Rongeurs

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une injection sous-cutanée de PACAP-38 pour déclencher une migraine, puis subit des tests de sensibilité de la face et des pattes toutes les trente minutes pendant quatre heures, avec des filaments de Von Frey et des jets d'air. Le porteur indique que le retrait de la face ou de la patte signe une douleur modérée, et souligne que l'animal, libre de ses mouvements, peut échapper à la stimulation. Les bénéfices annoncés, comprendre les différences entre mâles et femelles puis développer des molécules pour les patients qui ne répondent pas aux traitements actuels, sont renvoyés au moyen et au long terme, l'objectif immédiat étant de mettre au point le modèle de migraine lui-même.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer un nouveau modèle de migraine en se basant sur les derniers résultats scientifiques et la clinique. Le PACAP, est une molécule qui est libérée lors des crises de migraine par les fibres nerveuses au niveau des méninges. Ainsi pour être au plus proche de la réalité clinique, nous souhaitons utiliser le PACAP pour provoquer l’activation des circuits de la douleur impliqués dans la migraine chez la souris. Pendant la phase « mal de tête », la douleur ne peut être générée qu’au niveau des méninges puisqu’il n’existe pas de récepteurs à la douleur dans le cerveau. Nous évaluerons les effets de cette molécule au niveau du comportement, mais également en utilisant des marqueurs d’activation neuronale, tels que Fos et pERK chez le mâle et la femelle. Nous souhaitons comparer d’une part l’activation des régions du système nerveux central chez les mâles et les femelles pour voir s’il y a des différences entre les mâles et les femelles, mais aussi en fonction des variations hormonales qui ont lieu pendant le cycle sexuel chez la femelle.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet nous permettra de développer un modèle animal plus proche de la clinique et des dernières études scientifiques. les mécanismes d’intégration de la douleur méningée au niveau du système nerveux périphérique et central chez les mâles et les femelles. En effet la migraine touche plus les femmes que les hommes, mais les études ont été majoritairement réalisées chez les mâles. Pourtant, il est connu qu’il existe des différences d’intégration inhérentes au sexe et au cycle hormonal. Ainsi à moyen terme, identifier les différences ainsi que le rôle des différentes régions cérébrales dans ce nouveau modèle murin de migraine nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A long terme, il serait intéressant de comprendre comment des molécules telles que le PACAP peuvent induire des migraines. Ceci permettrait de développer de nouvelles molécules pour offrir des alternatives aux patients qui ne répondent pas aux traitements proposés actuellement comme les triptans ou les anti-CGRP.

Procédures

Mesure de la sensibilité cutanée céphalique et extra-céphalique : les jours d’injection pendant 4h toutes les 30 minutes ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air après l'injection des molécules en sous cutané (chaque application dure 3 secondes). Les jours entre les injections, la mesure se fait une fois.

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Enfin, les stimulations mécaniques avec les filaments de Von Frey ou les jets d’air avec l’AirPuff induisent un retrait de la face ou de la patte signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure au maximum 3 secondes.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau ainsi que d'autres organes pouvant servir à d'autres études : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Il est donc nécessaire de réaliser les observations chez l’animal in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela évitera de mettre à mort de nouveaux animaux pour ces autres études.

Raffinement

La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur engendrée dans le cadre du modèle. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique), nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les point limite fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher ainsi que de papier de nidification, élément important pour la souris. La mise à mort est réalisée par une overdose de ketamine /xylazine.

Choix des espèces

La souche C57BL6 est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui est difficilement réalisable chez le rat. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les souris sont considérées comme adultes.

Soumises à une chirurgie crânienne de trois heures, 380 souris subissent ensuite des séances d'isolement pouvant atteindre quarante-huit heures et une privation de sommeil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever leur tissu cérébral. Les tests portent sur le déplacement et le remplacement d'objets, dix minutes par séance avec trois heures d'isolement avant et après l'acquisition, et cherchent à savoir si la stimulation d'une petite structure, le Claustrum, restaure la consolidation des souvenirs chez des souris génétiquement modifiées modélisant la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que des groupes de vingt animaux sont nécessaires pour en amener douze au bout du protocole, l'expression du virus et le placement de la fibre à 50 micromètres près échouant sur les autres.

Objectifs

Le Claustrum est une petite structure télencéphalique ayant la caractéristique de projeter à l’ensemble du cortex cérébral. Outre son rôle supposé dans la conscience, il est associé à diverses fonctions physiologiques, allant de la régulation du cycle veille-sommeil à la modulation des processus attentionnels. De manière intéressante, des études récentes suggèrent un rôle central du Claustrum dans les mécanismes de consolidation mnésique, i.e. le processus permettant le stockage à long terme des informations mnésiques nouvellement acquises. Cette perspective revêt une importance particulière étant donné que ces processus de consolidation sont altérés précocement dans la maladie d'Alzheimer, une pathologie caractérisée, entre autres, par des déficits mnésiques. Des données préliminaires sur un modèle murin pré-clinique de la maladie d'Alzheimer (génétiquement modifiée) ont révélé une altération précoce de l'activité claustrale. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le fonctionnement du Claustrum en condition normale et pathologique, avec un accent particulier sur son rôle potentiel dans la modulation des processus de consolidation mnésique. Une approche novatrice consistera à restaurer une activité claustrale physiologique dans le but de récupérer un phénotype comportemental sain chez des souris génétiquement modifiées modélisant la phase pré-clinique de la maladie d'Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra donc de 1) caractériser pour la première fois l’activité physiologique du Claustrum au cours du cycle veille-sommeil et en fonction des différents états de vigilance ; 2) de déterminer par quels mécanismes le Claustrum sous-tend la consolidation mnésique et 3) de déterminer si la stimulation spécifique de ce noyau mimant son fonctionnement physiologique permet de restaurer une consolidation mnésique normale chez un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer. Cette étude permettra de mieux comprendre le réseau cérébral impliqué dans le processus de consolidation mnésique, tout en ouvrant de nouvelles perspectives pour restaurer cette consolidation dans le contexte pathologique de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Lors de la procédure 1, Les animaux seront soumis à une chirurgie (3h). Ils seront isolés le temps d’expériences de déplacement d’objet ainsi que de remplacement d’objet avec des jours d’habituation, d’acquisition et de test (10 minutes par séance). Ils seront également isolés pour des durées plus longues lors de l’aquisition (3h avant et après les 10 minutes) ainsi que lors de la privation de sommeil

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induire de la douleur et une altération de l’état de santé des animaux. Un isolement de maximum 48h sera nécessaire après la chirurgie ainsi que pour l’expérience d’enregistrement de l’activité Claustrale en fonction des états de vigilance durant un nycthémère complet (procédure 1). Cet isolement pourra provoquer un stress. Les souris des groupes d’activation ou d’inhibition pharmacologique du claustrum et leur contrôle devront subir une contention avant l’injection en intra-péritonéal de l’agent pharmacologique ou véhicule. La contention ainsi que l’injection peuvent causer un état de stress chez l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever le tissu cérébral fixé

Remplacement

Notre projet vise à étudier le rôle du Claustrum dans la consolidation de la mémoire et ses possibles altérations chez un modèle murin de la maladie d’Alzheimer. A l'heure actuelle, ce projet ne peut ni être réalisé à l’aide de modèles cellulaires, ni être simulé par des techniques informatiques. En effet, la mémoire repose sur la présence d’interactions fonctionnelles dynamiques entre structures cérébrales et nécessite donc de travailler chez l’animal.

Réduction

Les calculs de puissance sont pris en compte dans la détermination du nombre d'animaux requis pour les expérimentations. Les expériences d’imagerie calciques associées à l’approche pharmacologique et celles d’optogénétique sont dépendantes : 1) de la bonne expression des virus et 2) d’une localisation exacte (à 50µm) de la fibre. Les expériences précédentes réalisées chez nos collaborateurs montrent que des groupes de 20 animaux sont nécessaires pour arriver à 12 animaux effectuant l’entièreté du protocole et pouvoir détecter des différences inter-groupes de l'ordre de 15-20%. Des tests statistiques paramétriques sont effectués.

Raffinement

La chirurgie sera opérée sous anesthésie gazeuse supplémentée par une couverture analgésique locale par injection sous-cutanée au niveau de la zone d’incision chirurgicale. Une pommade d’anesthésique local limitera les douleurs aux oreilles dues aux barres d’oreilles, l’ajout de pommade à base de vitamine A limitera le dessèchement oculaire. Pendant la chirurgie une injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien assurera l’analgésie et il sera ajouté au biberon pendant 1 à 3 jours pour assurer l’analgésie post-opératoire. Enfin, la température corporelle sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté. La lutte contre l’hypothermie se poursuit jusqu’au réveil complet de l’animal en plaçant sa cage sous une lampe chauffante. Elle sera suivie d’un isolement de 48 heures maximum afin de ne pas provoquer de changement dans la hiérarchie dans la cage, en laissant le temps à la souris de bien se remettre de la chirurgie. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience par du personnel formé, plus particulièrement avec une observation détaillée la semaine suivant la chirurgie. En amont des expériences, les animaux seront familiarisés à la manipulation par l’expérimentateur afin de diminuer le stress. Ils seront également habitués à l’utilisation d’une boite (plutôt qu’un tunnel qui abimerait le dispositif électrophysiologique) pour le transport de l’animal depuis sa cage d’hébergement au dispositif expérimental et vice-versa. Un isolement temporaire sera nécessaire mais ne dépassera pas 12h pour réaliser les tâches comportementales et la privation de sommeil.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est la souris. La question posée requiert un modèle animal possédant une structure neuroanatomique comparable à celle du cerveau humain. En particulier l’hippocampe, le cortex frontal sont des cibles majeures du Claustrum et sont affectées dans la maladie d’Alzheimer. Ces structures anatomiques sont conservéeschez la souris, mais pas chez des organismes plus simples tels que C. Elegans, drosophile ou poisson zèbre. Le modèle génétiquement modifié de la maladie d’Alzheimer (disponible au laboratoire) constitue un modèle de référence pour étudier l’impact de la pathologie amyloïde sur la dynamique cérébrale. L'ensemble des souris sera utilisé à un stade de développement correspondant à de "jeunes adultes". Les procédures débuteront entre 8 et 10 semaines. En effet, à cet âge, le système nerveux central est complètement développé (les interneurones hippocampiques sont matures à l’âge d’1 mois), et les souris présentent d’excellentes performances de mémoire spatiale.

Fortement immunodéprimées pour ne pas rejeter les tumeurs ovariennes humaines greffées sous la peau de leur flanc, 636 souris de cinq à six semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit trois injections intraveineuses d'anticorps conjugués dans la veine de la queue, et subit jusqu'à vingt-quatre pesées et vingt-quatre mesures de tumeur au pied à coulisse. Le porteur reconnaît que la croissance de la tumeur peut gêner la locomotion et que la contention pour ces mesures génère du stress et une douleur possible au niveau de la tumeur. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever les tumeurs, l'effectif comptant 10 % d'animaux greffés en plus pour compenser les prises de greffe manquées.

Objectifs

Le cancer de l’ovaire est la 9ème cause de cancer chez la femme, le nombre de nouveaux cas diagnostiqués en 2020 en France est estimé à 5320, avec 200 000 nouveaux cas dans le monde entier. Cela en fait, en France, la 5ème cause de mortalité par cancer (CIRC, 2021). Le cancer de l’ovaire peut être asymptomatique pendant longtemps, c’est pourquoi il est malheureusement souvent diagnostiqué à un stade avancé, et le taux de survie des patientes n’est alors que de 17% à 5 ans. Malgré une efficacité initiale élevée, les types les plus courants de carcinomes ovariens rechutent fréquemment en formes résistantes aux chimiothérapies. Les anticorps conjugués à des drogues font partie d’une nouvelle classe de thérapie ciblée. Ils consistent à fixer la chimiothérapie sur un anticorps dirigé contre un récepteur exprimé à la surface des cellules cancéreuses pour la véhiculer au cœur de la tumeur. Ce projet vise à tester l’efficacité anti-cancéreuse de 9 anticorps conjugués dans 4 modèles de cancer de l’ovaire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie de traitement par les anticorps conjugués soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de cancer de l’ovaire. Les données issues de ce travail seront totalement innovantes puisqu’elles porteront sur des composés qui n’ont jusqu’à présent jamais été évalués dans une étude d’efficacité pré-clinique dans le contexte du cancer de l’ovaire, et qui contribueront potentiellement à un meilleur pronostic et survie chez les patients atteints de cette affection.

Procédures

- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 3 injections intraveineuses d’anticorps conjugués à raison d’un par semaine dans la veine de la queue, 30 secondes. Au maximum 24 pesées et 24 mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de 3 par semaine.

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). L’injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut entrainer une gêne à la locomotion. Les injections en intra-veineuse hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Le traitement avec chacun des anticorps conjugués n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris aux doses choisies.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement des tumeurs et analyses.

Remplacement

Des tests in vitro ont été effectués au préalable et ont permis d’affiner le design de l’étude en identifiant les anticorps les plus prometteurs pour cette indication mais les interactions avec la tumeur sont complexes et impactées par différents paramètres (structure cellulaire, rigidité). Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur et au sein de l’organisme nécessitent de travailler sur un organisme entier et complexe. Pour cette raison nous devons effectuer ces études d’efficacité chez la souris.

Réduction

L’effectif des groupes a été déterminé grâce à un test de puissance statistique qui nous a aidé à déterminer que nous aurions besoin de 8 animaux par groupe. Nous avons également besoin de 4 animaux par groupe pour les études d’histologie. Pour les 12 groupes, il faudra donc 144 animaux. Avec une prise de greffe d’environ 90%, 10% soit 15 animaux supplémentaires par modèle seront greffés. Les études sur les différents modèles tumoraux seront réalisées en séquentiel, les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation de 7 jours et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en pratiquant la contention une fois par jour pendant 5 jours. Les expérimentateurs possèdent l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi du modèle de cancer de l’ovaire ainsi que pour l’administration de traitements en intraveineuse. Par ailleurs, l'état des animaux sera évalué par une grille de scoring sur des critères comportementaux (activité, isolement…), physiques (poils hérissés, dos voûté…) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite. Les critères observables sont évalués quotidiennement, les critères mesurables (poids, taille des tumeurs) sont évalués trois fois par semaine. Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Si jugé nécessaire, un traitement antalgique sera mis en place.

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler sur des tumeurs issues de cellules humaines afin d’être au plus près de la réalité clinique, nous avons donc besoin d’animaux présentant un système immunitaire fortement déprimé afin d’éviter le phénomène de rejet. La souris est l’espèce la plus adaptée pour cet objectif, cette souche étant un modèle qui permet une prise tumorale efficace avec de nombreuses lignées humaines. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

2 710 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à douze injections de traitement et douze injections d'un traceur luminescent, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour des prélèvements post-mortem. Greffées en sous-cutané ou en intraveineux avec des cellules tumorales de myélome, ces souris immunodéprimées subissent des séances d'imagerie sous anesthésie et des prélèvements sanguins, les tumeurs pouvant se nécroser, s'ulcérer au point d'injection ou gêner leurs mouvements. Les retombées annoncées, moins de toxicité pour les patients grâce à une meilleure pharmacocinétique, restent au futur, et le porteur affirme que l'animal reste "inévitable" à ce stade et que "l'animal entier" est "nécessaire".

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est une tumeur maligne caractérisée par une infiltration de la moelle osseuse. La survie à 5 ans de patients atteints de MM est de 48,5 % et malgré l'introduction de médicaments immunomodulateurs et d'inhibiteurs du protéasome, de nombreux patients présentant des caractéristiques à haut risque ont toujours de faibles taux de survie. Malgré des avancées importantes dans les stratégies thérapeutiques ces dernières décennies, le myélome multiple reste incurable. La surveillance de la progression maligne et de la récidive de la maladie après le traitement est un défi central pour améliorer les résultats des patients atteints de MM. Les objectifs du projet sont de développer de nouveaux nanotransporteurs pour la délivrance de molécules d’intérêts à visés thérapeutiques dans le cadre de traitement anti-cancéreux notamment dans le myélome multiple. Ces nanotransporteurs auront également la capacité d’être couplées à des molécules pour le dépistage ou le suivi du développement tumoral par imagerie chez l’Homme. Nos expertises pluridisciplinaires à l’interface entre la chimie et la biologie, nous permettent de développer des nanotransporteurs aux caractéristiques physico-chimiques divers (polymérique, lipidique et inorganique de tailles variables). Ces molécules synthétiques pourront encapsuler des agents thérapeutiques tels que des peptides, des chimiothérapies, des protéines. Les nanotransporteurs seront couplés à des molécules thérapeutiques et fonctionnalisés pour le ciblage des cellules cancéreuses ou de son environnement direct afin d’améliorer l’efficacité et la spécificité du traitement. Ils pourront également être utilisés pour l’amélioration de la sensibilité, du suivi des tumeurs et du diagnostic. Cette première partie du projet consistera à identifier via des études pharmacocinétiques sur souris saines les nanotransporteurs proposant les meilleures propriétés cinétiques ainsi que la biodistribution la plus adéquates en fonction de l’utilisation souhaitée (traitement, imagerie). Dans un second temps, nous évaluerons précliniquement sur un modèle de tumoral de myélome murin l’efficacité thérapeutique de ces nouvelles molécules formulées en nanotransporteurs.

Bénéfices attendus

Menée à bien, cette étude devrait permettre de connaître la place des différentes nanotransporteurs dans l’arsenal thérapeutique et diagnostic actuel du myélome. La comparaison des différentes nanotransporteurs ciblées devrait permettre de mieux comprendre l’influence de la taille et de la composition des nanotransporteurs sur le ciblage actif, et de montrer leur intérêt d’un point de vue pharmacocinétique. Cela montrera l’intérêt des nanotransporteurs pour réduire les toxicités associées aux traitements du cancer chez l’Homme grâce à l’amélioration de la pharmacocinétique par rapport aux chimiothérapies classiques.

Procédures

Pour la mise en place des modèles tumoraux, les animaux seront soumis à une injection sous cutanée ou intra veineuse de cellules tumorales d'une durée

Impact sur les animaux

Certaines molécules envisagées sont en essais cliniques et leurs effets indésirables sont donc connus. Les nuisances dues à leurs utilisations peuvent être les suivantes : une perte de poids, un œdème, une tachycardie, une dyspnée, une hypotension, un syndrome de réponse respiratoire systémique (SIRS) ou une pneumonie (inflammation de la couche mince de tissu située entre les sacs alvéolaires). Les nuisances identifiées sur souris implantées avec des cellules tumorales sont l'apparation d'une tumeur dont la taille va augmenter si ce n'est dans les groupes traités avec les nouveaux médicaments qui s'ils sont efficaces devraient réduire la taille de ces tumeurs. En évoluant la tumeur pourrait présenter une apparence de nécrose ou s'ulcérer au lieu d’injection ou génêr l'animal dans ses mouvements. Les transporteurs de médicaments testés ont pour but d’améliorer la délivrance des traitement directement dans l’environnement tumoral par leur fonctionnalisation et de ce fait, d’en réduire les effets secondaires et en potentialisant leurs pouvoirs thérapeutiques.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement et analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro déterminant la spécificité de ciblage et la cytotoxicité des nanotransporteurs ont été préalablement réalisé afin de remplacer une partie des expérimentation in vivo. Cependant à ce stade du projet, l’utilisation de modèles animaux reste inévitable pour examiner l’aspect translationnel de nos travaux. Un modèle de greffe orthotopique est notamment important car même s’il demande un suivi tumoral par imagerie (sous anesthésie) il reste plus représentatif du microenvironnement du myélome (cancer du sang) ; l’animal entier est donc nécessaire. En effet, la pharmacocinétique des groupes de traitement cités ci-dessus et la toxicité systémique (toxicité qui affecte tout l’organisme) ne peut être déterminées que in vivo. Cette étude préclinique, visera à évaluer la pertinence clinique de l’utilisation des nanotransporteurs pour le traitement du myélome multiple et d’y intégrer les paramètres environnementaux inhérent à un organisme entier.

Réduction

Les effectifs sont justifiés par l’importante variabilité des résultats obtenus pour l’efficacité du traitement pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux a été calculé mathématiquement et les résultats entre les groupes d’animaux seront comparés avec des tests statistiques adaptés et robustes permettant de mettre en évidence l’effet des traitements testés sur la croissance des tumeurs. Le nombre de paramètres mesurés par animal a été optimisé et nous avons privilégié les études longitudinales lorsque cela était possible. L’étude de toxicité sur souris saine ainsi que de biodistribution servent d’études pilotes avec un nombre restreint de groupes qui conditionnera la suite du projet, le nombre annoncé est donc un nombre maximum d’animaux pour l’étude complète de 5 nanotransporteurs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en portoir ventilés en groupe sociaux selon les normes en vigueur avec des conditions d’hébergement et d’enrichissement de leur environnement conformes à la validation de la cellule bien-être (ex : bâton à ronger, coton pour faire un nid permettant à l’animal d’exprimer des comportements naturels). Les animaux observeront une période d’acclimatation après réception. Un tunnel dans la cage et/ou une habituation à la contention (2-3x par semaine sur au moins 1 semaine) sera réalisée avant chaque procédure afin de minimiser le stress due à la contention lors des injections ou à leur manipulation. Toutes les manipulations susceptibles de générer de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Chaque animal est étroitement suivi dès lors qu’il entre dans l’une des procédures (2 à 3 fois par semaine) afin d’identifier les signes de stress, de douleur le plus précocement possible. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin de soustraire l’animal à toute forme de souffrance en interrompant la procédure. Les données seront intégrées à l’aide d’une grille d’évaluation (état de stress, niveau de douleur, taille de tumeur, etc.) et l’animal pris en charge selon le score obtenu.

Choix des espèces

La raison la plus importante du choix des souris pour nos études est leur similitude avec les organismes humains en ce qui concerne l’anatomie, la physiologie et la génétique. Dans le domaine de la cancérologie , la greffe de cellules tumorales ne peut être réalisée avec succès que sur des souris immunodéprimées adultes afin d'éviter tout phénomène de rejet de la greffe de cellules tumorales ce qui permet ensuite de suivre la croissance tumorale au cours diu temps et d'évaluer l'impact de candidats médicaments sur cette croissance.

Les souris sont tuées quand la lésion de leur coussinet plantaire atteint 10 mm ou se nécrose, les hamsters avant qu'ils n'aient perdu 20 % de leur poids, seuil précédé de prostration et d'isolement dans la cage. 410 souris et 310 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Anesthésiés, ils reçoivent une inoculation de Leishmania, sous la peau du coussinet plantaire pour les souris, avec une lésion qui grossit pendant trois mois et réduit leur mobilité, dans l'abdomen pour les hamsters, chez qui le parasite colonise le foie et la rate. Aucune expérience n'est menée sur eux pour elle-même, ils sont infectés pour que le laboratoire dispose de parasites virulents et de tissus parasités pour ses autres projets, et le porteur écrit que cet effectif "n'exige aucune approche statistique".

Objectifs

Le développement des Leishmanies est complexe et très partiellement élucidé notamment chez les mammifères. Initialement deux populations morphologiquement distinctes ont été distinguées: Un stade de développement ne peut s’établir en dehors des cellules hôtes à l’exception de Leishmania donovani et Leishmania mexicana pour lesquelles il est possible de produire ce stade pouvant se développer en absence de cellules hôtes mammifères. Néanmoins ceux-ci présentent des caractéristiques très différentes de es stades lorsqu’ils sont isolés à partir d’un individu malade. Ce projet permettra de produire un stade de développement de Leishmania major, Leishmania amazonensis, Leishmania tropica, Leishmania infantum et Leishmania donovani et d’avoir accès à des tissus fortement parasités qui pourront être utilisés pour la réalisation des projets scientifiques du laboratoire. En effet ceux-ci sont axés sur la connaissance de la biologie des Leishmanies et de ses interactions avec ses hôtes pour l’identification à terme de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, ce projet propose de comparer différents modes d’administration des parasites ainsi que la faisabilité d’utiliser des mâles et non plus seulement des femelles. La réalisation de ce projet repose sur 4 procédures : (1) et (3) raffinement des modes d’administration des parasites et faisabilité quant à l’utilisation de souris et hamsters mâles pour la production de parasites (2) recours à des souris pour le prélèvement de tissus cutanés et/ou ganglions drainant le site d’inoculation (4) recours à des hamsters dorés pour le prélèvement de leur rate et de leur foie L’inoculation des parasites est réalisée sur animaux anesthésiés. Les animaux sont observés chaque semaine et cette observation est couplée à une mesure du poids des individus. Les animaux sont mis à mort aux points limites définis dans le projet selon les méthodes approuvées.

Bénéfices attendus

Deux bénéfices distincts sont attendus. L’un vise à faire évoluer, si possible, nos modèles expérimentaux pour une amélioration de la santé et du bien-être animal et un raffinement des techniques d’injection. L’autre concerne la connaissance de la biologie des Leishmania et les bénéfices qui en découlent pour la santé humaine et animale. Les parasites du genre Leishmania pathogènes pour l’homme se développent dans deux hôtes distincts, les insectes vecteurs et hôtes, et les mammifères. Le passage d’un hôte à l’autre entraîne une transformation des parasites d’un stade de développement dans l’insecte hématophage à un autre stade de développement dans les cellules des hôtes mammifères et réciproquement. Chez l’homme la multiplication d’un stade de développement au sein des cellules phagocytaires telles que les macrophages provoque à terme la maladie. Aujourd’hui il n’existe toujours pas de vaccination et les traitements actuels sont non seulement toxiques mais deviennent aussi de moins en moins efficaces en raison de l’apparition de parasites résistants au peu de médicaments disponibles. Or les espèces du complexe Leishmania donovani provoquent une leishmaniose viscérale mortelle en absence de traitement efficace tandis que les autres espèces provoquent des lésions cutanées souvent défigurantes à l’origine de stigmatisations sociales importantes notamment chez les femmes. Seule la compréhension du programme complexe de développement de Leishmania pourra nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la génération de nouveaux médicaments et de vaccins, et, pour y parvenir il est primordial d’avoir accès à des parasites virulents purifiés à partir d’animaux infectés. A court terme ce projet nous permet donc de travailler avec des parasites biologiquement pertinents pour toutes nos recherches. A long terme les résultats de nos recherches pourront se traduire en avancées majeures dans la prévention et la chimiothérapie des différentes formes de leishmanioses.

Procédures

Pour les hamsters et les souris les animaux sont : 1) anesthésiés pour pratiquer l’inoculation des parasites. Durée de contention de l’animal pour l’injection intrapéritonélae de l’anesthésique inférieure à 30 secondes/animal et la durée de l’anesthésie varie de 15 à 30 minutes. Le temps d’inoculation sous-cutanée des parasites est de l’ordre de 30 secondes/animal. 2) suivis périodiquement (hebdomadaire, à minima à compter du 2ème mois post-injection des parasites) pour l’évolution de la pathologie. Pour les souris, l’animal est maintenu pendant la mesure puisqu’il doit être tenu immobilisé afin de pouvoir mesurer l’épaisseur du coussinet plantaire, lieu de l’injection des parasites et donc du développement de la lésion. Le temps de la contention/mesure est inférieur à 30 secondes/souris. Pour la procédure de raffinement des voies d’injection, les souris pourront être anesthésiées par voie gazeuse afin de permettre les mesures de taille des lésions. Dans ce cas la durée de l’anesthésie sera réduite à 5-10 minutes. Pour les hamsters, ceux-ci sont uniquement déplacés individuellement dans le pot à peser, la totalité de l’intervention étant également inférieure à 30 secondes/hamster. Pour la procédure de raffinement des voies d’injection, les hamsters seront anesthésiés par voie gazeuse et maintenus ainsi pendant la procédure d’imagerie in vivo qui comporte une injection intrapéritonéale. La totalité de cette procédure est évaluée à 45 minutes/individu.

Impact sur les animaux

Les effets attendus sur les animaux dépendent de l’espèce de Leishmania inoculée et du site d’injection. Les Leishmania responsables d’atteintes cutanées telles que L. amazonensis, L. major ou L. tropica lorsqu’elles sont injectées dans le coussinet plantaire des souris vont créer localement une réponse immune. Ceci permettra le recrutement des cellules de type macrophage dans lesquelles les parasites vont pouvoir se multiplier et conduire progressivement à la création d’une lésion non nécrosante quand les parasites sont inoculés à certaines souris. Au cours du temps les effets sur les animaux vont passer de silencieux (pas de signe visible) pendant un mois à progressivement symptomatique. Durant cette période la taille de la lésion va augmenter entraînant une réduction de la mobilité dans le cas d’une injection dans les coussinets plantaires mais sans impact sur l’alimentation et l’hydratation car l’expérimentation est arrêtée avant d’atteindre les points limites et donc ce stade (au plus trois mois après l’inoculation). Les espèces de Leishmania viscérales, L. infantum et L. donovani vont colonisées principalement le foie et la rate des hamsters. Dans ce cas aussi la première phase de la maladie est silencieuse et peut durer de 1 à 3 mois. Au-delà, le premier signe clinique de l’évolution de la pathologie est une stabilisation de la prise de poids suivi d’une perte progressive de poids. Cette perte de poids lorsqu’elle atteint 20% (point limite de l’expérimentation) s’accompagne souvent d’une réduction de la mobilité voire de prostration et d’isolement dans la cage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent en effet être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car la fin de la procédure implique la mise à mort des animaux pour réaliser le prélèvement des lésions ou organes internes sources de parasites.

Remplacement

Quatre limitations majeures sont à noter quant à l’utilisation de parasites maintenus uniquement en culture : (1) il n’existe aucune méthode permettant de générer et cultiver in vitro certains stades de développement de L.major, L. tropica, L. infantum et de L. amazonensis, (2) à terme les subcultures in vitro des diverses espèces de Leishmania à certains stades de développement se traduisent par la perte rapide d’une mécanisme indispensable pour s’établir chez l’hôte mammifère, (3) il est présentement impossible d’obtenir un autre stade de développement à partir de L. donovani maintenues in vitro, (4) certaines formes de L. donovani sont différentes de celles provenant de tissus animaux, elles ne s’établissent pas chez les mammifères modèles – hamsters- auxquels ils sont inoculés.

Réduction

Ce projet est avant tout destiné à la production de Leishmania virulents ou de tissus colonisés par les parasites pour permettre la réalisation des différents projets scientifiques du laboratoire. De fait il n’exige aucune approche statistique pour définir le nombre d’animaux à utiliser. Ce nombre est donc estimé en fonction des projets du laboratoire en sachant que les parasites purifiés à partir de chaque animal sont utilisés pour plusieurs types d’expérience qui sont ainsi planifiées en conséquence. Les animaux infectés devant être mis à mort pour la production de parasites ou de tissus infectés, il est donc impossible de les réutiliser.

Raffinement

Les animaux sont placés dans des cages en portoir ventilés, la nourriture et l’eau de boisson sont stérilisées (irradiation ou autoclavage). Tout le matériel utilisé (seringues, aiguilles, instruments de mesure) est stérile ou décontaminé avant contact avec les animaux. L’infection parasitaire étant silencieuse en termes de signes cliniques pendant les 8 premières semaines, souris ou hamsters sont observés tous les jours par le personnel de l’animalerie au moment du changement des cages ou par l’expérimentateur. A partir du 2ème mois suivant l’injection des parasites, les animaux sont également examinés chaque semaine pour l’apparition et le suivi des signes cliniques de la maladie. Pour les souris inoculées avec les parasites qui cible le derme, l’évolution de la lésion au site d’injection est estimée par mesure de l’épaississement du coussinet plantaire ou bien du site d’injection chaque semaine par l’expérimentateur. Lorsque celle-ci atteint une taille moyenne maximale de 10 mm (point limite dans le cas d’une injection dans les coussinets plantaires) ou en cas de nécrose les souris sont mises à mort. En cas de détérioration de l’état général des souris celles-ci seront mises à mort. Dans le cas des hamsters, les animaux sont pesés chaque semaine pour mesurer l’évolution de la leishmaniose. Les animaux sont mis à mort selon la procédure validée avant d’atteindre le point limite (20% perte de poids). Pour ces deux espèces, l’injection des parasites est réalisée après anesthésie légère des animaux. Durant la procédure, en cas de prostration ou difficulté locomotrice un gel d’hydratation pourra être placé dans la cage tout comme les granulés alimentaires. De même, une litière douce à base de cellulose pourra être substituée à la litière traditionnelle. Dans ce projet plusieurs sites d’injection des parasites seront comparés quant à la production en nombre de parasites et la possibilité de travailler sur les tissus parasités. Dans la mesure où aucune différence liée au mode d’administration ne serait mise en évidence, la voie d’inoculation choisie pour toute la durée du projet serait celle respectant au mieux la santé et le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le choix des modèles souris et hamster est lié à la susceptibilité de certaines de ces espèces vis-à-vis des Leishmania. Certaines lignées de souris consanguines dites sensibles permettent le développement de L. major, L. tropica et L. amazonensis dans les lésions localisées au site d’inoculation. Certaines souris sont préférentiellement choisies pour la production de ces parasites car elles développent rapidement des lésions très riches en amastigotes et non nécrosantes. En revanche le modèle souris est peu adapté pour les espèces de Leishmania viscérales telles que L. donovani ou L. infantum, d’où le choix du hamster qui développe une pathologie proche de celle observée chez l’homme et rend possible la production en nombre des parasites à partir de la rate et le foie des animaux infectés. L. major, L. tropica et L. amazonensis seront inoculées à des souris âgées de 5 à 8semaines. L. donovani et L. infantum seront inoculées aux hamsters entre la 5ème et la 8ème semaine soit avant la stabilisation de la prise de poids pour un animal non traité. En effet, l’un des premiers marqueurs révélateurs de l’initiation des dommages systémiques est la stabilisation dans la courbe d’évolution du poids, le second révélateur de la progression des dommages étant une perte pondérale.