Rongeurs
Investigation de l’activité antibactérienne d’anticorps polyclonaux dans un modèle murin de sepsis
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Infectées par Pseudomonas jusqu'au sepsis, les souris traversent quarante-huit heures que le porteur décrit comme les plus critiques en douleur et en mortalité, le modèle conduisant à la mort de l'animal en l'absence de traitement. 560 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objet est de tester l'activité antibactérienne d'anticorps polyclonaux contre une bactérie responsable de près de 10 % des infections nosocomiales et souvent résistante aux antibiotiques. Le porteur annonce une analgésie et une surveillance trois fois par jour pendant les deux premiers jours, sans préciser la dose bactérienne administrée, le nombre de groupes, ni le calcul qui aboutit à 560 souris, dont il écrit seulement que l'effectif "doit permettre de faire des analyses statistiques robustes".
Objectifs
Pseudomonas est une bactérie responsable de près de 10% des infections nosocomiales. Les infections à pseudomonas sont en augmentation et sont généralement associées à des résistances aux antibiotiques. Elles représentent ainsi une réélle menace pour la santé publique. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'activité antibactérienne d'anticorps polyclonaux dans un modèle murin de sepsis (réponse inflammatoire généralisée associée à une infection grave).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de valider l'activité antibactérienne des anticorps polyclonaux et de proposer une alternative thérapeutique dans un domaine ou le besoin médical est important. Ce projet pourrait aussi ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de lutte contre les infections bactériennes.
Procédures
Les traitements se feront par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée. Une contention légère sera faite par du personnel qualifié sur les souris pour l'administration des traitements, afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Ces manipulations ainsi que les piqures ne dureront que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères.
Impact sur les animaux
Le modèle utilisé ici conduit à la mort de l’animal en l'absence de traitement. Il s'accompagne d'une l’inflammation locale et systémique, source de douleur et d’inconfort. Il est donc classé comme procédure sévère. Les premières 48 heures qui suivent le challenge bactérien sont les plus critiques en termes de douleur et de mortalité. A partir de 48h, l’état des souris s’améliore avec une chute des nuisances et de la mortalité.
Devenir
Après chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêt pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
Si des tests in vitro permettent d'évaluer l'activité des nouvelles thérapies, les études chez l'animal restent indispensables pour valider leur potentiel thérapeutique dans un environnement physiologique. Ces études permettent aussi de repérer une éventuelle toxicité des traitements et éclairent sur les modes d'action engagés.
Réduction
Le nombre d'animaux prend en compte le besoin de réduction (règle des 3R) et les contraintes statistiques liées au modèle et aux analyses qui seront réalisées. Le nombre d’individus par cohorte doit permettre de faire des analyses statistiques robustes.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 12 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des frisottis sont placés dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Des signes cliniques et points limites ont été définis afin de monitorer objectivement la souffrance des animaux au cours du modèle. La douleur sera évitée par injection d'analgésiques en fonction des signes cliniques observés ou en euthanasiant les animaux. Les premières 48h qui suivent le challenge bactérien sont les plus critiques en termes de douleur et de mortalité. Une attention particulière sera donc apportée durant cette période avec une surveillance des souris 3 fois par jour. Cette surveillance pourra être renforcée avec augmentation de la fréquence des passages si besoin. Une analgésie sera aussi appliquée 3 fois par jour durant les 48 premières heures du modèle (la première injection sera réalisée 15 minutes avant le challenge bactérien). A partir de 48h environ, l’état des souris traitées doit s’améliorer. L'analgésie sera alors décidée en fonction de l'état des animaux en prenant en compte les éléments suivants: morphologie générale, poids, paupières, aspect des larmes, aspect de la zone urogénitale, apathie, comportement en groupe, activité de la respiration.
Choix des espèces
Le modèle de sepsis décrit dans ce projet a été validé et caractérisé dans des publications. Nous travaillerons avec des souris femelles (les souris femelles étant plus légères elles permettent d'utiliser moins d'anticorps).
Evaluation par imagerie IRM de la fonction cérébrale d’un modèle murin du syndrome Cornelia de Lange
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Rendues haplo-insuffisantes pour le gène Nipbl, les souris de ce modèle reproduisent selon le porteur les symptômes du syndrome de Cornelia de Lange, dont des comportements auto-agressifs. 18 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien pendant trois semaines, à partir du sevrage, d'une molécule déjà en essai clinique en cancérologie, puis passent deux heures sous anesthésie gazeuse pour une imagerie cérébrale, à l'issue de laquelle elles sont tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur affirme réduire le nombre d'animaux "au minimum permettant de répondre à la question scientifique" tout en reconnaissant l'absence de données préliminaires sur la taille d'effet attendue, et présente un éventuel effet du traitement comme la première piste thérapeutique pour des enfants qui n'en ont aucune.
Objectifs
Le syndrome de Cornelia de Lange est une maladie rare du développement qui affecte plus de 9000 enfants en Europe, 30 000 aux Etats Unis. Il s’agit d’un retard de développement de la croissance accompagné de défaut de formation du cerveau, du système auditif, du cœur et d’une partie du système digestif. la cause génétique de ce syndrome est une insuffisance du gène nommé Nipbl. Il en résulte des problèmes d'expression de nombreux gènes. Les enfants souffrant de ce syndrome sont de plus petite taille que la normale, marchent très tardivement , doivent subir des interventions chirurgicales réparatrices, ne parlent pas ou parfois très tardivement, et ont des comportements auto-agressifs. Il n’y a aucune piste thérapeutique à ce jour. Avec un modèle de souris haplo-insuffisant pour le gène Nipbl, qui récapitule les symptomes des patients, nous avons trouvé que le syndrome induisait un arrêt de la prolifération cellulaire embryonnaire prématurée. Des cellules sénescentes ( en arrêt de prolifération) ont été identifiées dans tous les organes au cours du développement y compris dans le cerveau des nouveaux nés. Le traitement des souris gestantes par une molécule en essai clinique en oncologie permet la naissance de souriceaux de taille normale sans malformation cardiaque sans cellule sénéscente y compris dans le cerveau. Notre projet va étudier si le traitement des souris au sevrage et au cours de la maturation du cerveau peut prevenir ou limiter la sénéscence dans le cerveau et les effets fonctionnels tels que l 'agressivité .
Bénéfices attendus
Un effet positif du traitement sur le fonctionnement neuronal serait un atout majeur et permettrait d’apporter pour la première fois une piste thérapeutique pour les patients qui n’en ont aucune jusqu ‘aujourdh’ui. ce projet ouvrirait les discussions avec les cliniciens qui s 'ocupent des enfants affectés par le syndrome afin d'évaluer l 'utilisation du médicament.
Procédures
Les souris seront traitées avec le médicament pendant 3 semaines par un gavage quotidien durant 15 secondes . Elles seront ensuite anesthésiées pour un examen d'imagerie cérébrale de 2 heures . elles seront mises à mort à la fin de l 'examen
Impact sur les animaux
La prise du médicament par gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiquée par un expérimentateur très habitué. Le processus ne prend que 30s . Examen clinique par IRM sous anesthésie gazeuse : la seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque le vetflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.
Devenir
Les souris seront mise à mort à la fin du protocole d'imagerie pour collecter les cerveaux à des fins d'histologie
Remplacement
Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. L’étude de l’impact de la délétion de Nipbl sur le développement cérébral et l’éventuelle correction de ces anomalies par le traitement nécessite de recourir à l’animal car il n’existe aucune alternative. Il n’est pas possible d’obtenir ces informations par les organoides qui ne peuvent rendre compte du développement, de la maturation et du fonctionnement d’un organe aussi complexe que le cerveau. Il n’existe pas non plus de modèle informatique de la maladie.
Réduction
Le recours à l’animal étant incontournable, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum grâce à l’utilisation de méthodes non-invasives d’Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM) et de Spectroscopie à Résonnance Magnétique (SRM). Ces méthodes avancées permettent de réaliser des explorations couvrant la totalité du cerveau et d’obtenir un grand nombre d’informations quantitatives dans le cadre d’un examen clinique sous anesthésie générale. Le caractère non invasif de l’exploration rend possible la réalisation d’examens répétées sans dommage pour l’animal. En l’absence de données préliminaires permettant de connaitre la "taille d'effet" attendue et compte-tenu de notre expérience en IRM préclinique, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum permettant de répondre à la question scientifique
Raffinement
Le raffinement concernera la diminution du stress par l’utilisation d’une anesthésie légère lors de l’IRM. Les animaux étant hébergé dans le même bâtiment que celui où sera réalisé l’imagerie, le délai d’acclimatation ne sera que de 2 à 3 jours, une habituation à l'expérimentateur sera assurée lors de l’arrivée des animaux. Pendant les sessions d’imagerie, les animaux seront plongés sous anesthésie gazeuse afin d’éviter tout stress. Ils bénéficieront d’un monitorage physiologique continu (t° rectale, respiration) avec un système dédié au rongeur permettant d’adapter immédiatement l’anesthésie afin d’éviter toute situation de détresse cardio-respiratoire. Les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en plexiglas, cartons à ronger, fast-track, balançoires). Des points limites adaptés et précoces seront mis en place pour la procédure . Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage.
Choix des espèces
la souris peut être facilement modifiée génétiquement. Notre modèle murin récapitule parfaitement le phenotype des patients. elle est un bon modèle de biologie du développement, un avantage pour une pathologie du développement . Les souris seront traitées post-sevrage (3 semaines) lors de la maturation du cerveau qui persiste jusque 3 mois chez les rongeurs.
Prélèvement des tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) et gestion des mutations entrainant des nuisances chez des modèles animaux génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
Poissons zèbres : 12500
162 500 animaux non-humains vont être utilisés pour un seul geste chacun, trois millimètres de queue ou d'oreille coupés en cinq secondes chez 150 000 souris vigiles, quatre millimètres carrés de nageoire caudale prélevés sous anesthésie chez 12 500 poissons zèbres. Les procédures sont déclarées légères pour 156 750 d'entre eux et modérées pour 5 750, ce dernier niveau correspondant aux lignées dont les mutations provoquent, selon le porteur, "des douleurs, de l'inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités". Le projet relève de la gestion d'élevage, identifier génétiquement les animaux produits et repérer les lignées dont les mutations nuisent, pour constituer les lots destinés à d'autres projets. Le porteur écarte la pommade anesthésiante, qui allongerait l'intervention et pourrait gêner le génotypage, ainsi que l'analgésie par injection, et estime à 60 000 les animaux gardés vivants sur cinq ans pour renouveler les reproducteurs ou partir en expérimentation, les autres étant tués quand leur combinaison de gènes ne sert ni à l'élevage ni aux expériences.
Objectifs
L'établissement utilisateur est constitué de deux instituts de recherche qui s’intéressent à différents domaines (neuroscience, cardiologie, génétique, physiologie, cancérologie,...). Dans le cadre des projets utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à des demandes d’autorisation de projet), des modèles animaux précliniques génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important de détecter et gérer les pathologies induites par les mutations dans les élevages (appelé phénotypes dommageables) de ces modèles et de bien caractériser génétiquement les animaux produits (appelé : le génotypage). L’ensemble permet un élevage adapté pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et optimisée aux besoins des scientifiques de ces instituts.
Bénéfices attendus
Pour le bénéfice direct, ce projet permet d'optimiser la gestion et l’élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des chercheurs pour les expérimentations qui seront faites à l'issue de ce projet. Il permet également de prendre en charge rapidement et donc de minimiser les souffrances qui pourraient être induites par les mutations des modèles animaux. Il y a également un bénéfice indirect, car les modèles précliniques génétiquement modifiés permettent de reproduire chez l’animal des pathologies humaines. Ce projet permet la caractérisation génétique ces modèles qui sont ensuite utilisés sur des projets dont l’objectif est la compréhension ou le traitement de ces pathologies et pour notre établissement dans de nombreux domaines (neuroscience, cardiologie, génétique, physiologie, cancérologie, …)
Procédures
Les souris vigiles seront prélevées d’un petit bout de tissu à l’oreille ou à la queue (3mm maximum de tissu), l’intervention dure 5 secondes et se fait une seule fois par animal. Les poissons subiront une anesthésie par balnéation suivie d’un prélèvement d’une portion de 4mm² (5% maximum) de la partie cartilagineuse de la nageoire caudale, capable de régénération complète en 20 jours. Des mutations chez des souris génétiquement modifiées peuvent entrainer des nuisances (phénotype dommageable) durant l’élevage chez l’animal. Elles apparaissent à différents temps de la vie de l’animal et sont directement pris en charge. Il y a également une procédure spécifique pour évaluer le bien-être des animaux lors de la création d'une lignée génétiquement altérée. Elle est non invasive et est basé sur l’observation de paramètres zootechniques et physiologiques en élevage.
Impact sur les animaux
Les nuisances lors d'un prélèvement de tissu pour le génotypage sont essentiellement du stress léger lors de la contention, de la pêche par épuisette ou de la sédation (poisson) et de la douleur légère lors de la coupe du tissu. En fonction du modèle de pathologie, les mutations entrainant un phénotype dommageable, induisent en général et à des degrés divers, des douleurs, de l’inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités selon le génotype. La procédure d'évaluation du bien-être des animaux est sans douleur sauf si un phénotype s'avère dommageable par cette évaluation. Cette demande de projet traite ces nuisances pour en minimiser aux maximum les souffrances animales.
Devenir
Les procédures d'évaluation et de gestion des phénotypes dommageables s'appliquent durant toute la vie des animaux. Les animaux pourront être mis à mort en élevage pour la gestion de la colonie ou bien partir en utilisation continue en expérimentation. Pour les procédures de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique des animaux le devenir peut-être soit la mise à mort car la combinaison de gènes n’est pas utilisable pour les expérimentations et l’élevage, soit les animaux sont gardés en vie pour renouveler les reproducteurs en élevage ou sont utilisés sur des projets expérimentaux prévus pour ces animaux (estimé à 60000 animaux sur 5 ans).
Remplacement
Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement altérés pour des projets scientifiques . Les modèles animaux sont justifiés par la nécessité de caractériser des mécanismes ou pathologies complexes qui font intervenir plusieurs grands systèmes biologiques entre eux (en neuroscience, cardiologie, oncologie par exemple). Les chercheurs des instituts développent ces modèles le plus souvent après avoir testé leurs hypothèses sur des systèmes moléculaires et cellulaires et justifié le remplacement dans leurs demandes d’autorisation de projet expérimentaux. Dans l’institut nous encourageons l’utilisation de modèles alternatifs. Par exemple une équipe a mis en place des organoïdes intestinaux qui leurs a permis de développer et consolider leurs hypothèses avant le passage sur leurs modèles de souris génétiquement modifiées. Des modèles cellulaires sont également utilisés. Enfin les projets des instituts explorent les mécanismes de pathologies complexes faisant intervenir de nombreux tissus et interactions cellulaires, le recours à l’animal dans son ensemble est indispensable.
Réduction
Les animaux produits, issus de ce projet, et utilisés en expérimentation font tous l’objet d’une analyse statistique pour permettre la détermination des lots expérimentaux et l’analyse des résultats. Chaque chercheur a défini ses outils et échantillons pour ses expérimentations qui sont évalués indépendamment. L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages et à limiter la surproduction d’animaux non utilisés dans les projets scientifiques. Pour cela, les chercheurs définissent et mettent en place les accouplements avec les zootechniciens pour des objectifs de production adaptés aux projets scientifiques. La production est suivie avec des rapports trimestriels avec des indicateurs de productivité adaptés. Chaque trimestre, la production peut donc être revue et réajustée. Elle sera réduite au strict besoin, limitant le nombre de prélèvements de tissus pour génotypage. Nous cherchons au maximum à optimiser les schémas d’accouplements (mutations portées par les parents) pour réduire le génotypage ou éviter l’apparition d’un phénotype dommageable. Nous favorisons les élevages qui fournissent 100% d’animaux utiles ce qui permet de réduire le nombre d’animaux à produire d’une part et d’autre part permet de ne pas génotyper tous les individus. Pour le génotypage en gestion de colonie, nous recherchons systématiquement les lignées non ou peu utilisées. La production de ces lignées est soit fortement réduite, soit arrêtée. Elles sont en parallèle sécurisées par cryoconservation des gamètes ou des embryons. Il est compliqué d’apprécier l’impact de ces mesures sur la réduction mais il est aisé de comprendre qu’elles concourent toutes à l’optimisation de la production aux seuls animaux qui seront utilisés dans les projets scientifiques ou en gestion de colonies et donc de réduire le nombre d’animaux à génotyper ou exprimant le phénotype dommageable. Enfin, nous cherchons à améliorer nos pratiques. Tout d’abord, si le prélèvement invasif est indispensable, nous nous orienterons vers la coupe à l’oreille par rapport à la coupe de queue plus douloureuse et nous sommes en cours de mise au point de la technique de prélèvement de follicule de poil considérée sans douleur que nous espérons pouvoir mettre progressivement en place dans les années à venir. La procédure d'évaluation du bien-être des animaux est basée sur les recommandations du guide Européen sur les animaux génétiquement altérés soit 14 animaux sur 2 générations.
Raffinement
Les techniques de prélèvement de tissus pour le génotypage sont effectuées en routine et le geste est très court et précis. La douleur est légère. Le raffinement est de s’assurer d'un process cadré et éprouvé, appliqué par des zootechniciens expérimentés pour réduire le stress des animaux, l’intensité et la durée de la douleur induite. L’utilisation de pommade anesthésiante n’est pas envisagée pour éviter une intervention plus longue et le produit pourrait interférer avec la technique de génotypage. L’analgésie par injection n’est aussi pas recommandée car la piqûre augmente la nuisance sur l’animal. Toutefois, les éléments suivants sont mis en place : manipulation par un zootechnicien expérimenté, le poste de prélèvement est codifié et préparé en amont pour éviter les gestes parasites pendant le prélèvement pour réduire le stress des animaux. L’animal est pris en contention et la biopsie est rapidement et précisément effectuée avec un matériel désinfecté et aiguisé pour réduire le temps et intensité de douleur. L’animal, remis dans sa cage est observé. En cas de mauvaise reprise de l’activité ce qui constitue le principal point limite, il sera pris en charge. Les observations quotidiennes permettent de s’assurer de la bonne cicatrisation. En cas de mauvaise cicatrisation (point limite) des pommades cicatrisantes peuvent être utilisées. Chez le poisson un raffinement particulier est apporté aux conditions d’isolement maintenues dans le système d’hébergement en circulation, maintenant des paramètres d’eau stables. Le point limite est de s’assurer de la bonne nage des poissons. Pour le raffinement des phénotypes dommageables, les lignées sont aujourd’hui bien connues et le phénotype bien caractérisé. La stratégie de raffinement est de mettre en place le plus tôt possible une procédure de surveillance de l’apparition des nuisances (le caractère spécifique du phénotype ne nécessite pas l’utilisation d’une grille pour la détermination du point limite). Il peut s’agir également d’avoir une procédure d’hébergement adapté avec l’ajout d’un enrichissement ou des manipulations très douces pour les lignées modèles d’épilepsie par exemple. La procédure d’évaluation du bien-être animal est non invasive et sans douleur basée sur l’utilisation d’une grille de paramètres zootechniques et physiologiques. Le risque est la détection d‘un phénotype dommageable qui sera immédiatement pris en charge et classifié selon la procédure sur la gestion des phénotypes dommageables.
Choix des espèces
La création de modèles pour comprendre des pathologies humaines est très développée chez la souris car les outils pour générer ces modèles génétiquement modifiés sont très efficaces. D’autre part, la souris est un mammifère avec de nombreuses similitudes dans les processus biologiques avec l’homme. Son temps de génération est considéré court (3 mois) et son élevage simple en laboratoire. Le poisson-zèbre est un modèle incontournable pour la recherche : une fécondation et un développement embryonnaire externe rapide et transparent, la facilité d’accès au matériel génétique permettant le développement des techniques d’ingénierie génétique. Son génome présente 70% d’homologie avec celui de l’homme (85% pour les gènes impliqués dans des pathologies humaines), il présente également des capacités originales de régénération des tissus (système nerveux, rétine, cœur, etc.) qui en font un modèle idéal pour la compréhension de ces mécanismes, pouvant aboutir à l’identification de pistes thérapeutiques majeures transposables chez l’homme. Pour les biopsies : souris à partir de 14 jours jusqu'à 4 semaines maximum. L'essentiel des lignées sont génotypées à 14 jours pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte. La biopsie de nageoire : majoritairement jeune adulte entre 1 et 3 mois avant maturité sexuelle afin de ne conserver que les animaux de génotype d'intérêt à l'âge adulte, des animaux plus vieux peuvent être concernés en cas de doute ou erreur sur le génotype.
Utilisation de sondes fluorescentes chez la souris pour une meilleure compréhension des mécanismes de distribution et d’internalisation des récepteurs
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une chirurgie du cou pour cathétériser l'artère carotide, avec un risque d'atteinte du nerf vague et de rupture de vaisseau, précède une perfusion de cinq minutes de sondes fluorescentes. 24 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant tués avant tout réveil. Le porteur écrit que l'exposition aux sondes "sera rapidement suivie de la mise à mort des animaux ce qui devrait limiter toute nuisance potentielle", présentant ainsi la mise à mort comme une mesure de protection. Cinq des 24 souris sont affectées au "réapprentissage des gestes de chirurgie" et ne rejoignent le projet que si l'opération réussit, quatre servent à fixer la dose, et les quinze dernières aux trois sondes à tester.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) est la deuxième cause de décès et la troisième cause d'invalidité dans le monde. Lorsqu'une personne subit un AVC, une hormone appelée angiotensine II est produite en plus grande quantité. En se fixant sur son récepteur, cette hormone va induire une contraction des vaisseaux sanguins ce qui va réduire l’apport de sang au cerveau et donc augmenter la gravité de l'AVC. Certains nouveaux candidats médicaments sont capables de faire rentrer ces récepteurs hormonaux à l’intérieur des cellules, les rendant donc inaccessibles pour l’angiotensine II. Ceci permettrait de prévenir la contraction des vaisseaux sanguins cérébraux. Cette internalisation des récepteurs pourrait donc participer à une protection cérébrovasculaire en cas d’AVC. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons développé et testé sur cellules, des outils fluorescents spécifiques permettant de localiser avec précision ces récepteurs. L’objectif de ce projet est de tester ces outils fluorescents pour visualiser in vivo la distribution et l’internalisation des récepteurs dans les vaisseaux cérébraux notamment en définissant les doses des outils fluorescents à utiliser in vivo.
Bénéfices attendus
Ce projet préliminaire nous permettra de fixer la dose des sondes à utiliser in vivo puis de valider la méthodologie d’évaluation de la distribution des récepteurs. L’étude de cette distribution des récepteurs est importante pour comprendre et caractériser les mécanismes et les effets de certains traitements de l’accident vasculaire cérébral.
Procédures
Les souris subiront une chirurgie carotidienne pour cathétérisation de l’artère carotide puis une infusion de 5 minutes via ce cathéter sera effectuée. L’expérimentation n’excédra pas 1h.
Impact sur les animaux
risques d’atteintes du nerf vague lors du cathétérisme de l’artère carotide L’exposition à ces sondes (durée de perfusion de 5 minutes) sera rapidement suivie de la mise à mort des animaux ce qui devrait limiter toute nuisance potentielle dues à ces molécules.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et le sang pour des analyses.
Remplacement
Pas de remplacement possible car l’objectif est de visualiser et étudier la distribution des récepteurs de l'angiotensine II directement au niveau du tissu cérébral et cérébrovasculaire. Les outils fluorescents spécifiques que nous souhaitons tester ont été synthétisées et purifiées par des laboratoires partenaires. Leur caractérisation pharmacologique complète a été réalisée sur des modèles cellulaires et ex vivo (artère cérébrale isolée perfusée) qui permettent d’estimer les doses nécessaires à notre objectif.
Réduction
Afin de réduire au maximum l’utilisation d’animaux, la détermination de la dose à administrer sera déterminée dans un premier temps pour un seul outil fluorescent. La dose à utiliser pour les 2 autres outils fluorescents sera basée sur l’utilisation de la première car nos études préliminaires montrent une affinité équivalente pour nos 3 outils fluorescents. Le nombre total d’animaux pour ce projet sera de 24 : 5 souris dédiées au réapprentissage des gestes de chirurgie (si succès de la chirurgie, ces souris seront incluses dans le projet), 4 souris afin déterminer la dose des sondes à utiliser (2 souris pour 2 doses différentes) et enfin 15 souris (5 souris pour chacune des 3 sondes à tester). Ce projet étant un test préliminaire, aucun test statistique n’a été utilisé.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en portoir avec des cages ventilées et filtrées, à 5 souris par cage. Ces cages seront enrichies (tunnel en polycarbonate, buchette de peuplier…) – période d’acclimataion minimale de 1 semaine. Pendant toute la durée de la chirugie et jusqu’à la mise à mort de l’animal, la profondeur de l’anesthésie sera régulièrement contrôlée par l’absence de reflexe de retrait de la patte aux pincements interdigitaux et absence du réflexe cornéen ; un anti-douleur sera administré 1 h avant le début de la chirurgie ; la température corporelle sera contrôlée via une sonde rectale et maintenue à 37°C; la cornée sera protégée par un gel ophtalmique ; la durée d’utilisation des animaux sera limitée à 1h sous anesthésie, avec contrôles des paramètres vitaux à des valeurs physiologiques. Les animaux seront mis à mort par surdose d’anesthésie en cas de lésion du nerf vague ou d’une rupture d’un vaisseau avec hémorragie trop importante lors de la chirurgie.
Choix des espèces
Les souris utlisées seront des C57Bl/6j mâles agées de 10 semaines, poids entre 20 et 30g). C’est ce même modèle de souris qui a été utilisé pour les études cérebrovasculaires et cardiovasculaires précedentes, afin de permettre la comparaison. Cet âge correspond à un stage adulte jeune chez qui la pose d’un cathéter dans l’artère carotide est facilitée par rapport à des animaux plus jeunes.
Elevage de lignées murines génétiquement modifiées pour l’étude du développement des cellules hématopoïétiques.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Immunodéficientes par construction génétique, les souris de ces lignées développent des tumeurs à partir de deux mois et succombent entre trois et six mois à l'envahissement de la cage thoracique. 412 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 300 d'entre elles et sévère pour 112, l'objet du projet étant d'élever ces lignées pour étudier le développement des cellules souches du sang. Les actes déclarés se limitent à une biopsie de phalange entre le septième et le dixième jour après la naissance, sur des nouveau-nés, et à une surveillance quotidienne des doubles mutants pour repérer les signes d'anémie sévère, alimentation et mobilité réduites, croissance altérée, blancheur des pattes. Toutes les souris à phénotype dommageable sont tuées avant deux mois, avant l'apparition des tumeurs, et leurs cellules hématopoïétiques sont analysées, y compris chez des fœtus prélevés à partir du treizième jour de gestation.
Objectifs
Les cellules du sang assurant l’oxygénation des tissus et la défense immunitaire se développent à partir d’un petit nombre de cellules appelées : cellules souches hématopoïétiques (CSH). L’ensemble des mécanismes biologiques qui contrôlent le pool de CSH au cours de la vie ainsi que la différenciation de ces CSH en cellules du sang ne sont pas totalement élucidés. D’autre part la perturbation de ces mécanismes participe au développement de maladies auto-immunes et de leucémies chez l’homme. Aussi une meilleure compréhension de la biologie de ces cellules permettra de développer des cibles et des stratégies thérapeutiques pour les pathologies humaines. Nous nous intéressons plus particulièrement à une famille de protéines responsable de pathologies hématopoïétiques humaines notamment dans certaines leucémies. Ce projet vise à déterminer le rôle de ces protéines dans le développement précoce des cellules souches hématopoïétiques en utilisant des souris génétiquement invalidées pour ces protéines. Ce projet consiste à l'élever des lignées de souris génétiquement modifiées qui présentent un phénotype dommageable avec une baisse de l'immunité et le développement de tumeur.
Bénéfices attendus
L'étude de souris déficientes pour des protéines impliquées dans l'immunité et le développement de tumeurs thymiques, nous permettra de définir les rôles de ces protéines durant la mise en place du système sanguin, ce qui à notre connaissance n’est pas été élucidé. La compréhension du développement des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques est importante pour élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les pathologies du sang (telles que l’anémie, les maladies auto-immunes et les leucémies) et pour améliorer les techniques d’expansion de ces cellules lors de greffe de cellules hématopoïétiques dans le cadre de thérapies anti-cancéreuses.
Procédures
Les souris déficientes pour les protéines étudiées dans cet élevage ont une immunité réduite (immunodéficientes) et développent des tumeurs après l'âge de 2 mois.La biopsie de phalange se fait entre 7 et 10 jours.
Impact sur les animaux
Les souris immunodéficientes sont plus suceptibles aux infections d'opportunistes pour prévenir de cela ces animaux seront élevés dans des conditions les plus aspetiques possibles. Les souris développant des tumeurs susccombent entre 3 et 6 mois suite à l'envahissement de la cage thoraxique par la tumeur. Ces animaux seront euthanasiés bien avant le développement de ces tumeurs à l'âge de 2 mois. L’effet indésirable est la nuisance du prélèvement des phalanges entre le 7ieme et le 10ieme jours postpartum qui génère une douleur légère de courte durée.
Devenir
Toutes les souris à phénotype dommageable produites seront mises à mort avant le développement de tumeurs et utilisées pour l'analyse des cellules hématopoïétiques.
Remplacement
La mise en place du système sanguin nécessitent des interactions cellulaires ainsi que des migrations de cellules hématopoïétiques dans l'organisme, ces mouvements cellulaires ne peuvent pas être remplacés par des systèmes ex-vivo. L'utilisation d'organismes vivants est donc nécessaire.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d’animaux avec un phénotype dommageable en adaptant les croissements de souris et en limitant les croissements qui produisent ces souris. Les foetus possèdent un nombre réduit de cellules hématopoïétiques réduisant ainsi le nombre de cellules pouvant être analysées par individu, pour cela nous envisageons d’utiliser 12 fœtus /génotype et par stade de développement. Autour de la naissance, le nombre de cellules hématopoïétiques est déjà plus important et à ces stades de développement 10 animaux /génotypes seront suffisant pour les analyses de tissus et de populations hématopoïétiques. Les animaux de 30 jours ont une taille proche de l’adulte et les cellules hématopoïétiques sont présentes en plus grand nombre, les expériences seront réalisées sur 6 animaux à phénotypes dommageables. Les cellules et tissus hématopoïétiques issus des foetus et des animaux seront comparés à des animaux contrôles sauvages et hétérozygotes de phénotype non dommageable.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances liées à l’immunodéficience des souris, nous allons héberger ces animaux dans un environnement le plus aseptique possible (cages ventilées et filtrées et manipulation des animaux sous hotte). Et pour éviter les souffrances des animaux développant des tumeurs thymiques, nous euthanasierons ces animaux avant l’apparition des tumeurs et des douleurs liées à celles-ci à l’âge de 2 mois. Dans ces conditions d’élevages et d’après les utilisations décrites pour ces animaux ne souffrent pas de surinfection ou de douleurs tumorales. Les animaux doubles mutants feront l'objet d'une observation accrue par observation quotidienne jusqu'a 10 jours puis tous les 2 jours pour détecter des signes de souffrances liés à une anémie sévère (alimentation et mobilité réduite, croissance des nouveau-nés altéré, blancheur des pattes) et en cas de souffrance les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux modèles de choix facilement modifiables génétiquement et pour lesquels nous disposons d’un grand nombre d’outils moléculaires ( ex : Anticorps, cytokines…) permettant l’étude des cellules hématopoïétiques. Le développement des cellules hématopoïétiques murines débute chez l’embryon à partir de l’émergence des cellules sanguines au stade embryonnaire (E) 9,5 jusqu’au stade de jeune adulte (2 mois). Les stades de développement utilisés dans ce projet sont les stades embryonnaires 13,5 ; 14,5; 15,5; 16,5 et 18,5 jours post-coïtum, les nouveau-nés à la naissance (P0) et à 1 jour (P1) ainsi que les jeunes à 10, 30 et 60 jours après la naissance.
Évaluation des effets thérapeutiques cardiaques d’un nouveau virus adéno-associé
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Trente-deux souris sont cathétérisées jusque dans le cœur par la veine jugulaire, sous anesthésie générale, et ne sont pas réveillées. 126 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 94 d'entre elles et modéré pour 32. Baguées et biopsiées à trois semaines pour vérifier leur statut génétique, elles reçoivent une injection de virus adéno-associé à sept semaines, puis de trois à cinq électrocardiogrammes et un examen échographique, certaines jusqu'à l'âge de soixante semaines. Le porteur justifie la mise à mort systématique après cathétérisme par l'impossibilité de suturer la veine jugulaire, qu'il faut donc ligaturer, et par le risque que le cathéter lèse les valves cardiaques et provoque une insuffisance cardiaque droite.
Objectifs
L'objectif général du projet est d'évaluer les effets thérapeutiques d'un virus adéno-associé sur un modèle de souris présentant des troubles de la conduction de l'influx électrique cardiaque liés à une perte de fonction d'un gène impliqué dans cette conduction. Chez les humains, les mutations conduisant à une perte de fonction de ce gène sont à l'origine de pathologies génétiques responsables de morts subites (syndrome de Brugada et troubles de la conduction cardiaque) pour lesquelles il n'existe pas de thérapie préventive. Le virus adéno-associé a été montré, dans un modèle cellulaire, comme étant susceptible d'avoir un intérêt thérapeutique. Les objectifs spécifiques du projet sont d'évaluer les effets du virus adéno-associé sur : 1. la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque, à l'aide d'enregistrements de l'électrocardiogramme ; 2. la survenue d'arythmies ventriculaires ; 3. l'apparition de fibrose cardiaque secondaire à la perte de fonction du gène de la conduction au cours du vieillissement. Ces deux derniers objectifs ne seront réalisés que si le virus adéno-associé permet une amélioration de la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du virus adéno-associé sont une amélioration significative, voire une restauration complète de la vitesse de conduction de l'influx électrique cardiaque, et une disparition des arythmies ventriculaires et du remodelage fibrotique cardiaque.
Procédures
Trois semaines après la naissance, les souris seront baguées et biopsiées (afin de vérifier leur statut génétique) sous anesthésie générale. Dans une première étape du projet, 32 souris seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines, à 3 enregistrements de l'électrocardiogramme à l'âge de 7 (durée de 3 min), 9 (3 min) puis 12 semaines (15 min), et un examen échocardiographique (15-20 min) à 12 semaines, réalisés sous anesthésie générale. En fonction des résultats obtenus dans la première étape, 32 autres souris seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines et 2 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) à l'âge de 7 puis 9 semaines, réalisés sous anesthésie générale, puis une exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque, d'une durée de 20-30 min, réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale, sans réveil. Enfin, en fonction des résultats obtenus dans l'étape 1, 20 souris supplémentaires seront soumises à une injection du virus adéno-associé à l'âge de 7 semaines, à 5 enregistrements de l'électrocardiogramme (durée de 3 min) à l'âge de 7, 9, 30, 45 et 60 semaines et 1 examen échocardiographique (15-20 min) à 60 semaines, sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé dans ce projet est étudié depuis de nombreuses années. Ces souris présentent un trouble de la conduction de l'influx électrique cardiaque qui augmente progressivement avec l'âge, comme les patients, mais qui ne conduisent pas à des blocs complets de la conduction comme observé chez certains patients ou à la survenue de tachycardies ventriculaires sévères et/ou fibrillation ventriculaire comme observé chez d'autres patients. Elles se développent normalement et ne présentent pas de signes notables de souffrance. L'injection des virus adéno-associés sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale au point d'injection afin d'éviter stress et douleur. Les examens réalisés pour étudier les effets cardiaques des virus adéno-associés (enregistrement de l'électrocardiogramme et échographie) ne sont pas des techniques générant de la douleur mais ils seront cependant réalisés sous anesthésie générale pour éviter tout stress des souris et les maintenir en position stable. Pour les mêmes raisons, l'exploration électrophysiologique par cathétérisme intracardiaque sera également réalisée sous anesthésie. Cette procédure entraine une douleur au niveau du point de ponction cutanée pour cathétériser la veine jugulaire, qui sera prévenue par une anesthésie locale, comme cela est fait chez les patients. En ce qui concerne le virus adéno-associé, une étude antérieure a montré qu'il n'entraine pas d'effet indésirable chez des souris sauvages aux doses conduisant à un effet bénéfique dans le modèle cellulaire.
Devenir
A l'issue de la procédure 2 (effets du virus adéno-associé sur la fonction cardiaque), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur cœur pour des examens immunohistochimiques. A l'issue de la procédure 3 (exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque), les souris sont systématiquement mises à mort parce que cette procédure peut avoir des conséquences néfastes sur la souris. En effet, il est possible, mais difficile de suturer la veine jugulaire après avoir retiré le cathéter, ce qui nous oblige à la ligaturer pour éviter les hémorragies, perturbant ainsi le retour veineux depuis la tête de l'animal. Par ailleurs, bien que les cathéters aient un diamètre très faible (1/3-1/2 mm), ils sont suffisamment gros pour léser les valves cardiaques, ce qui peut induire une insuffisance cardiaque droite à plus ou moins long terme. La mise à mort des souris permet en outre de prélever le cœur pour des études biochimiques. A l'issue de la procédure 4 (effets à long terme du virus adéno-associé), les souris seront mises à mort à la fin de l'examen échographique afin de prélever leur cœur pour des examens histologiques.
Remplacement
Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée avec un modèle cellulaire, puis une étude in vivo chez la souris sauvage qui montrent que la surexpression du virus adéno-associé entraine une augmentation de l'expression du gène cible. Ces études sont à la base de ce projet réalisé sur un modèle pertinent pour la pathologie humaine. Seule l'expérimentation réalisée sur des animaux vivants peut permettre de démontrer une efficacité du traitement sur la fonction cardiaque : l'observation d'un effet bénéfique sur un modèle cellulaire est un pré-requis mais ne préjuge en rien de l'efficacité in vivo. Très spécifiquement dans le cadre de ce projet, les effets protecteurs de ce traitement sur les anomalies structurales du myocarde (fibrose) apparaissant au cours du vieillissement ne peuvent être appréhendés que sur l'animal vivant.
Réduction
Plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux (électrocardiographie et échocardiographie), afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Le projet est organisé en deux étapes successives. La seconde étape ne sera réalisée que si la première démontre que les souris traitées avec le virus adéno-associé présentent une amélioration significative de leur conduction cardiaque. Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en conciliant une puissance statistique suffisante à une interprétation la plus juste des données obtenues. Leur taille a été déterminée à l'aide du logiciel de statistiques Sigmastat sur la base de notre expérience antérieure. Une analyse statistique des résultats sera réalisée avec le même logiciel.
Raffinement
Lors du sevrage, le prélèvement d'une biopsie pour déterminer le statut génétique des souris est réalisé sous anesthésie générale. Les souris sont hébergées en cages ventilées enrichies de tunnels ou de cabanes pour se camoufler et/ou de frisottis pour fabriquer des nids. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Lors des examens électrocardiographiques et échographiques, ainsi que lors de la mise à mort, les animaux sont sous anesthésie générale. L'exploration fonctionnelle par cathétérisme intracardiaque est réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Lors des anesthésies, la température corporelle est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant rétrocontrôlé par une sonde rectale. A l'issue des procédures nécessitant une anesthésie, les souris sont placées dans des cages placées sur des tapis chauffants et surveillées de façon accrue jusqu'à leur réveil complet. Afin d’éviter toute douleur ou souffrance des souris, des signes cliniques (avec score de gravité) ont été définis pour chaque procédure et définissent les points limites au-delà desquels l’expérimentation est arrêtée et l’animal euthanasié sous anesthésie.
Choix des espèces
Le modèle de souris utilisé est le seul modèle murin de perte de fonction du gène de la conduction. Ce modèle est bien caractérisé et représente un bon modèle des pathologies humaines résultant des mutations "perte de fonction" de ce gène. Les souris seront injectées avec les virus adéno-associés à l'âge de 7 semaines, puis étudiées jusqu'à l'âge de 12 semaines dans la première étape, et de 60 semaines dans la seconde, parce que ces pathologies ne touchent que très rarement les enfants et les adolescents. Les souris utilisées seront des mâles et des femelles dans des proportions comparables parce que les pathologies d'intérêt chez l'humain touchent tous les genres. L'injection du virus à l'âge de 7 semaines permet, d'une part, de réduire la quantité d'AAV9 injectée et, d'autre part, d'obtenir une expression optimale de l'AAV9 avant d'en étudier les effets cardiaques chez les jeunes souris adultes (9, puis 12 semaines). Si le traitement s'avère efficace sur la conduction de l'influx électrique cardiaque, l'étude réalisée à l'âge de 60 semaines permettra de déterminer ses effets à long terme sur l'apparition de fibrose cardiaque observé normalement chez ces souris.
Evaluation de la réponse immunitaire de nanoparticules peptidiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Tuées pour qu'un volume de sérum jugé suffisant soit prélevé, 20 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent trois injections vaccinales, aux premier, quatorzième et vingt-huitième jours, un prélèvement sanguin précède la première dose, et leur sang est collecté après leur mise à mort. Le porteur indique n'avoir identifié, lors des essais antérieurs, aucun symptôme, ni rougeur, ni lésion cutanée, ni kyste au point d'injection. L'enjeu est industriel autant que scientifique, comparer ses nanoparticules peptidiques aux nanoparticules lipidiques déjà commercialisées, une formulation stable à 4 °C qui "simplifierait grandement" la préparation des doses et abaisserait les coûts de production.
Objectifs
Ce projet repose sur de nouvelles formulations permettant le transfert intracellulaire d’ARN messagers (ARNm). Jusqu’à présent, les ARNm sont exclusivement formulés avec des cocktails de lipides. Or ces complexes lipidiques présentent des stabilités limitées dans le temps, rendant nécessaire de les transporter et de les stocker à basses, voire très basses, températures (-20 à -80°C). Une fois une fiole décongelée et diluée dans les conditions adaptées à une injection intramusculaire, il est préconisé par Pfizer/BioNTech de ne pas utiliser ces préparations au-delà de 6 heures et de les éliminer. De notre côté, nous avons mis en évidence la très bonne stabilité des particules peptidiques que nous formons, sur plusieurs semaines après leur formulation et un simple stockage à 4°C. Récemment, nous avons réalisé une phase de vaccination sur des lapins et des souris et nous avons obtenu des évidences claires que les nanoparticules à base de peptides généraient une réponse immune. Cependant, nous n’avons pas pu établir une comparaison quantitative et qualitative de la réponse immunitaire chez l'animal entre nos nanoparticules peptidiques et les nanoparticules lipidiques actuellement sur le marché. Ainsi, nous souhaitons comparer la réponse immunitaire chez la souris avec ces deux types de formulations.
Bénéfices attendus
L’évaluation de l’efficacité des nanoparticules à générer une réponse immunitaire est un point crucial pour notre étude. Cependant, si nous avons des éléments expérimentaux démontrant une réponse immunitaire chez l’animal (souris et lapins), nous n’avons pas la possibilité expérimentale de savoir si cette réponse est aussi efficace que celle obtenue avec les ARNm commerciaux. Dans le cas d’une réponse immunitaire comparable selon les deux procédés, les perspectives pour le développement d’une formulation exclusivement réalisée avec un peptide seraient de nature à simplifier grandement les protocoles de préparations des doses vaccinales qui seraient alors basées sur un simple mélange entre ARNm et peptide, à température ambiante, et avec un transport et un stockage ultérieurs qui seraient grandement facilité. Ce nouveau type de formulation permettrait de réduire les couts de production des préparations vaccinales. Les résultats de ces études seront publiés et accessibles à la communauté scientifique et médicale.
Procédures
Le nombre d’intervention prévu chez les animaux sont au nombre de cinq. Une première intervention le premier jour permettra sur quelques minutes d’une part un prélèvement de sang chez l’animal non-traité, couplé à l’injection classique en intramusculaire d’une première dose vaccinale. Une deuxième injection vaccinale se déroulera au 14eme jour de l’expérimentation sur un processus global d’une minute. Une dernière injection sur une minute le 28eme jour assurera un « rappel vaccinal ». L’animal sera alors euthanasié (une minute) et son sang collecté pour réaliser de analyses ultérieures.
Impact sur les animaux
Les études expérimentales réalisées préalablement à cette phase n’ont pas permis d’identifier de symptômes de quelque nature que ce soit (rougeurs, lésions cutanées, kystes au point d’injection…).
Devenir
Afin d’obtenir des volumes de serum conséquents, les souris seront euthanasiées et le sang prélevé afin de procéder aux dosages d’anticorps correspondants aux types de vaccins utilisés.
Remplacement
Une réponse immunitaire globale est régie par une multitude de processus qu’il est impossible de mimer en milieu ex corpus. De fait, seules des injections selon des protocoles proches de ceux adoptés lors de stratégies vaccinales permettront d’évaluer tous ces paramètres.
Réduction
Nos procédures sont peu ou non-invasives, ce qui nous permet de maximiser le nombre d'expériences réalisées par la suite tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés au départ. Pour établir une signification précise de la réponse immunitaire obtenue, nous avons déterminé que des groupes de dix animaux était requis pour avoir une idée objective de la réaction des différents animaux aux types de vaccination reçue. Dix animaux par groupe sont ainsi nécessaires et suffisants.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être (contrôle de la température et de l’hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence d’enrichissement, change régulier des litières, eau et nourriture à volonté, surveillance quotidienne des animaux). Toutes les procédures sont réalisées de façon à limiter le stress et la souffrance des animaux (anesthésie et antalgique en cas de douleur). Les souris seront surveillées quotidiennement par nos soins et du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance de l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluations et points limites) sera strictement respecté, et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie.
Choix des espèces
Il s’agit de souris tout à fait adaptées à des études générales incluant des analyses de toxicologie, de tératologie, de pharmacologie ou de physiologie. Nous souhaitons, dans le cadre de ce programme de recherche, mettre en évidence une méthodologie alternative de préparations vaccinales pour induire une réponse immunitaire. Nous recevrons donc des animaux âgés de 2 mois, un âge reconnu pour avoir un système immunitaire mature., Ces animaux seront suivis pour une durée de 5 semaines (injections de 3 préparations vaccinales à J0, J14 et J28, et prélèvement sanguin final à J35).
Rôle du ganglioside A2B5 dans la réponse immunitaire dans le glioblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
La mise à mort est déclenchée dès qu'une souris perd 20 % de son poids, convulse, se paralyse, se prostre ou n'arrive plus à se déplacer. 68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune reçoit une greffe intracérébrale de cellules de glioblastome au cours d'une intervention chirurgicale d'environ trente minutes, et la tumeur provoque ensuite une perte d'appétit, une malnutrition puis une perte de poids, le porteur ne qualifiant de "douleur légère de courte durée" que les injections. Il vise à comprendre le rôle d'une molécule, A2B5, dans la réponse immunitaire, ce qui "permettrait" selon lui de nouvelles thérapies contre une tumeur cérébrale aujourd'hui sans traitement curatif.
Objectifs
A2B5 est une molécule exprimée par les cellules tumorales de glioblastome (tumeur cérébrale). L'objectif est d’analyser le rôle de la molécule A2B5 dans la réponse immunitaire. Pour cela, nous étudierons l'impact de l'expression de A2B5 dans l'activation du système immunitaire et dans le développement de la tumeur.
Bénéfices attendus
Le glioblastome est une tumeur cérébrale est une pathologie fatale (médiane de survie de 1 an) et pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Une meilleure compréhension du rôle joué par la molécule A2B5 (exprimé par la tumeur) dans les mécanismes immunitaires permettrait la mise en place de nouvelles thérapies pour les patients atteints de glioblastome.
Procédures
Les animaux recevront une greffe intracérébrale de cellules tumorales de glioblastome (68 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ). Les greffes intracérébrales sont des procédures chirurgicales.
Impact sur les animaux
La manipulation, contention des animaux, les injections d'anesthésiques pour la réalisation de la craniotomie sont générateurs de stress pour les animaux. Par ailleurs les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La progression tumorale induite par la maladie (glioblastome) provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids.
Devenir
L'ensemble des souris impliquées dans ce projet feront l’objet d’une analyse du système immunitaire et de l'évolution tumorale, ce qui nécessitera leur mise à mort.
Remplacement
Les nombreux partenaires (cellulaires et moléculaires) des processus dynamiques immunitaires et tumoraux nécessitent une approche expérimentale in vivo car il n’existe pas à ce jour de système suffisamment fiable pour mimer cette complexité biologique.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.
Raffinement
La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d’une grille de score. Les animaux seront euthanasiés dès l’apparition d’un signe de détresse (perte de poids supérieure ou égale à 20% du poids initial, convulsions, paralysie, prostration, difficulté à se déplacer). Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement.
Choix des espèces
Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales et à l'immunité tumorale. Les tumeurs de glioblastome générées dans ce modèle animal précis sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 6 semaines et utilisées à l’âge de 7 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ce modèle physiopathologique classique.
Inflammation pulmonaire et altérations cardiovasculaires dans un modèle de Bronchopneumpathie Obstructive Chronique (BPCO)
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
352 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 198 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et chacun subit la totalité des gestes du protocole. Sur animal éveillé, ils passent quinze minutes en pléthysmographie, quinze minutes d'épreuve d'effort sur tapis, quinze minutes de mesure de pression artérielle à la queue, et une prise de sang deux jours après une infection pulmonaire simulée. Sous anesthésie, un emphysème leur est induit, leur fonction cardiaque est mesurée par échographie et une sonde relève la pression transœsophagienne. Comme effets attendus, le porteur ne décrit pourtant qu'une "difficulté respiratoire modérée à l'exercice", une réduction de l'activité physique et un stress lié aux manipulations sur animal éveillé.
Objectifs
Les changements rapides dans notre environnement peuvent perturber l'équilibre délicat de nos poumons, entraînant des problèmes de santé tels que l'asthme et la Bronchopneumopathie Obstructive chronique (BPCO), une maladie pulmonaire chronique. Les substances que nous respirons peuvent également affecter d'autres parties de notre corps, comme le cœur, les vaisseaux sanguins, le cerveau, les muscles et les reins. Les infections virales ou bactériennes peuvent aggraver la BPCO, et des problèmes cardiaques sont fréquents chez les personnes atteintes de BPCO ou d'emphysème qui est une maladie qui entraine la destruction des alvéoles des poumons. Cela rend la respiration difficile, car les poumons ont du mal à se remplir d'air et à expulser le dioxyde de carbone. Comprendre comment cette maladie se développe ou s'aggrave est complexe, et nous ne comprenons pas encore complètement comment ils progressent dans le temps. Pour mieux comprendre comment les problèmes cardiaques se développent chez les personnes atteintes de BPCO, nous avons créé un modèle chez le rat qui imite cette maladie. Notre objectif est d'étudier comment la taille de l'emphysème affecte le cœur et les vaisseaux sanguins chez les rats, et comment l'inflammation et le vieillissement contribuent aux problèmes respiratoires et cardiaques après une infection pulmonaire. Nous allons également tester différentes approches pour réduire les impacts sur le système cardiaque chez les personnes atteintes de BPCO.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette recherche seront principalement de comprendre et d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents des répercussions cardiaques de l'emphysème. En analysant les composantes de l'inflammation et du vieillissement, nous visons à élucider les intrications complexes entre ces processus, offrant ainsi des perspectives plus approfondies sur les facteurs qui contribuent aux dysfonctionnements cardiaques observés dans le contexte de la BPCO. De plus, en éclaircissant les liens entre l'inflammation, le vieillissement et la pathologie cardiaque, cette recherche pourrait contribuer à la découverte de biomarqueurs potentiels et à la mise en évidence de voies thérapeutiques ciblées.
Procédures
La totalité des animaux seront soumis aux mêmes gestes techniques suivants: sur animal éveillé la pléthysmographie/fonction respiratoire (15 minutes par animal), tapis métabolique/épreuve d'effort (15 minutes par animal), mesure non invasive de la pression artérielle à la queue (15 minutes par animal), prélèvement sanguin de 0,1 mL sera effectué à la queue deux jours après avoir mimé une infection pulmonaire (environ 1 minute par animal). L'animal sera anesthésié pour induire l'emphysème (10 minutes au total), analyser la fonction cardiaque par échographie (environ 15 minutes par animal) et enfin mesurer la pression transœsophagienne (environ 15 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Nous avons maintenant plus de 5 ans de recul sur ce modèle. Les animaux peuvent présenter les symptômes classiques de l'emphysème pulmonaire chez l'homme, tels qu'une difficulté respiratoire modérée à l'exercice et une réduction de l'activité physique. De plus, un stress lié aux manipulations non invasives sur animal éveillé peut exister chez l'ensemble des animaux (prise de la pression artérielle, prise de sang et épreuve d'effort).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre des prélèvements d'organes. L'objectif principal de cette euthanasie est de réaliser une exploration histologique approfondie, mettant particulièrement l'accent sur des organes tels que le cœur et les poumons. Ce processus est essentiel pour une compréhension détaillée des éventuelles altérations histopathologiques et pour valider les atteintes pulmonaires et cardiaques.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode en laboratoire capable de reproduire les conditions exactes rencontrées chez les personnes atteintes d'emphysème ou de BPCO. Pour mieux comprendre ces maladies et leurs mécanismes, des expériences sur des rats sont nécessaires. Cela nous permet d'étudier les processus inflammatoires qui se produisent dans les poumons lors de la BPCO. Ces expériences sont difficiles à réaliser chez les humains, et il n'existe pas de modèle cellulaire qui puisse reproduire parfaitement la maladie.
Réduction
Nous avons maintenant plus de 5 ans de recul sur ce modèle, ce qui nous permet de réduire le nombre d'animaux à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats, en utilisant les données publiées de notre équipe de laboratoire pour une procédure similaire et des études fonctionnelles au niveau cardiaque chez le rat. Nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés grâce à une approche rationnelle et organisée des protocoles : des études échographiques, hémodynamiques et biologiques sont réalisées sur le même rat, ce qui permet de diminuer le nombre de rats et d'optimiser les interprétations. De plus, à la fin du protocole, les animaux sont utilisés par plusieurs groupes de recherche de l'équipe pour étudier les fonctions pulmonaires, cardiaques, vasculaires et musculaires. Afin de réduire le nombre d'animaux et d'augmenter la puissance statistique, un maximum de déterminations seront réalisées sur tous les animaux. Le nombre d'animaux utilisés dans ce protocole (22 animaux par groupe, soit un total de 352 animaux) a été calculé afin d'obtenir des résultats significatifs grâce à des outils statistiques.
Raffinement
Notre objectif est de réduire au strict minimum la détresse imposée aux animaux. Les rats seront hébergés de manière appropriée, avec un enrichissement du milieu permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Les animaux seront surveillés de près et les points limites établis seront appliqués. Nous évaluerons les critères de souffrance animale (rythme cardio-respiratoire, reprise de mouvement, état de prostration, hydratation) ; en cas de détresse anormale, les animaux seront euthanasiés par injection létale d'anesthésique. Chaque jour, les animaux seront contrôlés par un zootechnicien formé lors de sa visite de zone.
Choix des espèces
Le modèle de rat est largement caractérisé sur le plan cardiovasculaire, avec un nombre important de travaux décrits dans la littérature quant à sa faisabilité. La physiologie cardiaque des rongeurs et notamment du rat présente de grandes similitudes avec celle de l’homme, tant au niveau des régulations que de la structure morpho-fonctionnelle. Le modèle rongeur présente l’avantage de permettre des investigations depuis l'échelle cellulaire et moléculaire jusqu'aux mesures sur l'animal en laboratoire, en utilisant les mêmes techniques exploratoires employées chez l’homme. Les études sont réalisées sur des animaux adultes mâles âgés de 8 semaines, ainsi que sur des mâles âgés de 18 mois, afin d'étudier l'effet du vieillissement.
Validation de l’immunisation contre des protéines membranaires impliquées dans le processus de carcinogenèse chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit cinq injections intramusculaires ou sous-cutanées et subit huit prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, avec un risque de plaie ou d'infection aux points de piqûre que le porteur mentionne. L'objet immédiat reste de vérifier que les souris fabriquent des anticorps contre des protéines repérées par criblage cellulaire, et que l'immunisation tient sur une année d'observation, l'effet anticancéreux n'étant abordé qu'ensuite. Le porteur écrit qu'il "apparaît nécessaire" de tester le rôle de ces protéines dans un modèle animal complexe, et renvoie la validation de leur intérêt thérapeutique à "d'autres projets déposés ultérieurement", donc à d'autres animaux.
Objectifs
Le vieillissement cellulaire est caractérisé par un arrêt de la prolifération cellulaire, qu’elle soit physiologique (vieillissement naturel) ou accéléré (stress oncogénique notamment). Considérée dans un premier temps comme bénéfique en permettant l’élimination de cellules anormales (cellules « âgées » ou présentant des mutations) ce vieillissement cellulaire est présenté actuellement comme pouvant avoir également une facette délétère. En effet une trop grande quantité de cellules vieillissantes peut induire la production de facteurs sécrétés qui vont jouer un rôle favorable dans le processus de carcinogenèse, aussi bien dans l’initiation que dans la propagation du Cancer. En combinant un criblage cellulaire et l’analyse de bases de données publiques des protéines membranaires impliquées dans le processus pro-tumoral ont pu être mise en évidence, afin de pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques, soit prophylactique soit curative. Dans un premier temps chaque candidat identifié subira une étape de validation avec une approche in vitro. Ensuite il faut induire dans un modèle animal la production d’anticorps dirigés contre less candidats cibles. Pour chaque candidat cible 3 voies d'immunisation seront utilisées : une approche novatrice avec l’utilisation d’ARNm, une approche plus classique dite approche peptidique et une troisième approche combinant les deux. La production d’anticorps dirigés contre les protéines d’intérêt sera vérifiée ainsi que la durabilité de l’immunisation en observant sur une année les souris immunisées. Enfin si ce projet montre la capacité à « vacciner » sans effet secondaire les animaux contre ces protéines membranaires alors l’impact de cette vaccination comme thérapie anticancéreuse sera testé, soit dans une approche prophylaxique soit dans une approche curative.
Bénéfices attendus
Ce projet est un projet qui vise à démontrer la capacité à induire la production d’anticorps dirigés contre des protéines potentiellement impliquées dans le Cancer. Le but étant ensuite, au travers d’autres projets déposés ultérieurement, de valider l’impact de l’inhibition de ces protéines comme potentiel outil thérapeutique. La vaccination étant une voie novatrice explorée actuellement pour lutter de façon prophylaxique ou curative contre des maladies comme le Cancer.
Procédures
Lors de toutes les interventions décrites ci-après les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) et un anesthésique local sera également appliqué (pommade, collyre). Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins, 8 au total. Chaque prélèvement sanguin durera entre 3 et 5 minutes (de l'endormissement au réveil de l'animal). Pour immuniser les animaux ils recevront 5 injections qui pourront être intra-musculaires (ARNm), sous-cutanées (peptides), ou bien 2 intra-musculaires et 3 sous-cutanées. Chaque injection durera 5 à 6 minutes (endormissement, rasage, antalgique, injection, réveil).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir un stress modéré lors de la manipulation (pesée hebdomadaire, observation) et lors de l’initiation de l’anesthésie gazeuse. Les animaux pourront ressentir de la douleur lors de chaque prélèvement sanguin ainsi que lors de chaque injection, qu’elle soit réalisée en intra-musculaire ou en sous-cutanée. Risque de plaie ou d’infection au point d’injection ou au point de prélèvement.
Devenir
A l'issu de la procédure les animaux seront mis à mort. Du sang sera prélevé ainsi que les organes lymphoïdes (impliqués dans la réaction immunitaire) et un maximum d'organes afin d'étudier les modifications éventuelles liées à l'immunisation.
Remplacement
Des études montrent que les acteurs du vieillissement peuvent être impliqués dans le Cancer. Des analyses haut débits ont permis d'identifier certains de ces acteurs. Après avoir validé ces acteurs par des expériences in vitro, il appraît nécessaire de tester le rôle réel de ces acteurs dans un modèle animal complexe. Pour cela des animaux seront alors immunisés contre ces acteurs du vieillissement. Une fois que la production d'anticorps contre ces cibles aura été validé alors l'effet de cette "vaccination" pourra être testée dans des modèles de cancer.
Réduction
Ce protocole cherchera à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La capacité à immuniser des souris contre des protéines d’intérêt, qui sont produire à un faible niveau dans les conditions physiologiques, sera testée, après que les candidats cibles aient subi un maximum de test in vitro. Il n’y aura pas de tests statistiques dans ce protocole, le but étant pour chaque cible de voir quelle voie d’injection permet la production maximale d’anticorps, s’il y a bien production d’anticorps. Les deux sexes seront utilisés car, même si aucun effet sexe, nous ne pouvons l’exclure de façon définitive pour chaque cible. Enfin la collaboration pour ce projet avec une équipe qui a une très forte expertise concernant l'immunisation des souris permettra d'utiliser directement les concentrations optimales, ce qui permettra également de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Dès leur arrivée dans l’animalerie les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation aux expérimentateurs. Les animaux seront pesés une fois par semaine, et observés à la fois par le personnel animalier (une fois par semaine lors du change) et les expérimentateurs (une à deux fois par semaine, hors geste expérimental) dans le cadre du suivi de l’état général des souris. Une liste précise permettant de scorer les signes éventuels de souffrance sera alors utilisée afin d’évaluer si les animaux présentent des signes de souffrance ou d’atteinte d’un point limite qui entrainerait leur mise à mort. Afin de diminuer au maximum le stress et la douleur des animaux ils seront anesthésiés et recevront l'analgésie appropriée lors des injections et des prélèvements sanguins. Les animaux seront hébergés dans des cages présentant des enrichissements comme du coton de nidation, des batonnets de bois et éventuellement des tunnels.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix pour les études sur l’animal (1) de par son homologie avec le génome humain (plus de 90% d’homologie) et également (2) de par les différents modèles génétiques qui ont été développés chez la souris. Une fois que la production d'anticorps contre les cibles aura été validé, il sera nécessaire d'aller plus loin en testant l'impact de cette vaccination dans des modèles de cancer chez la souris (modèles génétiques de susceptibilité au Cancer). Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte car ce projet nécessite des animaux dont le système immunitaire est mature.
Evaluation in vivo de l’action antitumorale d’une surexpression de GPER sur la croissance et la réponse au traitement standard des glioblastomes dans un modèle de greffe orthotopique de glioblastome humain chez la souris immunodéprimée. (EU2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
Une greffe de glioblastome humain dans le cerveau, au moins dix séances d'imagerie sous anesthésie, dix séances de radiothérapie, douze administrations du composé testé et un test d'éviction d'obstacle trois fois par semaine : 164 souris immunodéprimées vont subir ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tumeur cérébrale implantée provoque des effets délétères que le porteur qualifie lui-même de non réversibles, et la répétition des anesthésies peut entraîner une accoutumance obligeant à augmenter les doses administrées. L'objet du projet est de vérifier si l'augmentation d'une protéine, combinée à son activation par une molécule, ralentit la croissance tumorale et améliore la réponse aux traitements standards, les retombées annoncées pour les patientes et les patients restant renvoyées au conditionnel. 116 souris sont tuées dès l'atteinte d'un point limite, et 48 autres, dites "satellites", plus tôt encore, à la fin du schéma de traitement, pour analyser leurs tissus.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment l'augmentation de la quantité d'une protéine affecte la croissance des tumeurs cérébrales chez les souris, et favorise leur réaction aux traitements anticancéreux habituels. L'objectif final est d'appliquer cette méthode aux patients. Des études précédentes sur des données de patients ont montré que plus cette protéine est présente, meilleure est la survie des patients, surtout chez les femmes. En laboratoire, nous avons aussi observé que lorsqu'on augmente la quantité de cette protéine, le nombre de cellules tumorales diminue de moitié. De plus, nous avons constaté qu'un activateur de cette protéine a un effet antitumoral sur des tumeurs greffées sous la peau de souris, qu'elles soient mâles ou femelles. Notre objectif est maintenant d'étudier comment une augmentation de la quantité de cette protéine combinée à son activation par une molécule spécifique affecte la croissance tumorale et la réponse aux traitements anticancéreux standards dans un modèle de tumeur intracérébrale chez la souris (qui se rapproche de la réalité chez l'humain). Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet constitueront une base pour comprendre le rôle de la protéine étudiée dans l’augmentation de la survie des patients et éventuellement proposer l'utilisation de l'activateur de cette protéine pour le traitement des glioblastomes chez les patients dont la tumeur présente une forte quantité de cette protéine. Cette étape est indispensable pour soutenir le transfert clinique de nos travaux en lien avec une thèse de doctorat et les financements de la Ligue contre le cancer et du CNRS. En effet, ce projet innovant (très peu décrit dans la littérature) permettrait à terme de mieux comprendre les processus responsables des différences d'apparition des glioblastomes et de réponse au traitement entre les hommes et les femmes. En cas de résultats probants, cela permettrait d'apporter de nouvelles voies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant des inducteurs (qui augmentent la quantité) et des activateurs (qui augmentent la fonctionnalité) de cette protéine dans le cas du traitement de tumeurs chimiorésistantes marquées par un échec thérapeutique (chimio-sensibilisation).
Procédures
- greffe intracérébrale (1 seule itération à J0) : durée=45 min (EU1) - Imagerie bioluminescence (au minimum 10 injections) : durée 15 min (EU2) - Traitement par radiothérapie (10 itérations) : durée 10 min pour chaque session (EU2) - Traitement par le composé d'intérêt (12 itérations) combiné ou nonà la chimiothérapie (10 itérations) : durée 1 min par traitement (EU1). - Test d'éviction d'obstacle (3 fois par semaine ) : durée 5 min (EU1)
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l'implantation même du glioblastome (apparition d'une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus non réversibles). Puis, le schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et l'imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine selon le timing dans le projet) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux. Lorsque les sessions de bioluminescence sont le même jour que la radiothérapie, une seule anesthésie sera réalisée, l'irradiation et l'imagerie se faisant sur le même site où est hébergé l'irradiateur. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques peut être observée, nécessitant une augmentation des volumes administrés : ce phénomène est maitrisé par le laboratoire. Une attention toute particulière sera portée aux animaux notamment en optimisant au maximum les conditions de transport des animaux. Les administrations quotidiennes de l'activateur de la protéine conduisent à un dérangement journalier des animaux, le cycle jour/nuit de l'animalerie étant inversé, la gêne occasionnée sera faible, les animaux étant ainsi manipulés durant leur phase d'activité. Le site d'injection dans le péritoine sera alterné chaque jour (gauche-droite) pour éviter les réactions liées à l'injection et des aiguilles très fines seront utilisées pour l'injection.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue des procédures. Ainsi 164 souris au maximum seront mises à mort dès lors de l'atteinte d'un point limite (étude efficacité/survie : 58 souris femelles et 58 souris mâles) ou plus précocement à l'issue du schéma de traitement de chaque groupe (48 souris "satellites" : 24 souris femelles et 24 souris mâles ). La mise à mort des souris "satellites" à la fin du schéma de traitement est justifiée de part la nécessité de réaliser une analyse des tissuss pour pouvoir caractériser l'impact de chaque modalité de traitement.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse à un traitement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes. De plus, la mise en place d'une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires. En outre, la réponse d'une tumeur traitée par un médicament dépend de la quantité de médicament qui parvient à la tumeur. De plus, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.
Réduction
Chacune des 3 étapes sera d’abord réalisée chez des animaux femelles puisque la surexpression de la protéine d'intérêt est de bon pronostic essentiellement chez les femmes, puis éventuellement testée chez des animaux mâles pour évaluer la pertinence de cette modulation hormonale pour les hommes. Dans le cadre de ce projet, les expérimentations seront menées étape par étape, tout d’abord en réalisant l’étude sur les animaux "femelles" associés à l'étape 1 qui concerne la comparaison in vivo de la croissance tumorale de cellules avec une forte quantité de protéine par rapport à des cellules tumorales ayant une quantité modéré de la protéine étudiée. Nous implanterons d'abord la concentration habituelle de cellules : si cette dernière offre un bon taux de prise tumorale et une croissance tumorale acceptable cette concentration sera validée et les animaux du groupe suivant ne seront pas utilisés. A l'inverse, si cette concentration s'avère insuffisante, les souris du groupe 3 seront greffées avec une concentration double. La concentration "optimale" retenue sera celle utilisée dans le reste de l'étude. Notre démarche consistera à réaliser successivement plusieurs séries d’animaux. Concernant le nombre de souris satellites, il s’agira de comparer, indépendamment chez les mâles ou les femelles, l’effet des traitements par rapport au groupe contrôle par l’analyse de marqueurs dans les tissus prélevés : ces analyses sont fiables et ne nécessitent qu’un effectif réduit pour révéler un effet, s’il existe. Ainsi on estime -à priori- que même si l’effet des traitements est faible, un effectif de 6 souris / groupe sera suffisant pour assurer une puissance statistique suffisante (simulation par logiciel de calcul de puissance). Concernant le nombre de souris en suivi de croissance tumorale, la comparaison se fera aussi indépendamment chez les mâles et les femelles. Ainsi, sur la base de nos précédentes études, on estime que l’effet des traitements aura un effet faible sur la croissance tumorale. Au minimum 6 mesures d'imagerie seront réalisées en suivi de traitement. Le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe est ainsi trouvé 10 animaux par groupe pour assurer une puissance statistique suffisante.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique, désinfection plaie, chirurgie aseptique, suivi post opératoire rigoureux) puis à la suite de la greffe (pesée 3 fois/semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale). Une vigilance accrue sera également menée lors de l'administration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'état sanitaire individuel des animaux, conditions de transport de façon à éviter au maximum stress des animaux). Un suivi quotidien garantissant le bien-être optimal des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau de boisson et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger). Quel que soit le groupe, nous réaliserons la mise à mort dès que les points limites définis apparaitront (perte de poids et problème de motricité essentiellement).
Choix des espèces
Dans les études menées pour comprendre le développement des cancers, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris mâles ou femelles seront âgées de 7 semaines au moment des greffes (20 à 26g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.
IMPLICATION ET POLARISATION DES CELLULES MYELOIDES AU COURS DE L’ONCOGENESE
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Tatouées aux phalanges à trois semaines puis biopsiées à la queue pour génotypage, les souris reçoivent à l'âge adulte une injection intrapéritonéale de cellules tumorales qui déclenche un adénocarcinome ovarien, colorectal ou pancréatique. 2 493 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 448 d'entre elles, avec des traitements administrés par gavage, dans l'eau de boisson ou par voie intrapéritonéale tous les quatre jours pendant soixante jours. Le porteur décrit une accumulation de liquide d'ascite dans le péritoine aux stades tardifs et une altération de l'état général, tout en affirmant que des résultats antérieurs ont permis de vérifier que ces points limites ne sont pas atteints, le seuil de mise à mort étant fixé à 40 % de prise de poids. Toutes sont tuées à la fin pour prélever le sang et les organes.
Objectifs
Il est reconnu que les cellules du microenvironnement tumoral, et plus particulièrement les macrophages, sont des acteurs clé dans le contrôle de la progression tumorale et de la réponse aux traitements. Plus récemment, d’autres cellules de la lignée des cellules myéloïdes, dont font partie les macrophages, ont été décrites et seraient recrutées au niveau de la tumeur. Au cours de la carcinogénèse, les macrophages, cellules de la défense immunitaire, basculent d’un phénotype anti-tumoral vers un phénotype favorisant la croissance tumorale. Ainsi, trouver des cibles et des traitements permettant de moduler le recrutement et le phénotype des cellules myéloïdes pourraient faire avancer les stratégies thérapeutiques du cancer. Nous avons en partie défini le rôle des macrophages, au cours de la progression tumorale dans différents cancers (adénocarcinome ovarien, carcinose péritonéale d’origine colorectale, cancer du pancréas). Pour la suite de ce projet, nous souhaitons tester l’efficacité de différents traitements pharmacologiques. Nous disposons de souris délétées spécifiquement au niveau des cellules myéloïdes pour des facteurs clé de la polarisation (Récepteur nucléaire PPAR-γ, facteurs de transcription LRH-1). Ainsi nous pourrons identifier plus clairement les voies de signalisation impliquées dans l’effet de nos agents pharmacologiques sur le recrutement et la polarisation des cellules myéloïdes dans la progression tumorale. Ces agents pharmacologiques pourraient agir en synergie avec les traitements de chimiothérapie conventionnelle ou éviter une rechute due à l’acquisition d’une chimiorésistance. Ainsi, nous souhaitons en parallèle étudier l’association de ces agents pharmacologiques avec le traitement de référence. Nous utiliserons ensuite des modèles déplétés pour différentes populations immunitaires (macrophages, ou lymphocytes) afin d’évaluer la part respective des différents acteurs cellulaires dans l’effet des agents pharmacologiques testés. Une autre approche thérapeutique envisagée serait le transfert adoptif de cellules myéloïdes polarisées en vue de bloquer la progression tumorale.
Bénéfices attendus
La recherche des mécanismes modulant le recrutement et les caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques des cellules myéloïdes au cours de la progression tumorale dans des modèles expérimentaux de cancers chez la souris, nous permettra de définir des cibles thérapeutiques pertinentes. L’évaluation de l’effet de différents agents pharmacologiques dans différents modèles de cancers (ovarien, colorectal et pancréatique) de proposer des thérapies ciblées selon le type de cancers.
Procédures
Les souris seront identifiées au sevrage (à 3 semaines) par tatouage au niveau des phalanges afin de pouvoir suivre de manière individuelle chaque animal. Une biopsie de queue sera effectuée pour le génotypage. Lorsque les souris sont adultes, un adénocarcinome ovarien sera induit par une injection intra-péritonéale de cellules tumorales. les souris seront ensuite traitée à l’aide d’agents pharmacologiques avec un suivi sur 60 jours (observations, suivi du poids). Deux autres types de cancers seront étudiés, un adénocarcinome colorectal et cancer du pancréas induits par une injection intra-péritonéale de cellules tumorales avec un suivi de 15 jours. Les traitements seront administrés par voie orale (eau de boisson ou par gavage) ou par voie intrapéritonéale tous les 4 jours pendant 60 jours ou tous les jours pendant 15 jours selon le modèle. Les observations et suivi dupoids nous permettront de suivre l'évolution de la maladie. Au sacrifice, des prélèvements (sang, différents organes), nous permettront d'étudier le dévéloppement des cellues tumorales et l'effet des traitements.
Impact sur les animaux
Les modèles murins trangéniques dont nous disposons dans cette étudene présenta pas de phénotype dommageable. Des tests de cytotoxicité des agents pharmacologiques seront réalisés au préalable avant l’administration des traitements aux souris afin d’éviter toutes nuisances ou effets indésirables. Dans ces modèles murins de carcinose, un liquide d’ascite s’accumule dans le péritoine lors des stades tardifs de la progression tumorale. Le développement tumoral peut engendrer un gain de poids important des souris avec une altération de l’état général. Les animaux seront mis à mort si la prise de poids est supérieure à 40% du poids initial, si les animaux présentent des signes de mutilations, des difficultés respiratoires. La durée de l’étude est définie selon des résultats antérieurs qui ont permis de vérifier que ces points limites ne sont pas atteints. Pour le traitement par injection intrapéritonéale, le point d’injection sera désinfecté et surveillé journalièrement. Pour le traitement par gavage ou dans l’eau de boisson, la prise hydrique sera évaluée journalièrement.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront euthanasiés ce qui permettra de réaliser différents prélèvements d’organes
Remplacement
Nous testerons plusieurs types de molécules (agents pharmacologiques) qui sont susceptibles de pouvoir moduler les caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques des cellules myéloïdes au cours de la progression tumorale. Ces molécules, auront été présélectionnées via des résultats préliminaires basés sur des tests in vitro qui permettent d’appréhender les effets potentiels d’une molécule sur les processus tumoraux. Des tests de cytotoxicité de ces molécules seront réalisés au préalable avant l’administration des traitements aux souris afin d’éviter toutes nuisances ou effets indésirables. Ces tests seront réalisés sur des cellules myéloïdes, population cible des molécules, et sur les lignées tumorales utilisées pour les modèles tumoraux chez la souris. Cette étape est essentielle pour éliminer les molécules pouvant induire la prolifération des cellules tumorales et pour estimer la concentration à administrer aux souris. Cette démarche permet de sélectionner les molécules et de limiter le nombre d’animaux utilisé.
Réduction
Les résultats actuels ont permis de valider, en fonction des différents et nombreux paramètres évalués, qu’un nombre de 6 souris par lot est nécessaire afin d’acquérir des données suffisantes et permettre d’effectuer des tests statistiques fiables. L’expérience et les données déjà acquises sur des souris contrôles nous permettrons de comparer la fiabilité de nos données et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux (éviter le double emploi). Le projet sera conduit en progressant par étape afin de limiter le nombre d’animaux. Une étude pilote sera menée pour déterminer l’innocuité et le choix d’agents pharmacologiques et de la durée de traitement Le choix des modèles transgéniques sera également réduit en fonction des résultats obtenues dans les premières étapes de ce projet et les approches in vitro qui seront menées en parallèle.
Raffinement
L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux. Les conditions d’hébergement permettront de conserver le comportement social des souris et de limiter le stress par l’enrichissement (papier pour la nidification, tunnel). le développement tumoral des animaux sera surveillé ainsi que son état général. Un animal sera mis à mort s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure, définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Le prélèvement de sang sera effectué sous anesthésie générale et anesthésie locale. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux en collectant le plus de données possibles. Les mécanismes impliqués dans le développement des cancers sont complexes. Ainsi, cette étude permettra d’étudier dans leur contexte physiopathologique les cellules myéloïdes, cibles thérapeutiques potentielles, et ne peut pas être mimée par une approche de culture cellulaire.
Choix des espèces
La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nous permettront d’explorer l’implication de différentes voies de signalisation, cibles pertinentes pour des approches pharmacologiques dirigées. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Adultes, souris âgées de 8 à 20 semaines afin d'avoir des souris avec un système immunitaire mature.