-Cov2. Nous utiliserons 2 lignées de souris afin de déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets. Les résultats serviront à mieux comprendre été prévenir les conséquences pulmonaires, vasculaires et cardiaques du Covid19.
Procédures
Chaque animal sera soumis une seule fois dans sa vie à un prélèvement caudal pour génotypage (EU1). Cet acte ne dure que quelques secondes. Certaines souris seront soumises à une administration intra-nasale sous anesthésie pendant 15 minutes (EU1). Certaines souris recevront dans l’eau de boisson un anti-hypertenseur pendant 10 jours (EU1). Certaines souris seront étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie pendant 20 minutes (EU2). La pression artérielle sera aussi mesurée à la queue sur animaux vigiles (procédure indolore) après accoutumance à la contention pendant 5 jours (EU2). Certaines souris seront en plus soumises à une hypoxie chronique pendant 3 semaines avant l’étape finale (EU2). Pour les procédures chirurgicales sous anesthésie, la douleur sera évitée par l’administration d’anesthésiques et d’analgésiques (EU2). Certaines souris subiront une petite chirurgie au niveau du cou comprenant une anesthésie et une analgésie pendant 15 minutes et une injection intra-trachéale avant l’étape finale (EU2). Certaines souris recevront 1 à 5 injections intrapéritonéales (1 par jour) ou administrations intranasales sous anesthésie générale pendant 15 minutes avant l’étape finale (EU2). Pour toutes les souris, l’étape finale sera une procédure chirurgicale effectuée sous anesthésie avec analgésie pendant 15 minutes avant l’euthanasie (EU2).
Impact sur les animaux
Le transport des animaux entre les 2 sites peut engendrer une anxiété temporaire. L’infection induit une maladie pulmonaire et chez certains animaux une maladie intestinale avec des conséquences qui peuvent être très sévères selon la lignée murine: les plus forts sont la perte de poids, la diarrhée, l’affaiblissement allant jusqu’à la malnutrition puis la mort. les souris seront soumises à un stress hypoxique. L'hypertension pulmonaire induite par l’hypoxie chronique est modérée chez la souris normale mais pourrait être sévère chez les souris post infection induisant un stress physique. Un stress (peur ou détresse) des animaux est possible lors de l’acclimatation à la prise de pression systémique vigile. L’anesthésie peut induire des effets tels que l’hypothermie, des difficultés respiratoires ou dans les cas les plus critiques un arrêt cardio-respiratoire. La procédure chirurgicale peut également être source d’hémorragie ou de douleur post-opératoire. Les procédures d’injection peuvent potentiellement conduire à des infections.
Devenir
Les 1680 animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés en fin d’expérimentation à l’issue d’une mesure de la pression pulmonaire sous anesthésie dans l'EU2. Les animaux sont utilisés à des fins expérimentales qui nécessitent leur euthanasie afin de pouvoir mesurer leurs paramètres hémodynamiques et étudier les tissus. Ce projet est multisite, aucun animal supplémentaire n'est ajouté par rapport au projet 1/2.
Remplacement
Pour comprendre les conséquences au niveau de la fonction et de la structure des vaisseaux pulmonaires de l’infection au SARS-Cov2, il est nécessaire d’infecter des animaux afin d’être dans les conditions les plus proches des patients et afin de conserver l’ensemble des phénomènes intervenants dans la régulation des vaisseaux pulmonaires : inflammatoires (interactions cellules immunes et cellules vasculaires), vasculaires (interactions des cellules vasculaires entre elles), respiratoires (hypoxie locale) et éventuellement nerveux. Les études in vitro ne permettent pas d’évaluer les conséquences de façon intégratives. De plus, la régulation de la pression artérielle pulmonaire ou systémique et de la fonction cardiaque ne peuvent être évaluées qu'in vivo. Cependant, une fois ces conséquences tissulaires et cellulaires identifiées in vivo, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture (cellules vasculaires en culture) infectées ou non.
Réduction
1680 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Ces expériences n'ont jamais été réalisées ni en France, ni dans le monde, par d'autres équipes dans un protocole expérimental semblable.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Le poids des animaux est suivi tout au long des procédures. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum et une température et hygrométrie constantes. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l'espèce concernée dans les 2 établissements utilisateurs. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée et le poids des animaux sera mesuré régulièrement. Les points limites seront évalués selon une grille de suivi. Après infection, les souris seront observées quotidiennement et pesées tous les jours pendant 1 semaine, puis toutes les semaines. La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémique au cours de la procédure finale. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20 pour cent de perte de poids. Une perte de sang importante, des signes de souffrance (prostration, poil hérissé, yeux fermés) qui se maintiennent, une prostration, une incapacité à se déplacer, des yeux larmoyants et exorbités constituent également des points limites. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème antibiotique.
Choix des espèces
Nous effectuons des expériences avec des souris modifiées par transgénèse afin d’humaniser les souris pour en faire un modèle d’étude de l’infection au SARS-Cov2 dont la pertinence a été démontrée comme modèle pour étudier les effets liés au Covid19. Ces modèles de souris sont plus connus et plus facilement utilisables pour des études in vivo et pour les analyses d’organes que les autres modèles animaux existants (e.g. furet). Les études sur les effets de l’infection au SARS-Cov2 seront effectuées au stade adulte, lorsque le développement pulmonaire, vasculaire et cardiaque est fini, après l'âge de 8 semaines. Les études sont débutées sur des animaux à l’état adulte (2-5 mois) mais pas âgé permettant une étude au long cours sur plusieurs mois afin d'éviter d’avoir des effets liés à l’âge en fin d’étude.
Ventricule droit et insuffisance cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
Pendant le test d'effort, les rats reçoivent des chocs électriques, l'épreuve étant arrêtée au bout de trois chocs en trente secondes ou de cinq chocs en une minute. 210 rats Wistar mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection unique déclenche chez eux une insuffisance cardiaque droite qui peut entraîner leur mort, puis un traitement est initié quatre semaines plus tard pendant dix ou soixante jours, avec IRM et échocardiographie sous anesthésie, mesure de la fonction rénale, test d'effort sur animal vigile, et enfin un cathétérisme cardiaque de vingt minutes sans réveil dont le porteur indique que l'animal peut mourir pendant l'examen. Les rats perdant plus de 15 % de leur poids sont tués, et le porteur retient de jeunes adultes de 200 à 220 grammes pour leur "meilleure résistance à la toxicité de la molécule".
Objectifs
Malgré des améliorations thérapeutiques majeures sur les 30 dernières années, l’insuffisance cardiaque (IC) reste associée à une mortalité et un taux de réhospitalisation à 1 an élevés. Les traitements actuellement disponibles sont efficaces pour améliorer la fonction ventriculaire gauche. Aucune thérapeutique n’a démontré son efficacité pour améliorer la fonction ventriculaire droite dans l’IC. Les gliflozines (ou SGLT2 inhibiteurs) sont des traitements qui ont récemment prouvé leur efficacité, administré seul ou en association avec des traitements classique de l’IC, pour réduire la mortalité cardiovasculaire et/ou le risque d’hospitalisation pour IC. L’effet sur la fonction ventriculaire droite de cette classe thérapeutique n’a jamais été étudié. Étant donné les mécanismes d’action connus de cette classe thérapeutique, nous faisons l’hypothèse que les gliflozines ont un effet bénéfique sur la fonction ventriculaire droite dans l’IC. En utilisant un modèle expérimental de dysfonction ventriculaire droite chez le rat, nous allons étudier si les gliflozines sont capables d’améliorer celle-ci et déterminer les mécanismes impliqués. Cela permettra d’approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués avec l’objectif de développer de nouvelles stratégies pharmacologiques pour améliorer la prise en charge et le pronostic des patients IC.
Bénéfices attendus
Le modèle utilisé et le design expérimental nous permettra d’étudier l’aggravation de la dysfonction ventriculaire droite ainsi que les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la progression de la dysfonction ventriculaire droite afin d’identifier/d’évaluer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les Rat Wistar subiront une injection unique d'une molécule qui entraine une dysfonction du ventrciule droit au J1 de l'étude. Puis 4 groupe aurons quatre semaines après induction de l’IC droite, un traitement sera initié puis mise à mort après 10 jours de traitement et 4 autre groupe aurons quatre semaines après induction de l’IC droite, un traitement sera initié puis mise à mort après 60 jours de traitement .Chaque injection de traitement serais de quelques secondes par animal. L'analyse des effets fonctionnels (IRM et échocardiographie cardiaque) qui sera effectuée sous anesthésie pour une durée de 10 minutes/rat. La fonction rénale sera évaluée sous anesthésie gazeuse 10 minutes/rat maximum pour l'injection du traceur fluorescent suivie d'un test à l'effort qui sera effectué sur les animaux vigiles. Le protocole invasif (cathétérisme cardiaque) sera réalise sur des animaux profondément anesthésiés et sera sans réveil(durée 20 minutes / rats ).
Impact sur les animaux
Les procédures sont classées modère . L'injection de la molécule entrainera potentiellement une dysfonction du ventrciule droit .Les deux procédures mènent à une insuffisance cardiaque. qui peut entraine le décès de l'animal. Les naissances des tests d'effort sont une fatigue de l'animal qui est évalué par des chocs électriques, mais tout cela est prise en compte avec une fiche procédure qui d'écrit les points limite du test. Arrêt du test à l'effort au bout de 3 chocs électriques en 30 secondes ou de 5 chocs électrique en 1 minute. On replace l'animal dans sa cage une fois le test fini ou les points limite définie dans le protocole dépasser. Pour le cathétérisme cardiaque, l'animal subira une chirurgie pour insertion d'un capteur de pression dans la carotide pour obtenir les pressions volume au niveau du coeur du rat, chaque animal sera mise à mort à la fin du test. Il se peut que l'animal décède lors du test ce cathétérisme cardiaque.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque série d’expérimentations suite au cathétérisme cardiaque pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Dans l’objectif de limiter le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous mettrons en place certaines expériences in vitro (tests de prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant, l’utilisation des animaux est rendue nécessaire, car il n’existe pas à ce jour de modèle d’IC in vitro et encore moins de modèle d’IC droite in vitro. Les études fonctionnelles in vivo de notre projet ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro à cause de la complexité de la pathogenèse de l’IC droite. En effet, des études dans notre modèle animal sont nécessaires pour comprendre les altérations globales cardiaques lors du développement de l’IC droite et son traitement (altérations simultanées des lymphatiques, des cellules immunitaires, des fibroblastes et du métabolisme des cardiomyocytes, modifications progressives de l’hémodynamique ventriculaire gauche et droite). Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque droite par échocardiographie, IRM, de la fonction rénale, de la capacité d'exercice. A la phase terminale nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats (n=24 par groupe) nécessaires afin de détecter une différence de 10%. Des résultats historiques obtenues lors des expériences précédemment effectuées dans le laboratoire ont démontré qu’un nombre de 24 animaux par groupe sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie/IRM. Il faut souligner que l’analyse répétée en échocardiographie ou en IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif. Concernant l’induction de l’IC droite, un suivi de la survie post-administration dune sera mis en place afin d’affiner et donc de limiter le nombre d'animaux par groupe.
Raffinement
Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel, Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C , hydrométrie à 55% et luminosité à 100 lux avec une durée de cycle de lumière normal soit 12h/12h). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera observée avant le début des protocoles. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA . Les rats perdant plus de 15 % de leur poids seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les expériences in vivo, ne peuvent pas être remplacées par des études in-vitro, qui nécessite des études fonctionnelles et physiopathologiques sur un modèle intégré. Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous allons dans ce projet utiliser essentiellement des rats, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles. Chaque animal est identifié de façon individuelle par une puce d’identification Les rats mâles Wistar jeunes adultes (200-220 g) seront utilisés pour induire l’IC droite. Cet âge est justifié par la meilleure résistance des animaux à la toxicité de la molécule, permettant de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés.