Rongeurs

800 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinq gavages, subir dix-huit prélèvements sanguins et cinq mises à jeun, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent des mélanges d'antibiotiques pendant quelques jours à deux mois, pour que leur flore intestinale soit détruite, puis passent jusqu'à quatre tests métaboliques comportant chacun six heures de jeûne et quatre prises de sang. Le porteur écrit que ce protocole produit "a priori peu d'effets indésirables", tout en listant déshydratation, perte de poids et diarrhées. Toutes sont tuées pour que leurs cellules intestinales productrices d'hormones soient triées, au service d'une question posée en termes de santé humaine, l'obésité et les maladies inflammatoires de l'intestin.

Objectifs

Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bactéries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des hormones qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines (EECs). Ces cellules libèrent les hormones en réponse à des modifications de leur environnement. Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Il a été montré que la déplétion complète du microbiote intestinal induit une modification importante des EECs et une augmentation des niveaux circulant de certaines hormones. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous modulerons le microbiote intestinal par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler. Nous chercherons notamment à identifier quelles sont les bactéries ou leurs produits responsables des modifications observées des EECs, ainsi qu’aux conséquences fonctionnelles des niveaux élevés de certaines hormones intestinales.

Bénéfices attendus

Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires de l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment certains produits microbiens ou certaines bactéries modulent les fonctions des EECs et quelles sont les conséquences sur la physiologie de l’hôte. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées dans différents contextes microbiens et d’en déduire les produits microbiens qui régulent ces cellules. Compte tenu des fonctions importantes de ces hormones pour la santé, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux et ainsi agir sur les fonctions quelles régulent, notamment dans le cas de maladies où ces fonctions sont altérées.

Procédures

Les 800 animaux recevront des mélanges d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant quelques jours à deux mois. Toutes les expérimentations seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront pesés deux fois par semaine, et leur consommation alimentaire mesurée en parallèle. Au maximum quatre tests métaboliques seront réalisés sur tous les animaux. Chaque test comporte une phase de jeûne (6h), quatre prélèvements sanguins au maximum, et un gavage ou une injection d’un stimulus d’intérêt Certains animaux recevront une injection préalable à l’administration du stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas deux heures entre la première prise de sang et la dernière et chaque prélèvement de sang en lui-même n’excède pas trente secondes. Un gavage supplémentaire au moment de la mise à mort (entre 10 minutes et une heure avant l’euthanasie) sera également réalisé sur des animaux mis à jeun pendant 2 à 6 heures pour la mesure du transit intestinal. Des prélèvements de sang seront réalisés lors de la mise à mort, avant le gavage et au moment de la mise à mort. Lors des mesures de transit, certains animaux recevront également une injection préalable pour étudier le rôle des hormones. Au total, les 800 animaux pourront recevoir jusqu’à 5 gavages, être prélevés pour leur sang 18 fois et mis à jeun 5 fois, en recevant les traitements antibiotiques pendant un maximum de deux mois.

Impact sur les animaux

Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux. Les effets indésirables des antibiotiques peuvent être une déshydratation, une perte de poids ou l’apparition de diarrhées. Les injections, gavages et prélèvement de sang peuvent induire une légère douleur et un stress du fait de la contention. Les jeûnes peuvent conduire à une perte de poids réduite, rattrapée les jours suivants. Les stimuli administrés n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques

Remplacement

L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin du fait de l’absence de modèles pour cultiver un microbiote complexe en contact direct avec un épithélium intestinal dans des conditions physiologiques. De plus, il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’étudier l’ensemble des EECs.

Réduction

Dans ce projet, nous utiliserons des groupes de 8 animaux de même sexe. Ce nombre a été évalué comme suffisant par l’analyse statistique des variations de chaque variable au sein d’un groupe lors de projets précédents La rareté des cellules entéroendocrines nécessitant l’utilisation de tissus entiers pour chaque application. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles car l’effet sexe est inconnu. Des analyses statistiques permettront d’étudier l’effet sexe sur la déplétion du microbiote.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter, d'un abri en propylène rouge, et d’un support suspendu et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage pour éviter l'isolement. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Une grille de décision (points limites) est établie.Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées. Les hormones intestinales et le système digestif de la souris étant très proche de celui de l’Humain, l’utilisation du modèle souris apporte des connaissances généralisables pour la santé humaine.

Aucune souris n'est gardée plus de vingt-huit jours après l'injection des cellules leucémiques, ni au-delà du point limite si elle l'atteint avant. 32 souris NSG, dépourvues de système immunitaire, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent la leucémie dans la veine de la queue, puis un traitement cellulaire une semaine plus tard, trois prises de sang caudales et des séances d'imagerie sous anesthésie après injection d'un produit dans le ventre. Le porteur décrit la maladie qu'il leur donne, poils hérissés, baisse d'activité, perte de poids et parfois début de paralysie des pattes arrière, pour comparer deux thérapies cellulaires dont l'une pourrait, à terme, persister plus longtemps chez les patients.

Objectifs

La thérapie anti-cancéreuse appelée CAR-T cells, est produite à partir des cellules du patient. Ces cellules sont modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses, ce qui permet de traiter la leucémie. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité disparait à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de ces cellules à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. De plus, nous souhaitons utiliser une nouvelle source de cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST) : celles-ci sont capables de persister à long terme chez les patients. Aussi, nous souhaitons fabriquer des cellules anti-cancéreuses à partir de ces VST. Nous obtiendrons des CAR-VST qui permettraient d’apporter un bénéfice majeur par rapport au traitement de référence par CAR-T car persistant plus longtemps dans l’organisme. Nous devons donc d’abord vérifier qu’elles sont aussi efficaces que les cellules thérapeutiques CAR-T classiques. Pour cela, nous souhaitons étudier ce nouveau traitement en comparaison au traitement actuel par CAR-T cells et montrer premièrement qu’elles sont aussi efficaces que le traitement actuel.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de déterminer si les CAR-VST possèdent un effet anti-leucémique et s’il est comparable au traitement de référence par CAR-T cells. Nous souhaitons voir un effet comparable dans cette expérimentation et valider l’acquisition de cette fonctionnalité anti-tumorale. Puis, dans une prochaine saisine, nous souhaiterions montrer que nos cellules persistent plus longuement dans un modèle de leucémie.

Procédures

-Une injection de cellules leucémiques à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J0 (1min) -Une injection de cellules « traitement » à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J7 (1min) -Un prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J14, J21 et J28 (1min) Imagerie des souris par signal lumineux des cellules tumorales : -contention manuelle et injection ventrale d’un produit d’imagerie permettant de suivre les cellules leucémiques, -pendant le temps où la substance agit (10min), induction de l'anesthésie pour que l’animal reste immobile pendant l’imagerie (30min max)

Impact sur les animaux

- L’injection intraveineuse est douloureuse mais de courte durée et elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction (arrêté par compression avec une compresse stérile). - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront une maladie type leucémie avec des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des pattes arrière. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie. Pendant la prise d'images, les souris seront endormies et ne ressentiront aucune douleur. - Le prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale sera réalisé avant l’imagerie, avec contention douce.

Devenir

Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 28 jours post injections ou en cas de point limite atteint.

Remplacement

Nous continuons à réaliser des expériences sur cellules pour générer des résultats sur le ciblage des cellules tumorales et valider leur potentiel anti-leucémique de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement développé dans un organisme. Cette saisine permet de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence.

Réduction

Nous utilisons un nombre de souris permettant de générer des résultats fiables et de sécuriser la mise en œuvre si des souris sont à exclure de l’étude du fait de la complexité des gestes techniques. Un effectif de 3 souris par groupe est suffisant selon la simulation d’un outil statistique (G-Power), mais nous souhaitons ajouter 2 souris supplémentaires dans les groupes traités, afin d’avoir une meilleure représentativité des échantillons et pouvoir mieux les caractériser. Nous aurons besoin de 16 souris pour cette saisine. Si les résultats ne sont pas probants, nous souhaitons répéter cette expérience une seconde fois. Cette saisine comprendra 32 souris au maximum.

Raffinement

Les souris seront logées dans une grande cage avec des jouets et des matériaux, avec 3 ou 5 souris par cage, pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien aérée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, une personne qualifiée vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, une grille de score permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper le mal être.

Choix des espèces

La souris NSG ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.

Le protocole revient à faire passer à des rongeurs l'équivalent préclinique des essais de phase 1 menés sur des volontaires humains sains, pour établir la dose à laquelle une molécule en développement devient toxique. 1 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les uns pour des prélèvements, les autres parce qu'ils ont reçu des substances dont le porteur ignore les effets à long terme. En douze semaines, un même animal peut recevoir jusqu'à 336 administrations, subir 64 prélèvements sanguins et passer 60 tests comportementaux, censés mesurer la motricité, la cognition, la douleur, l'anxiété et la dépression, sans qu'aucun de ces tests soit nommé. Le porteur affirme que ces modèles ont une "prédictivité reconnue", au motif qu'ils "répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché".

Objectifs

La nécessité d’évaluer la sécurité des médicaments et des molécules en cours de développement est apparue suite aux accidents thérapeutiques du début du XXème siècle voire aux tragédies comme ce fut le cas pour la thalidomide. Dans ce cadre, l’étude de l’index thérapeutique et de l’innocuité d’une molécule est primordiale. Il s’agit de déterminer les doses à administrer afin d’obtenir la concentration sanguine permettant l’effet recherché mais également d’évaluer la dose à laquelle les premiers effets secondaires apparaissent. Ces études sont fréquemment réalisées sur des rongeurs et pourraient être également considérées comme l’équivalent préclinique des études de phase 1 en développement clinique impliquant des volontaires sains. Dans ce projet, nous proposons d’administrer des composés en cours de développement à des rongeurs puis d’adresser jusqu’à 3 questions interdépendantes : - La première interrogation est de savoir comment le composé se comporte vis-à-vis de l’organisme - Ce projet permet également d’évaluer les éventuels effets secondaires d’une molécule lors de son administration aux doses que l’on souhaite utiliser pour traiter la maladie. Pour cela, des animaux sains sont traités par le composé à tester et leur comportement est observé pour détecter des effets non souhaités. - Finalement, ce projet permet de déterminer la dose d’apparition des effets indésirables. Ceci est réalisé en administrant un composé à une dose supérieure à la dose thérapeutique et à étudier leur comportement pour détecter des effets non souhaités.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la connaissance des effet secondaires des nouveaux médicaments et à la sélection de nouveaux traitements ayant une balance bénéfice/risque la meilleure possible.

Procédures

Les animaux de ce projet subiront sur une période de 12 semaines un maximum de 336 administrations, de 64 prélèvements sanguins ( en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire) et de 60 tests de comportements, ces tests de comportements permettront de mesurer l’impact de la molécule sur le système moteur, cognitif, nociceptif mais aussi sur le niveau d’anxiété ou de dépression des animaux. Les administrations durent moins de 30 secondes en prenant en compte le temps d’injection et également le temps de la contention. Une injection intraveineuse dure environ 5 min avec le temps de l’anesthésie, le temps de dilater la veine, l’injection et le point de compression au site d’injection. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Les tests de comportement sont généralement courts (entre 30 sec et 5 min) et ne dépasse pas 30 min pour le plus long.

Impact sur les animaux

LLes administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations (administration de composés, contention, …) et tests comportementaux peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun cela peut induire un stress chez l’animal. Les tests de comportement peuvent induire un inconfort thermique, un stress, une légère désorientation ou des douleurs de courte durée.

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux est mise à mort pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu’il soit possible de disséquer les mécanismes d’action des nouveaux médicaments in vitro, les réponses globales des animaux suite aux traitements sont des évènements difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi, vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les analyses du présent projet nécessitent des observations uniquement possibles chez l’animal vivant. De plus, les effets secondaires sont par nature imprévisibles. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, des prélèvements post-mortem seront associés aux études in vivo dans l’objectif de soutenir les données obtenues par des analyses histologiques ou biochimiques. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous associons plusieurs tests de comportement sur les mêmes animaux afin de ne pas multiplier les cohortes Après analyse de puissance statistique, nous envisageons d’utiliser 10 animaux par groupe. Des analyses statistiques finales sont réalisées. Les animaux incluent dans ce projet vont nous permettre de mener 50 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation. Les animaux inclus dans ce projet vont nous permettre de mener 25 études réparties sur les 5 ans de l'autorisation.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi, un certain nombre de mesures sont mises en oeuvre, avec notamment l’intégration d’une phase d’acclimatation à l’arrivée des animaux sur site (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Nous portons une attention particulière à fournir aux animaux des conditions optimales d’hébergement afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux sont hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Comme il est important que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres, nous fournissons un enrichissement important du milieu. Pour les souris, l’enrichissement du milieu comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Pour les rats, l’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton pour permettre aux animaux de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement est suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Une grille de score permet de surveiller les points limites préalablement défini et le devenir de l’animal est évaluer à l’aide d’un arbre décisionnel permettant d’éviter les souffrances inutiles.Les animaux sont pesés au minimum une fois par semaine, mais dès les premières administrations, ils sont pesés les jours d’injection ainsi que tous les jours d’expérience. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Chaque fois que les animaux sont soumis à divers tests, le choix des tests, la fréquence de leur mise en oeuvre et leur ordre d’exécution est établi afin d’impacter le moins possible le bien-être des animaux. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Des raffinements spécifiques pour chaque procédure seront mis en place.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat. De plus, tous nos modèles répondent favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permettent aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Dans ce projet, nous utilisons des jeunes adultes (souris de 4 à 5 semaines et des rats de 6-7 semaines au début du projet). Il s’agit de s’adresser à des animaux dont l’activité spontanée est suffisante pour réaliser les tests proposés.

Les souris employées sont immunodéficientes, condition qui les rend vulnérables à la moindre infection et sans laquelle elles rejetteraient le muscle humain qu'on leur greffe. 390 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une greffe chirurgicale de trente minutes sous anesthésie, une semaine de récupération, un transport routier d'une heure vers un second établissement, puis jusqu'à seize séances de résonance magnétique sous anesthésie générale en un an, chacune pouvant durer deux heures. Toutes sont tuées en fin de projet pour que le muscle greffé et les autres organes soient analysés.

Objectifs

Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Nous nous intéressons aux dystrophies musculaires, un groupe hétérogène de maladies génétiques touchant le muscle squelettique. Dans ce projet nous allons greffer des fragments de muscle humain ou des muscles 3D générés in vitro à partir de cellules humaines pour étudier la régénération musculaire chez l’homme. Notre objectif est de comprendre comment elle se déroule et comment elle peut être perturbée dans le cas des maladies touchant le muscle squelettique. Un autre objectif de notre projet est de tester la régénération musculaire in vivo d’un muscle 3D d’origine humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de comprendre comment la régénération musculaire se déroule dans le muscle squelettique humain, sain et malade (caractérisé par une dégénérescence et une faiblesse musculaire). Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension de la régénération musculaire chez l’homme et le développement de nouvelles thérapies visant améliorer la régénération musculaire chez l’homme

Procédures

Les animaux sont immunodéficients et sont donc plus sensibles aux infections. Les animaux seront soumis à une greffe musculaire, une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et analgésie d’une durée de 30 minutes. Après une période de récupération d’une semaine, les animaux seront transférés en voite double emballage avec enrichissement, croquette et hydrogel dans un second établissement par un transport de 1h par un transporteur agréé en véhicule climatisé . Après un temps d'acclimatation de 7 jours, les animaux seront soumis à des analyses par résonance magnétique nucléaire (RMN) réalisées sous anesthésie générale d'une durée maximale de 120 minutes (16 répétitions sur 1 an). A l’issue de la période de maintien, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en vue des différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Dans notre projet, nous greffons des biopsies musculaires humaines ou des muscles 3D générés avec des cellules humaines chez la souris. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection, l'animal pourrait alors ressentir une douleur locale au niveau du site d'injection. Lors des anesthésies effectuées pour l'ensemble des gestes techniques, les risques/contraintes peuvent être les suivants : effets sur le fonctionnement normal du corps pendant l'anesthésie (hypothermie, hypotension, hypoxie). Les analyses tissulaires réalisées par résonance magnétique nucléaire peuvent induire un stress de courte durée. Le phénotype dommageable de la lignée se traduit par une immunodéficience qui implique un risque accru aux infections. Le transport entre les différents établissement peuvent générer du stress.

Devenir

Ce projet implique 390 souris en total. Ces animaux seront euthanasiés en fin de projet pour l’analyse indispensable des muscles greffés et des autres organes (foie, etc) est indispensable.

Remplacement

Nous travaillons sur la régénération musculaire chez l’homme. Les études réalisées in vitro et en culture ne donnent qu’une vision partielle du comportement des cellules musculaires humaines lors de la régénération musculaire et elles ne peuvent pas recréer in vitro la complexité observée in vivo avec l’ensemble des acteurs cellulaires qui y participent.

Réduction

390 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).

Choix des espèces

La xénogreffe des muscles humain dans des animaux immunodéficients est indispensable pour pouvoir tester le comportement in vivo du tissu musculaire humain. Nous utiliserons des souris entre 2 et 3 mois d'âge. A ce stade, les souris sont déjà adultes (l’effet de la croissance pourrais affecter les résultats) et elles ont une taille facilitant la chirurgie)

Pour vérifier si l'obésité se transmet à la descendance par les ARN des spermatozoïdes, des ARN prélevés chez des hommes obèses sont microinjectés dans des œufs fécondés de souris, et la descendance est laissée grossir. 744 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À quatre mois elles subissent un test de tolérance au glucose, à quatre mois et demi un test de sensibilité à l'insuline, avec des prises de sang à la queue toutes les quinze minutes la première heure puis toutes les demi-heures. Une souris qui perd 10 % de son poids deux semaines de suite est tuée, et les autres le sont à cinq mois et demi pour prélever reins, tissus adipeux, cœur, pancréas, prostate, cerveau et foie.

Objectifs

L'obésité pose aujourd'hui un grave problème de santé publique. Bien que cette pathologie soit étroitement associée à une mauvaise hygiène de vie, de plus en plus de données épidémiologiques et expérimentales convergent vers la même idée : nos gènes se « souviennent » de l’hygiène de vie de nos parents ou en d’autres termes un phénotype nouvellement acquis ici l’obésité peut être transmis à la descendance via la lignée germinale paternelle et/ou maternelle. Ce type d’hérédité non darwinienne est un processus nouveau mettant en jeu des mécanismes dits « épigénétiques » qui font appel à des modifications qui ne sont pas codées par la séquence nucléotidique du gène. Contrairement aux modifications génétiques, les modifications épigénétiques induites par l’environnement sont instables et ne persistent que pendant 2 ou 3 générations. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ce type d’hérédité sont encore très mal connus. On sait néanmoins que les petits ARNs présents dans le spermatozoïde de souris rendues obèses par une alimentation riche en graisse et en sucre sont les vecteurs de cette hérédité. L'objectif principal de notre projet est de valider le rôle des ARN des spermatozoïdes dans l’hérédité épigénétique de l’obésité chez l'homme. Pour cela, des ARN de spermatozoïdes d’hommes obèses et d’hommes non-obèses seront microinjectés dans des œufs fécondés de souris. Les caractères obèse et diabétique seront analysés sur les animaux obtenus. La présente demande correspond à l’analyse phénotypique des animaux obtenus après microinjection et de leurs descendants.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider le rôle des ARN de spermatozoïdes comme vecteurs de l'information épigénétique de l'obésité et du diabète chez l'homme. Sur le plan fondamental, ce projet conduira à mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’hérédité de l’obésité et du diabète chez l’homme. Sur le plan clinique, cette compréhension est une étape importante pour sinon stopper au moins ralentir l’épidémie mondiale de l’obésité. Cela conduira à identifier les parents, ici les pères, susceptibles de transmettre cette maladie à leurs descendants. Dans un premier temps, ce projet apportera des arguments aux cliniciens pour intégrer les parents et les descendants de parents obèses dans des programmes de prévention. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de valider une méthode pour enlever ces marques épigénétiques délétères (marques non stables) soit via des voies interventionnelles (amaigrissement) soit par des voies moléculaires (éliminant des molécules inductrices).

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à 3 séries de prélèvements. A l'âge de 4 mois, les souris subissent un test de tolérance au glucose (Test GTT) et à l'âge de 4mois 1/2 un test pour mesurer leur sensibiltié à l'insuline (test ITT). Pour ces 2 tests, du sang sera prélevé au niveau de la queue . La glycémie est vérifiée toutes 15min la 1ère heure et toutes les 30 min la 2ème heure. A l'âge de 5 mois, les souris seront mises à mort et un prélèvement de sang sera effectué.

Impact sur les animaux

A notre connaissance, les animaux obtenues après microinjection d'ARN de spermatozoïdes ne développent pas de pathologies graves. Même si elles peuvent devenir obèses et diabétiques, la sévérité de ces pathologies reste modérée. L' Injection Intrapéritonéale de Glucose ou d'Insuline et le prélèvement à la queue, associés aux tests GTT et ITT, induisent une douleur légère de courte durée. Le prélèvement de sang en fin de procédure induit également une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure expérimentale. Cela nous permettra de prélever plusieurs tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie). Certains seront directement congelés pour des analyses moléculaires et d'autres seront fixés pour analyses histologiques. Ce matériel biologique nous est indispensable pour réaliser les analyses moléculaires nécessaires à la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'hérédité épigénétique de l'obésité et du diabète.

Remplacement

Notre travail porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis chez les mammifères et plus spécifiquement l'hérédité. L’hérédité épigénétique a été étudiée sur plusieurs modèles animaux vertébrés ou non-vertébrés. En utilisant des vers, il a été ainsi montré que les ARN étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique pour des caractères sensorielles. Le rôle des ARN des spermatozoïdes comme vecteurs connus de cette hérédité a été montré chez la souris car il n’est pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou des modèles animaux non vertébrés pour étudier le rôle des ARN dans l’hérédité épigénétique de l’obésité. C'est pourquoi nous devons utiliser ce modèle expérimental animal pour valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme. Seul le modèle murin peut permettre de récapituler toutes les étapes de développement embryonnaire d’un organisme multicellulaire de mammifère. A l’heure actuelle, ce type de différenciation ne peut pas être réalisé in vitro. C’est pour cela que ce modèle a été utilisé jusqu’à présent et a permis démontrer que les ARN de spermatozoïdes de souris étaient un vecteur de l’hérédité épigénétique de l’obésité. Pour savoir si cela reste vrai chez l’homme, seul ce modèle expérimental est disponible. C’est pourquoi nous avons choisi de l’utiliser. Nous avons utilisé comme approches alternatives le vers pour étudier les mécanismes moléculaires de l’hérédité épigénétique. Néanmoins même si grâce à cette approche, nous avons pu identifier des mécanismes moléculaires associés, nous ne pouvons définir si ces mécanismes sont identiques dans des modèles animaux expérimentaux comme la souris et si ces mécanismes épigénétiques s’appliquent pour des maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète de type II. Néanmoins les différences spécifiques entre les espèces et les tissus peuvent limiter la généralisation des résultats obtenus à partir de ce modèle non vertébré. Par conséquent, il est nécessaire d'utiliser ce modèle animal vertébré, la souris, pour obtenir une vision plus complète de la complexité de l'hérédité épigénétique de l'obésité et valider l'hypothèse selon laquelle les ARN des spermatozoïdes sont des vecteurs de l'hérédité chez l'homme.

Réduction

Avant ces expériences, nous avons utilisé, parallèlement à notre modèle murin et en collaboration, un modèle non-vertébré, Caenorhabditis elegans, un petit ver transparent et non parasitaire. Ce modèle nous a permis d’étudier certains aspects des mécanismes moléculaires de cette hérédité sans avoir recours au modèle animal vertébré. D’autre part afin de calculer la taille de l’échantillon nécessaire, nous avons réalisé un calcul de puissance basé sur nos précédentes expériences, test qui permet de minimiser le nombre d’échantillons et donc d'animaux nécessaires pour valider ou non notre hypothèse de départ. Enfin, grâce à nos analyses du transcriptome d'hommes obèses, nous avons sélectionné les hommes où les variations transcriptomiques étaient les plus fortes. Ce sont ces préparations qui seront utilisées dans ces expériences pour maximiser les potentiels effets des ARN sur la descendance.

Raffinement

Dans un souci de Raffinement, voici les dispositions que nous mettrons en place pour minimiser les souffrances éventuelles et le stress qui pourraient être générées par nos expériences : • Nous nous attendons à ce que nos souris deviennent obèses. Pour éviter de les séparer lorsqu’elles vieillissent (et ainsi de respecter le maximum de souris autorisées par cage) et de les stresser inutilement (en évitant de perturber la dominance déjà établie), les souris seront regroupées par 4 dans une cage dès leur arrivée à l’animalerie. Ces animaux seront observés hebdomadairement pour pouvoir détecter d’éventuels problèmes. Si un de nos animaux est gravement blessé (bagarre ou autres), et/ou perd 10% de son poids pendant 2 semaines consécutives, cet animal sera mis à mort et répertorié. • Un intervalle d’au moins une semaine sera respecté entre chaque test GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Toutes les souris seront manipulées au moins une fois par semaine • Les souris seront identifiées par punch à leur arrivée. Cette identification est définitive et ne peut pas induire d’infection. D’autre part, elle permet une identification rapide des souris lors des tests GTT et ITT et limite ainsi les manipulations des animaux. • Afin de limiter le stress lors des tests GTT et ITT, chaque souris sera identifiée par 0, 1, 2 ou 3 traits au feutre au niveau de la queue pour accélérer leur identification (feutre inodore spécial et non toxique). Le premier test (GTT) sera réalisé lorsque la souris sera âgée de 4 mois, le second test (ITT) sera réalisé une à deux semaines après. Lors des tests de GTT et ITT, la glycémie sera vérifiée toutes les 15 min (1ère heure) toutes les 30 min (2ème heure) pendant une période de 2 heures. Si lors des tests ITT, la glycémie est faible (

Choix des espèces

Notre projet porte sur la transmission paternelle de caractères nouvellement acquis sur un mammifère. Nous avons choisi d’utiliser la souris car la technique de micro-injection d’ARN dans les œufs fécondés est solidement établie dans cette espèce ce qui n’est pas le cas chez le rat seul autre modèle expérimental de mammifère largement utilisé pour étudier l’obésité et le diabète. D’autre part, au cas où nous voudrions poursuivre ce projet en étudiant l’impact de gènes spécifiques dans ce mode d’hérédité, nous pourrions utiliser ou générer des souris génétiquement modifiées invalidées pour le gène d’intérêt. Les pesées seront réalisées une fois par semaine de l’âge de 1 à 5 mois 1/2. Cela nous permettra de suivre le possible développement de l’obésité. Les tests GTT et ITT seront effectués à l'âge de 4 mois et 4mois 1⁄2 respectivement. En effet, nos résultats ainsi que ceux publiés par d'autres groupes montrent que la micro-injection d'ARNs spermatiques dérivant de souris obèses induit le diabète seulement chez les animaux adultes. Les prélèvements de sang terminal et d’organes et tissus (reins, tissus adipeux, coeur, pancreas, prostate, cerveau, foie) seront réalisés à l’âge de 5 mois 1/2. La mise à mort aura lieu 2 semaines après le dernier test pour que les souris récupèrent d’un éventuel stress et que les analyses moléculaires ne soient pas altérées.

Une partie des souris utilisées est irradiée du corps entier pour éliminer ses défenses immunitaires, d'autres sont immunodéficientes de naissance et développeraient des maladies hors d'un hébergement protégé. 2 580 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit des cellules tumorales sous la peau, des injections sous-cutanées, intraveineuses ou dans l'abdomen sous anesthésie, et jusqu'à six séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie, certaines étant transportées vers un autre établissement pour l'irradiation. Toutes sont tuées en fin d'étude pour que la radioactivité soit mesurée dans les organes prélevés.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos recherches est le développement de nouvelles techniques d’imagerie pour évaluer l’état d’avancement de la pathologie et permettre d’adapter les traitements de façon la plus individualisée possible à chaque patient grâce à un examen indolore d’imagerie médicale. Nous travaillons également sur une nouvelle modalité de traitement appelée radiothérapie interne vectorisée (RIV) qui utilise la même chimie que les sondes d’imagerie. Nos développent donc des solutions pour mieux détecter et traiter le cancer en « attachant» une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales. La différence réside dans le type de radioactivité utilisé : * pour la détection, on utilise de très faibles doses de radioactivité qui traverse le corps et est détectée par des caméras dédiées. * pour le traitement, on utilise de la radioactivité à très faible rayon d’action qui va détruire les cellules à proximité. Pour que le traitement par RIV soit efficace, il faut d’abord s’assurer qu’il se lie bien aux cellules tumorales, c’est pourquoi le développement de ces nouveaux traitements est souvent associé au développement d’un examen diagnostique. Il est également nécessaire de bien valider que le traitement ne va pas endommager les organes sains et qu’il exerce une action antitumorale. Nos objectifs sont donc triples : * Développer des outils diagnostiques qui serviront de socle pour déterminer si un traitement par RIV peut être développé sur une cible donnée (identifiée préalablement in vitro). * Evaluer l’efficacité antitumorale de traitements RIV visant la même cible. * En dernier lieu évaluer précisément les doses de radioactivité reçues à la tumeur mais également aux autres organes pour les extrapoler à l’homme afin de s’assurer que le traitement sera efficace sur la tumeur et sans danger sur les organes sains

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser précisément à la fois des traceurs diagnostiques d’imagerie nucléaire mais également des composés de thérapie. Il sera à terme ainsi possible de valider en amont du traitement si il se lie bien aux cellules tumorales du patient grâce à une imagerie non invasive afin de lui proposer un traitement parfaitement personnalisé par radiothérapie interne vectorisée, modalité thérapeutique actuellement en plein essor.

Procédures

* Pour certains animaux, une irradiation corps entier dans une autre EU avec transport agréé sans sortie de leur cage – une heure avec le transport. * Une injection sous-cutanée sous anesthésie – environ 5 minutes d’anesthésie et injection sur quelques secondes * Une injection intraveineuse sous anesthésie – environ 5 minutes d’anesthésie et injection sur quelques secondes * Au maximum 6 imageries sous anesthésie : au maximum 1 heure sous anesthésie pour une imagerie limitée à 55 minutes * Une injection intrapéritonéale sous anesthésie– environ 5 minutes

Impact sur les animaux

- L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu sous des conditions sanitaires strictes. - le transport pour irradiation pourrait provoquer un certain stress. - l’implantation sous cutanée de cellules tumorales va mener à une masse sous cutanée qui pourrait si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - L’injection intraveineuse pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales si elle n’est pas maitrisée. - Les produits administrés pour le diagnostic ne devraient pas impacter l’état de santé des animaux car les doses sont très faibles. Pour la thérapie, les produits peuvent provoquer une perte de poids transitoire. - Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées.

Devenir

Différentes mesures de radioactivité et analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible pour les études de biodistribution et que le traitement envisagé est bien efficace sur la lignée étudiée pour les études d’efficacité.

Réduction

Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. L’effectif d’animaux dans les groupes expérimentaux a été adapté pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant l’effectif à son maximum. Par expérience, les groupes de n=5 souris sont suffisamment robustes pour permettre d’identifier le métabolisme et la pharmacocinétique dans les études de biodistribution. L’imagerie sera répétée et permettra d’éviter d’euthanasier des animaux pour chaque point de temps examiné et ainsi de réduire l’effectif d’autant. Les effectifs devront être étoffés à n=10 pour les études d’efficacité pour prendre en compte les variabilités de réponse au traitement et de pousse tumorale sur le long terme. Enfin, les 1ères données obtenues sur les études dosimétriques permettent d’optimiser les groupes avec n=7 souris pour s’assurer l’obtention de résultats interprétables. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle, permet d’optimiser le nombre d’animaux pour chaque étude et d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.

Raffinement

L’imagerie utilisée dans nos études est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. La SBEA de l’établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 10 individus en fonction de la taille des cages et du nombre d’animaux par groupes. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera placé dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie eux-mêmes très proches des appareillages humains, facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine.