Rongeurs

Des souris génétiquement modifiées développent une maladie du muscle cardiaque après une dose de tamoxifène, donnée par la bouche à leur mère gestante juste avant la naissance ou injectée dans leur abdomen au deuxième jour de vie. 444 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tatoués aux doigts à dix jours et biopsiés à la queue, les descendants passent ensuite sous anesthésie un ECG, une IRM et une stimulation du cœur qui vise à déclencher des arythmies, avec un risque de fibrillation ventriculaire et de mort pour certaines souris. Toutes sont tuées, les reproductrices en fin de fertilité, les autres pour des analyses ex vivo, et le porteur annonce que les souris subiront "le maximum de procédures possibles" pour limiter l'effectif.

Objectifs

La mort subite cardiaque due aux arythmies cardiaques représentent jusqu’à 85 % des cas de mortalité chez des patients atteints d’infarctus ou de maladies cardiaques (cardiomyopathies). Ces arythmies sont souvent déclenchées par des cellules cardiaques spécialisées appelés fibres de Purkinje. Ces fibres forment un réseau de conduction électrique rapide assurant la contraction coordonnée du cœur afin de pomper efficacement le sang. Bien que ces fibres ne représentent qu’une infime partie du cœur (2% de la masse du cœur), plusieurs études suggèrent que des dysfonctionnements au niveau de ces fibres jouent un rôle important dans les arythmies cardiaques et la mort subite chez l’Homme. L’objectif principal de ce projet est d’élucider comment ces dysfonctionnements peuvent provoquer des arythmies cardiaques. Notre hypothèse est que des perturbations de la structure ou de la fonction des fibres de Purkinje dans certaines formes de maladies cardiaques (cardiomyopathies) représentent un facteur de risque élevé de mort subite. Pour cela nous allons étudier la structure et l’activité électrique de fibres de Purkinje des modèles de cardiomyopathies chez la souris. Parmi les modèles de cardiomyopathies, nous travaillerons sur des souris modifiés génétiquement avec une dysfonction des fibres de Purkinje, identifiés chez des patients atteints de malformations cardiaques ou de cardiomyopathies très souvent associées à des arythmies.

Bénéfices attendus

La survenue de mort subite est très souvent liée à une arythmie ventriculaire imprévisible qui dans sa grande majorité provient d’un défaut du réseau de Purkinje. Malheureusement ce réseau ne représente qu’une infime partie du cœur et son étude chez l’Homme est limitée à des mesures invasives et indirectes. L’utilisation de souris transgéniques, chez lesquelles ce réseau est facilement identifiable, est un atout majeur pour comprendre l’origine des arythmies ventriculaires. Ce projet devrait nous permettre d’identifier des facteurs de prédisposition aux arythmies ventriculaires dans plusieurs modèles de cardiomyopathies.

Procédures

Dans la procédure 1, les souris gestantes seront traitées une fois, juste avant la naissance et par voie orale avec du tamoxifène (molécule induisant les cardiomyopathies chez la descendance) (Durée : moins d’un minute). Dans la procédure 2 (6-7 semaines), la descendance aura une injection dans l’abdomen de tamoxifène au 2ème jour après la naissance (durée : Moins d’un minute), une identification par tatouage digital à 10 jours (durée: moins d’un minute), une biopsie de la queue pour le génotypage (identification de la variation génétique) (duré : moins d’un minute). Ces animaux seront sous anesthésie générale pour les analyses de l’activité électrique (ECG, IRM et stimulation cardiaque).

Impact sur les animaux

Les animaux présentant les points limites suivants seront euthanasiés par dislocation cervicale : L’administration par voie orale du tamoxifène peut provoquer un stress à l’animal et provoquer la mise-bas des femelles gestantes. De plus, au moment du traitement par voie orale, le tamoxifène peut également suivre une fausse route. Chez les nouveau-nés, l’injection de tamoxifène peut provoquer un retard de croissance. L’anesthésie générale peut entraîner des difficultés respiratoires se manifestant par des spasmes abdominaux et ne devraient pas engendrer de nuisances ou d’effets indésirables particuliers sur les souris. L’induction d’arythmies ventriculaires par la stimulation cardiaque pourrait entrainer des effets indésirables sévères (fibrillation ventriculaire, tachycardie ventriculaire) et même conduire au décès de certains animaux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasié suite à la fin de fertilité ou bien afin d’effectuer des analyses ex vivo.

Remplacement

Pour le moment, les études sur cellules, organes artificielles ou par modélisation informatique ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de la structure et fonction complexe des fibres de Purkinje. Cependant, les résultats obtenus pourront enrichir de futurs modèles mathématiques des fibres pour la réalisation de simulation virtuelle de la fonction cardiaque et des arythmies.

Réduction

Les animaux subiront le maximum de procédures possibles (sous anesthésie générale) afin d’obtenir le maximum de données sur un minimum de d’animaux. Dès que les résultats auront une puissance statistique minimale pour être exploités, la production de souris sera arrêtée.

Raffinement

Les mesures de raffinement sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adaptés) et seront manipulés par des personnes compétentes et formées. L’état des animaux sera contrôlé quotidiennement afin d’éviter toute souffrance. Les animaux seront anesthésiés quand nécessaire et des points limites sont déterminés afin d’utiliser une méthode analgésique ou bien d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : -animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner -modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), -6 à 15 souriceaux par portée -modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en termes de manipulation génétique. Les stades de développement utilisés dans ce projet sont les suivants : -Souris adultes : des souris génitrices qui permettront le maintien de la lignée de souris transgéniques (à partir 6-8 semaines jusqu’à 24 semaines) et la descendance à partir du 3ème jour jusqu’à 6 semaines.

220 souris nude immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement. Chacune est opérée sous anesthésie pendant 30 minutes pour recevoir sous la peau deux patchs d'albumine bovine, avec douleur, inflammation et risque d'infection au site d'implantation, et le porteur écarte les anti-inflammatoires non stéroïdiens parce que l'inflammation locale fait partie de ce qui est étudié. Ces implants visent à terme la régénération du cartilage chez l'humain, après des "tests plus importants sur gros animal". Le porteur conclut à la "nécessité de continuer les expérimentations" chez les rongeurs, "sans remplacement possible", et fixe l'effectif de 220 sans aucun test statistique, en annonçant des "observations directes".

Objectifs

Le développement d’implants, composés uniquement à base d’albumine et associés à l’ingénierie tissulaire, s’apparente à une nouvelle voie de recherche potentielle pour la régénération du cartilage chez l’Homme. Les implants seront entièrement composés d’albumine bovine et seront construits en deux parties : une partie dite « poreuse » et une autre partie dite « lisse ». L’objectif, ici, est de proposer un matériau bicouche biomimétique, favorisant la regénération tissulaire. Nous souhaitons, dans un premier temps, tester la biocompatibilité de ces implants chez la souris, en vue de leur utilisation pré-clinique en observant l’intégration de l’implant celllulaire après une implantation en sous-cutanée chez des souris nude immunodéprimées. Les tests in vivo sur ces souris nude seront une première étape de validation avant des tests plus importants sur gros animal, puis des applications cliniques.

Bénéfices attendus

Les biomatériaux sont devenus un élément clé pour le développement de l’ingénierie tissulaire. Nous espérons, à terme, le développement d’un nouvel implant pour la régénération du cartilage chez l’Homme. Dans le contexte actuel, cet implant offrirait une nouvelle voie de recherche, permettant ainsi de surmonter les limites des traitements conventionnels : intégration tissulaire chez le patient de l'implant, et morbidité du site donneur dans les traitements actuels prélevant un greffon d'un site donneur implanté au niveau d'un site receveur à un autre endroit du corps. Cet implant sera innovant car il sera formulé à partir de matériau d’origine naturelle, et ensemencé de cellules saines du patient lui même. Il ne nécessitera donc pas de traitement immunosuppresseur et ne sera pas sujet au rejet immunitaire. Ce projet est en accord avec les nouvelles avancées en santé humaines, visant à réaliser des implants tout biologiques et personnalisés pour chaque patient.

Procédures

Procédures chirurgicales : 1 par animal, implantation sous cutanée de deux patchs d'albumine, sur animaux anesthésiés. 30 minutes d'intervention par animal.

Impact sur les animaux

La procédure de mise en place de l’implant est une procédure invasive. Les nuisances attendues sur les animaux concernent : la douleur liée à la chirurgie, l’inflammation post opératoire, l’infection au niveau du site d’implantation.

Devenir

Mise à mort pour prélèvement.

Remplacement

Des études in vitro antérieures ont démontré l’efficacité de ces échafaudages bicouches pour l’adhésion et la différenciation de chondrocytes. Pour une étude plus approfondie, ce projet contraint de mettre en place des études in vivo. En effet, la complexité de l'environnement physiologique sous-cutané, impossible à reproduire in vitro (vascularisation, cellules du système immunitaire, molécules inflammatoires…) atteste de la nécessité de continuer les expérimentations sur un modèle animal (rongeurs), sans remplacement possible. Seuls les échafaudages bicouches efficaces in vitro seront testés sur les animaux.

Réduction

Etant donné le nombre d’analyses nécessaires (études histologiques, immunohistologiques…) et afin de valider les résultats, le nombre maximum d’animaux nécessaires a été évalué à 220 souris pour 3 ans, nombre d'animaux nécessaire pour pallier la différence interindividuelle des cellules issues des donneurs, des aléas de la chirurgie, et des nombreuses analyses prévues qui nécessiteront chacune plusieurs échantillons. Il n'y aura pas de tests statistiques, nous effecturons des observations directes.

Raffinement

Afin de nous assurer du bien-être des animaux, nous porterons une attention particulière tout d’abord à l’anesthésie per-opératoire, en faisant en plus de l’anesthésie générale, une analgésie pré opératoire. L’analgésie post-opératoire sera réalisée en injection sous cutanée. Les anti-inflammatoires non stéroidiens seront évités car les phénomènes de cicatrisation et de régénération tissulaire étudiés sont liés aux phénomènes inflammatoires locaux qui se mettent en place. La chirurgie sera privilégiée le matin car les animaux seront isolés dans une cage en post-opératoire précoce le temps du réveil, et remis en groupe dans la soirée. Nous privilégierons également l’emploi de femelles car elles présentent un comportement plus calme lors de la réintroduction en groupe après une période d’isolement. Comme l’intervention pourrait avoir des retentissements sur le déplacement de l’animal durant les premières heures après la chirurgie, la nourriture sera mise dans la litière et le bec du biberon placé bas afin de faciliter l’alimentation. Nous mettrons en place également des éléments d’enrichissement de l’environnement (bâtonnets, nids, coton…) afin de permettre la fabrication de nids notamment. Le type d’animal utilisé présente un phénotype dommageable mais les animaux seront dans des cages fermées et sur un portoir ventilé dans un environnement stérile et des conditions de manipulation adaptée à l’entretien de tels animaux. Si les animaux implantés au cours de l'étude présentent des signes précoces de douleur, d’inconfort ou de détresse (changements de comportement : animal prostré et isolé du reste du groupe, perte de poids et d’appétit, variations de leur apparence physique : anomalie cicatricielle observée au niveau des points de sutures), l’expérimentation sera arrêtée. Ces potentiels signes de douleurs seront évalués et scorés à partir d'un tableau de référence, permettant de juger si l'animal devra être mis à mort si celui ci atteint un point limite.

Choix des espèces

Pour tester la biocompatibilité et l’intégration tissualire, nous utiliserons des souris immunodéficientes : souris pour les implants, ensemencés ou non de cellules. Seuls les implants validés in vitro seront implantés chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (après 8 semaines de vie minimum) pour présenter des systèmes physiologiques matures.

Tués à l'issue pour que la réussite du geste chirurgical puisse être évaluée, 140 souris et 70 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un anesthésique par voie intrapéritonéale, deux à trois injections sous-cutanées d'analgésique, puis subissent selon l'espèce la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire ou la ligature d'un uretère, opérations d'une quinzaine de minutes. Le porteur indique que les premières séances se font sur des animaux morts et qu'il utilise en priorité des animaux surnuméraires d'autres études, mais affirme que l'animal vivant reste "indispensable" pour ressentir les différences anatomiques entre individus, leur force et leurs réactions. Le projet ne produit aucune connaissance, sept expérimentateurs d'une entreprise privée y entretenant deux gestes chirurgicaux, à raison de 20 souris ou 10 rats par compétence et par personne, pour satisfaire une exigence réglementaire de formation continue.

