Rongeurs

Fournir à des clients de l'industrie pharmaceutique des échantillons de sang de rongeur : 2 160 souris et 270 rats vont être utilisés à cette fin, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un composé par gavage, injection ou voie intratrachéale, puis jusqu'à huit prélèvements de sang en vingt-quatre heures, ou deux par semaine pendant plusieurs semaines. Certains subissent une chirurgie de quarante minutes pour la pose d'un cathéter, et quand un gros volume de sang est commandé, la souris est anesthésiée, sa cage thoracique ouverte et le sang prélevé directement dans le cœur. Le porteur indique ne réaliser aucun test statistique sur les données produites, le protocole étant fixé par le mode d'administration, la fréquence et la durée que le client demande.

Objectifs

Au cours du développement préclinique, un grand nombre d’études sont effectuées afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité des candidats médicaments. Les études pharmacocinétiques, qui sont menées en parallèle, permettent d’étudier le devenir du composé dans un organisme vivant. Classiquement, il s’agit de caractériser son absorption, sa distribution dans l’organisme, son métabolisme et enfin son élimination. Les données collectées dans le cadre de ces études permettent notamment d’affiner les doses et par conséquent de contribuer à la détermination de fenêtres/marges thérapeutiques, qui matérialisent la zone de concentrations permettant d’observer une efficacité tout en limitant la survenue d’effets secondaires/toxiques. En tant que prestataire de services pour l’industrie pharmaceutique, nous proposons à nos clients de réaliser la phase expérimentale de leurs études pharmacocinétiques. Ce projet a donc pour objectif de fournir à nos clients des échantillons de sang prélevés chez le rongeur (rat ou souris) et dont l’analyse permettra de connaître les variations de concentration plasmatique des candidats médicaments au cours du temps après une administration unique ou répétée.

Bénéfices attendus

Les échantillons de sang collectés seront traités et les plasmas ou sérums obtenus seront analysés par nos clients afin d’établir le profil pharmacocinétique de leur candidat médicament et de déterminer les doses qui permettront d’obtenir un effet optimal avec des effets secondaires maitrisés.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations de composés soit par voie orale (gavage), intrapéritonéale, sous-cutanée (durée inférieure à 1 minute) ou intraveineuse à la veine de la queue (durée inférieure à 5 minutes) ; soit par voie intranasale, intratrachéale, topique (durée inférieure à 1 minute) ou intraveineuse à la veine jugulaire sous anesthésie gazeuse (durée inférieure à 5 minutes). Dans la majorité des cas il s’agira d’une administration unique, mais elles pourront également être répétées sur plusieurs jours ou semaines. Des prélèvements répétés de sang seront réalisés soit sur animal vigile via un cathéter vasculaire, à la veine de la queue ou submandibulaire (souris uniquement), soit sur animal anesthésié par ponction directe de la veine jugulaire (durée: quleques minutes). Ces prélèvements seront réalisés le plus souvent pendant les 24 à 72h suivant l’administration avec un maximum de 8 prélèvements sur 24h, mais ils pourront également être étalés sur plusieurs semaines (2 prélèvements par semaine maximum). Certains animaux subiront des chirurgies d’implantation de cathéters vasculaires (durée de la chirurgie : environ 40 minutes) et/ou de pompes osmotiques en SC (durée de la chirurgie : environ 20 minutes) . Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être effectué en intra-cardiaque de façon terminale (durée inférieure à 1 minutes) sous anesthésie chez le rat, sous anesthésie et analgésie morphinique chez la souris.

Impact sur les animaux

Pour les administrations de composés, les animaux seront maintenus en contention, ce qui peut générer du stress. Un ou plusieurs gavages pourront être réalisés, ou des injections de composés impliquant l’introduction d’une aiguille. Certaines modalités d’administration nécessiteront d’avoir recours à l’anesthésie des animaux. Certains animaux subiront également une chirurgie d’implantation de pompe osmotique et/ou de cathéters qui pourra nécessiter de les isoler dans leur cage d’hébergement. Des prélèvements de sang seront réalisés, impliquant parfois des ponctions directes dans les vaisseaux à l’aide d’une aiguille ou d’une lancette. Ces prélèvements pourront nécessiter également d’anesthésier les animaux et ce de façon répétée. Dans le cadre de prélèvements multiples, jusqu’à 8 prélèvements pourront être réalisés toutes les 24h sur 24 à 72h, ou encore 2 prélèvements maximum par semaine pendant plusieurs semaines. Lorsque des volumes importants de sang seront nécessaires, le prélèvement pourra être réalisé en intracardiaque de façon terminale : dans ce cas les animaux seront anesthésiés et une thoracotomie sera réalisée pour les souris.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter différents organes.

Remplacement

Si des méthodes d’extrapolation in vivo des effets observés in vitro sont de plus en plus utilisées, comme la modélisation pharmacocinétique à fondement physiologique, ces approches présentent malgré tout encore certaines limites, notamment la difficulté à paramétrer certains processus mis en jeu en particulier pour les phases d’absorption et d’excrétion. Ces approches ne constituent qu’une aide à la caractérisation des interactions pharmacocinétiques, et l’évaluation in vivo du devenir d’un composé dans un organisme vivant reste incontournable.

Réduction

Toutes les mesures seront prises pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet tout en prenant en compte les besoins de nos clients (volumes de sang, nombre de points de prélèvements, de voies d’administrations et de doses à tester nécessaires). Chaque animal pourra être son propre contrôle, et le recours à des prélèvements répétés au cours du temps sur le même animal permet également de limiter le N total par étude. Nous ne réalisons pas de tests statistiques sur les données obtenues. Le nombre d'animaux par groupe (N=3 par dose ou par temps de prélèvement) a été déterminé sur la base de nos études précédentes où il est apparu qu'un nombre de 3 animaux est le nombre minimum permettant de conclure sur le profil pharmacocinétique d'un composé en tenant compte de la variabilité inter-individuelle.

Raffinement

L’ensemble des expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement grâce à une grille de score. Des points limites précis et spécifiques à chaque procédure sont également préalablement établis afin de s’assurer que toute douleur/souffrance éventuelle des animaux pourra être détectée et prise en charge rapidement. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie et les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie appropriées. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention. Les prélèvements sanguins ainsi que les volumes d’administration seront réalisés selon les recommandations éthiques. Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. Lorsque qu’une chirurgie sera nécessaire pour l’implantation de pompe osmotique ou de cathéter, elle sera réalisée en conditions aseptiques, et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue (minimum 2 fois par jour) en phase post-opératoire. De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie.

Choix des espèces

Ces études de pharmacocinétique vont permettre de déterminer les doses qui seront ensuite utilisées pour les études d’efficacité et de pharmacologie de sécurité chez le rongeur, ce qui justifie le choix des espèces retenues pour ce projet. Le choix entre souris et rat sera ensuite conditionné notamment par l’historique des études déjà réalisées par nos clients, le choix du modèle de pathologie envisagé par la suite, et les volumes de sang requis pour les bioanalyses. Les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : - Des rats de tous âges soit environ 150 à 600g - Des souris de tous âges soit environ 20 à 40g L’âge des animaux dépendra du protocole à réaliser, des objectifs de l’étude et des candidats médicaments à tester

848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'abdomen et un prélèvement de sang sous anesthésie, puis développent des lésions intestinales bénignes, effet recherché par le protocole. Le bénéfice annoncé tient à la découverte éventuelle de marqueurs précoces du cancer colorectal, quand l'atteinte est provoquée dès le départ chez chaque animal. L'effectif de 848 n'est rattaché à aucun calcul, le porteur indiquant seulement s'appuyer sur des données antérieures et vouloir engager de petits groupes pour abandonner vite les pistes non concluantes.

Objectifs

Le cancer colorectal (CCR) reste un problème majeur de santé publique malgré les progrès réalisés ces dernières années. De ce fait, il est urgent de développer des outils permettant un suivi précoce de patients à risque, permettant la mise en place de traitements adaptés minimisant l’évolution des lésions précoces en lésions cancéreuses. A ce titre, ce projet se focalisera sur les mécanismes biologiques impliqués dans l’initiation tumorale, l’élucidation de ces derniers pouvant aboutir à de nouvelles cibles thérapeutiques ou aider au dépistage. Plusieurs études ont montré le rôle critique de certaines cellules tapissant l'intestin dans la mise en place d’une réponse immunitaire dérégulée, pouvant potentiellement favoriser l’initiation tumorale. L’objectif de ce projet est de découvrir comment ces cellules peuvent dialoguer avec le système immunitaire et favoriser l’inflammation. Nous nous focaliserons sur le rôle d'une classe de molécules messagères particulières de l’inflammation. Notre stratégie expérimentale visera à comparer la fréquence d’initiation de lésions intestinales bénignes dans des souris pour lesquelles un gène responsable de la production de ces molécules sera inactivé ou non.

Bénéfices attendus

Nous attendons des résultats prometteurs, permettant une meilleure compréhension des toutes premières étapes de la mise en place d'un environnement inflammatoire dans le tube digestif, connu comme facteur augmentant le risque de développement de lésions précancéreuses. A ce titre, ce projet peut avoir des bénéfices en termes de découverte de biomarqueurs précoces (à visée préventive et diagnostique).

Procédures

Les animaux recevront des injections de substances (les injections durent moins d’une minute), et un seul prélèvement sanguin sous anesthésie (d’une durée de 5 min).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis aux nuisances suivantes : injection de substances par voie intrapéritonéale et prélèvement sanguin, générant un stress et une douleur de manière ponctuelle. L'effet indésirable est le développement, à terme, de lésions intestinales bénignes.

Devenir

Les individus seront euthanasiés et utilisés pour prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Les questions posées dans le cadre de ce projet (interactions entre types cellulaires et organes différents) impliquent l’utilisation de modèles murins reflétant au mieux la physiologie d’un point de vue intégrée. La réponse aux questions soulevées dans ce projet ne peut en aucun cas être abordée par un seul modèle de substitution.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini en nous appuyant sur les données précédemment obtenues, afin de nous permettre d’obtenir des données interprétables. Notre stratégie pour réduire le nombre d’animaux consistera à engager de petits groupes d’individus, nous permettant de valider ou d’invalider nos hypothèses de travail le plus rapidement possible. Si une de nos pistes de travail ne s’avère plus pertinente, les expériences associées seront abandonnées, réduisant de fait le nombre d’animaux engagés en procédures.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale consiste à analyser les individus à des temps très précoces, pour minimiser la mise en place de l'initiation de lésions intestinales, et demander un suivi de ces derniers lors des changes hebdomadaires. Afin de réduire au maximum la douleur et l’angoisse que certaines procédures pourraient engendrer chez les animaux, les animaux seront traités avec des anesthésiques et des analgésiques. Une stratégie de suivi adaptée sera mise en place pour le devenir des animaux (grilles de scores), incluant des points limites suffisamment prédictifs.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif et immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. Les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet sont d'excellents modèles pour induire l'apparition de lésions intestinales, récapitulant leur développement chez l'homme. Les animaux seront étudiés entre 6 et 20 semaines d'âge, dès lors que le système digestif est mature.

Privées de leurs organes génitaux par une chirurgie avec réveil, puis exposées vingt et un jours à des manques d'oxygène répétés huit heures par jour, 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie subit un infarctus du myocarde provoqué sous anesthésie générale pendant trois heures, une autre un jeûne de six heures suivi d'une injection d'insuline et de six prélèvements de sang à la queue en quatre-vingt-dix minutes. L'objet déclaré est de comprendre comment les hormones sexuelles modifient les effets cardiaques de l'apnée du sommeil. Le porteur indique que le manque d'oxygène provoque dyspnée, perte de poids, stress et baisse d'activité, tout en concluant que les souris "s'adaptent" au bout de trois jours, et il chiffre à 20 % la mortalité attendue pendant l'infarctus.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil est une des maladies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, elle peut entrainer des maladies cardiaques. Cette maladie correspond à des apnées répétitives pendant le sommeil, entrainant un manque d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de nombreux problèmes dans l’organisme dont des complications cardiaques. De plus les hormones sexuelles jouent dans le développement de cette maladie. En effet il y a plus d’hommes que de femmes qui en sont atteints (2 hommes pour 1 femme). Chez les femmes l’apparition de cette maladie augmente après la ménopause et chez les hommes cette maladie entraine une diminution de leurs sécrétions de testostérone. Les connaissances cliniques et fondamentales sur les interactions entre le sexe et le coeur en hypoxie sont très peu connues. Ainsi l’objectif de ce projet est de comprendre précisément le lien entre le sexe, le manque d’oxygène et la dysfonction cardiaque associés,à travers l’ 1) évaluation de l’ infarctus du coeur chez les souris mâles et femelles ne produisant plus hormones sexuelles, exposées à l’hypoxie, 2) évaluation des interactions entre les protéines activées pendant le manque d’oxygène en fonction des hormones sexuelles de la souris. En considérant le rôle des hormones sexuelles dans cette étude, nous aurons une contribution unique permettant de mettre en lumière des aspects qui n’ont pas été évalués dans les modèles précliniques d’une maladie qui se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles selon l’Organisation Mondiale de la Santé.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux comprendre le fonctionnement du syndrome d’apnées du sommeil qui est répandu et fortement associé aux maladies cardiovasculaires qui, selon l’Organisation Mondiale de la Santé, se place aux plus hauts rangs des maladies mortelles. En considérant le rôle des hormones sexuelles, nous aurons une contribution unique permettant de mettre en lumière des aspects qui n’ont pas encore été évalués dans les modèles précliniques.

Procédures

Pour répondre à la première partie du projet les souris seront opérés pour retirer leurs organes génitaux, afin de ne plus produire d’hormones sexuelles (15min). Ensuite les souris seront placées en hypoxie ou en normoxie pendant 21 jours. A la fin de leur exposition à l’hypoxie ou à la normoxie, elles subiront une infarctus du cœur sous anesthésie générale (3h). A la fin de cette procédure, sous anesthésie générale et sans réveil, elles seront mises à mort par prélèvement cardiaque. Pour répondre à la deuxième partie du projet, les souris seront opérés pour retirer leurs organes génitaux, afin de ne plus produire d’hormones sexuelles (15 min). Ensuite les souris seront placées en hypoxie ou en normoxie pendant 21 jours. Elles subiront un test de tolérance à l’insuline ou au glucose. Ce test consiste à injecter de l’insuline ou de glucose chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60 et 90 minutes après l’injection (30 secondes par injection ou prélèvement). A la fin de leur exposition à l’hypoxie ou à la normoxie, elles seront mises à jeun pendant 6 h puis injectées ou non à l’insuline, puis mises à mort par prélèvement de sang sous anesthésie générale (mise à mort au bout de 30 secondes d’anesthésie générale), puis les organes d’intérêt seront prélevés pour réaliser les études mécanistiques associées au projet.

Impact sur les animaux

L’hébergement des souris dans l’animalerie conventionnelle de HP2 entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement de la machine permettant la mise en place de l’HI. L’ablation des organes génitaux des souris étant une chirurgie avec réveil peut être une source de stress et de douleurs pour l’animal. L’exposition à l’HI induit une dyspnée, une perte de poids, un stress et une diminution de l’activité chez la souris, qui interviennent exclusivement pendant la phase d’hypoxie (8h/j), qui correspond à la phase de sommeil des animaux. Ces atteintes sont transitoires, la perte de poids et la dyspnée sont observées au cours des 3 premiers jours d’exposition, puis les animaux s’adaptent et les courbes de prise de poids sont ensuite parallèles à celles des animaux exposés à la normoxie. Le test de tolérance à l’insuline et au glucose chez l’animal éveillé nécessite une mise à jeun de 6 heures et une injection intrapéritonéale d’insuline, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal.

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements d'organes.

Remplacement

Sur des modèles cellulaires, il est possible d’avoir des modèles d’hypoxie ou d'infarctus. Cependant, ces deux modèles nécessitent le même stimulus (i.e. manque d’oxygène). Donc ils ne peuvent pas être étudiés simultanément sur un modèle in vitro. Pour notre projet nous ne pouvons donc pas « remplacer » ce modèle animal par un autre modèle cellulaire puisqu’il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant de comprendre l’effet de l’hypoxie et de l’infarctus du cœur sur les organes et l’organisme entier. Il s’agit d’une étude du corps animal entier, impliquant des modifications de l’organisme et une communication entre les organes. Il est donc impossible de la remplacer.

Réduction

Suite à des travaux antérieurs, nous avons « réduit » au maximum le nombre d’animaux par groupe pour observer des éventuelles différences significatives. Nous utiliserons un logiciel statistique pour réaliser des tests adaptés aux paramètres à évaluer. Le nombre d’animaux est calculé par connaissance du nombre de données finales nécessaire par technique pour réaliser des tests statistiques adéquats, et observer des différences significatives (p

Raffinement

Un hébergement selon les règles de bien-être animal dans une animalerie adaptée et autorisée, avec eau et nourriture à volonté, et enrichissements à leur disposition dans les cages. Les animaux seront toujours manipulés après une semaine minimum de repos dans l’animalerie. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie. Ils seront observés quotidiennement dans leur cage pendant toute la durée de l’hébergement et du protocole d’hypoxie, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet. Pour toutes les procédures qui le nécessitent, les animaux seront sous anesthésie générale avec des antalgiques et les animaux ne seront pas réveillés. Une fois endormies, elles seront transférées sur tapis chauffants pour maintenir leur température corporelle leur température. Du lacrygel sera mis sur les yeux des animaux pour empêcher le dessèchement oculaire L’anesthésie sera vérifiée tout au long de la chirurgie (pincement de la patte postérieure ou de la queue). Tous les gestes et soins effectués sur les animaux seront réalisés par des personnes formées et compétentes.

Choix des espèces

La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être extrapolées à l’Homme, notamment dans le cadre d’études systémiques, permettant ainsi de comprendre les mécanismes physiologiques avant d’entreprendre des études cliniques chez l’humain. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est le modèle de référence dans les publications. Les souris auront 6-14 semaines, ceci correspond à l’âge adulte de l’animal, cela nous permet de minimaliser les variations possibles liées à l’âge de l’animal.

444 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon la procédure, le tamoxifène qui déclenche la maladie cardiaque des souriceaux génétiquement modifiés est donné par la bouche à la mère juste avant la naissance, au risque de provoquer la mise bas ou une fausse route, ou injecté aux petits au deuxième jour. Suivent un tatouage aux doigts, une biopsie de la queue, puis ECG, IRM et stimulation cardiaque sous anesthésie. Le porteur écrit que le projet "devrait" permettre d'identifier des "facteurs de prédisposition" aux arythmies, alors que la stimulation peut provoquer fibrillation ou tachycardie ventriculaire et la mort de certaines souris. Il écarte cellules, organes artificiels et simulation au nom de l'"organisme entier", et le même texte figure sous un second numéro de projet, avec 444 souris également.

Objectifs

La mort subite cardiaque due aux arythmies cardiaques représentent jusqu’à 85 % des cas de mortalité chez des patients atteints d’infarctus ou de maladies cardiaques (cardiomyopathies). Ces arythmies sont souvent déclenchées par des cellules cardiaques spécialisées appelés fibres de Purkinje. Ces fibres forment un réseau de conduction électrique rapide assurant la contraction coordonnée du cœur afin de pomper efficacement le sang. Bien que ces fibres ne représentent qu’une infime partie du cœur (2% de la masse du cœur), plusieurs études suggèrent que des dysfonctionnements au niveau de ces fibres jouent un rôle important dans les arythmies cardiaques et la mort subite chez l’Homme. L’objectif principal de ce projet est d’élucider comment ces dysfonctionnements peuvent provoquer des arythmies cardiaques. Notre hypothèse est que des perturbations de la structure ou de la fonction des fibres de Purkinje dans certaines formes de maladies cardiaques (cardiomyopathies) représentent un facteur de risque élevé de mort subite. Pour cela nous allons étudier la structure et l’activité électrique de fibres de Purkinje des modèles de cardiomyopathies chez la souris. Parmi les modèles de cardiomyopathies, nous travaillerons sur des souris modifiés génétiquement avec une dysfonction des fibres de Purkinje, identifiés chez des patients atteints de malformations cardiaques ou de cardiomyopathies très souvent associées à des arythmies.

Bénéfices attendus

La survenue de mort subite est très souvent liée à une arythmie ventriculaire imprévisible qui dans sa grande majorité provient d’un défaut du réseau de Purkinje. Malheureusement ce réseau ne représente qu’une infime partie du cœur et son étude chez l’Homme est limitée à des mesures invasives et indirectes. L’utilisation de souris transgéniques, chez lesquelles ce réseau est facilement identifiable, est un atout majeur pour comprendre l’origine des arythmies ventriculaires. Ce projet devrait nous permettre d’identifier des facteurs de prédisposition aux arythmies ventriculaires dans plusieurs modèles de cardiomyopathies.

Procédures

Dans la procédure 1, les souris gestantes seront traitées une fois, juste avant la naissance et par voie orale avec du tamoxifène (molécule induisant les cardiomyopathies chez la descendance) (Durée : moins d’un minute). Dans la procédure 2 (6-7 semaines), la descendance aura une injection dans l’abdomen de tamoxifène au 2ème jour après la naissance (durée : Moins d’un minute), une identification par tatouage digital à 10 jours (durée: moins d’un minute), une biopsie de la queue pour le génotypage (identification de la variation génétique) (duré : moins d’un minute). Ces animaux seront sous anesthésie générale pour les analyses de l’activité électrique (ECG, IRM et stimulation cardiaque).

Impact sur les animaux

Les animaux présentant les points limites suivants seront euthanasiés par dislocation cervicale : L’administration par voie orale du tamoxifène peut provoquer un stress à l’animal et provoquer la mise-bas des femelles gestantes. De plus, au moment du traitement par voie orale, le tamoxifène peut également suivre une fausse route. Chez les nouveau-nés, l’injection de tamoxifène peut provoquer un retard de croissance. L’anesthésie générale peut entraîner des difficultés respiratoires se manifestant par des spasmes abdominaux et ne devraient pas engendrer de nuisances ou d’effets indésirables particuliers sur les souris. L’induction d’arythmies ventriculaires par la stimulation cardiaque pourrait entrainer des effets indésirables sévères (fibrillation ventriculaire, tachycardie ventriculaire) et même conduire au décès de certains animaux.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront euthanasié suite à la fin de fertilité ou bien afin d’effectuer des analyses ex vivo.

Remplacement

Pour le moment, les études sur cellules, organes artificielles ou par modélisation informatique ne peuvent pas remplacer l’organisme entier en raison de la structure et fonction complexe des fibres de Purkinje. Cependant, les résultats obtenus pourront enrichir de futurs modèles mathématiques des fibres pour la réalisation de simulation virtuelle de la fonction cardiaque et des arythmies.

Réduction

Les animaux subiront le maximum de procédures possibles (sous anesthésie générale) afin d’obtenir le maximum de données sur un minimum de d’animaux. Dès que les résultats auront une puissance statistique minimale pour être exploités, la production de souris sera arrêtée.

Raffinement

Les mesures de raffinement sont mises en place à toutes les étapes du projet, notamment au cours de l’hébergement (cage collective, litière et enrichissement adaptés) et seront manipulés par des personnes compétentes et formées. L’état des animaux sera contrôlé quotidiennement afin d’éviter toute souffrance. Les animaux seront anesthésiés quand nécessaire et des points limites sont déterminés afin d’utiliser une méthode analgésique ou bien d’interrompre le protocole en cas d’apparition de signes de détresse.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : -animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner -modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), -6 à 15 souriceaux par portée -modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en termes de manipulation génétique. Les stades de développement utilisés dans ce projet sont les suivants : -Souris adultes : des souris génitrices qui permettront le maintien de la lignée de souris transgéniques (à partir 6-8 semaines jusqu’à 24 semaines) et la descendance à partir du 3ème jour jusqu’à 6 semaines.

Une injection sous la peau tous les deux à trois jours pendant huit semaines, trois mesures de tumeur par semaine, jusqu'à quatre prélèvements sanguins : 85 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit dans le flanc des cellules cancéreuses humaines, laisse croître une tumeur sous la peau, puis reçoit dans la veine de la queue des cellules immunitaires modifiées censées la détruire. La mise à mort sert à prélever le sang et la tumeur. Le porteur retient des souris NSG, incapables de combattre la moindre infection et maintenues en milieu protégé pour cette raison, et affirme qu'"aucune alternative non-animale n'est aujourd'hui disponible".

Objectifs

Les immunothérapies, stratégies privilégiées contre le cancer, visent à stimuler le système immunitaire du patient pour éliminer les cellules cancéreuses. Il est possible de récupérer et modifier les cellules immunitaires du patient, afin qu’elles reconnaissent les cellules cancéreuses, avant de les réinjecter au patient, avec une efficacité clinique démontrée. Nous avons généré des cellules immunitaires capables de reconnaître un sous-type de cancer du sein très agressif et d’autres cancers agressifs et capables d’éliminer des cellules cancéreuses in vitro. Cependant, il est nécessaire de vérifier le potentiel thérapeutique in vivo. Dans ce projet, nous utiliserons des souris permettant l’étude de la croissance des tumeurs en présence des cellules immunitaires spécifiques de la tumeur, avec pour objectif de valider la capacité de ces cellules immunitaires à éliminer les cellules tumorales in vivo. Différents traitements de soutien aux cellules immunitaires injectées seront administrés permettront de sélectionner la condition expérimentale la plus efficace.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positifs, cette étude permettra de valider une nouvelle opportunité thérapeutique pour les patients atteints de cancer, du sein, de l’ovaire ou de sarcome. Ceci accélèrera la validation préclinique de cet outil thérapeutique afin d’entamer le transfert vers la clinique.

Procédures

Pour réaliser l'injection sous-cutanée de cellules cancéreuses humaines, la souris est maintenue environ 15 secondes. Une seule injection est effectuée par animal. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. L’injection intraveineuse, se fera au niveau de la veine de la queue (1 min d’immobilisation). Injection sous cutanée de molécules de soutien des cellules lymphocytes ou sérum physiologique : tous les 2 à 3 jours pendant 8 semaines maximum (d'après ce qui est décrit en moyenne dans la littérature). Des prélèvements sanguins seront également réalisés sur animaux vigiles, l’animal est maintenu immobile environ 50 secondes (15 secondes pour l’application de l’anesthésique puis 45 secondes pour le prélèvement). Ces prélèvements seront réalisés 3 ou 4 fois en fonction des groupes. Les souris seront également pesées deux fois par semaine, la souris est maintenue environ 15 secondes.

Impact sur les animaux

Les cellules tumorales seront injectées en sous-cutané dans le flanc droit de la souris, sur animal vigile. Pour cela l’animal est tenu en contention. Le volume injecté est faibl. Une seule injection est réalisée par animal, d’une durée d’environ 15 secondes. Suite à cette injection la souris développera une tumeur. La croissance tumorale sera suivie par mesure au pied à coulisse (3x/sem, 15 sec) sur animal vigile. Le traitement consiste en une injection intraveineuse de cellules immunitaires modifiées. A ce jour, aucun effet indésirable associé au transfert de cellules immunitaires modifiées chez la souris n’a été rapporté dans la littérature. Nous n’envisageons donc pas d’effets indésirables liés à ce traitement. De même aucun effet indésirable n’a été reporté dans la littérature concernant l’injection en sous-cutanée de protéines solubles. Néanmoins, les animaux peuvent ressentir un désagrément voire une douleur modérée au moment des prélèvements sanguins qui est minorée par l’utilisation d’une anesthésie locale

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir analyser la composition du système immunitaire dans le sang et au sein de la tumeur.

Remplacement

Des expériences in vitro ont déjà été réalisées afin de confirmer la fonctionnalité des cellules immunitaires générées et leur capacité à éliminer des cellules tumorales. Les animaux sévèrement immunodéprimés (NSG) correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires puisqu’ils permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires murines. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires génétiquement modifiées in vivo, ce qui est un des objectifs de cette étude.

Réduction

Cette procédure devrait nous permettre de sélectionner la condition expérimentale permettant d’observer le meilleur effet de notre traitement. Cette condition sera utilisée par la suite pour évaluer d’autres candidats de thérapie cellulaire. Nous avons utilisé un outil statistique (G-power) permettant de définir le nombre minimal d’animaux nécessaires et suffisants pour satisfaire la validité scientifique de l’étude. Par ailleurs, un nombre optimal d’échantillons et de données seront collectés pour chaque animal pour utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour répondre à l’ensemble des questions de l’étude.

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet n’ont pas de système immunitaire, ils sont donc incapables de lutter contre des infections virales ou bactériennes. Ils doivent être hébergés dans un environnement protégé pour éviter toutes contaminations. Les analyses de croissance des tumeurs sont non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par l’observation quotidienne des animaux par des personnes compétentes, par la pesée des animaux et la mesure du développement tumoral. Des points limites adaptés sont définis de manière objective, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance. Aucun effet indésirable lié à l’injection des cellules immunitaires humaines dans le modèle de souris utilisé n’est attendu. Les prélèvements sanguins peuvent entrainer une douleur, pour pallier cela les animaux sont traités par un anesthésique local quelques min avant les prélèvements.

Choix des espèces

Les souris utilisées correspondent au modèle majoritaire pour l’évaluation de l’efficacité des thérapies cellulaires utilisant des cellules immunitaires puisqu’elles permettent la greffe de cellules tumorales humaines et l’injection de cellules immunitaires humaines en l’absence de cellules immunitaires de souris. Ce modèle est le seul modèle vivo disponible dans le cadre de notre projet, aucune alternative non-animale n’est aujourd’hui disponible pour s’assurer de la fonctionnalité des cellules immunitaires transférées in vivo, ce qui est l’objectif de cette étude. Les animaux utilisés seront à l’âge de 6-8 semaines afin de pouvoir réaliser les greffes sous-cutanées et l’injection en intraveineuse des cellules immunitaires dans des conditions optimales.

1 260 souris vont être utilisées, chacune subissant au moins une chirurgie intracérébrale d'une heure, répétée pour certaines, puis jusqu'à huit tests comportementaux, tendance à la rotation, capacité motrice, anxiété, agilité, mémoire spatiale, coordination, force de saisie et force neuromusculaire. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour collecter leur cerveau. Le porteur reconnaît qu'un très faible pourcentage ne se réveillera pas après la chirurgie et que la multiplicité des tests provoque stress et fatigue. Sur le remplacement, il écrit que ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro parce qu'elles dépendent d'un modèle murin de la maladie de Parkinson, argument qui prend le recours à la souris pour sa propre justification.

Objectifs

La maladie de Parkinson est caractérisée par une dégénérescence progressive de certains neurones cérébraux. Ce projet vise à évaluer l'impact de cette dégénérescence sur l'expression des gènes, les marques épigénétiques (modifications de l’ADN non génétique), et le statut de maturation des neurones impliqués. Nous utiliserons un modèle de souris pour la maladie de Parkinson qui induit la perte de neurones et des déficits moteurs. Les objectifs majeurs du projet sont d’analyser les changements moléculaires et physiologiques dans certains neurones suite aux lésions, de comparer les changements dû au sexe, et d'identifier des cibles thérapeutiques modifiables afin de restaurer une activité normale. Ce projet impliquera 1260 animaux et ne peux pas être remplacé par d’autres modèles. Plusieurs analyses seront effectuées sur chaque animale afin de réduire leur nombre, et des mesures spécifiques assureront le minimum de nuisances sur le bien-être des animaux. Ce projet permettra de mieux comprendre la maladie de Parkinson et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour son traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet analysera les changements moléculaires et physiologiques dans les interneurones du cortex moteur primaire de la souris adulte en réponse d’une synucléinopathie dans la substantia nigra comme modèle de la maladie de Parkinson. Ce projet permettra d'identifier des cibles thérapeutiques modifiables dans ces interneurones pour restaurer une activité normale de neurones moteurs, et d’identifier les différences dû au sexe. Ce projet permettra de mieux comprendre la maladie de Parkinson et d’ouvrir de nouvelles perspectives pour le traitement de cette maladie.

Procédures

Une injection intracérébrale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 1 heure et sera effectuée au moins une fois sur tous les animaux, et deux fois sur certains animaux. Les animaux seront soumis 2 fois au test de tendance à la rotation qui durent 10 minutes. Les animaux seront soumis 2 fois à un test de capacité motrice qui durent 3 minutes par jour sur 5 jour. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau d'anxiété et dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test d'agilité qui dure 2 minutes par jour sur 5 jour. Certains animaux seront soumis à un seul test de mémoire spatiale qui dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de coordination motrice qui dure 5 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de force de saisie qui dure 3 fois 1 minute. Certains animaux seront soumis à un seul test de force neuromusculaire qui dure 3 fois 1 minute.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale. Comme pour toute chirurgie, il se peut qu’un très faible % de souris ne se réveille pas après la chirurgie. Les tests de comportement et leur multiplicité peuvent provoquer du stress et de la fatigue chez les animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort et leurs cerveaux sont collectés pour plusieurs analyses.

Remplacement

Nos recherches sur les effets de la dégénérescence des neurones dopaminergiques nécessitent des souris pour comprendre comment cela impact les circuits cérébraux impliquants notamment les interneurones du cortex moteur. Nous utilisons la souris comme modèle pour s'appuyer sur les résultats de recherches antérieures. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent d’un modèle murin de la maladie de Parkinson.

Réduction

Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses sur chaque souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée avec un tapis chauffant jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine, pour éviter le stress de l'isolement, et sont observés et pesés quotidiennement pendant 2 jours avec alimentation plus riche. Pour évaluer les points limites, les animaux seront inspectés quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciale), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront une alimentation enrichie.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la maladie de Parkinson. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines. Ce projet implique un modèle de la maladie de Parkinson qui nécessite des souris adultes. La pathologie sera initiée chez des souris âgées de 60 jours, considérées comme de jeunes adultes. Des analyses comportementales, histologiques et moléculaires seront effectuées entre 3 et 9 mois plus tard pour permettre à la pathologie de se développer.

Greffées d'une tumeur en sous-cutané, 2 500 souris passent des séances de radiothérapie de cinq à cinquante minutes sous anesthésie gazeuse, et reçoivent des médicaments par gavage, en intrapéritonéal, en intraveineux ou en sous-cutané, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit qu'aucun effet secondaire dû à la radiothérapie n'est attendu et qu'aucun analgésique ne sera donc employé, tout en prévoyant la mise à mort par dislocation cervicale des animaux prostrés, désorientés, amaigris ou présentant une nécrose au point d'injection. L'équipe dispose d'un appareil rare en France et traite à ce titre les souris de collaborateurs et de sociétés privées qui font appel à ses services. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur indiquant qu'ayant reçu un traitement et des cellules cancéreuses elles ne peuvent servir à une autre étude.

Objectifs

L’objectif des projets nécessitant de la radiothérapie préclinique est de développer l’association de la radiothérapie avec d’autres traitements anticancéreux de types chimiothérapie, thérapie ciblée, nano médicaments ou encore immunothérapie dans le but d’améliorer l’efficacité. Ces projets nécessitent d’optimiser les schémas d’association (traitement administrés en même temps ou en décalée et dans ce cas déterminer le laps de temps optimal entre l’administration du médicament et la radiothérapie) et les fractionnements (dose et nombre de séances) optimums de la radiothérapie afin de pouvoir proposer en essai clinique les combinaisons de traitements les plus efficaces. Notre équipe possède un appareil de radiothérapie tridimentionnelle guidée par l’image permettant de délivrer des traitements par radiothérapie similaires à ceux délivrés pour les patients. Ce type d’installation et de savoir-faire restent rares sur notre territoire Français et unique dans un rayon de 300km autour de notre site géographique. C’est pourquoi des collaborateurs ou sociétés privées, évaluant des combinaisons à base de radiothérapie, font appel à nos services pour délivrer des traitements de radiothérapie sur leur souris. Ce projet a été évalué et validé par le comité scientifique de notre établissement.

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer l’efficacité des traitements en optimisant des combinaisons innovantes, en utilisant des médicaments de divers types et en déterminant les meilleurs schémas de combinaisons (administré en même temps ou en décalé, doses totales de Radiothérapie et le nombre de séance de radiothérapie…). Les études que nous mènerons dans le cadre de ce projet nous permettront de sélectionner les schémas de combinaisons les plus prometteurs en terme d’efficacité sans induire de toxicités chez les petits rongeurs. Ceux-ci pourront être sélectionnés pour le développement d’essais cliniques. Les autres candidats, moins prometteurs, seront écartés et ne seront pas utilisés dans de futures études.

Procédures

- Développement des tumeurs : Injection sous cutanée de la tumeur (une seule fois). Le développement de la tumeur prend environ 10 jours à partir de la date d'injection. -Les médicaments (chimiothérapie, immunothérapie, thérapie ciblée ou nanoparticules) seront administrés: par voie orale (utilisation d’une canule spécifique permettant l’administration du médicament directement dans l’estomac) ou en intrapéritonéale (injection) sur des animaux non anesthésié ; ou en intraveineuse ou sous cutanée sur des animaux sous anesthésie gazeuse (Isoflurane 2%)- Les animaux seront traités par Radiothérapie sous anesthésie gazeuse (Isoflurane 2%). Ces séances pourront durer entre 5 minutes et 50 minutes selon la technique utilisée. - Des animaux pourront avoir une imagerie IRM sous anesthésie gazeuse - Des prélèvements de sang pourront être réalisés (au niveau maxillaire) sous anesthésie gazeuse (volume maximum prélevé et fréquence selon les recommandations de l’annexe 1). - Après euthanasie des prélèvements d’organes/tumeurs pourront être réalisés.

Impact sur les animaux

Aucun effet secondaire ou nuisance dû à la Radiothérapie n’est attendu. Concernant les médicaments qui seront combinés à la radiothérapie, nous utiliserons des doses n’ayant pas induits de toxicités dans des études précédentes in vivo ou études préliminaires (in vitro, par essais de cytotoxicité). Cependant, une attention particulière sera donnée sur une potentielle apparition de nécrose au niveau du site d’injection en intraveineux ou en sous cutanée des molécules associées.

Devenir

Etant donné que les animaux auront reçu un traitement et une injection de cellules cancéreuses, ils ne pourront être utiliser pour une autre étude. Ainsi, tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’étude de l’efficacité des médicaments, utilisés en combinaison avec de la radiothérapie, ne peut se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’étude sur animaux. De plus, pour l’étude d’association avec des médicaments modulant le système immunitaire (immunothérapies) nous sommes dans l’obligation de travailler avec des animaux immunocompétents. Enfin, il est largement décrit dans la littérature que l’effet de la radiothérapie dépend du niveau d’oxygénation de la tumeur (hétérogène uniquement en clinique et sur le modèle animal) et du microenvironnement tumoral qui est l’ensemble des cellules constituant la tumeur (cellules cancéreuses, cellules des vaisseaux sanguins, cellules immunitaires…). Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour ces études. Toutefois des études préalables des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permettront de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT).

Réduction

Pour l’évaluation de l’efficacité d’une combinaison (un médicament et une radiothérapie), il sera nécessaire de traiter 4 groupes d’animaux (contrôle-véhicule ; médicament évalué (chimiothérapie, thérapie ciblée, immunothérapie, nanoparticule…) ; radiothérapie seule ; combinaison médicament +radiothérapie. Nous prévoyons d’évaluer ces efficacités avec 8 animaux par groupe pour les modèles de tumeurs d’origine humaine qui seront greffées sur des souris immunodéficiences et 10 animaux par groupes pour les modèles de tumeurs d’origines murines qui seront greffées à des souris immunocompétentes. Ces effectifs tiennent compte de notre expérience sur la variabilité observée pour ces différents modèles de cancers et permettent de pouvoir conclure à une potentielle supériorité des combinaisons en utilisant des tests statistiques validés.

Raffinement

Les séances de radiothérapie seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de maintenir les animaux immobile et de réduire leur niveau de stress. Après une séance de radiothérapie, les animaux sont réveillés sous lampe chauffante pour prévenir toute hypothermie puis replacés dans leur cage. La douleur associée à cette procédure ne nécessitera donc pas l’emploi d’analgésique. Aucune toxicité n’est attendue suite à la radiothérapie délivrée et les doses utilisées des médicaments associées seront celles utilisées usuellement en préclinique, n’ayant pas induit de toxicité dans des études précédentes réalisée sur souris, ou dans des études vitro (sur des cellules en culture) de cytotoxicités. Cependant, si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), ou si une nécrose est observées au niveau du site d’injection des médicaments, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Durant leur hébergement, les souris seront maintenues dans des cages ayant une surface adaptée pour accueillir 8 à 10 individus. L’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront données à volonté. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage permettant la formation de nids.

Choix des espèces

Le modèle de souris est parfaitement approprié car les expérimentations sur culture cellulaire ne permettent pas de reproduire la complexité d’un organisme complet, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. En oncologie, la plupart des modèles expérimentaux de cancers humains sont développés chez la souris. Dans le cas d’étude avec de l’immunothérapie, la souris porteuse de tumeurs d’origine de souris reste le modèle de choix dans les études de l’activation du système immunitaire anti-tumoral. La formation de tumeurs dans des souris homogènes (même type de souris) permet de travailler avec un nombre d’animaux relativement réduit et de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Pour ce projet nous prévoyons de traiter 2500 souris porteuses de tumeurs pour une durée de 5 ans (500 souris par an). Les animaux seront utilisés à un âge minimum de 8 semaines de manière à avoir un système immunitaire mature pour les souris immunocompétentes et un poids corporel d’au moins 18-20 g afin d’avoir une pharmacocinétique des médicaments homogène.