Objectifs

L’utilisation des animaux de laboratoire dans les procédures invasives est strictement encadrée par la loi. La bonne pratique d’expérimentation nécessite une bonne connaissance de la biologie des espèces utilisées et aussi la connaissance théorique et pratique des méthodes d’exploration sur le modèle animal. L’objectif de ce projet est de fournir des connaissances indispensables et d’enseigner les bonnes pratiques d’expérimentation animale. Dans notre entreprise, les techniciens doivent maitriser des techniques chirurgicales nécessaires à la réalisation de certains modèles, chez le rat et la souris. L’objectif de ce projet est de répondre à l’exigence règlementaire concernant la formation continue et le maintien des compétences du personnel. Ce projet vise à améliorer les pratiques expérimentales, à assurer la qualité scientifique et le bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour bénéfice le maintien et l’amélioration continue du bien-être des animaux utilisés dans nos projets de recherche préclinique, grâce au maintien et au raffinement des compétences du personnel sur les gestes techniques chirurgicaux, chez le rat et la souris. L’apprentissage et le maintien des compétences dans de telles conditions donne l’assurance de fournir des résultats fiables et dont la qualité et l’exactitude ne peuvent être remis en cause. L’entraînement permet d’acquérir une maîtrise des gestes permettant de réduire le temps d’anesthésie générale, ceci limite le stress chez l’animal. De même l’ensemble des actes impliquant une incision sont réalisés sous couverture analgésique.

Procédures

Les gestes techniques traités dans ce projet se pratiquent sur rats et /ou souris : • Les administrations intrapéritonéales d’anesthésiques sont pratiquées sur animaux vigiles en contention manuelle, à raison d’une administration par animal. Cet acte concerne l’ensemble des animaux du projet et nécessite environ 10 sec de contention. • Les administrations sous cutanées d’analgésie sont pratiquées sur animaux vigiles en contention manuelle, à raison de deux à trois administrations par animal. Cet acte concerne l’ensemble des animaux du projet et nécessite environ 10 sec de contention. • Chirurgie avec pose de cathéter à la veine jugulaire chez le rat. Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas. Une seule chirurgie est réalisée tout au long de la vie de l’animal et dure 15 minutes environ. • Chirurgie avec ligature unilatérale de l’uretère. Un protocole d’analgésie pré- et post-opératoire s’applique dans ces cas. Une seule chirurgie est réalisée tout au long de la vie de l’animal et dure 15 minutes environ.

Impact sur les animaux

Les nuisances décrites ci-dessous représentent des cas rares qui sont évités par la réalisation d’un bon tutorat et d’un apprentissage progressif. De manière générale, quel que soit le type de chirurgie, les nuisances engendrées peuvent survenir durant les gestes péri-opératoires qui impliquent des administrations aux animaux, notamment par voie intrapéritonéale avec passage possible dans la vessie ou injection dans le caecum. La régulation de la température corporelle et l’hydratation des animaux peut, si elle est mal maîtrisée, engendrer des effets indésirables durant la phase de réveil et au-delà. Post-chirurgie, les nuisances pouvant être constatées sont de type perte de poids, piloérection et prostration. Ces effets sont quantifiés et constituent des points d’arrêt anticiper de l’expérimentation. Dans certains cas, il peut arriver que la chirurgie nécessite l’hébergement en individuel, cela peut engendrer un stress chez les animaux.

Devenir

La mise à mort des animaux à l’issue des procédures est indispensable afin de pouvoir évaluer la réussite des actes chirurgicaux.

Remplacement

Avant toute manipulation des animaux, le personnel concerné procède à la lecture des procédures descriptives des techniques pour lesquelles il doit être formé, s’appuie sur les descriptions présentes dans la littérature scientifique et suit des démonstrations réalisées par le personnel compétent pour le geste technique en question. Les premières séances d’apprentissage et d’entraînement à ce type d’acte sont réalisées sur animaux morts, au préalable du travail sur animaux vivants anesthésiés. Il existe peu de solution de remplacement permettant la formation et le maintien des compétences du personnel. L’utilisation de l’animal vivant est indispensable pour ressentir les différences anatomiques inter individu, la force et les réactions de celui-ci.

Réduction

Les premières étapes de formation sur ces techniques chirurgicales sont réalisées sur des animaux morts. Nous utilisons ensuite en priorité des animaux surnuméraires des études, des animaux issus de nos élevages non entrés en expérimentation plutôt que des animaux achetés à cette fin, chez des fournisseurs agréés. Le nombre d’animaux inclus est fonction du nombre de compétences à acquérir et à maintenir et du nombre de personnes concernées. A ce jour, ce projet concerne 7 expérimentateurs et englobe 2 techniques, l’une chez la souris et l’autre chez le rat, dont les compétences sont à acquérir et/ou maintenir. 20 souris et/ou 10 rats sont nécessaires pour acquérir et/ou maintenir une compétence pour une personne. Le nombre de souris nécessaires pour acquérir et/ou maintenir une compétence est plus important que le nombre de rat, du fait de sa plus petite taille.

Raffinement

Nous incluons exclusivement des animaux en bon état général, hébergés dans des conditions respectant le bien-être animal, sous atmosphère contrôlée (température, hygrométrie, fond sonore…), avec l’enrichissement du milieu adéquat (fibre pour nidification, rouleau carton…) et en groupe sociaux harmonieux. Une phase d’acclimatation de 5 jours minimum est appliquée avant toute manipulation des animaux. Dans un premier temps, les séances d’apprentissage à ce type d’acte sont réalisées sur animaux morts. Dans un second temps ou pour des séances de maintien de la compétence, ces actes sont réalisés sur des animaux analgésiés et anesthésiés, sans réveil post chirurgie. La réalisation de ces gestes avec réveil de l’animal n’est réalisée que lorsque leur maîtrise a été validée lors des étapes précédentes, par le tuteur et/ou le responsable des compétences. L’ensemble des gestes sont réalisés en condition de stérilité (matériel stérile, utilisation de stérilisateurs à bille, etc.) afin d’éviter tout risque d’infection. Une fois anesthésiés, les animaux sont installés sur des couvertures chauffantes pour assurer le maintien de leur température corporelle. Pour les mêmes raisons, des enrichissements de type coton sont ajoutés dans leur cage pour la phase de réveil, voire au-delà. Pour les chirurgies impliquant l’ouverture de la paroi abdominale, une réhydratation à l’aide de sérum physiologique est mise en place et des cubes d’eau gélifiée avec des granulés d’aliment sont ajoutés dans les cages. Pour les animaux devant être isolés, un enrichissement supplémentaire est apporté au sein de leur cage. Les consommables utilisés (aiguilles, cathéters, fils de suture) sont stériles et adaptés à la taille de l’animal et au type de tissu impliqué afin d’éviter toute douleur ou gêne inutile. L’état clinique des animaux est évalué plusieurs fois par jour par les personnes impliquées dans ces formations ou maintien des compétences (tuteurs, soignant, etc.). Un carnet de santé, traçant précisément tous les gestes réalisés, le cas échéant les signes cliniques observés ainsi que les soins apportés, est mis en place. L’atteinte des points limites conduit à la mise à mort des animaux concernés.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces utilisées pour mener à bien nos programmes de recherche précliniques. A ce jour, de par leurs similarités physiologiques avec l’homme, ces deux espèces de rongeurs sont les plus adaptées pour évaluer les propriétés pharmacologiques de molécules d’intérêt et d’en connaître les risques de toxicité avant les premiers essais chez l'homme. Les animaux utilisés seront des animaux adultes car les études réalisées au sein de notre établissement le sont sur des individus adultes.

30 rats mâles adultes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit huit injections dans la veine de la queue, deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis enchaîne une semaine de tests, activité locomotrice spontanée sur cinq minutes, mémoire immédiate sur dix minutes, deux mesures d'anxiété de cinq minutes chacune et une mémoire de travail évaluée trois matinées de suite. L'objet est d'observer si des vésicules produites par des cellules de foie en culture exposées à des polluants alimentaires provoquent anxiété et troubles de la mémoire, les biomarqueurs et les cibles thérapeutiques annoncés relevant de l'espoir que le porteur formule. Sur le remplacement, il indique avoir remplacé les animaux non-humains par des hépatocytes en culture pour produire les vésicules, et affirme que leur effet sur le cerveau ne peut pas l'être.

Objectifs

La stéatohépatite non alcoolique est une maladie chronique qui concernerait plus de 200 000 personnes en France chaque année. Elle correspond à une accumulation de graisses dans le foie sous forme de gouttelettes lipidiques associée à une inflammation. En dehors des altérations purement hépatiques, ces stéatoses peuvent aussi être reliées à des troubles cérébraux (anxiété, stress et dépression). Des études ont conduit à évaluer l’exposition aux polluants environnementaux comme facteur favorisant la progression de cette maladie du foie. Les polluants qui seront étudiés ici sont présents dans l’alimentation et en raison de leurs propriétés lipophiles, ils s’accumulent dans le foie et le cerveau, où ils peuvent générer des troubles de l’anxiété et des altérations cognitives. L’exposition à ces polluants modifie également la quantité et les caractéristiques des petites vésicules produites par le foie, vésicules qui peuvent perturber le fonctionnement d’autres cellules de l’organisme. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons chez le rat adulte les conséquences hépatique et cérébrale de l'injection de ces vésicules libérées et isolées à partir de cellules de foie en culture et exposées à des conditions enrichies en gras et aux polluants étudiés.

Bénéfices attendus

Nous espérons ainsi identifier de nouveaux biomarqueurs d’exposition et/ou d’effets des polluants choisis ainsi que de nouvelles cibles thérapeutiques en étudiant le rôle des vésicules dans la progression de cette maladie du foie et le lien avec de possibles atteintes cérébrales. Cette étude devrait nous permettre : d’étudier l’impact au niveau du foie et du cerveau de l’administration de ces vésicules chez des rats.

Procédures

La seule intervention pouvant être à l’origine de mal-être est l’injection des vésicules à la veine de la queue, injection qui sera répétée 8 fois pour chaque animal tout au long des 4 semaines de traitement. Chaque animal sera donc injecté 2 fois par semaine pendant 4 semaines consécutives. Les tests comportementaux seront quant à eux effectués sur une période d’une semaine, entre 8h et 13h. Un premier test consistera à évaluer l'activité locomotrice spontanée de l’animal durant 5 minutes. La mémoire immédiate de l’animal sera également testée pendant une durée de 10 minutes. Deux tests complémentaires, chacun d’une durée de 5 minutes seront réalisés pour évaluer le niveau d'anxiété des animaux. Un dernier test se proposera d'évaluer la mémoire de travail des animaux. Il sera réalisé sur 3 jours consécutifs pendant 5 minutes par matinée. Ainsi chaque animal effectuera un à deux tests par jour pendant une semaine.

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables identifiés attendus sont les suivants : stress de contention lié à l'injection des vésicules extracellulaires ainsi que le stress lié à l’introduction de l’aiguille dans la veine caudale . D’après les éléments de la littérature et l’expérience des porteurs du projet, aucun des tests comportementaux prévus ne provoque des signes de mal-être chez les animaux.

Devenir

Une fois les tests comportementaux réalisés, les animaux seront mis à mort et les tissus d’intérêts à l’étude seront prélevés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Nous avons remplacé l’utilisation d’animaux pour la production des VE par des hépatocytes en culture soumis à un environnement enrichi en graisse et/ou en polluants environnementaux. Cependant, l’impact de ces vésicules sur les fonctions du foie et du cerveau (activité, anxiété, mémoire de travail) ne peut pas être évalué sur des cellules de foie isolées, ni remplacé.

Réduction

Le nombre total d'animaux est le nombre estimé juste et nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs du projet dans des conditions de réalisation acceptables garantissant ainsi le bon déroulement de l'expérimentation, la prise en charge adaptée des animaux de façon à garantir au mieux leur bien-être et une exploitation statistique satisfaisante des résultats. Le nombre de 27 animaux prévu a été déterminé pour une puissance statistique fixée a priori de 0,90, des effectifs égaux dans les 3 groupes expérimentaux (n=9/groupe) et la variation estimée la plus sensible dans l'ensemble des mesures effectuées. A ce nombre, nous nous laissons la possibilité d’ajouter 1 individu supplémentaire par groupe de manière à pallier à une éventuelle atteinte de seuils critiques irréversibles. Soit un total de 30 animaux au maximum (n=10 par groupe).

Raffinement

Les animaux qui seront achetés pour ce projet seront maintenus et élevés selon les conditions d’élevage habituelles en accord avec les contraintes fixées par la réglementation, placés à 2 par cage selon les dispositions réglementaires dans des portoirs ventilés avec des buchettes et frisure de papier kraft comme enrichissement. Leur comportement sera surveillé afin de s'assurer de l'absence de mal-être ou de comportement agressif entre les animaux. En ce qui concerne les injections à la veine caudale, la douleur sera contrée par badigeon avec un anti-douleur local et le stress induit par le tube de contention sera réduit par une habituation d'une durée d'une semaine.

Choix des espèces

Des rats adultes mâles ont été choisi pour être plus représentatif de la réalité humaine où les hommes présentent un taux d’incidence de stéatohépatite deux fois plus élevé que les femmes. Les animaux entreront dans l’étude à l’âge de 6 semaines et seront acclimatés à leur nouvel environnement pendant 8 à 10 jours. A ce stade ils auront atteint leur maturité sexuelle et sont donc considérés comme jeune adulte, ce qui est représentatif du profil de la population touchée.

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, dépourvue des défenses qui lui permettraient de rejeter les cellules tumorales qu'on lui greffe. 8 172 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Éveillées, elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous la peau du flanc, puis des traitements deux fois par semaine jusqu'à l'atteinte du point limite, environ trois semaines pour les groupes non traités, et pour certaines quatre injections directement dans la tumeur dès qu'elle atteint 100 mm3. Leur mort permet les analyses post-mortem, le porteur revendiquant la nécessité de valider dans "un organisme dans son intégralité" des observations qu'il a d'abord obtenues sur lignées cellulaires.

Objectifs

Les immunothérapies anti-tumorales visent à détruire les cellules cancéreuses en stimulant ou en réorientant le système immunitaire (SI). Ces traitements sont prometteurs et permettent déjà de guérir des patients, mais certaines tumeurs échappent au SI et il est essentiel d’améliorer ces approches. Les lymphocytes T tueurs sont des cellules essentielles pour l’immunité anti-tumorale. Pour fonctionner, elles ont besoin de reconnaître un peptide (appelé néoantigène - néoAg), exprimé par les cellules cancéreuses. Identifier les mécanismes de production de néoAgs et des stratégies pour moduler leur expression est un enjeu central de la recherche en immunothérapie. Les chercheurs ont longtemps cherché des néoAgs provenant de gènes codants, dérivant de mutations acquises par les cellules tumorales pendant le développement du cancer. Mais ces mutations sont souvent spécifiques à chaque patient, et donc difficiles à cibler. Il faut donc trouver d’autres sources de néoAgs. On parle souvent du rôle des gènes dans le développement de pathologies humaines, mais ils représentent seulement 2% du génome. On a longtemps pensé que le reste du génome (dit silencieux) ne s’exprimait pas. Plusieurs études récentes ont montré que le génome silencieux peut s’exprimer dans les tumeurs et favoriser leur destruction par le système immunitaire. L’inactivation de gènes impliqués dans « la mise sous silence » du génome silencieux permet son expression et conduit à une meilleure reconnaissance des tumeurs par le SI. Ils sont donc des candidats prometteurs pour le développement de thérapies. Il reste cependant beaucoup à comprendre sur la nature exacte de la régulation de ce génome silencieux et c’est le but de ce projet. Le premier objectif est d’identifier des gènes participant à sa « mise sous silence ». Le deuxième est de cibler ces gènes pour améliorer la réponse immunitaire anti-tumorale. Le troisième est de déveloper un traitement pour spécifiquement réveiller une partie du génome silencieux codant pour un néoAg pour améliorer les réponses immunitaires anti-tumorales. L’objectif général du projet est de comprendre les mécanismes de régulation du génome silencieux pour mieux instruire l’établissement de protocoles d’immunothérapie.

Bénéfices attendus

Il est essentiel de noter que la très grande majorité des cancers développent des mécanismes très efficaces qui inhibent la réponse immunitaire. Un enjeu actuel de la recherche en immunothérapie est d’identifier des mécanismes de productions de néoantigènes (qui seraient des nouvelles cibles) par les cellules tumorales et d’établir des traitements ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet. Ces expériences vont permettre de mieux caractériser le ou les mécanismes de régulation du génome silencieux dans les cellules tumorales. En effet, certains éléments du génome permettent de produire des protéines spécifiques de la tumeur et capables d’augmenter la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur et non les tissus sains. Par ailleurs, ce projet cherche à mettre en place un protocole permettant d’augmenter l’expression de ces néoantigènes afin de pouvoir les utiliser dans des stratégies thérapeutiques pour améliorer de manière large la réponse des cancers à l’immunothérapie.

Procédures

Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées à des souris par voie sous-cutanée au niveau d’un des flancs, sur animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Un à deux prélèvements sanguins (2 semaines après injection) et/ou au moment de la mise à mort des animaux seront réalisés sur animaux vigiles (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 sec). Dans une deuxième procédure, après l’injection de cellules tumorales (identique à la 1ère procédure), les animaux seront traités par injection sur animaux vigiles 2 fois par semaine (durée du geste inférieure à 10sec), jusqu’à l’atteinte du point limite (environ 3 semaines pour les souris recevant les tumeurs sans traitement) ou pour un maximum de 60 jours (si les tumeurs sont rejetées). Un à deux prélèvements sanguins (2 semaines après injection) et/ou au moment de la mise à mort des animaux seront réalisés sur animaux vigiles (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 sec). Dans une troisième procédure, les animaux seront injectés par voie sous-cutanée au niveau du flanc (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Dans une quatrième procédure, des cellules tumorales seront injectées sur les animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Dès que les tumeurs atteignent environ 100mm3, le traitement sera injecté dans la tumeur des animaux vigiles à raison de 4 injections tous les 4 jours ( durée du geste inférieure à 10 sec). Un des groupes d’animaux sera également injecté en intraveineuse 24h avant le début du traitement.

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Pour les expériences d’injections de cellules tumorales ou des traitements, il est attendu une douleur directe associée à l’utilisation d’une aiguille. Pour le prélèvement de sang, il est attendu une douleur légère liée à la réalisation (gène de courte durée). En ce qui concerne les injections intratumorales, nous utiliserons un format de traitement utilisé en routine pour traiter des patients par injections locales. Aucune inflammation n’est attendue après ce traitement, mais les souris peuvent ressentir de la douleur pour un temps limité après l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour des analyses post-mortem

Remplacement

Les lignées tumorales ont d’abord été étudiées in vitro (marqueurs de surface, croissance). Dans le cas des traitements visant à manipuler spécifiquement l’expression de néoantigènes dérivant du génome silencieux, des expériences ont été réalisées in vitro dans les lignées cancéreuses, nous savons donc qu’elles réagissent à ce traitement. Le projet est aussi avancé que possible, cependant des tests in vivo sont maintenant nécessaires pour comprendre le rôle de ces lignées sur la réponse immunitaire dans un contexte physiologique entier. En effet, dans le cas des lignées cellulaires déficientes pour des gènes de régulation, nous allons analyser la présence de cellules immunitaires entre les conditions déficientes et contrôles grâce à un prélèvement de sang.

Réduction

Lorsque cela est possible, afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés, les études sont réalisées au préalable sur des lignées cellulaires in vitro, modifiées pour les gènes d'intérêt. Nous pouvons ainsi tester un nombre important de paramètres, puis passer aux modèles animaux uniquement quand le projet est aussi avancé que possible. Cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet. Néanmoins, il est nécessaire de valider ces observations dans le contexte d'un organisme dans son intégralité plus physiologique. Le nombre d'animaux par groupe est défini à l'aide d'un outil statistique.

Raffinement

Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte des points limites. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés 2 à 3 fois par semaines pour leur état général et pour mesurer la taille de la tumeur.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes. Enfin, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantables disponibles.